JPS61181399A - エンザイムアツケイの実行方法及び該方法実行用化学組成物 - Google Patents
エンザイムアツケイの実行方法及び該方法実行用化学組成物Info
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- JPS61181399A JPS61181399A JP61019173A JP1917386A JPS61181399A JP S61181399 A JPS61181399 A JP S61181399A JP 61019173 A JP61019173 A JP 61019173A JP 1917386 A JP1917386 A JP 1917386A JP S61181399 A JPS61181399 A JP S61181399A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本開明ハ、工ンザイムアツセイを実行する方法と、該方
法を実行するためく基質となる安定な化学組成物とに関
するものである。
法を実行するためく基質となる安定な化学組成物とに関
するものである。
前記工ンプイムアツセイは、次の一般反応式による種々
の酵素の過酸化物九対する活性を利用するものである。
の酵素の過酸化物九対する活性を利用するものである。
酵素＋ＲＯＯＨ−＋ ｃ ＋ ＲＯＨ（１）Ｃ＋ Ａ
Ｈ２→酵素＋Ｈ２０＋ Ａ （！Ｉ）これらの
式で、Ｃは酵素ラジカル−酸素化合物を示し、Ａは水素
原子の損失によって着色を変化させる色原体物質である
。
Ｈ２→酵素＋Ｈ２０＋ Ａ （！Ｉ）これらの
式で、Ｃは酵素ラジカル−酸素化合物を示し、Ａは水素
原子の損失によって着色を変化させる色原体物質である
。
酵素は、上に定ｍされた如く、過酸化物に対し活性のあ
る如何なる酵素でもよく、それＫはペルオキシダーゼ、
カタラーゼクメンヒドロペルオキシド、及びミエロベル
オキシイーゼカ含まれるが、これらのみに限られるもの
ではない。
る如何なる酵素でもよく、それＫはペルオキシダーゼ、
カタラーゼクメンヒドロペルオキシド、及びミエロベル
オキシイーゼカ含まれるが、これらのみに限られるもの
ではない。
以下の記載を通して、簡単にするために代表的な酵素と
してペルオキシダーゼを用いる。
してペルオキシダーゼを用いる。
色原体物質の実例としては次のものがある：クロロナフ
トール、べ／ジジン、テトラメチルベンジジン、３−ア
ミノ−９−エチルカルバゾール、ジクロロナフトール、
ジクロロナフトール％ ３％ ３’％ ５．５１−テト
ラメチルベンジジンジヒドロクロリド、３．３’、５．
５′−テトラメチルベンジジン（ジヒドロクロリドジヒ
ドラート）３−メチルベンゾチアゾール−２，１−ヒド
ラゾン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、２．２’ −ア
ジノージ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン［）、
４−アミノアンチピリン／フェノール、０−ジアニシジ
ン、０−トリイジン、５−アミノサリチル酸、グアヤコ
ール、Ｏ−トリジン、ピロガロール。
トール、べ／ジジン、テトラメチルベンジジン、３−ア
ミノ−９−エチルカルバゾール、ジクロロナフトール、
ジクロロナフトール％ ３％ ３’％ ５．５１−テト
ラメチルベンジジンジヒドロクロリド、３．３’、５．
５′−テトラメチルベンジジン（ジヒドロクロリドジヒ
ドラート）３−メチルベンゾチアゾール−２，１−ヒド
ラゾン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、２．２’ −ア
ジノージ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン［）、
４−アミノアンチピリン／フェノール、０−ジアニシジ
ン、０−トリイジン、５−アミノサリチル酸、グアヤコ
ール、Ｏ−トリジン、ピロガロール。
普通用いられるアッセイの実例を以下に簡単に記載する
。
。
エンザイム イムノアッセイ（ＥＩＡ）この試験では、
ある特定の抗原の存在を確めるべき媒質Ｋ、適当な不溶
化された抗体、即ちペルオキシダーゼで砲台された抗体
を加える。
ある特定の抗原の存在を確めるべき媒質Ｋ、適当な不溶
化された抗体、即ちペルオキシダーゼで砲台された抗体
を加える。
洗浄の後、Ｈ２Ｏ２と色原体物質を含む基質を加える。
試験される抗原が存在する場合には、ペルオキシダ・−
ゼで胞合された抗体は抗原と結合する。基質の添加はＨ
２Ｏ２のペルオキシダーゼによる分解を惹起こし発色さ
せる。
ゼで胞合された抗体は抗原と結合する。基質の添加はＨ
２Ｏ２のペルオキシダーゼによる分解を惹起こし発色さ
せる。
イムノペルオキシダーゼアッセイ（ＩＰＡ）この方法は
、一つの抗原と、一つの抗抗原と、ペルオキシダーゼで
胞合された抗体、抗抗体、抗抗原より成る砲台体を用い
る。ペルオキシダーゼは結合されていて、上の場合と同
様に基質の添加により発色する。
、一つの抗原と、一つの抗抗原と、ペルオキシダーゼで
胞合された抗体、抗抗体、抗抗原より成る砲台体を用い
る。ペルオキシダーゼは結合されていて、上の場合と同
様に基質の添加により発色する。
ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ抗体法（ＰＡＰ
）通常この方法は、次の作用物質の相互結合を用いる： 抗原、抗抗原（ラビット中で生ずる）、ヤギの抗うビッ
トｌｆＧ抗体、及びベルオΦシイーゼー抗ベルオギシダ
ーゼ抗体（ラビット中で生ずる抗ペルオキシダーゼ抗体
）。ここでもペルオキシダーゼの結合が得られ、基質を
添加すると発色に導かれる。
