HU177004B

HU177004B - Analiticheskoe sredstvo dlja opredelenija vehhestv imejuhhikh peroksidativnykh aktivnosti

Info

Publication number: HU177004B
Application number: HU78MI629A
Authority: HU
Inventors: Lam Charles T Wai
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1977-03-14
Filing date: 1978-01-30
Publication date: 1981-06-28
Also published as: BR7800603A; SE7801164L; DE2803955C3; GB1552747A; JPS6122780B2; IT1104148B; DE2803955B2; AR220329A1; FR2384261A1; FR2384261B1; DE2803955A1; DE2857298C2; AU3279478A; CA1098808A; IT7847859A0; SE430104B; IN148528B; JPS53115288A

Description

A találmány peroxidatív aktivitást mutató anyagok meghatározására szolgáló analitikai eszközre vonatkozik.

A találmány szerinti készítmény egy szerves hidroperoxidot, egy az adott hidroperoxid és egy peroxidatív aktivitást mutató anyag jelenlétében kimutatható változást szenvedő indikátor anyagot és egy I, II vagy 111 altalános képlettel jellemezhető higítóanyagot ahol Rí és R₂ lehet azonos vagy 10 különböző és jelenthet hidrogénatomot, 1 -6 szénatomos alkil- vagy alkoxi-csoportot vagy egy aril· csoportot vagy ezek elegyeit és/vagy egy IV általános képletű bórsav-trialkanolamin-észtert tartalmazó - ahol m, n és p lehet azonos vagy 15 különböző, és jelenthet egy 1 és 4 közötti egész számot -- kompozícióval átitatott mátrix anyagot tartalmaz.

A találmány szerinti vizsgálati eszköz felhasználásával a peroxidatíven aktív anyagok meghatározá- 20 sa úgy történik, hogy egy feltehetően peroxidatíven aktív anyagot tartalmazó mintát érintkezésbe hozunk a találmány szerinti analitikai eszközzel. Az eljárás segítségével tehát lehetővé válik egy vizsgalati mintában peroxidatív aktivitással rendelkező 25 komponensek kvalitatív és fél-kvantitatív meghatározása.

A technika állása szerint számos módszer ismeretes peroxidatíven aktív anyagok jelenlétének kimutatására különféle mintákban, így vizeletben, 30 fekália szuszpenziókban és gyomor- és béltartalmakban. Az úgynevezett peroxidatíven aktív anyagok jellegzetes képviselői a hemoglobin és származékai. Az elnevezés onnan származik, hogy ezek az 5 anyagok a peroxidáz enzimhez hasonló viselkedést mutatnak. Egy másik elterjedt elnevezés szerint a pszeudoperoxidáz megjelölést kapták. A peroxidatíven aktív anyagok enzimszerűsége abban mutatkozik meg, hogy katalizálják a peroxidok és a benzidin, o-tolidin, 3,3’,5,5’-tetrametil*benzídin, 2,7-diaminofluorén vagy más hasonló indikátor anyagok között lejátszódó redox reakciót és eközben kimutatható változáson, például színváltozáson mennek keresztül. Ennélfogva segítségükkel lehetőség van rejtett vér kimutatására analitikai mintákban.

Az évek során több különféle módszert fejlesztettek ki, amelyek mindegyike a színváltozást szenvedő indikátorok peroxidos oxidációjának katalízisén alapul. Először is ide tartoznak a nedves kémiai eljárások és az úgynevezett „bemerítő és leolvasó” típusú reagenssel bevont indikátor csíkokat felhasználó eljárások. Egy ide tartozó jellegzetes nedves kémiai eljárást ismertet a következő cikk. Richard M. Henry és munkatársai. Clinical Chemistry Principles and Techniques (Hagerstown, Marylandi Harper and Row /1974/, 1124-1125). Az eljárás során jégecet (puffer), difenilamin (indikátor) és hidrogénperoxid kerül felhasználásra. Bár a nedves módszerek analitikai célokra alkalmasnak mutatkoztak, kétségtelenül számos hátránnyal ren177004 delkeznek, amelyek közül elsősorban a reagens kis stabilitását és nem megfelelő érzékenységét kell kiemelni. A stabilitás - következésképpen az érzékenység — csökkenése ezeknél a reagenseknél olyan mértékű, hogy néhány napi tárolás után új 5 reagens oldatokat kell készíteni, ami egyrészt erősen leköti az analízist végző személy idejét, másrészt rontja a gazdaságosságot, mert ily módon drága reagensek mennek veszendőbe.

Egy másik eljárás a peroxidatíven aktív anyagok 10 meghatározására az úgynevezett „bemerítő és leolvasó” típusú reagens csíkokat felhasználó eljárás. Ilyen eszköz például az Ames Company Division of Miles Laboratories Inc. által előállított és HEMASTIX^R néven forgalmazott reagens csík. Ez a 15 reagens csík lényegében egy porózus papír mátrixból áll, amely egy műanyag csíkhoz vagy nyélhez van erősítve. A papír át van itatva egy szerves hidroperoxid és o-tolidin puffereit elegyével. Ha az ily módon elkészített csíkot egy hemoglobint, mi- 20 oglobint, eritrocitákat vagy más pszeudoperoxidázokat tartalmazó folyadékba merítjük, a papír megkékül, és a kék szín intenzitása arányos a peroxidatíven aktív anyag koncentrációjával a vizsgált mintában. így, a reagens csíkon mutatkozó színt 25 összehasonlítva egy összehasonlító skálával, az analízist végző személy fél-kvantitatív alapon meghatározhatja a mintában jelenlevő, peroxidatíven aktív anyag mennyiségét.

