SE430104B - Testkomposition for bestemning av ett peroxidativt aktivt emne i ett prov samt dess anvendning - Google Patents

Description

7so1154-0 2.

Clinical Chemistry Principles and Techniques (Hagerstown, Maryland; Harper and Row, 1974, p. 1124-1125). Detta förfarande innebär att man använder isättika (buffert), difenylamín (indikator) och väteper- ioxid. Ehuru dylika våta förfaranden har visat sig kunna användas analytiskt, är de aoek behäfteae med självklara naekaeler, av vilka den icke minst framträdande är dålig stabilitet hos reagenserna och otillräcklig känslighet. Dylika reagenslösningar lider av den inne- boende svagheten, att stabiliteten (och därmed känsligheten) avtar så snabbt att nya reagenslösningar måste framställas efter några dygns lagring, vilket nödvändigtvis resulterar i både att alltför imycket tid kräves av_den analytiska personalen och i dålig ekonomi -genom att man måste kasta bort dyrbara reagens.

Ett andra förfarande för bestämning av peroxidativt aktiva äm- nen och som är det förfarande, som för närvarande föredrages av kli- nisk undersöknings- och analyspersonal, är användning av s.k. rea- gensremsor av typen "doppa och avläs". En typisk sådan anordning är en reagensremsa som framställes av Ames Company Division of Miles Laboratories, Inc. och saluföres under namnet Hemastix . Denna reagensremsa omfattar i huvudsak en porös pappersmatris fäst på en remsa eller ett handtag av plast. Papperet är impregnerat med en buffrad blandning av en organisk hydroperoxid och o-tolidin. När remsan neddoppas i en vätska innehållande hemoglobin, myoglobin, erytrocyter eller andra pseudoperoxidaser, utvecklas en blå färg i epapperet, vars intensitet är proportionell mot koncentrationen av det peroxidativt aktiva ämnet i provet. Genom jämförelse av den utveck- lade färgen i reagensremsan med en standardfärgskala kan den som ut- _för undersökningen göra en halvkvantitativ bestämning av den okända mängden i provet.. _ Fördelarna med reagensremsor i förhållande till våta kemiska förfaranden är i huvudsak av två slag: remsor är lättare att använda eftersom de varken kräver framställning av reagens eller någon till- hörande apparatur, och reagensen uppvisar större stabilitet, vilket resulterar i större noggrannhet, känslighet och ekonomi. 7 De inneboende fördelarna hos remsor i förhållande till våta kemiska förfaranden kräver emellertid, trots den ökade stabiliteten och känsligheten, fortfarande ytterligare förbättring. Även om dessa egenskaper hos förefintliga kända remsor för bestämning av pseudoper- oxidaser har avsevärt förbättrats i förhållande till våta kemiska förfaranden, så skulle det icke desto mindre innebära ett stort fram- isteg om dylika remsor kunde göras ännu mer stabila vid lagring och 7801164-0 5 ännu mer känsliga för peroxidativt aktiva ämnen. Det var för att upp- nå dylika förbättringar som det forskningsarbete, som resulterade i föreliggande uppfinning, igångsattes.

Minst tre försök för att uppnå ovannämnda mål har rapporterats inom den kända tekniken. Ett referat i Chemical Abstracts, volym 85, p. 186 (1976) beskriver ett förfarande med dubbla doppningar för fram- ställning av reagensremsor innehållande o-tolidin och fenylisopropyl- hydroperoxid. I detta förfarande framställes en lösning av indikatorn (o-tolidin - 2HCl) och polyvinylpyrrolidon i etanol. Till denna lös- ning sattes en mindre mängd av ytaktivt medel och en tillräcklig mängd citratbuffert för åstadkommande av pH 5,7. Filterpappersremsor impreg- nerade med etylcellolosa doppades i denna lösning och torkades. Det så impregnerade filterpapperet doppades därefter i en andra lösning, innehållande l,4-diazabicyklo¿2.2.27oktan, fenylisopropylhydroperoxid och polyvinylpyrrolidon, löst i en blandning av etanol och toluen. Ändamålet med detta experiment var att stabilisera kombinationen av peroxiden och indikatorn genom användning av bicyklooktanderivatet och polyvinylpyrrolidon.

Ett andra dylikt förfarande beskrives i den amerikanska patent- skriften 5.855.471. Denna patentskrift beskriver användningen av fosfor- eller fosfonsyraamider, i vilken substituent amidogrupperna i första hand är N-morfolinradikaler.