）通常この方法は、次の作用物質の相互結合を用いる： 抗原、抗抗原（ラビット中で生ずる）、ヤギの抗うビッ
トｌｆＧ抗体、及びベルオΦシイーゼー抗ベルオギシダ
ーゼ抗体（ラビット中で生ずる抗ペルオキシダーゼ抗体
）。ここでもペルオキシダーゼの結合が得られ、基質を
添加すると発色に導かれる。
更に前記諸アッセイに加うるに１例えば与えられた媒質
中の酵素の活性を検出する方法の如き、他の細胞外試験
が通常行われている。このような場合には、基質は酵素
を含む媒質中に直接添加され、酵素活性／濃度の関係は
生じた発色の強さから得られる。
中の酵素の活性を検出する方法の如き、他の細胞外試験
が通常行われている。このような場合には、基質は酵素
を含む媒質中に直接添加され、酵素活性／濃度の関係は
生じた発色の強さから得られる。
前記諸アッセイ及び類似のアッセイが今日では種々の臨
床試験に広く用いられている。しかしながら、光、金属
イオン、不純物等の影響の下に極めて容易に起こる過酸
化物の分解によってラジカル酸素を生じて、自発的に発
色するから、色原体物質と過酸化物は長期間は共在する
ことができないが故に、前記諸方法の使用はその直前Ｋ
ｆｊ！′ｒ鮮な基質溶液を調製する必要から苛酷な制限
を受ける。このように自発的に反応した基質は信頼でき
る結果を得るには用いることができず、更新しなければ
ならない。
床試験に広く用いられている。しかしながら、光、金属
イオン、不純物等の影響の下に極めて容易に起こる過酸
化物の分解によってラジカル酸素を生じて、自発的に発
色するから、色原体物質と過酸化物は長期間は共在する
ことができないが故に、前記諸方法の使用はその直前Ｋ
ｆｊ！′ｒ鮮な基質溶液を調製する必要から苛酷な制限
を受ける。このように自発的に反応した基質は信頼でき
る結果を得るには用いることができず、更新しなければ
ならない。
当業者には明白な如く、劣化することなく使用に備えて
貯蔵しうる基質を用いる工ンザイムアツセイを得て、該
基質を用いるすべての試験を単純化し迅速化することは
非常に望ましい。
貯蔵しうる基質を用いる工ンザイムアツセイを得て、該
基質を用いるすべての試験を単純化し迅速化することは
非常に望ましい。
本出願人による％願昭 号には、色原体物質と過
酸化物の混合物を安定化する方法と、該混合物を安定化
するための化学組成物と、それＫよって得られた安定溶
液が記載されている。
酸化物の混合物を安定化する方法と、該混合物を安定化
するための化学組成物と、それＫよって得られた安定溶
液が記載されている。
この種の安定溶液を用いてエンザイムアツセイを実行す
る方法を提供することが、本発明の一目的であり、実際
に見出された。
る方法を提供することが、本発明の一目的であり、実際
に見出された。
これらの溶液を同じく本発明の方法に於いて生物学的試
験に基質として用いるべきときＫは、溶液を細胞内諸験
に用いるか細胞外試験に用いるかに従って１組成と条件
に特定の要求があることが見出された。これも本発明の
他の一目的となるものである。
験に基質として用いるべきときＫは、溶液を細胞内諸験
に用いるか細胞外試験に用いるかに従って１組成と条件
に特定の要求があることが見出された。これも本発明の
他の一目的となるものである。
詳細に云えば、細胞内アッセイを行うとき、有用な染色
反応を得るには、有−溶媒と水性溶液の比は予め定めら
れた範囲になければならないことが見出された。細胞内
試験を行うことを望む場合には、前記範囲は異ったもの
であり、細胞外アッセイの場合より遥かに制限される。
反応を得るには、有−溶媒と水性溶液の比は予め定めら
れた範囲になければならないことが見出された。細胞内
試験を行うことを望む場合には、前記範囲は異ったもの
であり、細胞外アッセイの場合より遥かに制限される。
本発明によるエンザイムアツセイを行う方法は、酸素の
存在を試験すべき媒質を次の成分：ａ０色原体化合物； ｂ、過酸化物； 。、水混和性有機溶媒； ６．水性だ媒又は緩衝液； ００次の一般式の化合物； ハロゲン原子、ニド−基、ｓｏ ｏｎ基、ｆｌｃＨ２Ｃ
Ｈ２ＮＨ２基又は低級アルキル基であり、ＸはＮ、０１
−Ｃ又は８である。ただしＸがＯ又はＳなるときはＸの
隣りの二重結合は単結合で代えられる； 又は次の一般式の化合物； この式で、へ、Ｒ，、、Ｒ６、Ｒ，、のおのおのは、水
素原子、低級アルケニル基、−ＮＨ２、時として＊換さ
れたフェニル基、−Ｎｏ 、ハＱゲン原子、−０ＣＨ
，、水ｒｌｌ基、Ｃ’０ＯＣ１；Ｈ，基、ｃｏｏａ基、
ＯＨＣｏｏ”（基又はＳＯ２０Ｈ基である；又は次の一
般式の化合物： この式で、馬とＲ８はそれぞれ水酸基又は低級アルケニ
ル基であり、 Ｒ，＆−１．アルケニル基であり、Ｒよ
。は時として１個又は復数個のＣＬ ’１０の直鎖又
は分枝アルキル基で置換されたアズレン基である； 又は次の一般式の化合物； この式で、ＹとＺはそれぞれ０１Ｎ”−１又はＳであり
、Ｒ工、は水素原子又は 争１［ヒドロキシフェニル基である； 又は次の一般式の化合物； この式で、〜、〜、Ｒ１，、Ｒ工、のおのおのはそれぞ
れ独立に水素原子、水酸基又は低級アルキル基である： 又は化合物（１）、（［ｌ）、（２）、（９）又は（ｖ
）の一つの塩； を含む組成物と接触させ、発色があるか否かを検査する
にある。
存在を試験すべき媒質を次の成分：ａ０色原体化合物； ｂ、過酸化物； 。、水混和性有機溶媒； ６．水性だ媒又は緩衝液； ００次の一般式の化合物； ハロゲン原子、ニド−基、ｓｏ ｏｎ基、ｆｌｃＨ２Ｃ
Ｈ２ＮＨ２基又は低級アルキル基であり、ＸはＮ、０１
−Ｃ又は８である。ただしＸがＯ又はＳなるときはＸの
隣りの二重結合は単結合で代えられる； 又は次の一般式の化合物； この式で、へ、Ｒ，、、Ｒ６、Ｒ，、のおのおのは、水