A reagens csíkok előnyei a nedves kémiai eljárá- 30 sokkal szemben kettősek: a csíkok használata könnyebb, miután a reagensek készítésére és berendezésre nincs szükség, a felhasznált reagensek nagyobb stabilitással rendelkeznek, ami nagyobb pontosságot, jobb gazdaságosságot és érzékenységet 35 eredményez.

Bár a reagens csíkok kétségtelenül fontos előnyökkel rendelkeznek a nedves kémiai eljárásokkal szemben, stabilitási és érzékenységi jellemzőik még további javításra szorulnak. Jóllehet a technika 40 állása szerint ismert és használt csíkok lényegesen jobbak a nedves kémiai eljárásoknál, kétségtelenül nagy haladást jelentene, ha tárolás alatti stabilitásuk és peroxidatíven aktív anyagokkal szembeni érzékenységük tovább javítható lenne. A találmány 45 célkitűzése egy ilyen, javított tulajdonságú készítmény előállítása.

A korábbi irodalomban legalább három olyan eljárást rögzítettek, amelyek célkitűzése ennek a feladatnak a megoldása volt. A Chemical Abstracts 85 50 (1976) 186 egy o-tolidint és fenilizopropil-hidroperoxidot tartalmazó reagens csík előállítására szolgáló két merítéses eljárást ír le. A módszer szerint az indikátor (o-tolidin · 2HC1) és polivinilpirrolidon etanolos oldatát készítik el. A kapott oldathoz kis 55 mennyiségű felületaktív anyagot és a pH-érték 3,7-re történő beállításához szükséges mennyiségű citrát puffért adnak. Az így előállított oldatba etilcellulózzal impregnált szűrőpapírcsíkokat merítenek, majd megszáritják a csíkokat. Az így impregnált 60 szűrőpapír csíkot ezután egy másik, 1,4-diazabiciklo[2,2,2]oktánt, fenilizopropil-hidroperoxidot és polivinilpirrolidont etanol és toluol elegyében feloldva tartalmazó oldatba merítik. A kísérlet célja a peroxid és indikátor kombinációjának stabilizálása volt 65 azáltal, hogy biciklooktán származékot és polivinilpirrolidont használtak.

Egy másik hasonló eljárás a 3 853 471 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban került leírásra. Ez a szabadalmi leírás foszforés foszfonsavamidok felhasználásáról tartalmaz kitanítást, ahol a szubsztituáló amidocsoportok elsősorban N-morfolino-gyökök.

A fenti kísérletekhez társul még a 3 252 762 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, ahol a szerves hidroperoxidokat egy kolloid anyagban, például zselatinban fizikailag kapszulázzák. így, amikor a csík felhasználásra kerül, a vizes minta feloldja a zselatin kapszulát, ezáltal felszabadítva a hidroperoxidot az indikátorral egy peroxidatíven aktív anyag jelenlétében lejátszódó reakció számára.

Valamennyi eddigi kísérlet közös alapgondolata a reagens oly módon történő stabilizálása volt, amely megakadályozta a potenciálisan 'összeférhetetlen reaktív komponensek, így a hidrogénperoxid és az indikátor idő előtti egyesülését és ezáltal stabilabbá tette az analitikai csíkokat. Azt mondhatjuk tehát, hogy az eddigi módszerek nem tűzték ki célul a stabilitás és érzékenység egyidejű javítását, megelégedtek a meglevő érzékenység megőrzésével, amit úgy értek el, hogy megakadályozták a reagens bomlását a tárolás során.

Egy másik, a technika állása szerint ismert eljárás a 3 236 850 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban került ismertetésre. Ez a szabadalom katalizátorként és oxidálószerekként használt szerves hidroperoxidok stabilizálására vonatkozik. A szabadalmi leírásban primer, szekunder vagy tercier amin-sók és szerves hidroperoxidok együttes felhasználásáról szerepel kitanítás. A szabadalomnak azonban reagens vizsgálati csíkok előállítása semmiképpen nem tárgya.

Felismerve azt, hogy a fent leírt eljárások .egyike sem éri el a peroxidatíven aktív anyagok meghatározására szolgáló vizsgálati reagens csíkokban megkívánt stabilitást és érzékenységet, arra az elhatározásra jutottunk, hogy teljesen új megoldást keresünk. Ezt az eltérő megközelítést a jelen találmány kidolgozását megalapozó kísérletek során alakítottuk ki. Eredményeképpen olyan kompozíciót és eszközt kaptunk, amely teljes mértékben megfelelt a stabilitással és érzékenységgel szemben támasztott megnövekedett követelményeknek.

