DE3017107C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Trennung von Glycohämoglobin
und nicht glycolisiertem Hämoglobin im Wege der
Elektrochromatographie unter Verwendung von Citratagargel
und Puffern. Die Ansprüche 2 bis 9 betreffen Ausgestaltungen
dieses Verfahrens.
Um einer verläßlicheren Steuerung des Zuckerspiegels und etwaiger
langfristiger diabetischer Folgen näherzukommen wurde
bereits die Messung glycosilierter Derivate normalen Hämoglobins,
wie Hämoglobin A1c vorgeschlagen, siehe D. Gonen
und A. H. Rubenstein, Diabetologia 15, 1 (1978). Ein solches
Hämoglobinderivat entsteht durch post-transcriptionale Glycosilierung
von Hämoglobin A₀ (Erwachsenen-Hämoglobin) am Valinrest
der Beta-Kette, einer langsamen chemischen Umsetzung,
welche während der gesamten Lebensdauer eines Erythrocyten
(etwa 120 Tage) vor sich geht, wobei die herrschende
Glucosekonzentration der wichtigste Faktor für die Menge des
entstehenden Hämoglobin A1c ist.
Eine raschere elektrophoretische Mobilität des glycosylierten
Hämoglobins durch Elektrophorese mit Agargel konnte bereits
im Jahre 1957 nachgewiesen werden, jedoch ohne die Möglichkeit
einer quantitativen Bestimmung. Obwohl es den Anschein
hatte, daß die Hämoglobinproportionen bei einigen Diabetikern
größer waren, konnte das auf dem Agargel an sich nachgewiesene
glycosylierte Hämoglobin nicht quantifiziert werden, siehe
S. Rahbar u. a., Biochem. und Biophys. Res. Comm. 36, 838
(1969). Die Versuche zur quantitativen Bestimmung wurden
daher größtenteils im Wege der Chromatographie durchgeführt,
D. W. Allen u. a. J. Am. Chem. Soc., 80, 1628 (1958).
Obwohl wiederholt die Wichtigkeit einer quantitativen Bestimmung
des glycosylierten Hämoglobins für die Prüfung der
Zuckersteuerung in Diabetikern aufgezeigt wurde, bediente sich
die Praxis durchweg aufwendiger chromatographischer Trennverfahren,
vgl. W. R. Holmquist und W. A. Schroeder, Biochem.
Biophys. Acta, 82, 639 (1964) und L. A. Trivelli u. a. N. Engl.
J. Med., 281, 353 (1971). Hierbei konnte nachgewiesen werden,
daß Diabetiker regelmäßig eine zweifache Zunahme des Hämoglobin
A1c-Spiegels als der Hauptkomponente der glycosylierten
Hämoglobine in peripherem Blut zeigen.
Angesichts der klinischen Bedeutung der glycolysierten Hämoglobinbedingungen
und des sehr geringen Unterschieds zwischen
normalen und anormalen Werten besteht ein Bedürfnis nach einer
rasch und routinemäßig durchführbaren Analyse, die auch quantitativ
möglich und genau genug ist, um Rückschlüsse auf Störungen
des Zuckerhaushaltes zuzulassen. Verschiedene Vorschläge
zur Verbesserung der chromatographischen Analyse leiden an
mangelnder Genauigkeit. Aufwendigere Verfahren erfordern isoelektrische
Fokussierung oder reine spezifische Antikörper,
die schwer zu beschaffen sind.
Die Erfindung hat ein einfaches aber genau arbeitendes Verfahren
zur Trennung von Glycohämoglobinen und nicht glycosylierten
Hämoglobinen zur Aufgabe.
Die Aufgabe wird durch das Verfahren auf elektrochromatographischer
Grundlage unter Verwendung von Citratagargel und einem Gelpuffer
dadurch gelöst, daß ein Agargel mit einer Naßdicke von 0,1-0,5 mm
ein Citratgelpuffer mit einer Citratkonzentration von
0,02-0,05 M und einem pH von 5,8-6,8 ein Citratküvettenpuffer
mit einer Citratkonzentration von 0,05-0,1 M und
einem pH von 6-6,5, und einer Feldstärke von 5-20 V/cm angewendet
werden.