素原子、低級アルケニル基、−ＮＨ２、時として＊換さ
れたフェニル基、−Ｎｏ 、ハＱゲン原子、−０ＣＨ
，、水ｒｌｌ基、Ｃ’０ＯＣ１；Ｈ，基、ｃｏｏａ基、
ＯＨＣｏｏ”（基又はＳＯ２０Ｈ基である；又は次の一
般式の化合物： この式で、馬とＲ８はそれぞれ水酸基又は低級アルケニ
ル基であり、 Ｒ，＆−１．アルケニル基であり、Ｒよ
。は時として１個又は復数個のＣＬ ’１０の直鎖又
は分枝アルキル基で置換されたアズレン基である； 又は次の一般式の化合物； この式で、ＹとＺはそれぞれ０１Ｎ”−１又はＳであり
、Ｒ工、は水素原子又は 争１［ヒドロキシフェニル基である； 又は次の一般式の化合物； この式で、〜、〜、Ｒ１，、Ｒ工、のおのおのはそれぞ
れ独立に水素原子、水酸基又は低級アルキル基である： 又は化合物（１）、（［ｌ）、（２）、（９）又は（ｖ
）の一つの塩； を含む組成物と接触させ、発色があるか否かを検査する
にある。
水混和性有機溶媒は、好適には１．６０Ｄに等しいかそ
れより大きい気相双極子モーメントを持つ。
れより大きい気相双極子モーメントを持つ。
本発明の一好適実３１態様によれば、酸素（１ペルオキ
シダーゼ、カタラーゼ≠≠≠−年４゛°、及ヒミエロペ
ルオキシダーゼ のうちから選ばれる。
シダーゼ、カタラーゼ≠≠≠−年４゛°、及ヒミエロペ
ルオキシダーゼ のうちから選ばれる。
本発明の方法は、例えばアッセイがＩＰＡ又はＰＡＰで
あるとき１刑胞内アツセイに有効に用いることができる
。
あるとき１刑胞内アツセイに有効に用いることができる
。
更に一好適実施態様によれば、本発明の方法は実行すべ
きアッセイが例えばＥＩＡの如き細胞外の酵素活性試験
である場合にも有用である。
きアッセイが例えばＥＩＡの如き細胞外の酵素活性試験
である場合にも有用である。
本発明の一好適実旅態様によれば、アッセイが細胞内ア
ッセイであるとき、有機溶媒と水性溶液の比は、容積百
分率で４５ ： ５５と２５ニア５の間にあり、好適に
は約３５：６５である。
ッセイであるとき、有機溶媒と水性溶液の比は、容積百
分率で４５ ： ５５と２５ニア５の間にあり、好適に
は約３５：６５である。
本発明の他の一好適実施態様によれば、アッセイが剋胞
外アッセイであるとき、有機済媒と水性浴液の比は、容
ｄｔＦ：ｉ分率で８０：２０と２０：８Ｑの間にある。
外アッセイであるとき、有機済媒と水性浴液の比は、容
ｄｔＦ：ｉ分率で８０：２０と２０：８Ｑの間にある。
細胞外アッセイと細胞内アッセイの両者の場合Ｋ、ジメ
チルスルホキシドが有機溶媒として格別に便利であるこ
とが見出された。
チルスルホキシドが有機溶媒として格別に便利であるこ
とが見出された。
本発明の方法を実行するための化学組成物は次のものを
含むことを％微とする： ａ０色原体化合物； ｂ過酸化物； 。、水混和性有機溶媒； ｄ、水性溶媒又は緩衝液； 。、上に定義された一般式（１）、（■）、＠）、（転
）又は（Ｖ）を持つ化合物、又は該化合物の塩。
含むことを％微とする： ａ０色原体化合物； ｂ過酸化物； 。、水混和性有機溶媒； ｄ、水性溶媒又は緩衝液； 。、上に定義された一般式（１）、（■）、＠）、（転
）又は（Ｖ）を持つ化合物、又は該化合物の塩。
前記組成物は更に水性溶液中ＫＯ乃至５０００ｐｐｍの
キレート化剤を含むことができる。キレート化剤は好適
にはリン酸塩、アセトアニリド、クエン酸塩又は８−ヒ
ドロキシキノリンの単独のもの、或いはこのようなキレ
ート化剤の二種以上の混合物のうちから選ばれる。
キレート化剤を含むことができる。キレート化剤は好適
にはリン酸塩、アセトアニリド、クエン酸塩又は８−ヒ
ドロキシキノリンの単独のもの、或いはこのようなキレ
ート化剤の二種以上の混合物のうちから選ばれる。
本発明の一好適実施態様によれば、前記組成物は次のも
のを含む： ０乃至２００ｐｐｍのピロリン酸塩 ０乃至２ＱＯｐｐｍのアセトアニリド ０乃至ｔｏｏｏｐｐｍのクエン酸塩 ０乃至ｚｏｏｏｐｐｍの８−ヒドロキシキノリン又はそ
の半値酸塩。
のを含む： ０乃至２００ｐｐｍのピロリン酸塩 ０乃至２ＱＯｐｐｍのアセトアニリド ０乃至ｔｏｏｏｐｐｍのクエン酸塩 ０乃至ｚｏｏｏｐｐｍの８−ヒドロキシキノリン又はそ
の半値酸塩。
水混和性有機溶媒は好適には１．６０ＤＫ等しいか又は
それより大きい双極子モーメントを持つ。
それより大きい双極子モーメントを持つ。
有機溶媒は、好適にはメタノール、エタノール、ジオキ
サン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ジメチルス
ルホ／、ヘキサメチルリン酸トリアミド又はジメチルホ
ルムアミドから選ばれる。
サン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ジメチルス
ルホ／、ヘキサメチルリン酸トリアミド又はジメチルホ
ルムアミドから選ばれる。
一般式（１）の化合物は、好適には８−ヒドロキシキノ
リン、４−クロロ−７−（）リフルオロメチル）キノリ
ン、５−クロロ−７−ヨード−８−ヒドロキシキノリン
、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、或いは８−ヒ
ドロキシキノリ／の銅塩又は半値酸塩のうちから選ばれ
る。
リン、４−クロロ−７−（）リフルオロメチル）キノリ
ン、５−クロロ−７−ヨード−８−ヒドロキシキノリン
、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、或いは８−ヒ
ドロキシキノリ／の銅塩又は半値酸塩のうちから選ばれ
る。
一般式（Ｊｌ）の化合物は好適には４−アニリノスルホ
ン酸であり、一般式（２）の化合物は好適にはコレカル
シフェロール−１１−アル。
ン酸であり、一般式（２）の化合物は好適にはコレカル