Förutom dessa försök finnes även ett försök beskrivet i den amerikanska patentskriften 5.252.762, där den organiska hydroperoxi- den är fysikaliskt innesluten inuti ett kolloidalt material, såsom gelatin. När en dylik provremsa användes löser det vattenhaltiga provet gelatinkapslarna, varigenom hydroperoxiden frilägges för reak- tion med indikatorn i närvaro av en peroxidativt verksam substans.

Vart och ett av dessa tidigare försök syftade till att stabi- lisera reagenserna, så att de potentiellt icke förlikbara reaktiva beståndsdelarna (hydroperoxid och indikator) icke skulle kombineras i förtid och därigenom göra provremsan mindre känslig. Man kan emel- lertid säga, att dessa kända förfaranden icke syftade till de kombi- nerade ändamålen att samtidigt öka stabiliteten och känsligheten utan att de snarare försökte konservera.rådande känslighet genom ett förhindrande av sönderdelning av reagenserna under lagring.

Ytterligare en känd publikation, som är av intresse, är den amerikanska patentskriften 5.256.850. I denna patentskrift beskrives stabilisering av organiska hydroperoxider, som användes såsom kataly- satorer och oxidationsmedel. I patentskriften beskrivas användning 7801164-0 4 av primära, sekundära eller tertiära aminsalter med organiska peroxi- der. Denna publikation avser på intet sätt provremsor innehållande reagenser. _ _ Sedan man insett, att inget av ovan beskrivna förfaranden skul- le uppnå den grad av stabilitet och känslighet, som önskades i en provremsa för bestämning av peroxidativt aktiva ämnen, beslöt man sig för att angripa problemet på ett helt annat sätt. Detta sätt att angripa problemet upptäcktes under forskning, som ledde till förelig- gande uppfinning och resulterade i en komposition och en anordning, som fullständigt uppfyllde de önskade syftemålen beträffande ökad »stabilitet och känslighet.. Ännu mer överraskande erhölls emellertid ytterligare en för- del vid detta arbete, nämligen ett förbättrat förfarande för fram- r ställning av den här avsedda anordningen, varigenom framställningen blir avsevärt enklare än de förfaranden som.angives i de ovan angivna, gkända publikationerna, och närmare bestämt ett förfarande med en en- da doppning.

Kort sagt består föreliggande uppfinning i en testkomposition och en anordning för bestämning av närvaron av en pseudoperoxidas i ett prov. Testkompositionen omfattar en organisk hydroperoxid, en indikator som är i stånd att framtvinga en bestämbar respons i när- varo av en hydroperoxid och ett peroxidativt verksamt ämne, samt en- dera eller bägge av f ä (1) et: utspäaningsmedei med før-main O T R 1\s+ o , Rl-s-Rz , R/ 2 »I o o Rl_ / NR1R2 eller blandningar därav, där Bl och R2 är lika eller olika och be- tecknar alkyl eller alkoxi innehållande l till ca 6 kolatomer, eller aryl och r l (2) en boratester med formeln /ccflzïnl- o\ N_(cuz)n_ 0- B (CH2)p*-0 7801164--0 5 i vilken m, n och p, som kan vara lika eller olika, är heltal från l till ca 4.

Anordningen enligt föreliggande uppfinning omfattar ovannämnda komposition införlivad i en bärarmatris. Förfarandet omfattar fram- ställning av testkompositionen och dess införlivande i matrisen.

Den organiska hydroperoxid, som skall användas i testkomposi- tionen, kan väljas bland många välkända organiska hydroperoxider.

Den måste emellertid vara i stånd att reagera med ett peroxidativt verksamt ämne i närvaro av en peroxidkänslig indikator för frambring- ande av en bestämbar respons, såsom en färgförändring eller en föränd- ring i den mängd ljus, som absorberas eller reflekteras av testkompo- sitionen. Bland de hydroperoxider, som har visat sig vara lämpliga, må nämnas tert.butylhydroperoxid, kumenhydroperoxid, diisopropylbensen- hydroperoxid, 2,5-dimetylhexan-2,5-dihydroperoxid, paramentanhydro- peroxid eller blandningar därav. Av dessa har kumenhydroperoxid visat sig vara den lämpligaste.

Det finns många indikatorer, som är i stånd att frambringa en bestämbar respons i närvaro av en hydroperoxid och en pseudoperoxidas, och som därför lämpar sig för användning enligt uppfinningen. Dessa omfattar föreningar av s.k. "bensidintyp", och typiska exempel på dylika är bensidin, o-tolidin, 5,3',5,5'-tetrametylbensidin, 2,7- diaminofluoren eller blandningar av dessa i olika proportioner.