Az eddigieknél is meglepőbb módon, a kísérletekből egy további nem várt előny is származott, nevezetesen, lehetővé vált egy javított eljárás kidolgozása a találmány szerinti eszközök előállítására, amely szerint az előállítás döntően egyszerűbb, mint az ismert eljárások, és amely az egyszeri merítéses eljárások közé tartozik.

Röviden összefoglalva, a találmány egy analitikai eszközre vonatkozik, amely vizsgálati mintákban pszeudoperoxidáz-jellegű anyagok kimutatására szolgál. összetételét tekintve az eszköz egy, szerves hidroperoxidot, egy az adott hidroperoxid és egy peroxidatíven aktív anyag jelenlétében mérhető változást szenvedő indikátort és egy I, II vagy III általános képlettel jellemezhető hígítóanyagot - ahol Rj és R₂ lehet azonos vagy különböző és jelenthet hidrogénatomot, 1—6 szénatomos alkil- vagy alkoxicsoportot vagy arilcsoportot - és/vagy egy IV általános képletű bórsav-trialkanolamin-észtert tartalmazó — ahol m, n és p lehet azonos ⁵vagy különböző és jelenthet egy 1 és 4 közötti egész számot — kompozícióval átitatott mátrixot tartalmaz.

A találmány szerinti analitikai eszközben felhasználható szerves hidroperoxidok jól ismert szer- 10 vés hidroperoxidok közül kerülhetnek ki. Ezen felül alkalmasnak kell lenniük arra, hogy egy peroxidatíven aktív anyaggal reakcióba lépjenek egy peroxid-érzékeny indikátor jelenlétében és ennek során mérhető választ adjanak, például színváltozást szén- 15 vedjenek, vagy változzon az analitikai készítmény által abszorbeált vagy reflektált fénymennyiség. Az alkalmasnak talált hidroperoxidok közé tartoznak a következő vegyületek: terc-butil-hidroperoxid, kumén-hidroperoxid, diizopropil-benzol-hidroperoxid, 20 2,5 -dimetilhexán-2,5-dihidroperoxid, paramentán-hidroperoxid vagy ezek elegyei. Ezek közül a kumén-hidroperoxid mutatkozott a legelőnyösebbnek.

Sok olyan indikátor létezik, amelyek mérhető változást szendvednek hidroperoxid-vegyületek és 25 egy pszeudoperoxidáz jelenlétében, és amelyek ennék következtében alkalmasak a találmány szerinti készítményekben való felhasználásra. Ide tartoznak az úgynevezett „benzidin-típusú” vegyületek, közelebbről például a benzidin, o-tolidin, 3,3’,5,5’-tetra- 30 metil-benzidin, 2,7-diaminofluorén vagy ezek változó arányú elegyei.

A bórsav észterek, amelyek feltételezés szerint hozzájárulnak a stabilitás megjavulásához, a korábban megadott szerkezeti képlettel jellemezhetők. A 35 IV általános képlet alá eső vegyületek közül különösen alkalmasnak találtuk a bórsav-trimetanolamin-észterét, bórsav-trietanol-amin-észtert és a bórsav-tri(n-propanol)amin-észtert. Ezek a vegyületek leírhatók a IV általános képlettel, ahol m, n 40 és p azonos egész számokat, közelebbről 1, 2, 3-at jelentenek.

A találmány szerinti eszközökben felhasználható bórsavészterek mennyisége tág határok között változhat. Ez többek között a példákból is kitűnik. 45 így az I. példában a bórsav-trietanolamin-észter ekvivalenseinek mólaránya a kumén-hidroperoxid ekvivalensnyi mennyiségeinek számához viszonyítva 4,71. Ugyanakkor a III. példában ez az arány 2,83, azaz 1,42 normalitásban kifejezve, tehát azt 50 is figyelembe véve, hogy a peroxid difunkcionális.

A példákkal illusztrált, körülbelül 1,4—5 közötti mól-ekvivalens arány azonban semmi esetre sem korlátozó jellegű. A bórsavészter minden olyan mennyiségben alkalmazható, amely megfelelő stabi- 55 litást és érzékenységet képes biztosítani az analitikai készítményben, az aktuális mennyiséget a találmány kitanítása alapján dolgozó szakemberek minden nehézség nélkül meg tudják határozni.

A találmány egyik előnyös foganatosítási módja go szerint a kompozíció kumén-hidroperoxidot, o-tolidint, dimetilszulfon és dimetilszulfoxid elegyét és bórsav-trietanolamin-észtert tartalmaz.

A mátrixot átitató készítmény előállítása szokásos módon úgy történik, hogy valamennyi össze- 65 tevő megfelelő mennyiségét vízben vagy más alkalmas közegben feloldjuk vagy szuszpendáljuk. A vízen kívül erre a célra alkalmas közegek például a következők: kloroform, metanol etanol, metilénklorid, ciklohexán.