シフェロール−１１−アル。
緩衝液は、好適にはリン酸塩緩衝液（ＰＢ）、トリス緩
衝液（ヒドロキシメチル−アミノメタン）、ホウ酸塩緩
衝液、及びグリシン緩衝液のうちから選ばれる。
衝液（ヒドロキシメチル−アミノメタン）、ホウ酸塩緩
衝液、及びグリシン緩衝液のうちから選ばれる。
色原体物質は、好適には次のものを含む群から選ばれる
： クロロナフトール、ベンジジン、テトラメチルベンジジ
ン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ジクロロナ
フトール、ジプロそナフトール、３．３’、５．５′
−テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド、３．３’
、５．５１−テトラメチルベンジジン（ジヒドロクロリ
ドジヒドラート）、３−メチルベンゾチアゾール−２、
ニーヒドラゾン、Ｐ−フェニル酢酸、２．２’−アジノ
ージ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）、４−
アミノ−アンチピリン／フェノール、０−ジアニシジン
、０−）ルイジン、５−アミノサリチル酸、グアヤコー
ル、〇−トリジン、ピロガロール。
： クロロナフトール、ベンジジン、テトラメチルベンジジ
ン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ジクロロナ
フトール、ジプロそナフトール、３．３’、５．５′
−テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド、３．３’
、５．５１−テトラメチルベンジジン（ジヒドロクロリ
ドジヒドラート）、３−メチルベンゾチアゾール−２、
ニーヒドラゾン、Ｐ−フェニル酢酸、２．２’−アジノ
ージ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）、４−
アミノ−アンチピリン／フェノール、０−ジアニシジン
、０−）ルイジン、５−アミノサリチル酸、グアヤコー
ル、〇−トリジン、ピロガロール。
本発明の好適実７！！態様によれば、有機溶媒と水性溶
液の間の比は、容積百分率で４５ ：５５と２５ ：
７５の間にあり、好適には容積百分率で約３５：６５で
ある。
液の間の比は、容積百分率で４５ ：５５と２５ ：
７５の間にあり、好適には容積百分率で約３５：６５で
ある。
本発明の他の一好適実施態様によれば、有機溶媒と水性
溶液の比は、容積百分率で８０ ： ２０と２０：８０
の間にある。
溶液の比は、容積百分率で８０ ： ２０と２０：８０
の間にある。
前記組成物のＰＨは７と８の間、好適には約７．６でな
ければならない。
ければならない。
すべての本発明の前記及び他の特徴及び利点は、次の例
示のための実施向からよりよく了解されるであろう。た
だし実施例は本発明を制限するものではない。
示のための実施向からよりよく了解されるであろう。た
だし実施例は本発明を制限するものではない。
実施例１乃至１５
次の諸実施例は、本発明の組成物の細胞内／細胞外作用
を例示するものである。
を例示するものである。
有機溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳ０）を用
い、トリス緩衝液を用い、その容積比を変化させて数種
の組成物を調製した。
い、トリス緩衝液を用い、その容積比を変化させて数種
の組成物を調製した。
すべての組成物は、次の物質を含んでいた：１００ ｍ
ｇの８−ヒドロキシキノリン半硫酸塩、 ５００ダの４
−クロロ−１−ナットール、Ｒ留水、（資）ダのアセト
アニリド、ｓｏｑのビロリン酸塩、及びｓ ｏ ｏ１ｎ
９のクエン酸塩。水とＤＭＳ Ｏの合計容積は１ｔであ
った。
ｇの８−ヒドロキシキノリン半硫酸塩、 ５００ダの４
−クロロ−１−ナットール、Ｒ留水、（資）ダのアセト
アニリド、ｓｏｑのビロリン酸塩、及びｓ ｏ ｏ１ｎ
９のクエン酸塩。水とＤＭＳ Ｏの合計容積は１ｔであ
った。
得られた組成物を１ｔ月間机上に貯蔵し、細胞に結合し
た形と遊離した溶液の形の両方のペルオキシダーゼ（西
洋ワサビ）の存在の比較試験を実行するに用いた。これ
らの試験の結果を、相対的な染色の強さとしてす１表に
詳細に示した。
た形と遊離した溶液の形の両方のペルオキシダーゼ（西
洋ワサビ）の存在の比較試験を実行するに用いた。これ
らの試験の結果を、相対的な染色の強さとしてす１表に
詳細に示した。
才 １ 表
実施例番号 ＤＭＳＯ容積％容積績 合 形 遊離形
１ １０ かすかに かすか
に２ ２９ かすかに 可成
り３ ２５ 可成り 強く４
３０ 強く 強（５
３５強く 強（ ６４０強く 強（ ７４５可成り 強く ８ ５０ かすかに 強く９
５５ 強く１０
６ ｇ
強く１１ ６５
強く１２ ７０
強く１３ ７５
町成り１４ ８ｏ
可成り１５ ８５
かすかに実施例１６ ヒトの繊毛性性腺刺激ホルモンを測定するために、色原
体として４−アミノアンチピリン／フェノールを用い、
ＤＭ８０含量をあ％として前記諸夾施例とｌ′ｆｆ１様
な組成物を用いてｇＩＡ Ｅ験を行った。
１ １０ かすかに かすか
に２ ２９ かすかに 可成
り３ ２５ 可成り 強く４
３０ 強く 強（５
３５強く 強（ ６４０強く 強（ ７４５可成り 強く ８ ５０ かすかに 強く９
５５ 強く１０
６ ｇ
強く１１ ６５
強く１２ ７０
強く１３ ７５
町成り１４ ８ｏ
可成り１５ ８５
かすかに実施例１６ ヒトの繊毛性性腺刺激ホルモンを測定するために、色原
体として４−アミノアンチピリン／フェノールを用い、
ＤＭ８０含量をあ％として前記諸夾施例とｌ′ｆｆ１様
な組成物を用いてｇＩＡ Ｅ験を行った。
