DE2363344C3 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Blut und anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen in Körperflüssigkeiten - Google Patents

Description

in welcher Ri einen Pyridylrest oder einen gegebenenfalls durch niedere Alkyl- oder Alkoxygruppen substituierten Phenylrest und R₂ Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest bedeuten, ist.

2. Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger saugfähig ist.

wirksame Myoglobin findet sich beispielsweise nach einem Herzinfakt im Harn.

Besonders häufig tritt ferner Blut im Harn auf, wenn Blasen- oder Nierensteine vorliegen. Für einen empfindlichen Nachweis aller dieser Substanzen eignet sich deren peroxidatische Wirkung besonders. Der aus einem Hydroperoxid freigesetzte Sauerstoff wird hierbei auf ein Chromogen übertragen welches zu einem Farbstoff oxidiert wird und so die ίο Anwesenheit der peroxidatisch wirksamen Substanz anzeigt. Insbesondere zum Nachweis von Blut wird diese Reaktion seit längerer Zeit in der medizinischen und forensischen Analytik herangezogen Sie wird in der Regel als Reagenzglas- oder Tüpfelreaktion durchge-,₅ führt, wobei als Hydroperoxid meist Wasserstoffperoxid verwendet wird. Als Chromogene kommen vor allem Benzidin, o-Tolidin oder Leukomalachitgrün zur Anwendung.

Schnellteste sind saugfähige Träger, meist Papiere, ίο die mit allen für die Nachweisreaktion nötigen Reagenzien imprägniert sind und nach einfachem Eintauchen in die Körperflüssigkeit eine Farbreaktion zeigen. Gemäß der großen Bedeutung, die Schnellteste in neuerer Zeit erlangt haben, sind diese auch schon

3. Teststreifen gemäß Anspruch 1, dadurch 25 verschiedentlich zum Nachweis von Blut in Körperfiüsgekennzeichnet, daß der Träger aus einem die sigkeiten entwickelt worden.

Reagenzien enthaltenden wasserfesten Film besteht.

4. Teststreifen gemäß einem der Ansprüche 1 -3,

dadurch gekennzeichnet, daß der Träger zusätzlich

nen Formel I

Da es beim Nachweis von Blut entscheidend auf die Empfindlichkeit des Schnelltests ankommt, ist schon

.-„ verschiedentlich versucht worden, die Empfindlichkeit

Hilfsstoffe, wie Puffer, Netzmittel, Verdickungsmit- 30 der an sich bekannten Nachweisreaktion durch Zusätze te! oder Stabilisatoren enthält. zu erhöhen. So sind beispielsweise in der deutschen

5.^Verwendung von Verbindungen der allgemei- Auslegeschrift 12 42 905 Testpapiere beschrieben, die

als aktivierende Zusätze bestimmte Chinolinderivate, vorzugsweise Chinin enthalten. Es wird zwar behauptet,' daß die Empfindlichkeit mit den angegebenen Zusätzen erheblich erhöht werden kann, jedoch ist es nach eigenen Versuchen praktisch nicht möglich, mit den so verbesserten Teststreifen, beispielsweise Blut in einer Konzentration von 5 Ery/mm³ nachzuweisen, wie es für eine Unterscheidung von normalen und pathologischen Werten nötig wäre.

Es wurde nun gefunden, daß man Teststreifen der eingangs genannten Art mit bisher unerreichbarer Empfindlichkeit erhält, wenn der Aktivator

(D

in welcher Ri einen Pyridylrest oder einen gegebenenfalls durch niedere Alkyl- oder Alkoxygruppen substituierten Phenylrest und R2 Wasserstoff oder

einen niederen Alkylrest bedeuten, als Aktivator 45 Verbindung der allgemeinen Formel I
beim Nachweis peroxidatisch wirksamer Substanzen
in Körperflüssigkeiten mit Hilfe von Teststreifen.

Die Erfindung bezieht sich auf Teststreifen zum Nachweis peroxidatisch wirksamer Substanzen in Körperflüssigkeiten, bestehend aus einem mit einem Hydroperoxid und mindestens einem Chromogen sowie einem Aktivator imprägnierten saugfähigen Träger.

Der Nachweis kleiner, mit dem Auge nicht mehr erkennbarer Mengen von Blut in Urin, Kot oder Erbrochenem ist sehr wichtig für die Diagnose von Blutungen in Magen, Darm und Harnwegen. Solche Blutungen werden zum Beispiel durch Tumore, Geschwüre oder Entzündungen an den entsprechenden Organen verursacht. Daneben kann unter dem Einfluß gewisser hämolytischer Toxine im Harn und im Plasma noch freies Hämoglobin auftreten. Blut und Hämoglobin sind peroxidatisch wirksam, d. h., sie setzen aus Hydroperoxiden Sauerstoff frei und übertragen diesen auf gewisse Akzeptoren. Das ebenfalls peroxidatisch

(I)

in welcher Ri einen Pyridylrest oder einen gegebenenfalls durch niedere Alkyl- oder Alkoxygruppen substituierten Phenylrest und R2 Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest bedeuten, ist.