Az analitikai eszköz előállítása egy-merítéses eljárással történhet. Ez alatt azt értjük, hogy a hordozó mátrixanyag egy részét bemerítjük a megfelelő oldatba vagy szuszpenzióba, majd az így átitatott anyagot szárítjuk. Az így készített eszköz reaktivitása stressz körülmények között, így 60-70 °C-on 1-3 napon át vagy még tovább végzett tárolás során is csak kevéssé csökken. Összehasonlítás céljából hasonló eljárással, de bórsav-észter és/vagy hígítóanyag jelenléte nélkül is készítettünk eszközöket. A kapott csíkokat lényegében azonos próbakörülmények között tartva a reaktivitás és az érzékenység zuhanásszerű romlását figyelhettük meg.

Az analitikai eszköz előállításához használt hordozó mátrix számtalan különféle formát ölthet. így a 3 846 247 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban nemez, porózus csík és szőtt vagy font üvegszálak használata került ismertetésre. A 3 552 938 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás fabotok, szövet, szivacsanyag és agyagos anyagok felhasználásáról tartalmaz kitanítást. Szintetikus gyanta gyapjú és üvegszálas nemezek felhasználását javasolja az

369 139 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás. Egy máák nagy-britanniai szabadalmi leírásban fény-áteresztő, vékony szálakból készült szitaanyagból készült bevonat felhasználását írják le papír mátrixon. Poliamid szálak alkalmazásáról ír a

170 397 számú francia szabadalmi leírás. Kétségtelen azonban, hogy a hordozó mátrixként leggyakrabban és legjobb eredménnyel alkalmazott anyagok, amelyek különösen alkalmasak a jelen találmány céljaira, a jól abszorbeáló papírok, például a szűrőpapír. Az előzőekből látható, hogy az alkalmas anyagot az anyagok széles köréből választhatjuk ki, és a mátrix különféle fizikai formákat ölthet. Valamennyi ilyen típusú anyag a találmány tárgykörébe tartozik.

A találmány szerinti eszközökben felhasznált készítmények· stabilitás és érzékenység növekedésének mechanizmusa még nem ismeretes teljes bizonyossággal. A készítményekben használt bórsav-észterek egyedülálló kémiai jellege azonban megfelelő alapot szolgáltat a megfelelő következtetések levonásához. Ismeretes, hogy a peroxidok általában instabil vegyületek, vagy legalábbis kevésbé stabilak, mint a legtöbb, a természetben előforduló anyag. Néhány peroxid robbanásveszélyes is. Más peroxidok, mint például a szerves hidroperoxidok, például a kumén-hidro peroxid, viszonylag stabilak, de savak, így például rejtett vér meghatározására általában használt eszközökben alkalmazott savak jelenlétében könnyen disszociálnak. Ha ez a bomlás egy oxidálható indikátor - például a korábban leírt indikátorok - jelenlétében zajlik le, redox reakció játszódik le. Valószínűnek látszik, hogy ez az idő előtti reakció az oka a peroxidatíven érzékeny reagenscsíkok csökkent érzékenységének.

Másrészt, a bórsav-észterek, például az itt leírt bórsav-észterek, a biciklusos struktúrában szereplő nitrogén- és bóratom struktúráját tekintve egyedülállóak, mert két elkülönült hídfő-atomot tartalmaznak. A nitrogénatom az egyik hídfőnél elekt- 5 ron-dús, miután egy magányos elektronpárt tartalmaz, amelyek kinyúlnak a molekula tengelyéből. A másik hídfő-atom, a bóratom a molekula másik axiális végén helyezkedik el, elektronhiányos, és igy hajlamos koordinációs követések létesítésére elekt- 10 ron-dús anionokkal.

A molekula elektronban gazdag nitrogénatom-vége könnyen felvehet egy protont, míg az elektronhiányos bór hídfő-atom koordinációs kötéssel kapcsolódhat egy anionos peroxid maradékkal. így fel- 15 tételezhetően az itt tárgyalt biciklusos molekulák sajátos elektroneloszlása stabilizálja a szerves peroxidokat az analitikai készítmény jelenlétében azáltal, hogy kémiailag beékelődik a peroxidos proton és oxigénatom közé, egy koordinatíven kap- >20 csőit ion-párt alkotva.

így a találmány szerinti vizsgálati eszközök esetében a megnövekedett stabilitás nagy valószínűséggel annak a következménye, hogy a szerves hidroperoxidok nem tudnak ionosán kölcsönhatni az 25 indikátorral mindaddig, amíg a vizsgált minta szolvatáló ereje meg nem bontja a peioxid-borát komplexet és fel nem szabadítja a peroxidot, amely így alkalmassá válik az indikátor oxidálására egy peroxidatív aktivitást mutató anyag jelenlé- 30 tében.

Annak ellenére, hogy kétségtelen stabilitás- és érzékenység-javulás következik be a fenti bórsav-észterek használata következtében, meglepő módon azt találtuk, hogy még jobb stabilitás és érzékeny- 35 ség biztosítható, ha a készítmények a korábban leírt hígítót és a bórsav-észtert együttesen tartalmazzák.