De boratestrar, som för närvarande anses bidraga till ökad stabilitet och känslighet, har den ovan angivna formeln. Bland före- ningar, som faller under denna allmänna formel, har det visat sig, att trimetanolaminborat, trietanolaminborat och tri(n-propanol)amin- borat är särskilt lämpliga. Dessa föreningar motsvarar ovan allmänna formel då m, n och p är samma heltal och är l, 2 respektive 3.

Den mängd boratester, som skall användas i föreliggande kompo- sition och anordning, kan variera inom vida gränser. Detta avspeg- lar sig i efterföljande exempel. Sålunda är molförhållandet mellan trietanolaminboratekvivalenter och kumenhydroperoxidekvivalenter 4,71.

Omvänt anges i exempel 3 ett molförhållande av 2,83 mellan borat och hydroperoxid (ett normalitetsförhållande av 1,42 om man tar hänsyn till att peroxiden är difunktionell).

Ekvivalentförhållanden mellan ca l,4 till ca 5, såsom anges i exemplen, ar emellertid icke begränsande med avseende på mängden bo- rac, som skall användas vid föreliggande uppfinnins- Varje mänsd _ H . .. . .- ' ' h som är tillräcklig for uppnaende av onskad grad av stabilitet oc _ . ~ ~ d K känslighet hos testkompositionen kan användas, och denna manå än .7801164--0 6 iclätt bestämmas vid laboratoriebordet med ledning av föreliggande be- skrivning av uppfinningen.

Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen omfattar kompo- sitionen kumenhydroperoxid, o-tolidin, en blandning av dimetylsulfon och dimetylsulfoxid samt trietanolaminborat. _ Testkompositionen framställes typiskt genom upplösning eller suspendering av varje beståndsdel som skall användas i vatten eller något annat lämpligt suspensionsmedel eller lösningsmedel. Dylika lösnings- eller suspensionsmedel omfattar kloroform, metanol, etanol, metylenklorid, cyklohexan etc. p D 1_Testanordningen kan framställas genom ett förfarande med en enda doppning. Följaktligen neddoppas en del av bärarmatrismateria~ let i lösningen eller suspensionen och torkas därefter. De så er- D hållna testanordningarna uppvisar mycket liten förlust av reaktivitet även efter lagring under svåra betingelser, såsom ca 60°C till ca 7000 under l-5 dygn och längre. För Jämförelses skull framställdes liknande testanordningar men utan närvaro av boratester och/eller utspädningsmedel. Då dessa remsor lagrades under i huvudsak identis- ka, svåra betingelser, observerades en avsevärd förlust i reaktivitet och känslighet.

Den bärarmatris, som användes vid framställning av testanord- ningen, kan ha en mängd olika former." Sålunda beskrives i den ameri- kanska patentskriften 5.846.247 användning av filt, porösa keramiska remsor och vävda eller till mattor formade glasfibrer. Den amerikans- ka patentskriften 3.552.938 beskriver vidare användning av trästickor, tyg, svampmaterial och lerhaltiga ämnen. Användning av ull av konst- harts och glasfiberfiltar såsom bärarmatris föreslås i den brittiska patentskriften 1.369.139. En annan brittisk patentskrift, 1.349.623, .föreslår användning av ett ljusgenomträngligt nätverk av tunna trådar såsom täckskikt för en underliggande pappersmatris. Polyamidfibrer omtalas i den franska patentskriften 2.170.397- Trots dessa förslag är det material, som företrädesvis användes såsom bärarmatris i kända anordningar och vilket särskilt lämpar sig för föreliggande uppfin- ning, ett vätskeabsorberande papper, såsom filtrerpapper. Av ovan- stående inses, att det finnes ett stort spelrum vid valet av lämpligt material för användning såsom bärarmatris, och att matrisen kan anta olika fysikaliska former. Alla dessa typer anses ligga inom ramen för föreliggande uppfinning.

.Den mekanism, varigenom föreliggande lösning av problemet att åstadkomma förbättrad stabilitet och känslighet åstadkommes, är icke' 7801164-0 7 säkert känd. De unika kemiska egenskaperna hos den boratester, som beskrives och för vilken skydd begäres enligt föreliggande uppfinning, utgör emellertid en tillräcklig grund för spekulationer. Det är känt, att peroxider är allmänt instabila föreningar, eller är åtmins- tone mindre stabila än de flesta föreningar, som förekommer i naturen.