基質を適用するとピンク色に発色した。結合されたペル
オキシダーゼの含量は５１０閣テ分光光度測定圧より定
められた。
オキシダーゼの含量は５１０閣テ分光光度測定圧より定
められた。
実施例１７
０−ジアニシジ／を色原体として用いＤＭＳＯ含量を３
０％として、実施例１６を繰返した。発色し、着色を４
００閣で測定した。
０％として、実施例１６を繰返した。発色し、着色を４
００閣で測定した。
実施例１８
５−アミノサリチル酸を色原体として用いて実施例１６
を繰返した。濃度を５４０ｍＫ於ける吸収を読んで測定
した。
を繰返した。濃度を５４０ｍＫ於ける吸収を読んで測定
した。
ｌｌｌ上
色原体を４−クロロ−ナフトールとし、 ＤＭＦ含量を
３５％とした、実施例１−１５の組成物と類似の組成物
を用い、Ｃｈｋａｍｙｄｉａ Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ
の測定をするためにＩＰＡを行った。基質を加えると不
溶性のウルトラマリン色に着色した錯体が得られた。
３５％とした、実施例１−１５の組成物と類似の組成物
を用い、Ｃｈｋａｍｙｄｉａ Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ
の測定をするためにＩＰＡを行った。基質を加えると不
溶性のウルトラマリン色に着色した錯体が得られた。
実施例田
ＤＭＳ Ｏ含ｔ２５％で、色原体として４−りａロー１
−す７トールを用い、Ｅｐｓｔｅｊｎ Ｂａｒ、 を
定めるためにｐＡＰ試験を行った。基質を加えると、ウ
ルトラマリン色の不溶性の錯体が得られた。
−す７トールを用い、Ｅｐｓｔｅｊｎ Ｂａｒ、 を
定めるためにｐＡＰ試験を行った。基質を加えると、ウ
ルトラマリン色の不溶性の錯体が得られた。
実施例２１乃至る
西洋ワサビからつくられたペルオキシダーゼの含量を評
価するために試験を行った。緩衝液に対し６５％の址の
エタノールを溶媒として用い、三種の異った色原体とし
てそれぞれ４−クロロ−１−ナフトール、０−ジアニシ
ジン、グアヤコールを用い°、三つの臭った試験を行っ
た。三つの試験はすべて互いに匹敵する結果を与えた。
価するために試験を行った。緩衝液に対し６５％の址の
エタノールを溶媒として用い、三種の異った色原体とし
てそれぞれ４−クロロ−１−ナフトール、０−ジアニシ
ジン、グアヤコールを用い°、三つの臭った試験を行っ
た。三つの試験はすべて互いに匹敵する結果を与えた。
比較試験
すべての前記実施例は、新たに調製された基質及び机上
に貯蔵された数週間の古さの基質で実行された。新たに
Ａ製された組成物で得られた結果と、数週間前に調製さ
れた組成物で僧られた結果の間に検出できる相違は全熱
なかった。
に貯蔵された数週間の古さの基質で実行された。新たに
Ａ製された組成物で得られた結果と、数週間前に調製さ
れた組成物で僧られた結果の間に検出できる相違は全熱
なかった。
代理人弁理士 斎 藤 侑
外１名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ、色原体化合物； ｂ、過酸化物； ｃ、水混和性有機溶媒 ｄ、水性溶媒又は緩衝液； ｅ、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） この式で、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３、及びＲ＿４のおの
おのはそれぞれ独立に、水素原子、水酸基、ＣＦ＿３基
、ハロゲン原子、ニトロ基、ＳＯ＿２ＯＨ基、ＮＨＣＨ
＿２ＣＨ＿２ＮＨ＿２基又は低級アルキル基であり、Ｘ
はＮ、Ｏ、−Ｃ又はＳである、ただしＸがＯ又はＳなる
ときはＸの隣りの二重結合は単結合で代えられる。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） この式で、Ｒ＿５、Ｒ＿（５＾１）、Ｒ＿６及びＲ＿（
６＾１）のおのおのは水素原子、低級アルケニル基、−
ＮＨ＿２、時として置換されているフェニル基、−ＮＯ
＿２、ハロゲン原子、−ＯＣＨ＿３、水酸基、ＣＯＯＣ
＿６Ｈ＿５基、ＣＯＯＨ基、ＣＨ＿２ＣＯＯＨ基、又は
ＳＯ＿２ＯＨ基である。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） この式で、Ｒ＿７とＲ＿８はそれぞれ水酸基又は低級ア
ルケニル基であり、Ｒ＿９はアルケニル基であり、Ｒ＿
１＿０は、時として１個又は複数個のＣ＿１−Ｃ＿１＿
０の直鎖又は分枝アルキル基で置換されたアズレン基で
ある。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） この式で、ＹとＺはそれぞれＯ、Ｎ＾−又はＳであり、
Ｒ＿１＿１は水素原子又はヒドロキシフェニル基である
。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） この式で、Ｒ＿１＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４及びＲ
＿１＿５のおのおのはそれだれ独立に水素原子、水酸基
又は低級アルキル基である。 の化合物； 又は一般式（ I ）、（II）、（III）、（IV）又は（Ｖ
）の化合物の一つの塩； を含む成物を、酵素の存在を試験すべき媒質と接触させ
、発色があったか否かを確かめることを含むことを特徴
とする、エンザイムアッセイを実行する方法。 ２ 水混和性有機溶媒が、１．６０Ｄに等しいか又はそ
れより大きい気相双極子モーメントを持つことを特徴と
する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ アッセイが、細胞内アッセイであることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１又は２項のいずれか一項に記載