Dieses Verfahren eignet sich zur völligen Trennung in gesonderte
Abschnitte der Glycohämoglobine von Hämoglobin und anderen
Hämoglobinderivaten. Auch kann hiermit Hämoglobin A1c von
den übrigen A₁ Hämoglobinderivaten getrennt werden.
Weitere günstige Ausgestaltungen des Verfahrens ergeben sich
aus der Beschreibung und den Unteransprüchen.
Die theoretische Grundlage des erfindungsgemäßen Trennverfahrens
läßt sich besser unter dem Begriff "Elektrochromatographie"
als dem der Elektrophorese kennzeichnen, denn
- 1) beruht die Wanderung und Trennung der Hämoglobine im wesentlichen auf der kombinierten Wirkung der Wechselwirkung zwischen Molekülen entgegengesetzter Ladung der jeweiligen Proteine und geladenen Molekülen im Agargel,
- 2) entsteht in diesem Gel ein elektroendoosmotischer Fluß ung
- 3) wird eine Feldstärke angelegt.
Obwohl bisher der Ausdruck "Elektrophorese" allgemein üblich
war, sind die Grundsätze der Elektrochromatographie nicht unbekannt,
siehe R. J. Wieme, "Agar Gel Electrophoresis", S. 192-195
(1965). Im folgenden wird daher der Ausdruck "Elektrochromatographie"
für die elektrophoreseartige Trennung von Proteinen
auf Agargel unter sauren Bedingungen verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert ein Agargel mit einer
Naßdicke von etwa 0,1-0,5 mm. Die Art des Agars ist an sich
nicht kritisch, wenn auch der pH des Citratgelpuffers etwas
von der Art des Agars abhängt, denn Agar mit weniger negativen
Ladungen erfordert einen etwas anderen pH des Puffers, der
aber immer noch in dem weiter unten näher erörterten Bereich
liegt. Der optimale pH Wert kann im Einzelfall vom durchschnittlichen
Fachmann bestimmt werden. Geeignete Agarpräparate
sind handelsüblich und für das Verfahren der Erfindung
geeignet. Die benötigte Agarmenge liegt meist bei etwa
2 Volumen-%, aber größere oder kleinere Mengen, z. B. 1-3%
sind ebenfalls möglich, wenn die übrigen Bedingungen entsprechend
eingestellt werden. Im Regelfall sind aber Agarmengen
unter 1 Volumen-% nicht geeignet.
Wahlweise kann das Gel geringe Mengen, z. B. weniger als etwa
10 Gew.-% pro Volumeneinheit, eines oder mehrerer Befeuchter
enthalten. Beispiele hierfür sind Sucrose, Hydroxyäthylzellulose,
Glycerol, Sorbitol und dergleichen. Besonders bevorzugte
Mengen sind etwa 4-6%, bevorzugte Befeuchter
Sucrose und Sorbitol. Der Befeuchter hält geringe Wassermengen
an der Oberfläche und stabilisiert dadurch den nassen
Film. Darüber hinaus stabilisiert es auch den trockenen Film.
Ein Beispiel für diesen wahlweisen Zusatz enthält 4% Sorbitol
und 1% Glycerol.
Außerdem kann das Gel auch noch ein den trockenen Film stabilisierendes
Netzmittel enthalten, dessen Verwendung günstig ist.
Meist beträgt dessen Anteil weniger als etwa 0,1 Gew.-% pro Volumeneinheit.
Neben anionischen und unionischen oberflächenaktiven
Mitteln kommen auch andere benetzende Verbindungen in Frage. Beispiele
hierfür sind Polyvinylalkohol, Sulfatester von Alkylphenoxypolyoxyalkylenalkanole,
Alkylarylsulfonate, Alkalimetallsalze
der Sulfate und Sulfonate, Fettsäureseifen, Polyätheralkohole usf.