Bevorzugt sind Verbindungen mit R2 = Wasserstoff. Niedere Alkyl- und Alkoxygruppen haben 1 —4 Kohlenstoffatome, bevorzugt ist die Methyl- bzw. Methoxygruppe.

Überraschenderweise erhöhen die Verbindungen I die Empfindlichkeit von Peroxidasen pflanzlichen Ursprungs, wie z. B. von Meerrettichperoxidase nicht, sondern wirken spezifisch auf peroxidatisch wirksame Verbindungen des menschlichen oder tierischen Organismus. Dadurch ist es möglich, Blut oder Blutbestandteile im Stuhl oder in Erbrochenem selektiv neben

pflanzlichen Peroxiüasen nachzuweisen. Hierbei wird Myoglobin etwa mit der gleichen Empfindlichkeit nachgewiesen, wie Hämoglobin.

Die Empfindlichkeit der Nachweisreaktion wird durch einzelne Verbindungen der allgemeinen Formel I so gesteigert, daß es selbst in Urin möglich ist, einzelne Erythrocyten nachzuweisen, welche auf dem Testpapier als farbiger Punkt sichtbar werden. So läßt sich beispielsweise mittels a-Styryl-pyridin ein Testpapier herstellen, mit dem man 5 Erythrocyten/mm³ Urin noch deutlich nachweisen kann. Das entspricht einer Blutverdünnung von 1 :1 000 000.

Es ist selbstverständlich, daß nicht sämtliche unter die allgemeine Formel I fallenden Verbindungen in gleichem Maße aktivierende Eigenschaften besitzen. Man hat es somit in der Hand, die Empfindlichkeit beispielsweise eines Bluttests ganz auf die Anforderungen der Praxis einzustellen. Man erhält zum Beispiel Teststreifen zunehmender Aktivität, wenn man als Aktivatoren die im folgenden aufgezählten Verbindungen in ihrer Reihenfolge als Aktivatoren zugibt:

2-(PhenyIvinyl)-4-methyIpyridin₁,

Pyridyl-2-pyridyl-4-äthyIen,

2-(4-Methyiphenylvinyl)pyridin,

2-(4-Methoxyphenylvinyl)pyridin,

Di-(pyridyl-2)äthylen,

Pyridyl-2-pyridyl-3-äthylen,

Λ-Styryl-pyridin.

Das erfindungsgemäße Aktivierungsmittel wird in Mengen von ca. 0,05 — 1,0 g, vorzugsweise 0,2 - 0,5 g pro 100 ml Imprägnierlösung eingesetzt.

Im folgenden wird die Erfindung durch allgemeine und spezielle Beispiele näher erläutert:

Bestandteile eines Teststreifens für Blut sind neben dem Aktivator ein organisches Hydroperoxid, ein Oxydationsindikator, ein Puffer und ein oberflächenaktives Mittel sowie gewünsduenfalls Phosphoramide wie z. B. Phosphorsäuretrimorpholid zur Stabilisierung sowie sonstige Hilfsstoffe.

Als Hydroperoxide kommen z. B. Diisopropylbenzolhydroperoxid oder 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid in Frage, als Indikatoren solche aus der Benzidinreihe, wie o-Tolidin oder aus der Reihe der heterocyclischen Azine, wie Bis-(N-äthyl-chinolon-2)-azin oder (N-Methylbenzthiazolon-2)-(l-äthyl-3-phenyl-5-methyl-triazolon-2)-azin in Frage.

Die Indikatoren werden in Mengen von 0,05 -5g vorzugsweise 0,2 — 1,0 g pro 100 ml Imprägnierlösung eingesetzt

Als Puffer kommen z. B. Citrat-, Phosphat-, Phthalat- oder Succinatpuffer in Frage, wobei pH-Wert und Kapazität so gewählt werden müssen, daß sich nach dem Eintauchen des Teststreifens in die Körperflüssigkeit auf diesem ein pH-Wert von 4-7, vorzugsweise von 5—6 einstellt

Von Vorteil ist es auch, der Rezeptur geringe Mengen (ca. 0,05—0,5 g pro 100 ml) eines Komplexbildners wie Natriummetaphosphat oder Äthylendiamin-tetraessigsäure zuzufügen, wodurch falsch positive Reaktionen, die durch Metallspuren verursacht sein könnten, vermieden werden.

Da die Testpapiere aufgrund der relativ großen Mengen wasserlöslicher Substanzen zum Ausbluten neigen können, ist es praktisch, der Rezeptur Verdikkungsmittel wie Methylcellulose und insbesondere Polyvinylpyrrolidon in Mengen von ca. 0,5 - 5 g pro 100 ml zuzusetzen.