の方法。 ４ アッセイがＩＰＡであることを特徴とする特許請求
の範囲第１乃至３項のいずれか一項に記載の方法。 ５ アッセイがＰＡＰであることを特徴とする特許請求
の範囲第１乃至３項のいずれか一項に記載の方法。 ６ アッセイが細胞外の酵素活性の試験であることを特
徴とする、特許請求の範囲第１又は２項のいずれか一項
に記載の方法。 ７ アッセイがＥＩＡであることを特徴とする特許請求
の範囲第１、２又は６項のいずれか一項に記載の方法。 ８ 有機溶媒と水性溶液の比が、容積百分率で４５：５
５と２５：７５の間にあり、好適には約３５：６５であ
ることを特徴とする、特許請求の範囲第１乃至５項のい
ずれか一項に記載の方法。 ９ 有機溶媒と水性溶液の比が、容積百分率で８０：２
０と２０：８０の間にあることを特徴とする特許請求の
範囲第６又は７項のいずれか一項に記載の方法。 １０ 有機溶媒がジメチルスルホキシドであることを特
徴とする、特許請求の範囲第８又は９項のいずれか一項
に記載の方法。 １１ ａ、色原体化合物； ｂ、過酸化物； ｃ、水混和性有機溶媒； ｄ、水性溶媒又は緩衝液； ｅ、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） この式で、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３及びＲ＿４のおのお
のはそれぞれ独立に、水素原子、水酸基、ＣＦ＿３基、
ハロゲン原子、ニトロ基、ＳＯ＿２ＯＨ基、ＮＨＣＨ＿
２ＣＨ＿２ＮＨ＿２基又は低級アルキル基でありＸはＮ
、Ｏ、−Ｃ又はＳである。ただしＸがＯ又はＳなるとき
はＸの隣りの二重結合は単結合で代えられる。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） この式で、Ｒ＿５、Ｒ＿（５＾１）、Ｒ＿６及びＲ＿（
６＾１）のおのおのは水素原子、低級アルケニル基、−
ＮＨ＿２、時として置換されているフェニル基、−ＮＯ
＿２、ハロゲス原子、−ＯＣＨ＿３、水酸基、ＣＯＯＣ
＿６Ｈ＿５基、ＣＯＯＨ基、ＣＨ＿２ＣＯＯＨ基、又は
ＳＯ＿２ＯＨ基である。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ この式で、Ｒ＿７とＲ＿８はそれぞれ水酸基又は低級ア
ルケニル基であり、Ｒ＿９はアルケニル基であり、Ｒ＿
１＿０は、時として１個又は複数個のＣ＿１−Ｃ＿１＿
０の直鎖又は分枝アルキル基で置換されたアズレン基で
ある。 の化合物； 又は一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） この式で、ＹとＺはそれぞれＯ、Ｎ＾−又はＳであり、
Ｒ＿１＿１は水素原子又はヒドロキシフェニル基である
。 の化合物； 又は一般式▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） この式で、Ｒ＿１＿２、Ｒ＿１＿３、Ｒ＿１＿４、及び
Ｒ＿１＿５のおのおのはそれぞれ独立に水素原子、水酸
基又は低級アルキル基である。 の化合物； 又は一般式（ I ）、（II）、（III）、（IV）又は（Ｖ
）の化合物の一つの塩； を含むことを特徴とする、特許請求の範囲第１乃至１０
項のいずれか一項に記載の方法を行うための化学組成物
。 １２ 水混和性有機溶媒が１．６０Ｄに等しい又はそれ
より大きい気相双極子モーメントを持つことを特徴とす
る、特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 １３ 水性溶液が更に０乃至５０００ＰＰｍのキレート
化剤を含むことを特徴とする、特許請求の範囲第１１又
は１２項のいずれか一項に記載の組成物。 １４ キレート化剤が、ピロリン酸塩、アセトアニリド
、クエン酸塩、又は８−ヒドロキシキノリンの単独のも
の、又はそのようなキレート化剤の二種以上の混合物か
ら選ばれることを特徴とする、特許請求の範囲第１３項
記載の組成物。 １５ ０乃至２００ｐｐｍのピロリン酸塩、 ０乃至２００ｐｐｍのアセトアニリド、 ０乃至１０００ｐｐｍのクエン酸塩、 ０乃至２０００ｐｐｍの８−ヒドロキシキノリン又はそ
の半硫酸塩、 を含むことを特徴とする、特許請求の範囲第１４項記載
の組成物。 １６ 有機溶媒が、メタノール、エタノール、ジオキサ
ン、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ジメチルスル
ホン、ヘキナメチルリン酸トリアミド、又はジメチルホ
ルムアミドから選択されることを特徴とする、特許請求
の範囲第１１乃至１５項のいずれか一項に記載の組成物
。 １７ 一般式（ I ）の化合物が、８−ヒドロキシキノ
リン、４−クロロ−７−（トリフルオロメチル）キノリ
ン、５−クロロ−７−ヨード−８−ヒドロキシキノリン
、クロロヒドロキシキノリン、５−クロロ−８−ヒドロ
キシキノリン、或いは８−ヒドロキシキノリンの銅塩又
は半硫酸塩から選ばれることを特徴とする、特許請求の
範囲第１１乃至１６項のいずれ一項に記載の組成物。 １８ 一般式（II）の化合物が４−アニリノスルホン酸
であることを特徴とする、特許請求の範囲第１１乃至１
６項のいずれか一項に記載の組成物。 １９ 一般式（III）の化合物がコレカルシフェロール
であることを特徴とする、特許請求の範囲第１１乃至１
６項のいずれか一項に記載の組成物。 ２０ 緩衝液が、リン酸塩緩衝液（ＰＢ）、トリス緩衝
液（ヒドロキシメチル−アミノメタン）ホウ酸塩緩衝液
、及びグリシン緩衝液の間から選択されることを特徴と
