JPH0335166A - 混濁を防止する方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は臨床化学における血清、血漿または溶液状タン
パク質を含む他の液体の液状試料、特に高蛋白質濃度を
もつ試料および蛋白質組成物試料の混濁を低減しまたは
防止するための方法および試薬に関する。

［従来の技術とその問題点］ 臨床化学においては、血清試料および（または）血漿試
料を処理しそれらについて測光分析が必要とされること
が多い。知られる通り、測光測定は混濁によって不利に
影響される。混濁は試料中での蛋白質の沈殿によって引
起こされることがある。

蛋白質の多くは両性電解質である。それが可溶性である
限り、それらは、コロイド溶液を形成し、蛋白質は中性
塩により溶液から沈殿させ得る。沈殿したコロイドは再
溶解できる。蛋白質の溶解度は水素イオン濃度と溶液の
塩含有量とに左右される。それは等電点において最低で
ある。測光測定に関しよく測定可能な着色を得るに必要
なｐＨ値が低い場合、蛋白質はしばしば不可逆的に変性
される。得られるコロイドは変性蛋白質の濃度と型とに
よって、測定波長に種種な吸光度変動を引き起し、その
変動は不正確な測定を引き起す。

蛋白質沈殿による混濁は稀な病気例えば形質球増加症に
関連して、そして血漿試料に於て一様におこる。前記の
蛋白質はまたパラプロティンとも呼ばれる。

この様な妨害を避ける方法のひとつは、測光測定実施に
先立って蛋白質を沈殿させ、分離することである［＾ｎ
ａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４０　、４５０　（１９７
１）］。

しかし、この手順は複雑で自動化操作には向かない。も
うひとつの方法は、蛋白質を分離することなく、試料に
界面活性剤を添加することである［ＤＥ２９　４３　４
２３：Ｃ１１ｎ、ｃｈｅｉ、旦旦、９７５　（１９８４
）　］。しかしその方法は殆んどの血漿試料の場合に、
そして高蛋白質濃度試料および蛋白質組成物試料の場合
に、失敗している。

また混濁の問題は非常に大体積の試料に関する測定の場
合において、従って混濁それ自体が弱い場合においても
重大であることがある。測光反応に比して全吸光の相当
の割合を混濁が占め、それによって全体の測定を不正確
にすることがある。

市場で入手し得る分析システムは試料体積対試薬体積の
所定の比で働き、それ故妨害には敏感である。その上、
光度計の光路により、多くの他のシステムより混濁に対
しより敏感に反応する分析システムがある。

更に、混濁の問題は、最近紹介されたカプセル化学の原
理に基く分析システムの場合にしばしば起こることが示
されている（Ｃａｐｓｕｌｅ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｌｉｇｈ　５ｐｅｅｄ　
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ八ｎａｌｙｚｅ
ｒへ−Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

ｒａｒｒｙｔｏｗｎ、　Ｎ、　Ｙ、の会社パンフレット
　１９８５）。

前記の方法においては、試料と試薬とは不活性液体の膜
でカプセル化され、この形で導管中を培養、混合、反応
および測定の各部署に輸送される。

このシステムは特に混濁に対して敏感である。その原因
は光線の光路および光度計の円筒セルの非常に薄い層に
あると思われる（Ｈ，Ｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｆａｃｈｈ−
ｏｃｈｓｃｈｕｌｅ　Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ　ａ、Ｈ，の
デブロマ論文“Ｈｏｄ−ｅｌ　Ｉｒｅｃｈｎｕｎｇｃｎ
　ａｎ　Ｚｙｌ　１ｎｄｅｒｋｕｖｅｔｔｅｎ”　１９
８８　）　。

混濁による妨害の問題は特に低い色板光度を用いる分析
、例えば鉄の比色測定に干渉する。血清トランスフェリ
ンから鉄を分離するために尿素またはその誘導体例えば
グアニジンを用いることは鉄の比色測定において知られ
ている。他の分析機器たとえばｒｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｒ
Ａ−ＸＴおよびＲ，Ａ−１００もまた試料の混濁に敏感
であることがある。

［本発明による従来技術問題点の解決］本発明者は蛋白
質含有液体たとえば血清、血漿または他の液体中の混濁
を低減しまたは防止する新しい方法を見出した。本発明
は、限定はされないが、特に連続流れ方式［Ｓ、へｍｅ
ｒ、　Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、　Ｐａｔｈ。

２８．３１１−３２２　（１９５７）］、カプセル化学
の原理に従う分析および高蛋白質濃度と蛋白質組成とが
試料中に存在するような分析において、分析に先立ち蛋
白質を試料から除去する必要がなく、有用である。