A hígítóanyagok, mint már leírtuk, az I, II vagy . III általános képlettel jellemzett szerkezettel rendel- 40 keznek. Az ide tartozó vegyületek közül különösen az Ν,Ν-dimetilformamid, dimetilszulfoxid, dimetilszulfon vagy ezek elegyei bizonyultak a legalkalmasabbaknak. Más, működőképesnek bizonyult hígítóanyagok a benzilszulfoxid, 4-klórfenil-szulfon, 45 4-fluor-3-nitrofenilszulfon és más hasonló anyagok. Ezek a vegyületek közösen azzal jellemezhetők, hogy a nekik megfelelő általános képletben Rj és Rj egyaránt metilcsoportot képvisel.

⁵⁰

Az I, II és III általános képletű vegyületekben Rí és R₂ azonban sokféle jelentést vehet fel. így Rí és Rj jelentése lehet adott esetben helyettesített, 1-6 szénatómos alkilcsoport, így például metil-, etil-, propil-, izopropil-, η-butil-, izobutil-, szék- 55 -butil-, η-pentil-, izopentil-, neopentil-, terc-pentilcsoport és más izomerek, beleértve a hexán izomerjeit. Az ezeknek az alkilcsoportoknak megfelelő alkoxicsoportok szintén R₂ és R₂ definíciójába tartoznak. ¢0

Ha Rí és Rj árucsoportot jelent, lehet például adott esetben helyettesített arilcsoport, így fenil-, benzil-, tolil-, anilino- vagy naftilcsoport.

Rj és Rj adott esetben jelenlevő helyettesítői közül jellegzetesek a következő csoportok, amino-, 65 nitro-, amido-, nitrilo-, hidroxil-, alkoxi-, halogén-, fenil-, szulfonÚ-, karboxilcsoport.

A találmány szerinti készítményekben használt hígító mennyisége erősen változhat, és a mindenkori mennyiség megállapítása a területen átlagos ismeretekkel rendelkező szakember köteles tudásához tartozik. így, ha a hígító folyadék, például dimetilszulfoxid (lásd II. táblázat, infra), mennyisége körülbelül 10 és 100% között változhat, ami a készítményhez adott hígító mennyiségének viszonyát jelzi az oldószer vagy szuszpendálószer (a XII. példában víz) mennyiségéhez viszonyítva. Az előnyös tartomány 25 és 100% között van.

Hasonlóan, ha a hígító egynél több hígító vegyület elegye, a különböző komponensek aránya és mennyisége is tág határok között változhat, és a kísérletek során könnyen meghatározható.

Találmányunkat részletesen a következő példákkal illusztráljuk anélkül, hogy találmányunkat a példákra kívánnánk korlátozni.

I. példa

Analitikai kompozíció

Az analitikai kompozíció előállítása úgy történik, hogy az alábbiakban megadott összetevőket feloldjuk 150 ml ionmentesített vízben. A hozzáadás a felsorolás sorrendjében történik.

trinátriumcitrát 3,2g citromsav 2,2g etiléndiamintetr aecetsav-tetra- 0,1 · g nátriumsó dimetilszulfon10,0g nátrium-laurilszulfát1,0 g

6-metoxikinolin 0,5g dimetilszulfoxid 25,0 ml aceton 25,0 ml kumén-hidroperoxid 2,0g bórsav-trietanolamin-észter (Aldrich Chemical Co., Inc.) 10,0g o-tolidin 0,4g

II. példa

Analitikai eszköz

Whatmann 3MM szűrőpapír csíkokat az I. példa szerinti analitikai kompozícióba merítünk. Az átitatott csíkokat 70°C-on körülbelül 15 percen át szárítjuk, és így a készítménnyel impregnált hordozó mátrixot kapunk. A megszárított hordozó mátrixokat ezután műanyag (polisztirol) csíkokhoz vagy fogókhoz erősítjük, kétoldalon ragadó ragasztószalag segítségével, amely a 3 M Company forgalmazásával kerül piacra. A kapott eszközt peroxidatíven aktív anyagok kimutatására úgy használjuk, hogy a vizsgálni kívánt mintába, így vizeletbe merítjük és megfigyeljük a hordozó mátrixban mutatkozó színváltozást.

III. példa

A borát-észter hatása a stabilitásra

A kísérlet célja az volt, hogy összevessük a trietanolamin-borát hatását a rejtett vér kimutatására szolgáló készítményekre az egyéb ismert adalékanyagok hatásával. A következő összetételű készítményt állítottuk elő.

kloroform 100 ml o-tolidin 0,5g

2,5 -dimetilhexán-2,5-dihidroperoxid 2,0g poli(N-vinilpirrolidon) 10,0g

Az így előállított oldat 20 ml térfogatú, alikvot részeihez a következő táblázatban felsorolt adalékanyagok 1 1 g-nyi mennyiségét adtuk. Az így kapott készítményeket szobahőmérsékleten körülbelül 5 órán át állni hagytuk. A megfigyelés eredményeit az alábbi I. táblázatban rögzítettük.