する、特許請求の範囲第１１乃至１６項のいずれか一項
に記載の組成物。 ２１ 色原体物質が、クロロナフトール、ベンジジン、
テトラメチルベンジジン、３−アミノ−９−エチルカル
バゾール、ジクロロナフトール、ジブロモナフトール、
３、３＾１、５、５＾１−テトラメチルベンリシンジヒ
ドロクロリド、３、３＾１、５、５＾１−テトラメチル
ベンリシン（ジヒドロクロリドジヒドラート）、３−メ
チルゾンソ−チアゾール−２、１−ヒドラゾン、カ−ヒ
ドロキシフェニル酢酸、２、２＾１−アジノージ（３−
エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）、４−アミノアン
チピリル／フェノール、０−ジアニシジン、０−トルイ
ジン、５−アミノサリチル酸、グアヤコール、０−トリ
ジン、ピロガロールを含む群から選択されたものである
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１１乃至２０項の
いずれか一項に記載の組成物。 ２２ 有機溶媒と水性溶液の比が、容積百分率で４５：
５５と２５：７５の間にあることを特徴とする、特許請
求の範囲第３乃至５項のいずれか一項に記載の方法を行
うための組成物。 ２３ 有機溶媒と水性溶液の比が、容積百分率で約３５
：６５であることを特徴とする、特許請求の範囲第２２
項に記載の組成物、 ２４ 有機溶媒と水性溶液の比が、容積百分率で８０：
２０と２０：８０の間にあることを特徴とする、特許請
求の範囲第６項記載の方法を行うための組成物。 ２５ ７と８の間のＰＨを持つことを特徴とする特許請
求の範囲第２２項乃至２４項のいずれか一項に記載の組
成物。 ２６ ＰＨが約７．６であることを特徴とする、特許請
求の範囲第２５項記載の組成物。 ２７ 酵素がペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びミエロ
ベルオキシダーゼの間から選ばれることを特徴とする、
特許請求の範囲第１項乃至１０項のいずれか一項に記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL74205 | 1985-01-31 | ||
| IL74205A IL74205A (en) | 1985-01-31 | 1985-01-31 | Method for carrying out enzyme assays utilizing stable chemical compositions containing hydrogen peroxide and a chromogen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61181399A true JPS61181399A (ja) | 1986-08-14 |
Family
ID=11055643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61019173A Pending JPS61181399A (ja) | 1985-01-31 | 1986-01-30 | エンザイムアツケイの実行方法及び該方法実行用化学組成物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4849342A (ja) |
| JP (1) | JPS61181399A (ja) |
| DE (1) | DE3601686A1 (ja) |
| FR (1) | FR2576910B1 (ja) |
| GB (1) | GB2170600B (ja) |
| IL (1) | IL74205A (ja) |
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| JPH0619346B2 (ja) * | 1986-11-17 | 1994-03-16 | コニカ株式会社 | 過酸化水素定量用分析素子 |
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| DE3710881C1 (en) * | 1987-04-01 | 1988-07-14 | Surtec Patent Holding | Process for the explosive plating of carrier layers with metallic powders |
| JP3184894B2 (ja) * | 1989-10-05 | 2001-07-09 | エックスオックスエミス， インコーポレイテッド | ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系 |
| US5225325A (en) * | 1990-03-02 | 1993-07-06 | Ventana Medical Systems, Inc. | Immunohistochemical staining method and reagents therefor |
| US5206150A (en) * | 1990-10-26 | 1993-04-27 | University Of Kentucky Research Foundation | Composition of, method of producing and method of using a stabilized formulation for assaying peroxidase activity |
| US6046019A (en) * | 1991-07-09 | 2000-04-04 | Goumeniouk; Alexander P. | Diagnostic kits and methods for making granulocyte cell counts |