本発明者は、驚くべきことに、尿素または尿素誘導体と
界面活性剤とを含む血清または血漿試料に、蛋白質沈殿
剤例えばトリクロロ酢酸、過塩素酸または酢酸ウラニル
を加えても、蛋白質が沈殿しないことを見出した。即ち
、血清または血漿と界面活性剤との混合物中に尿素また
は尿素誘導体を存在させると、重大な混濁が生じること
を防止するという非常に意外なそして有利な効果が得ら
れるのである。

本発明は従って血清、血漿または溶液状蛋白質質を含む
他の液体の試料に界面活性剤を添加することにより該試
料における混濁を低減しまたは実質的に防出するにあた
り、該試料にさらに尿素または尿素誘導体を添加するこ
とを特徴とする、該試料における混濁を低減しまたは実
質的に防止する方法を提供する。

本発明はまた、蛋白質含有液体に添加して混濁を防止ま
たは低減するための、界面活性剤と尿素または尿素誘導
体とを含み、そして必要に応じて１種またはそれ以上の
添加剤剤をさらに含む、そして試薬混合物は必要に応じ
て水溶液状であってよい、試薬混合物を提供する。

使用される界面活性剤は好ましくは生化学的分析用に既
に知られているもの、例えば４−（１゜１．３．３−テ
トラメチルブチル〉＝フェノール（７）Ｘトキシ化物（
例えばｒｒｔｔｏｎ　Ｘ−１００＠＞または水酸化ベン
ジルトリメチルアンモニウム（例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｂ
”）である。他の界面活性剤例えばｐ−ｔｅｒｔ−オク
チルフェノキシポリエトキシエタノール、ラウリルアル
コールのポリオキシエチレンエーテル、ポリエチレンソ
ルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレン−１４−
ラウラートまたはポリエチレンソルビタンモノラウラ−
トを用いることもできる。

使用される尿素誘導体は特にチオ尿素とグアニジン（イ
ミノ尿素）とその酸付加塩とである。他の用い得る尿素
誘導体はメチル尿素である。

尿素または尿素誘導体と界面活性剤との組合せは、有利
には他の助剤および（または）特定の分析に要する試薬
をも含有する、予め混合した試薬混合物の形で分析すべ
き血清または血漿試料に添加することができる。

例えば鉄の測定には、その既混合試薬混合物は還元剤例
えばヒドロキシルアミン、アスコルビン酸またはチオグ
リコール酸と、銅との錯体化剤例えばチオセミカルバジ
ドまたは２．９−ジメチル−１，１０−フェナントロリ
ン（ネオクプロイン）と、若し必要ならば緩衝剤例えば
酢酸ナトリウムとを更に含有することができる。リン酸
塩および塩化物の測定には尿素または尿素誘導体と界面
活性剤との混合物に酸を加えることができる。

尿素および尿素誘導体はそれぞれ最終濃度１．０〜５．
　Ｏｎｏｆ／ｌで用いるのが好ましい。

界面活性剤たとえばＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００として
市販されているものは最終濃度■０〜５０ｇ／ｌで用い
るのが好ましい。

試料対試薬の体積比は好ましくは約１：１０乃至ｌ：２
０、さらに好ましくは約■：１４である。

本発明の試薬は測光分析に特に有用である。本発明の試
薬を使うこのような分析において、比色測定はたとえば
自動分析装置において、試料の１部と本発明の試薬（空
試薬）との混合物に関し、既知の方法で空試験値を測定
し、試料の他の部分と、空試薬中に溶解した色形成性試
薬（着色試薬）と混合し、そして空試験値を差引いた、
前記色形成性混合物の吸収および吸光度をそれぞれ測定
することにより行うことができる。この処理の後で例え
ば、トリアジン誘導体例えば“フェレンＳ”または“フ
ェロジン°°を用いて鉄の測定、そして硝酸鉄（ＩＩＩ
）を用いて塩化物の測定が行われる。

他の場合、例えばリン酸塩またはアルブミンの比色測定
の場合には、着色試薬を、界面活性剤と尿素または尿素
誘導体と混合して、そしてまた助剤および（または〉他
の試薬とも混合して、試料に始めに添加することもで、
きる。

［本発明の作用］ 本発明に従う方法は、手動分析並に不連続分析システム
［ｆ−ｆａｅｃｋｅｌ　：Ｒａｔｉｏｎａｌ　ｉｓｉｅ
ｒｕｎｇ　ｄｅｓ　ａ＋ｅｄｉ−ｚｉｎｉｓｃｈｅｎ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍｓ　、　１３６−１６２頁（
１９７９）］、連続流れによる分析システムおよびカプ
セル化学による分析システムで血清、血漿、液体等の液
状試料の分析のために特に有用である。