I. Táblázat

A minta száma Adalékanyag Eredmények

I	hexametiléntetramin	Nagyon sötét, majdnem fekete oldat. Rossz érzékenység
2	1,4-diazabiciklo [2,2,2,]-oktán	Sötétzöld/bama elszíneződés. Minimálisan érzékeny a vizeletben levő rejtett vérrel szemben
3	bórsav-trietanolamin-észter	Enyhe bámulás. Nagyfokú érzékenység a vizeletben található rejtett vérrel szemben
4	kontroll (adalékanyag nélkül)	Körülbelül 2 óra alatt megfeketedik. Használhatatlan rejtett vér kimutatására

IV. példa

A hígítóanyag hatásának vizsgálata

A következő komponenseket 500 ml-es csőrös

pohárba töltöttük:
kloroform	100 ml
kumén-hidroperoxid	4,0 g
o-tolidin	0,4 g
dimetilszulfoxid	25,0 ml

A kapott, enyhén sárga színű készítményt áttöltöttük egy Erlenmeyer lombikba, amelyet lezártunk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten (körülbelül 18,3 °C) állni hagytuk. Egy nap elteltével a vizsgált készítmény csak kismértékű sötétedést mutatott az eredeti színéhez képest.

V. példa

Összehasonlító kísérlet a IV. példával

Összehasonlítás céljára további készítményeket állítottunk elő, lényegében a IV. példa szerint járva el, de dimetilszulfoxid helyett 25 ml kloroformot használva. Ezt a dimetilszulfoxid nélküli készítményt egy Erlenmeyer lombikba zártuk és a IV. példában leírt körülmények között (azaz egy éjszakán át 18,3 °C-on) állni hagytuk. A IV. példában megfigyelt készítménnyel ellentétben ez a készítmény majdnem feketére változtatta a színét, ezzel igazolva, hogy a készítmény megnövekedett stabilitásában a hígítóanyagnak jelentős szerepe van.

VI. példa

Az analitikai eszközök stabilizálása borát-észerekkel

Kontroll

A következő összetételű oldatot állítottuk elő, azzal a céllal, hogy pszeudoperoxidázokra érzékeny reagens csíkot készítsünk a segítségével. A készítmény nem tartalmazza a találmány szerinti bórsav észtereket.

Víz 150 ml trinátrium-citrát 3,2g citromsav 2,2g etiléndiamintetraecetsav-tetranátriumsó 0,1g dimetilszulfon 10,0g

nátrium-laurilszulfát	1,0 g
6-metoxi-kinolin	0,5 g
dimetilszulfoxid	25,0 ml ⁵
aceton	25,0 ml
kumén-hidroperoxid	2,0 g 10
o-tolidin	0,4 g

VII. példa

A találmány szerinti eszköz

A VI. példa szerinti oldatot állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a kumén-hidroperoxid hozzáadása előtt 10 g trietanolamint adunk az elegyhez. 20 Az így kapott oldatból a VI. példában ismertetett módon állítottuk elő az analitikai eszközöket.

VIII. példa

1,4-diazabiciklo[2,2,2]oktán

A fenti VI. példa szerinti oldatot állítottuk elő, 30 azzal az eltéréssel, hogy a kumén-hidroperoxid hozzáadása előtt 10 g l,4-diazabiciklo[2,2,2]oktán-t adunk az elegyhez. Ezt az oldatot használtuk fel a VI. példa szerinti módszert alkalmazva a vizsgálati eszközök előállításához. 35

IX. példa

Hexametiléntetramin 40

A VI. példa szerinti oldatot állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a kumén-hidroperoxid hozzáadása előtt 10 g hexametiléntetramint adtunk az elegyhez . Az oldatból a vizsgálati eszközöket a VI. 45 példában leírt módon állítottuk elő.

X. példa

A stabilitás és érzékenység összehasonlítása

A VI—IX. példa szerinti eszközöket extrém körülmények közé helyeztük, annak megállapítására, hogy egymással összehasonlítva milyen stabili- 55 tást és érzékenységet mutatnak. Ennek megfelelően a VI-VIII. példa szerinti eszközöket három napon át körülbelül 60°C-on, míg a IX. példa szerinti készítményeket egy napig, körülbelül 70°C-on tartottuk. Ezután megvizsgáltuk az így kezelt eszkö- 60 zök érzékenységét, oly módon, hogy egy ppm vért tartalmazó vizeletbe merítettük őket. Csak a tríetanolamin-borátot tartalmazó (VII. példa szerinti) eszközök mutattak színváltozást ennél a vér-koncentrációnál (ami 0,015 mg/dl koncentráció- 65 nak felel meg). A többi eszköz érzéketlen maradt ilyen kis mennyiségű vénei szemben.

A következő példákkal a hígítóanyag stabilitást növelő hatását szemléltetjük.

XI. példa

Hat, különféle mennyiségű dimetilszulfoxidot tartalmazó oldatból hat különböző vizsgálati eszközt készítettünk. A részleteket a II. táblázatban adjuk meg.

A hat kompozíció mindegyikét a következő receptnek megfelelően készítettük:

Víz	75 ml
trinátrium-citrát	3,2 g
citromsav	4,5 g
bórsav-trietanolamin-észter	10,0 g
etiléndiamintetraecetsav-tetranátriumsó	0,1 g
dimetilszulfon	5,0 g
nátrium-laurilszulfát	1,0 g
6-metoxikinolin	0,5 g
kumén-hidroperoxid	2.0 g
o-tolidin	0,4 g

Az egyes készítményekhez rendre a II. táblázatban megadott mennyiségű dimetilszulfoxidot és metanolt adtuk.