| US5238817A (en) * | 1991-07-12 | 1993-08-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Chromogenic substrates for improving detection in a peroxidase-based assay |
| US5464755A (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-07 | Biolog, Inc. | Microbiological medium and method of assay |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4071321A (en) * | 1977-03-14 | 1978-01-31 | Miles Laboratories, Inc. | Test composition and device for determining peroxidatively active substances |
| US4071317A (en) * | 1977-03-14 | 1978-01-31 | Miles Laboratories, Inc. | Test composition and device for determining peroxidatively active substances and process for preparing same |
| US4148611A (en) * | 1978-06-28 | 1979-04-10 | Miles Laboratories, Inc. | Test composition, device and method for the detection of peroxidatively active substances |
| US4247631A (en) * | 1979-01-31 | 1981-01-27 | Millipore Corporation | Reagent and method for the analytic determination of hydrogen peroxide |
| US4278439A (en) * | 1979-12-17 | 1981-07-14 | Miles Laboratories, Inc. | Sensitizers for peroxidative activity tests |
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| EP0108526A3 (en) * | 1982-11-01 | 1984-07-11 | Beckman Instruments, Inc. | Method and reagent for the determination of peroxide and precursors thereof |
| EP0116454B1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-04-29 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent or luminometric assay |
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| DE3311887A1 (de) * | 1983-03-31 | 1984-12-20 | Byk-Mallinckrodt Chemische Produkte Gmbh, 6057 Dietzenbach | Verfahren zur bestimmung der peroxidase-aktivitaet durch endverduennungstitration und mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
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| US4447542A (en) * | 1983-04-04 | 1984-05-08 | Miles Laboratories, Inc. | Analytical test composition, device and method for the determination of peroxidatively active substances |
| US4556640A (en) * | 1983-06-29 | 1985-12-03 | Miles Laboratories, Inc. | Stabilized test composition, device and method for the determination of peroxidatively active substances |
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-
1985
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1986
- 1986-01-17 DE DE19863601686 patent/DE3601686A1/de active Granted
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