En del är explosiva. Andra, såsom organiska hydroperoxider (nämligen kumenhydroperoxid) är relativt stabila, men antas lätt dissociera i närvaro av syror, såsom de vilka vanligen användes i testanordningar, som är känsliga för ockult blod. När denna sönderdelning sker i när- varo av en oxiderbar indikator (såsom de här beskrivna), sker en redox-reaktion. Man antar att denna i förtid inträdande reaktion är orsaken till den minskade känsligheten hos peroxidativt käns- liga reaktionsremsor. Å andra sidan är boratestrar av det här beskrivna slaget unika till geometrin för kväve- och boratomerna i den bicykliska struktu- ren, i det att dessa atomer var för sig utgör ett brohuvud. Kväve- atomen vid det ena brohuvudet är elektronrik och innehåller ett odelat par av elektroner, som skjuter ut i riktning från molekylens axel.

Det andra brohuvudet, boratomen, som är belägen i den andra axiella änden av molekylen, uppvisar brist på elektroner och tenderar att koordinera med elektronrika anjoner.

På grund av sin elektronrikedom är det sålunda helt troligt att kväveänden av molekylen kan binda upp en proton, under det att den elektronfattiga boratomen vid det andra brohuvudet kan koordina- tivt kopplas med en anjonisk peroxidrest. Man tror sålunda, att den unika elektronfördelningen i de här diskuterade bicykliska molekyler- na stabiliserar den organiska peroxiden i föreliggande testkomposition genom att den kemiskt placerar sig mellan den peroxidiska protonen och syreatomen under bildning av ett koordinativt kopplat jonpar.

I föreliggande testkomposition antas sålunda den överraskande uökade stabiliteten uppkomma genom att den organiska hydroperoxiden hindras från att joniskt reagera med indikatorn tills den solvateran- de förmågan hos provet förstör peroxid-boratkomplexet och frigör per- oxiden för oxidation av indikatorn i närvaro av ett peroxidativt verk- samt ämne.

.Men även om den markerade ökningen i stabiliteten och känslig- heten är resultatet av användningen av boratestrar, så har det över- raskande befunnits, att ännu större stabilitet och känslighet kan uppkomma, då boratestern och ovannämnda lösningsmedel bägge ingår i testkompositionen. 7801164-o 8 r De såsom utspädningsmedel tjänande föreningarna, som antas bi- draga till den ökade stabiliteten och känsligheten vid föreliggande uppfinning, har ovan angivna formler. Av de föreningar, som omfattas av dessa allmänna formler, har det visat sig, att N,N-dimetylformamid, dimetylsulfoxid, dimetylsulfon eller blandningar därav är särskilt lämpliga. Andra utspädningsmedel, som har visat sig vara verksamma, är bensylsulfoxid, 4-klorfenylsulfon, 4-fluor-3-nitrofenylsulfon och andra. Dessa föreningar motsvarar de ovanstående formlerna, om Rl och R2 var för sig är metyl.

Omfattningen av beteckningarna Rl och R2 är enligt uppfinningen ganska vid.f Med Bl och R2 avses sålunda substituerad och osubstitue- rad alkyl innehållande l till ca 6 kolatomer. Exempel på alkylgrupper är metyl,letyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.butyl, n- pentyl, isopentyl, neopentyl, tert.pentyl och andra isomerer, inne- fattande isomererna av hexan. Dessa alkylgrupper är även belysande för de alkoxigrupper, som faller under ovanstående definition av Rl och R2. f Då Rl och R2 är aryl, är omfattningen likaledes vid, och ut- trycket aryl, såsom det användes här, omfattar substituerade och osub- stituerade arylgrupper, såsom.fenyl, bensyl, tolyl, anilino, naftyl etc. 0 - Typiska grupper, med vilka Bl och H2 kan vara substituerade, är amino, nitro, amido, nitril, hydroxyl, alkoxi, halogen, fenyl, sulfonsyra, karboxylsyra etc. p lMängden utspädningsmedel som användes i föreliggande komposi- rtion, anordning och förfarande kan variera inom vida gränser och kan lätt bestämmas vid laboratoriebordet. Då utspädningsmedlet är en vätska, såsom dimetylsulfoxid (se tabell II nedan), kan mängden varie- ra från ca 10% till ca 100%, beräknat på volymen utspädningsmedel som sättes till kompositionen, jämfört med volymen av lösningsmedel eller suspensionsmedel (i fallet exempel l2 vatten). En föredragen mängd _.är från ca 25% till ca 100%.