II. Táblázat
Analitikai készítmény	Dimetilszulfoxid (ml)	Metanol (ml)
1	0	75
2	5	70
3	10	65
4	25	50
5	40	35
6	60	15

A fenti módon előállított oldatok felhasználásával úgy készítettünk analitikai eszközt, hogy mindegyik oldatba egy-egy Whatmann 3MM szűrőpapírcsíkot merítettünk. A szűrőpapírcsíkokat kihúztuk a megfelelő oldatokból és szárítószekrényben 70 °C-on, 18 órán át szárítottuk.

A fenti erős igénybevétel után megvizsgáltuk a csíkok érzékenységét egy 1 :1,000,000 friss vért tartalmazó vizeletben, összehasonlítottuk a kifejlődött színek intenzitását az egyes csíkokon. A kapott eredményeket a következő II. táblázatban foglaltuk össze.

III. Táblázat

Az eszköz száma Szín-intenzitás

6-metoxikinolin	1,0 g
metanol	50,0 ml
bórsav-trietanolamin-észter	5,0 g
kumén-hidroperoxid	2,0 g
o-tolidin	0,4 g

0 nincs szín

1 nyomok

7 alig van aktivitáscsökkenés

Az eszközök számozása a II. táblázatban megadott analitikai készítmények számozását követte.

A színek intenzitását 0 és 8 közötti skálán jellemeztük. 8-al jelöltük azt a színt, amelyet frissen készített, extra igénybevételnek ki nem tett eszköz produkált a 6. számú készítményből előállítva. 0 azt jelenti, hogy nincs színváltozás, 7-el azt jelöltük, hogy az aktivitás alig csökkent, míg 1 azt mutatja, hogy az elszíneződés éppen csak megjelent.

A III. táblázat adatai meggyőzően mutatják, hogy az érzékenység nagymértékben nő a hígítóanyag - a jelen esetben a dimetilszulfoxid — mennyiségével.

A következő példákkal a különböző hígítóanyagok hatását illusztráljuk a készítmény szerinti, bórsav-észterekkel készült analitikai készítmények stabilitására.

XII. példa

A XI. példának megfelelően nyolc analitikai készítményt állítottunk elő, amelyek közül 7 különböző hígítóanyagot tartalmazott és a nyolcadik nem tartalmazott hígítóanyagot, azaz kontrollként szolgált. A kísérlet célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy a különböző hígítóanyagok milyen mértékben hatékonyak a peroxidatíven aktív anyagok kimutatására szolgáló készítmények érzékenységének növelésében. Valamennyi készítmény tartalmazott bórsav-észtert, méghozzá mindig azonos mennyiségben.

Az egyes oldatok a következő összetevőket tar-

talmazták:
Víz	50 ml
trinátrium-citrát	3,2 g
citromsav	2,2 g
nátrium-laurilszulfát	1,0 g

Az így előállított oldat kis alikvot mennyiségét 8 kémcsőbe töltöttük. Ezután az egyes kémcsövekbe a IV. táblázatban felsorolt hígítóanyagok kis mennyiségeit adtuk. A kémcsöveket lezártuk és egy héten át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A hét elteltével megvizsgáltuk a kémcsövek tartalmának relatív színsötétedését. Minél sötétebb a szín, annál kevésbé stabil a készítmény. A következő IV. táblázatban a készítményeket a stabilitás sorrendjében soroljuk fel, azaz az 1. készítmény a legstabilabb és a 8. a legkevésbé stabil.

IV. Táblázat

Analitikai Hígító készítmény dimetilszulfoxid

N,N-dimetilformamid dimetilszulfon benzilszulfoxid

4-klórfenil-szulfon

4-fluoro-3-nitrofenil-szulfon

2-imidazolidon (kontroll) nincs

A IV. táblázatban az 1. és 2. minták kiváló stabilitást mutattak, a 3. minta kevésbé volt stabil, de stabilitása kétségtelenül még jónak volt mondható, a 4—7. oldatok mérsékelten stabilak voltak, míg a 8. oldat, a kontroll, lényegesen instabilabb volt, mint az 1-7. minták bármelyike.

A következő példákban a találmány előnyös foganatosítási módjait mutatjuk be.

XIII. példa

A következő komponenseket elkeverjük 150 ml vízzel:

trinátrium-citrát 3,2 g citromsav 2,2 g etiléndiamintetraecetsav-tetranátriumsó 0,1 g

dimetilszulfon	10,0 g
nátrium-laurilszulfát	1,0 g
6-metoxikinolln	0,5 g	5
dimetilszulfoxid	25,0 ml
aceton	25,0 ml	10
bórsav-trietanolamin-észter	10,0g
kumén-hidroperoxid	2,0 g
o-tolidin	0,4 g	15

A kapott oldatba Whatmann 3 MM szűrőpapírcsíkokat merítünk, majd kivétel után a csíkokat 70°C-on szárítjuk. Megszárítás után a szűrőpapírokat 4 mm oldalhosszúságú négyzetekre vágjuk. 20 Ezeket a négyzeteket ezután felragasztjuk polisztirén fogókra, melyek mérete 8x15 mm. A ragasztáshoz mindkét oldalán ragadó ragasztószalagot használunk (3 M Company).