Spezifische Beispiele sind neben Polyvinylalkohol - der frei
von Polyvinylazetat sein sollte, Nonylphenylpolyoxyäthylensulfat,
Natriumlaurylsulfat, Nonylphenylpolyoxyäthylenäthanol.
Der Citratpuffer kann eine Citratkonzentration von etwa
0,02-0,05 M haben und wird in bekannter Weise hergestellt,
meist durch Lösen einer gewünschten Menge Natriumcitratdihydrat
in Wasser und Einstellen des pH Werts durch Zugabe einer
wässerigen Zitronensäurelösung. Beispiel einer günstigen Konzentration
ist 0,0375 M. Der geeignete pH-Bereich ist im Regelfall
5,8-6,8, wobei 6-6,3 bevorzugt werden. Wie bereits erwähnt,
sind geringe Nachstellungen je nach der zur Gelherstellung
verwendeten Agarart und -beschaffenheit erforderlich.
Das Gel muß eine Dicke von etwa 0,1-0,5 mm aufweisen.
Besonders bevorzugt werden etwa 0,3-0,4 mm. Es kann grundsätzlich
in beliebiger, bekannter Weise hergestellt werden.
Besonders einfach ist die Herstellung in Formkassetten nach
US-PS 34 99 265 und 36 35 808.
Die Elektrochromatographie kann nach den bei der Elektrophorese
üblichen Methoden durchgeführt werden. Die Feldstärke kann meist
5-20 Volt/cm betragen, wobei 10 Volt/cm die bevorzugte Feldstärke
ist, und das Verfahren dann meist 30-45 Minuten dauert.
Die genaue Zeitdauer ist an sich nicht kritisch und hängt im
wesentlichen von den übrigen Verfahrensbedingungen ab.
Die Menge des glycolisierten Hämoglobins kann durch Inspektion
des Gels geschätzt oder durch bekannte Methoden bestimmt werden,
z. B. durch einen die Maximalabsorption bei 420 nm ausnutzenden
Dichtemesser, was auch vereinfachte Verfahren zur
Herstellung von Hämolysaten zuläßt, z. B. durch Mischen von
einem Teil Blut mit 2 Teilen, 0,1 Gew.-% pro Volumeneinheit
Saponin enthaltendem Wasser. Ein Abschnitt der Mischung, meist
etwa 0,8 µl, wird dann in die Küvette mit der Gelprobe gegeben.
Die glycolisierte Hämoglobinmenge kann auch indirekt bestimmt
werden, indem die Fraktionen mit einem unspezifischen Protein-
Farbgeber wie Amidoschwarz oder Ponceau-S eingefärbt und dann
in einem Dichtemesser mit einer geeigneten Wellenlänge abgetastet
werden. Die Hämolysatproben müssen dann aber aus aufgearbeiteten
Erythrocyten hergestellt werden, da anderes Protein
beim Einfärben nicht anwesend sein darf. Diese Herstellung ist
aber von der Chromatographie her wohlbekannt.
Andere Verfahren zur Mengenbestimmung glycosilierten Hämoglobins
erschließen sich dem Fachmann.
Der Gelpuffer mit einer Citratkonzentration von 0,0375 M und
pH 6 bei Zimmertemperatur wurde durch Lösen von 11,03 g Natriumcitratdihydrat
in 1 l deionisiertem, destilliertem Wasser hergestellt.
Zur Einstellung der Lösung auf pH 6 wurden 7,2 g
Zitronensäure in 1 l deionisiertem, destilliertem Wasser gelöst
und die 0,0375 M Zitronensäurelösung in der erforderlichen
Menge der Lösung zugesetzt.