Då utspädningsmedlet är en blandning av fler än en föreningar av det slag som angives här, kan på liknande sätt förhållandet av mängderna av de olika föreningarna som användes i utspädningsmedlet , variera inom vida gränser, och dessa kan även lätt bestämmas i labora- torie. p Följande exempel avser att ytterligare belysa uppfinningen utan .att därför begränsa densamma. 7801164-0 9 A. Framställning av testkomposition och -anordning.

Exempel l. Testkompositionen.

En testkomposition framställdes genom upplösning av följande beståndsdelar i l5O ml avjoniserat vatten. Beståndsdelarna sattes till vattnet i den ordningsföljd som de anges. trinatriumcitrat 3,2 g citronsyra 2,2 g tetranatriumsalt av etylendiamin- tetraättiksyra 0,1 g dimetylsulfon l0,0 g natriumlaurylsulfat 1,0 g 6-metoxikinolin 0,5 g dimetylsulfoxid 25,0 ml aceton 25,0 ml kumenhydroperoxid 2,0 g trietanolaminborat (Aldrich Chemical Co., Inc.) 10,0 g 6-tolidin 0,4 Exempel 2. Testanordningen.

Remsor av filtrerpapper Whatmann EMM doppades i testkompositio- nen enligt exempel l. De doppade remsorna torkades vid 7000 under ca l5 minuter till bildning av bärarmatriser impregnerade med test- komposition. De torkade bärarmatriserna fästes sedan vid remsor el- ler handtag av plast (polystyren) medelst dubbelsidigt adhesiv tejp, inköpt från EM Company. De så erhållna testanordningarna kan användas för bestämning av peroxidativt verksamma ämnen genom neddoppning i ett prov, såsom urin som man misstänker innehåller dylika ämnen, och observation av eventuell färgutveckling i bärarmatrisen.

B. Provning av olika testkompositioners stabilitet.

Exempel 2. Vermæiav boratestern. Ändamålet med detta experiment var att demonstrera verkan av trietanolaminborat på testkompositioner för bestämning av ockult blod, jämfört med andra kända tillsatser. Följande lösning bereddes. kloroform l0O ml o-tolidin 0,5 g 2,5-dimetylhexan-2,5-dihydroperoxid 2,0 g poly(N-vinylpyrrolidon) l0,0 g Till prover på denna lösning (20 ml vardera) sattes l g av tillsatserna i efterföljande tabell. Dessa testkompositionslösningar fick stå vid rumstemperatur under ca 5 timmar och de iakttagna resul- taten har sammanställts i tabell I nedan. t73o11e4-o lO Prov nr Tillsats l _ Resultat l hexametylentetramin Mycket mörk, nästan svart lösning. f g Dålig känslighet. 2 l¿4-diazabicyklo- Mörkgrön/brunaktig missfärgning. Mi- - ¿2.2.g/oktan nimai känslighet för Ockult blod 1 f urin. 3 trietanolaminborat Svag brunfärgning. Hög känslighet g för ockult blod i urin. 4 * kontroll (ingen g Blev svart inom ca 2 timmar. Oanvänd- l tillsats g bar för analys av ockult blod.

Exemgel 4. Verkan av utspädningsmedel. g Till en bägare rymmande 500 ml sattes följande beståndsdelar: kloroform _ lOO ml kumenhydroperoxid 4,0 g to-tolidin 0,4 g dimetylsulfoxid t 25,0 ml Den så erhållna testkompositionen, som var svagt gulfärgad vid blandning av ovanstående beståndsdelar, överfördes till en Erlenmeyer- kolv, som igenkorkades och fick stå på laboratoriebordet vid rumstem- peratur (l8,3°C) över natten. Efter ett dygn hade testkompositionen blivit endast något mörkare än då den framställdes.

Exem el . Jämförelse med exempel 4.

En testkomposition för kontrolländamål, dvs. för jämförelse med föreliggande uppfinning, framställdes enligt samma förfarande som i exempel 4 med undantag för att dimetylsulfoxiden utbyttes mot 25 ml ytterligare kloroform. Denna testkomposition utan dimetylsulfoxid ' infördes i en Erlenmeyer-kolv, som tillslöts och fick stå på labora- toriebänken såsom i exempel 4 (dvs. vid l8,3°C under ett dygn). I motsats till kompositionen i exempel 4 mörknade kontrollkompositionen .till nästan svart färg, vilket antydde att testkompositionen erhöll förbättrad stabilitet genom utspädningsmedlet.

C. Testanordningarnas stabilisering genom boratestern. _ExemQel 6. Kontrollprov.

En lösning av följande testkomposition framställdes i och för framställning av en reagensremsa, som är känslig för pseudoperoxidaser.