［実施例］ 次の実施例は本発明を説明する。

実施例　ｌ 血清試料とヘパリン血漿試料［凝固防止のためにヘパリ
ンを加えて安定化した血漿試料］中の鉄濃度の測定 （ａ）試薬の調製 試薬　■　（空試薬） イミノ尿素塩酸塩１０８ｇを２回蒸留した水２００ｍ１
中に溶解する。イミノ尿素を溶解し、その溶液を室温に
した後、ヒドロキシルアミン塩酸塩８ｇとネオクプロイ
ン１０４■とＴｒｉｔｏｎｘ−１ｏｏＱ、２ｃｓｇとを
加え、完全に溶解する。

それからｐＨ値を０．ＩＮ苛性ソーダを用いて４．５に
調節し、２回蒸留した水を加えて全体を２５０ｍ１とす
る。

試薬　２　（着色試薬〉 フェレン８１０■を試薬ｌ（空試薬＞１０ｍ１中に溶解
する。

本実施例および他の実施例において、各試薬ｌおよび試
薬２は好ましい試料対試薬体積比１：７で使った。すな
わち試料の１容量部を最初に試薬１の７容量部と混合し
て空位を測定し、次に試薬２の７容量部をさらに加えて
混合し、好ましい試料対試薬体積比を１：１４とした。

混濁は検出されなかった。

鉄の測定は手動とテクニコン社から市販されている自動
分析装置“ＴＥＣＩＩＮＩＣＯＮ　ＣＨＥＷ　Ｌ　”°
を使った自動の両方で行った。試料は高度に病理学的な
蛋白質画分と蛋白質濃度８．５ｇ／’ｄ＋以上をもつ血
漿資料である。結果は次のとおりである。

ｌ　　　　　　　１３４ ２　　　　　　　５９ ３　　　　　　１６２ ４　　　　　　　７６ ５　　　　　　　３５ ６　　　　　　　６３ ２８ １ ５６ ８ ９ １ ７　　　　　　　６６　　　　　　　６１８　　　　　
　　７１　　　　　　　７３９　　　　　　　６８　　
　　　　　６７１０　　　　　　　３９　　　　　　　
３９１１　　　　　　　７３　　　　　　　６１１２　
　　　　　１２３　　　　　　１２８１３　　　　　　
　９５　　　　　　　９５ＣＨＥＨ１による自動分析に
おいては、キュベツトまたはフローセルは使わず、内径
約１．５ｍｙｎのポリテトラブルオロチレンの毛管の透
明な壁を通して比色効果およびネフロメータ効果を測定
した。

測光システムは１００Ｗタングステンハロゲン灯および
９個（空位用の１個と最終の色の出現を監視するための
８個）の監視または読取り場所を含んで戒る。

手動測定は次の如く行う。

血漿試料４００μＤに、１．ＯＮ塩酸２００μｍを混合
し、その混合物を２０分間室温に放置する。その混合物
を、トリクロル酢酸２００μｍ（１，２ｍｏｌ　／、１
！　）を用いて沈殿させる。沈殿物をガラス棒で拡げ、
３０００ｒ、ｐ、ｍ、で■０分間遠心分離する。

全試料と標準と上澄液とを次の処方に従ってピペットで
採収する。

蒸留水 水性Ｆｃ標準 １．４Ｎ塩酸 トリクロロ酢酸 （１，２ｍｏｌ／Ｉ） 上澄液 着色試薬 全試料　　標　準　　鑑−斜 ３００μｍ ３００μｍ １５０μ、１１　　　　　１５０ノｔ（Ｊ１５０μ、０
　　　　　　１５０メｔρ３００μｐ ６００μｍ ３００μ、１１３００　ＪＪ、（Ｊ 着色試薬：　フェレンＳ ネオクプロイン ヒドロキシルアミン ３　　　ｍ　ｍｏｌ／、１！ ６　　　ｍ　ｍｏｆ／、１！ １．２　　　ｍｏｌ／、Ｑ 混合の後、試料の吸光度（Ｅ　　　　）と標準の吸ｓａ
ｍｐ　ｌ　ｅ 光度（Ｅｓｔａ。ｄａｒｄ）とを全試料に対して、キュ
ベツト中６００ｎｍで測定する。