Zur Herstellung der Gellösung wurden 2 g Bacto-Agar,
4 g Sorbitol, 1 ml Glycerol und 2 mg Natriumazid mit 100 ml
Gelpuffer gemischt. Die Mischung wurde unter Rühren nach völliger
Lösung der Bestandteile in einem siedenden Wasserbad
erhitzt. Zur Formung der dünnen Gelschichten oder Filme wurden
Formkassetten verwendet. Die Gellösung wurde auf 65-70°C
gekühlt und sodann mit einer Glasspritze mit einem angeschlossenen
3 mm im Durchmesser betragenden Plastikrohr in den unteren
Nippel der Form eingespritzt. Hierbei wurde die Form in
aufrechter Lage gehalten, um eingeschlossene Luft über den
oberen Nippel auszutreiben. Nach Einspritzung von 5 ml Gel
wurd die Form auf einen Labortisch gesetzt, und durch Auflage
eines flachen 500 g schweren Gewichts überschüssige Gellösung
ausgetrieben. Nach Absetzen des Gels (bei Zimmertemperatur
nach etwa 5 Minuten) wurde jeder Gelabschnitt in eine
streckbare Kunststoff- und Aluminiumfolie gewickelt, und vor
Gebrauch bei 4° 24 Stunden gelagert. Diese Gele waren bei
dichtem Verschluß und Anwesenheit eines Konservierungsmittels
wenigstens 6 Monate beständig.
Zur Herstellung des Küvettenpuffers mit einer Citratkonzentration
von 0,1 M und einem pH von 6 bei Zimmertemperatur
wurden 29,41 g eines Natriumcitratdihydrats in 1 l entionisiertem,
destilliertem Wasser gelöst, und der pH durch Zugabe
von 0,1 M Zitronensäurelösung (bereitet durch Lösen von 19,21 g
Zitronensäure in 1 l entionisiertem, destilliertem Wasser) auf
6 eingestellt.
Die Hämoglobin A₀- und A1c-Eichwerte wurden durch Kolonnenchromatographie
nach Trivelli, a. a. O., ermittelt. Die Blutproben
entstammten einem Krankenhaus (Corning Hospital,
Corning, N. Y., USA). Die Elektrophoresezelle wurde mit einer
konstanten, 60 Volt liefernden Kraftquelle betrieben. 1 Teil
Blut wurde mit 2 Teilen oder 0,1 Gew.-% pro Volumeneinheit
wässeriger Saponinlösung gemischt und in jede Küvette 0,8 µl
Hämolysat (etwa 40 µg insges. Hämoglobin) gegeben.
Jede Küvette der Elektrophoresezelle wurde mit 90 ml Küvettenpuffer
gefüllt. Die Gele wurden in den Haltedeckel gegeben und
so auf den Zellenboden gesetzt, daß die Gelränder in den Puffer
eintauchten. Sodann wurde eine konstante Feldstärke von 10 V/cm
angelegt und etwa 30 Minuten aufrechterhalten. Nach Abschluß
der elektrochromatographischen Trennung wurden die Gele inspiziert
und nach einer von zwei Methoden quantifiziert. Nach der
ersten, bevorzugten Methode wurde das Gel aus der Elektrophoresezelle
herausgenommen, und im Ofen bei 63°C 15 Minuten lang getrocknet.
Das getrocknete Gel wurde dann unmittelbar in einem
Dichtemesser mit 420-nm-Filter abgetastet. Nach der anderen
Methode wurde das Gel mit Amidoschwarz oder Ponceau-S, bereitet
durch Lösen von 1-2 g Farbstoff in 1 l 5%iger Essigsäure,
5-10 Minuten eingefärbt, dann in 5%iger Essigsäurelösung
gespült und 20 Minuten im Ofen getrocknet. Das getrocknete Gel
wurde in der verdünnten Essigsäurelösung völlig entfärbt und
zur völligen Entfernung der Hintergrundfärbung in frischer Entfärbungslösung
gespült. Das glycosilierte Hämoglobin wurde in
einem Dichtemesser (bei 600 nm für Amidoschwarz, 520 nm für
Ponceau-S) abgetastet und dadurch quantitativ bestimmt.