A fenti módon előállított eszközöket három na- 25 pon át 60°C-on tartva próbáltuk ki és azt találtuk, hogy ezek érzékenysége alkalmassá teszi őket a vizeletben olyan kismennyiségű rejtett vér kimutatására, mint 0,015 mg%.

XIV. példa

Ez a példa a találmány szerinti analitikai eszköz egy másik előnyös foganatosítási módját illusztrálja. 35

A következő komponenseket a felsorolás sorrendjében összekeverve csőrös lombikban, keverés közben analitikai készítményt állítunk elő.

víz	75 ml	40
trinátrium-citrát	3,2 g
citromsav	4,15 g	45
bórsav-trietanolamin-észter	10,0 g
etiléndiamin-tetraecetsav	0,1 g
nátrium-laurilszulfát	1,5 g	50
metilszulfon	10,0g
6-metoxikinolin	0,6 g
N,N-dimetilformamid	75 ml	55
kumén-hidroperoxid	3,0 g
o-tolidin	0,8 g	60

lag segítségével felerősítjük a megfelelő műanyag fogókra.

Néhány ilyen módon készített csíkot egy napon át 70°C-on tartva, másokat 12 héten át 40 °C-on tárolva próbáltunk ki. Mindkét csoportba tartozó csíkok kékeszöld színt mutattak, amikor vizeletben 1 :1 x 10 ⁶ hígításban jelenlevő friss vérrel kerültek érintkezésbe.

összefoglalva, az eddigi példákkal bemutattuk, hogyan kell előállítani és használni a találmány szerinti készítményeket és analitikai eszközöket (I. és II. példa), összehasonlító vizsgálati eredményeket közöltünk a megnövekedett stabilitás és érzékenység igazolására (III-XII. példa) és leírtuk a találmány előnyös foganatosítási módjait (XIII. és XIV. példa). A bórsav-észterek és a hígítóanyagok külön-külön és együttesen mutatott hatását a III-V. példák illusztrálják, míg az analitikai eszközre gyakorolt hatást a VI-XI. példák mutatják be. A különféle hígítók használatát a XII. példában írtuk le.

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Analitikai vizsgálati eszköz peroxidatívan aktív anyagok meghatározására vizsgálati mintákban egy szerves hidroperoxidot - előnyösen kumén-hidroperoxidot vagy 2,5-dimetil-hexán-2,5-dihidroperoxidot - és egy az adott hidroperoxid és valamely peroxidatívan aktív anyag jelenlétében érzékelhető választ adó anyagot — előnyösen o-tolidint — tartalmazó analitikai készítménnyel átitatott hordozó mátrix formájában, azzal jellemezve, hogy a mátrixot átitató analitikai készítmény további komponensként egy I, II vagy III általános képletű hígítóanyagot — a képletekben

Rj és R₂ lehet azonos vagy különböző, és jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilvagy alkoxicsoport vagy arilcsoport — vagy ezek elegyeit, és egy IV általános képletű bórsav-trialkanol-amin-észtert — a képletben m, n és p jelentése azonos vagy különböző 1 és 4 közötti egész szám — tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti analitikai eszköz kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy hígítóanyagként dimetil-szulfoxidot, dimetil-szulfont, N,N-dimetil· -formamidot, 4-klór-fenil-szulfont, 4-fluor-3-nitro-fenil-szulfont vagy ezek elegyeit tartalmazza.
3. Az 1. igénypont szerinti analitikai eszköz kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy hígítóanyagként dimetil-szulfon és Ν,Ν-dimetil-formamid elegyét tartalmazza.
4. Az 1. igénypont szerinti analitikai eszköz kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy bórsav-trialkanol-amin-észterként bórsav-trimetanol-amin-észtert, bórsav-trietanol-amin-észtert, bórsav-tri(n-propanol)amin-észtert vagy ezek elegyeit tartalmazza.
5. Az.l. igénypont szerinti analitikai eszköz kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy bórsav-trialkanolA fenti készítménybe Whatmann 3MM szűrőpapírcsíkokat mártunk, majd a csíkokat körülbelül

11 percen át 90-92 °C-on szárítjuk. A megszárított csíkokat ezután egy kétoldalon ragadó ragasztó sza- 65

-amin-észterként bórsav-trietanol-amin-észtert tartalmaz.
6. Az 1. igénypont szerinti analitikai eszköz kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy hígítóanyagként dimetil-szulfon és Ν,Ν-dimetil-formamid elegyét és b órsav-trialkanol-amin-észterként bórsav-trietanol-amin-észtert tartalmaz.
7. Az 1. igénypont szerinti analitikai eszköz kiviteli alakja, szerves hidroperoxidként kumén-hidroperoxid, indikátorként benzidin, 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin, 2,7-diamino-fluorén vagy ezek ele5 gyei felhasználásával, azzal jellemezve, hogy hígítóanyagként dimetil-szulfon és N,N-dimetil-formamid elegyét és bórsav-trialkanol-amin-észterként bórsav-trietanol-amin-észtert tartalmaz.