Als Netzmittel verwendet man zweckmäGigerweise langkettige organische Sulfate oder Sulfonate, wie z. B. Natriumdodecylbenzolsulfonat, Dioctyl-natriumsulfosuccinat oder Natriumlaurylsulfat die bekanntlich Radikalkationen wie das oxydierte o-Tolidin stabilisieren. Die Netzmittel werden der Imprägnierlösung in Mengen von 0,5 — 5%, vorzugsweise 1 — 3%, zugesetzt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Testpapiere werden saugfähige Träger, wie z. B. Filterpapier,

ίο Cellulose oder Kunstfaservliese mit Lösungen der Reagenzien in leicht flüchtigen Lösungsmitteln imprägniert. Dies geschieht zweckmäßig in zwei oder drei getrennten Schritten. So wird beispielsweise zunächst mit einer Lösung imprägniert, welche ein Hydroperoxid, Netzmittel, Puffer und gegebenenfalls Dickungsmittel enthält. Danach wird mit einer Lösung eines Indikators und eines Aktivators der allgemeinen Formel 1 imprägniert

Die erfindungsgemäßen Teststreifen werden nach dem Trocknen in Streifen geschnitten und vorzugsweise in bekannter Weise zwischen einer Kunststoff-Folie und einem feinmaschigen Netzwerk eingesiegelt

Zum Nachweis peroxidatisch wirksamer Substanzen im Stuhl ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen Aktivatoren in bekannter Weise mit den Reagenzien in einen wasserfesten Film einzuarbeiten. Dies hat den Vorteil, daß die Oberfläche des Teststreifens zum Ablesen der Farbreaktion durch einfaches Abwischen gereinigt werden kann.

Die folgenden speziellen Beispiele erläutern die Erfindung noch näher:

Beispiel 1

Filterpapier wird nacheinander imit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40⁰C getrocknet:

Lösung 1

35,0 ml

0,1g
0,2 g

1,2molarer Citratpuffer vom pH 5,25
Äthylendiammtetraessigsäure,
Dinatriumsalz

Dodecylbenzolsulfonsäure-Natriumsalz
2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydropieroxid

(ca. 70% ig) 1,6 g

Phosphorsäuretrimorpholid 12,7 g

Äthanol 30,0 ml

Dest Wasser, ad 100,0 ml

Lösung 2

o-Tolidin
a-Styryl-pyridin
Toluol, ad

0,3 g

0,2 g

100,0 ml

Man erhält ein weißes Testpapier, welches sich beim Eintauchen in bluthaltigen Urin nach ca. 5-20 Sekunden blaugrün verfärbt Sind die Erythrocyten intakt, so sind die Papiere blaugrün gesprenkelt. 1st Hämolyse eingetreten, oder befindet sich von vornherein freies Hämoglobin im Urin, so werden die Papiere gleichmäßig blaugrün gefärbt Die Empfindlichkeit liegt bei ca. 5 Erythrocyten/mm³ oder der entsprechenden Menge Hämoglobin. Eine niedrigere Zahl intakter Erythrocyten kann unter Umständen noch einzelne grüne Punkte auf dem Testpapier hervorrufen. Die Empfindlichkeit gegenüber Myoglobin entspricht der von Hämoglobin.

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Beispiel 2

Filterpapier wird mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40⁰C getrocknet:

Lösung 1

UmolarerCitratpuffer vom pH 5,25 40,0 m!

Äthylendiamintetraessigsäure,

Dinatriumsaiz 0,1 g

Wasser, dest, ad 100.0 m i

Lösung 3

o-Tolidin
Verbindung I
Toluol, ad

0,25 g

0.25 g

100,0 ml

Man erhält Testpapiere mit praktisch den gleichen Eigenschaften wie das in Beispiel 1 beschriebene. Die Empfindlichkeit liegt zwischen ca. 5 und 20 Ery/mm³, und zwar nimml sie etwa in der u. a. Reihenfolge der Verbindungen I ab.

Verbindung I

Lösung 2

Dioctylnatriumsulfosuccinat 0,5 g

Polyvinylpyrrolidon , 0,5 g

Diisopropylbenzolhydroperoxid

(ca.50°/oig) 3,5 g

Phosphorsäuretrimorpholid 12,7 g

Methanol, ad 100,0 ml

Pyridyl-2-pyridyl-3-äthylen,

Di-(pyridyl-2)äthylen,

2-(4-Methoxyphenylvinyl)pyridin,

2-(4-Methylphenyl vinylpyridin,

Pyridyl-2-pyridyl-4-äthyien,

2-(Phenylvinyl)-4-methylpyridin.

Sämtliche hier angeführten Verbindungen literaturbekannt.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Teststreifen zum Nachweis peroxidatisch wirksamer Substanzen in Körperflüssigkeiten, bestehend aus eine -λ mit einem Hydroperoxid und mindestens einem Chromogen sowie einem Aktivator imprägnierten Träger, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivator eine Verbindung der allgemeinen Formel I