Die Genauigkeit dieser direkten Bestimmung wurde geprüft,
in dem Versuch wiederholt mit normalem Humanhämolysat und
Hämolysat von zwei Diabetikern durchgeführt und bei 420 nm
abgetastet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengefaßt.
Für das normale Bluthämolysat betrug der Durchschnitt 6,53.
Die Standardabweichung war 0,26, der Abweichungskoeffizient
4%, und der Blutglucosewert 85 mg-%.
Für die diabetischen Bluthämolysate waren die Durchschnittswerte
10,08 und 19,22, die Abweichungen 0,33 und 0,4, die Abweichungskoeffizienten
3,3 und 2,1%, die Blutglucosewerte 158
bzw. 348 mg-%.
Auch die Trennungsgenauigkeit der indirekten Methode wurde
überprüft. Vorgemischte Standardproben bekannter Hämoglobinmengen
A1c in Proben von Hämoglobin A1c und A₀ wurden dem erfindungsgemäßen
Verfahren unterzogen. Der Hämoglobin A1c-Gehalt
schwankte von 5-50%. Die Tabelle II zeigt die Durchschnittswerte
von je vier Bestimmungen des Hämoglobin A1c-Gehalts.
Die Analysegenauigkeit wurde durch wiederholte Versuche mit
normalem Blut und Inspektion mit Amidoschwarz und Ponceau-S
überprüft. Tabelle III zeigt die Ergebnisse.
| Amidoschwarz (600 nm) | ||||
| Ponceau-S (520 nm) | ||||
| S# 1 : 6,3 | ||||
| S#1 : 8,1 | ||||
| S# 2 : 6,6 | S#2 : 7,6 | |||
| S# 3 : 6,7 | S#3 : 7,4 | |||
| S# 4 : 7,2 | S#4 : 7,5 | |||
| S# 5 : 6,2 | S#5 : 7,2 | |||
| S# 6 : 5,9 | S#6 : 7,1 | |||
| S# 7 : 6,2 | S#7 : 7,7 | |||
| S# 8 : 6,7 | S#8 : 7,0 | |||
| S# 9 : 5,9 @ | S#10 : 6,14 @ | S#11 : 6,3 @ | S#12 : 6,6 @ | S#13 : 6,9 |
Die Angaben der Tabelle III wurden statistisch analysiert.
Für 13 Proben mit Amidoschwarzfärbung betrug der Durchschnittswert
6,43, die Standardabweichung 0,39, der Standardfehler des
Durchschnitts 0,11. Für 8 Proben mit Farbgebung durch Ponceau-S
betrug der Durchschnittswert 7,45, die Standardabweichung 0,36,
und der Standardfehler für den Durchschnitt 0,13.
Claims (9)
1. Verfahren zur Trennung von Glucosehämoglobinen und nicht
glycolisierten Hämoglobinen durch Elektrochromatographie
mit Citratagargel und einem Gelpuffer, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Agargel mit einer Naßdicke von 0,1-0,5 mm,
ein Citratgelpuffer mit einer Citratkonzentration von
0,02-0,05 M und einem pH von 5,8-6,8, ein Citratküvettenpuffer
mit einer Citratkonzentration von 0,05-0,1 M
und einem pH von 6-6,5, und eine Feldstärke von
5-20 V/cm angewendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Gel bis zu 10 Gew.-% pro Volumen eines Befeuchters
enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
der Befeuchter aus 4 Gew.-% pro Volumen Sorbitol und/oder
1,3 Gew.-% pro Volumen Glycerol besteht.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Gel bis zu 0,1 Gew.-% pro Volumen eines Netzmittels
enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das
Netzmittel aus 0,017 Gew.-% pro Volumen Polyvinylalkohol
besteht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Gel-Naßdicke 0,3-0,4 mm beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet,
daß der Gelpuffer eine Citratkonzentration von
0,038 M und einen pH von 6-6,3 hat.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet,
daß der Küvettenpuffer eine Citratkonzentration
von 0,1 M und einen pH von 6-6,3 hat.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Feldstärke 10 V/cm beträgt.
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