Denna.komposition innehåller icke boratestern enligt föreliggande upp- finning . i 7801164-0 ll H20 150 ml trinatriumcitrat 3,2 g citronsyra 2,2 g tetranatriumsalt av etylendiamintetraättiksyra 0,1 g dimetylsulfon 10,0 g natriumlaurylsulfat l,O g 6-metoxikinolin 0,5 g dimetylsulfoxid 25,0 ml aceton 25,0 ml kumenhydroperoxid 2,0 g o-tolidin 0,4 g Ett stycke filtrerpapper Whatmann EMM doppades i ovanstående testkompositionslösning och torkades vid 7000. Det torkade papperet skars till kvadrater med ca 5 mm sida, och dessa fästes vid plasthand- tag under användning av dubbelsidigt adhesiv tejp (från 3M Company), varvid testanordningar bildades.

Exempel Z. Föreliggande uppfinning.

En lösning framställdes såsom i exempel 6 ovan med undantag för att lO g trietanolaminborat tillsattes före tillsättningen av kumenhydroperoxiden. Testanordningar framställdes av denna lösning på samma sätt som i exempel 6.

Exempel 8 . iA-diazabicykiofizz.g7oktan.

En lösning framställdes såsom i exempel 6 ovan med undantag för att 10 g l,4-diazabicyklojë.2.@7oktan tillsattes före tillsätt- ningen av kumenhydroperoxiden. Denna lösning användes för framställ- ning av testanordningar på samma sätt som i exempel 6.

Exempel 2. Hexametylentetramin.

En lösning framställdes såsom i exempel 6 ovan med undantag för att lO g hexametylentetramin tillsattes före tillsättningen av kumenhydroperoxid. Testanordningar framställdes av denna lösning på samma sätt som i exempel 6 ovan.

Exempel 10. Jämförande försök beträffande stabilitet och känslighet.

Testanordningarna i exempel 6-9 utsattes för stränga betingel- ser för bestämning av deras relativa stabilitet och känslighet. An- ordningar från exempel 6-8 lagrades under tre dygn vid ca 6000 och de enligt exempel 9 under ett dygn vid ca 7000. Dessa för stränga betingelser utsatta testanordningarna provades sedan beträffande de- ras känslighet genom doppning i urin innehållande en milliondel blod.

Endast den anordning som innehöll trietanolaminborat (exempel 7) upp- 7801164-00 _ 12 visade en färgförändring vid denna koncentration av uckult blod (näm- .ligen 0,015 mg/dl). Återstâende anordningar var okänsliga vid denna koncentration av ockult blod.t _ D. Testanordningarnas stabilisering genom utspädningsmedlet.

Exemgel ll. _ Sex testanordningar framställdes av sex testkompositionslösning- 5 ar innehållande varierande mängder dimetylsulfoxid i enlighet med tabell II nedan. 0 5 De sex testkompositionslösningarna framställdes alla med föl- jande sammansättning: vatten 75 ml trinatriumcitrat ' ' 3,2 g citronsyra a 4,5 g crietanolaminborat a 10,0 g tetranatriumsalt av etylen- 7 5 diamintetraättiksyra 0,1 g dimetylsulfon 5,0 g natriumlaurylsulfat l,0 g 6-mecoxikinoiin ' 0,5 g kumenhydroperoxid 2,0 g 0-toliain o,4ag' Till var och en av dessa sex testkompositionslösningar sattes följande mängder av dimetylsulfoxid och metanol: Tabell II ,Testkomposition Dimetylsulfoxid Metanol nr (ml) (ml) i i 0 75 2 5 70 3 lO ' 65 4 25 50 5 40 35 6 60 15 Testanordningar framställdes sedan av var och en av dessa test- 5 kompositionslösningar genom doppning av ett stycke filtrerpapper Whatmann EMM i varje lösning. De doppade remsorna av filtrerpapper uttogs ur respektive lösning, torkades och utsattes för intensiva be- tingelser i en ugn vid 7000 under l8 timmar. 5 Efter denna behandling provades varje remsa i en testlösning innefattande en utspädning l:l.000.000 av färskt helblod i urin.

Intensiteten av den färg, som utvecklades i varje remsa, utgjorde ett 7801164-O 13 jämförelsemedel. Resultaten har sammanställts i tabell III nedan.

Tabell III Testanordning Färgförändringx* nrx l 0 (ingen färgning) 2 l (spår) 3 5 4 5 5 6 6 7 (nästan ingen förlust i reaktivitet) K Testanordningarnas nummer motsvarar testkompositionernas nummer i tabell II. xäFärgbedömningen baserade sig på en skala fiån.O till 8, varvid 8 be- tecknar den färg som framkallades av en nyframställd, utan intensi- va betingelser behandlad testanordning framställd av testkompositio- nen nr 6 (tabell II). En bedömning av O innebär ingen färgning, en bedömning av 7 antyder nästan ingen förlust i reaktivitet och en t bedömning av l antyder endast spår av färgning. _ Det är helt uppenbart av uppgifterna i tabell III, att känslig- heten ökar med mängden tillsatt utspädningsmedel (här dimetylsulfoxid) i testkompositionen.

E. ökad stabilitet hos testkompositionen (med boratester) vid till- sats av olika utspädningsmedel.

Exempel l2. Åtta testkompositioner framställdes på samma sätt som i exem- pel ll. Sju av dessa innehöll olika utspädningsmedel och en (kontroll) innehöll inget utspädningsmedel. Ändamålet med detta försök var att fastställa förmågan hos olika utspädningsmedel att öka stabiliteten hos testkompositioner, som var känsliga för peroxidativt verksamma ämnen, då mängden boratester i kompositionen hölls konstant.

En lösning framställdes innehållande följande beståndsdelar: vatten 50 ml trinatriumcitrat 3,2 g citronsyra 2,2 g natriumlaurylsulfat 1,0 g 6-metoxikinolin 1,0 g metanol 50,0 ml trietanolaminborat 5,0 g kumenhydroperoxid 2,Q g_ o-tolidin 0,4 g 27801164-0 14 Ett mindre prov på denna lösning sattes till vart och ett av åtta provrör. Därefter tillsattes små mängder av de utspädningsmedel, som är uppräknade i tabell IV, till vart och ett av provrören, varpå dessa tillslöts och fick stå vid rumstemperatur på laboratoriebordet .under en vecka. Vid slutet av denna vecka undersöktes provrören be- träffande relativ mörkfärgning, varvid testkompositionen var mindre stabil ju mörkare färgen var. Resultaten anges i tabell IV i ord- ningsföljden avtagande stabilitet (dvs. testkomposition 1 är den mest stabila och testkomposition 8 är den minst stabila).

Tabell IV Testkomposition Utspädningsmedel 'nr dimetylsulfoxid N,N-dimetylformamid dimetylsulfon bensyisuifoxia 4-klorfenylsulfon 4-fluor-3-nitrofenylsulfon 72 i 2-imidazolidon 8 (kontroll) ^ inget O'\U1\-I='\NIÛl-* I tabell IV uppvisar proven l och 2 utomordentlig stabilitet, lösningen 3 en mindre sådan men icke desto mindre god stabilitet, lösningarna 4-7 var måttligt stabila och lösningen 8, kontrollprovet, var avsevärt mindre stabil än lösningarna l-7. ' F. Föredragna utföringsformer. iExempel lfi.

Följande beståndsdelar blandas med 150 ml vatten: trinatriumcitrat 3,2 g citronsyra. 7 t 2,2 g tetranatriumsalt av etylen- diamintetraättiksyra 0,1 g _ aimetyisuifon 2 ' 10,0 g natriumlaurylsulfat 1,0 g 6-metoxikinolin 0,5 g dimetylsulfoxid 25,0 ml aceton. 25,0 ml trietanolaminborat 10,0 g kumenhydroperoxid 2 2,0 g o-tolidin ' 0,4 g g Remsor av filtrerpapper Whatmann 3MM doppades i ovanstående lösning och torkades vid 70?C. Sedan filtrerpapperet torkat skars 7801164-0 15 det i kvadrater med 4 mm sida. Dessa kvadrater monterades sedan på polystyrenhandtag med dimensionerna 8 x 15 mm under användning av dubbeisidigt adnesiv tejp (3M company) . i Testanordningar som framställts på ovanstående sätt utsattes för intensiva betingelser vid 60°C under tre dygn och befanns vara känsliga för ockult blod i urin i koncentrationer åtminstone så lå- ga som 0,015 mg%.

Exempel 14.

Detta exempel illustrerar en andra föredragen utföringsform av testanordningen enligt uppfinningen.

En testkomposition framställdes genom blandning av följande beståndsdelar i följande ordningsföljd i en bägare under omrörning: vatten 75 ml trinatriumcitrat 5,2 g citronsyra 4,15 g trietanolaminborat 10,0 g etylendiamintetraättiksyra 0,1 g natriumlaurylsulfat 1,5 g dimetylsulfon 10,0 g 6-metoxikinolin 0,6 g N,N-dimetylformamid 75 ml kumenhydroperoxid 3,0 g o-tolidin 0,8 g Remsor av filterpapper Whatmann EMM doppades i ovanstående komposition och torkades under ca 11 minuter vid ca 90~92°C. De torkade remsorna monterades sedan på plasthandtag under användning av dubbelsidigt adhesiv tejp.

En del av remsorna utsattes för intensiva betingelser genom lagring vid 70°C under ett dygn och andra genom lagring vid 40°C under tolv veckor. Bägge satserna av remsor utvecklade en blå/grön färg då de bringades i kontakt med en utspädning 1:1 x 10 av färskt helblod i urin.

Sammanfattningsvis kan sägas att ovanstående exempel visar hur man skall framställa och använda kompositionen och testanordningen enligt uppfinningen (exempel l och 2), jämförande resultat beträffan- de stabilitet och känslighet (exempel 3-l2) och beskriver föredragna utföringsformer (exempel 13 och 14). Verkan av boratestern och ut- spädningsmedlet, var för sig och 1 kombination med varandra, på test- kompositionen framgår av exemplen 3-5, Unåer det att Verkningarna Då testanordningen visas i exempel 6-ll. Användningen av olika utspäd- ningsmedel exemplifieras i exempel 12.

Claims (8)

7so1àe4-o 16 P a t e n t k r a v

1. iTestkomposition för bestämning av ett peroxidativt verksamt 'ämne i ett prov, omfattande en organisk hydroperoxid och en indikator, som är i stånd att frambringa en bestämbar respons i närvaro av hydro- peroxiden och ett peroxidativt verksamt ämne, k ä n n e t e c k n a d a v att kompositionen dessutom innefattar endera eller bägge av (a) ett utspädningsmedel med formeln g o R T 1>sæo , R1__.s___.R2 , 122 å, /o i R1_._c NR1R2 eller blandningar därav, varvid R1 och R2 är lika eller olika och be- tecknar väte, alkyl eller alkoxi, innehållande 1-6 kolatomer, eller aryl, och (b) en boratester med formeln i (cnzhï o\ N -- (CH2)n_- OjB (CHZ) _- O i vilken m, n och p, som är lika eller olika, är heltal från T till 4.

2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att *den innefattar utspädningsmedel, som utgöres av dimetylsulfoxid, dimetylsulfon, N,N-dimetylformamid, bensylsulfoxid, 4-klorfenylsul- fon, 4-fluor-3-nitrofenylsulfon eller blandningar därav.

3. Komposition enligt krav 1 eller 2, k ä n nve t e c k n a d anv att den innefattar boratester, vilken utgöres @v trimetanol- aminborat, trietanolaminborat, tri(n-propanol)aminborat eller bland- ningar därav.

4. Komposition enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k - in a d a v att den organiska hydroperoxiden utgöres av tert.* butylhydroperoxid, kumenhydroperoxid, diisopropylbensenhydroperoxid, 2,5-dimetylhexan-2,5-dihydroperoxid, paramentanhydroperoxid eller blandningar därav.

5. § Komposition enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k - 7801164-0 17 n a d a v att indikatorn är bensidin, o-tolidin, 3,3',5,5'- tetrametylbensidin, 2,7-diaminofluoren eller blandningar därav.

6. Komposition enligt något av kraven 1-5, k ä n n e t e c k - n a d a v att den är inkorporerad i en bärarmatris.

7. Komposition enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a d a v att bärarmatrisen utgöres av vätskeabsorberande papper.

8. Användning av en tesüxmçosüjrm flflíhtämning av ett peroxida- tivt verksamt ämne i ett prov, i det att provet bringas till kontakt med kompositionen och en bestämbar respons observeras, varvid nämn- da testkomposition dels omfattar en organisk hydroperoxid och en in- dikator, som är i stånd att frambringa nämnda respons i närvaro av hydroperoxiden och det peroxidativt verksamma ämnet, dels därjämte omfattar endera eller bägge av (a) ett utspädningsmedel med formeln o R . 1\s__.9o , R1..._ s__R2 , R X J/ 2 o /o R1"'C< NR R eller blandningar därav, varvid R1 och R2 är lika eller olika och be- tecknar väte, alkyl.eller alkoxi, innehållande 1-6 kolatomer, eller aryl, och (b) en boratester med formeln (CH ) '"_ O / 2 m \ N~-- (CH2)I1-- O -- B “\ / (cfi2)pv_- o i vilken m, n och p, som är lika eller olika, är heltal från 1-4.