１ｃｍの 鉄含有量（μｌ／ｄｌ）−標準値（μｑ／ｄｌ）　”　
ｓ並鮭虹Ｅｓｔａｎｄａｒｄ 血漿試料の鉄含有量について、本発明に従いＣＨＥＨ１
装置による測定を行い、本発明によらずにＴｅＣｈｎｉ
ＣＯｎＲＡ−ＸＴ分析機を使って行った測定と対比した
。その結果は次のとおりである。

ＣＨＥＭ　　　　１ ［μｇ／ｄ、ｌ！　］ ３４ ９ ６２ ６ ５ ３ １ （１６） ＲＡ−ＸＴ ［μｇ／ｄｎ　］ ５１ １００１＊ １１４６＊ １０５４＊ ５０１＊ ６１” １５３２＊ ８ ９ ６ １０９７＊ ９３９＊ １０３０＊ ＊・・・測定キュベツト中の混濁 ＲＡ ＸＴ分析機で使った試薬は次のとおりである。

フェニレンＳ 塩酸ヒドロキシルアミン 塩酸ネオクプロイン 緩衝液 ０　、９３ｍ　ｍｏｌ／、１！ ４５５ｍ　ｍｏｌ／、１！ ４．２８ｍ　１１１０１／Ｎ ｐ８４．５５ 測定製剤：　　　　２５μｍ試料 ３３５μＤ試薬 一連の血清試料についても、ＣＩＩＥ）１１分析機によ
り本発明方法に従う鉄分板と、尿素または尿素誘導体を
使わずにＲＡ−ＸＴ分析機による鉄分板とを行った。結
果は次のとおりである。

ＣＨＥＭ　　　１ ［μｇ／ｄｌｌ　］ ２６ １ ８ ３ ４ ３ １ ２３ ６ ６ ７ ７ ３７ １１ ３ ＲＡ−ＸＴ ［μｇ／ｄ、ｌｌ　］ ３０ １ ０４ ９ １２３０＊ ９ ７３０＊ ３６ ０ ９ ５ ４ ４２ １１２０＊ １ ＊・・・測定キュベツト中の混濁 使用した試薬は前記のものである。

実施例　２ 血清およびヘパリン血漿試料中のリン酸塩濃度の測定 試薬の調製 チオ尿素２５ｇを２回蒸留した水２００ｍ１中に溶解す
る。その溶液を室温にした後、その中に、モリブデン酸
アンモニウム（着色試薬）８７■を溶解し、そし回蒸留
した水を加え、全体を２５０ｍ１にする。

病理学的蛋白質画分をもつ血漿試料を、試料空試薬を用
いＴｅｃｈｎｉｃｏｎ社の自動分析装置ＲＡ−ＸＴを使
って測定する。湿潤剤Ｗをもつ０．９％食塩水を試料空
試薬として用いる。

結果は次のとおりである。

ＣＨＥＭ　　１ ［μｇ／ｄＮ］ ■　　　　　　　３．９ ２　　　　　　２．６ ３　　　　　　４．０ Ｒ，Ａ−ＸＴ ［μｇ／ｄ、ｌｌ　］ ４．０ ２．８ ４．１ ＊・・・測定キュベツト中の混濁 ＲＡ−ＸＴ分析機で使った試薬： モリブデン酸アンモニウム　０．２８ｍ　ｍｏｌ／、Ｑ
硫酸　　　　　　　　　　　　１３０ｍ　ｍｏｌ／Ｎ測
定製剤： ５μｍ ３２５μｍ 試料 試薬 実施例　３ 血清およびヘパリン血漿試料中のアルブミン濃度の測定 試薬の調製 尿素７５ｇを２回蒸留した水２００ｍ１中に溶解する。

溶液が室温に達した後、ブロモクレゾールグリーン（着
色試薬）５０■とＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００％Ｊ、　２
５ｇとを次々に溶解する。ｐＨ値を４．２に調節し２回
蒸留した水を加え全体を２５ｍ１とする。

病理学的蛋白質画分を持つ血漿試料をＴｅｃｈｎｉｃｏ
ｎ社の自動分析装置１’？Ａ−１００を使って測定する
。

結果は次のとおりである。

ＣＨＥＭ ［μｇ／ｄｆ） ｌ　　　　　　　　　　４．３ ２　　　　　　　　　４．８ ３　　　　　　　　３．７ ４　　　　　　　　　３、１ ５　　　　　　　　３．８ ６　　　　　　　　４．３ ７　　　　　　　　６．３ １　　　　　ＨＡ−ＸＴ ］　　　［μｇ／ｄＪ　］ ４．５ ４．７ ４．１ ３．２ ３．７ ４．１ ９．６＊ ３．５ ３．９ ３．７ ３．４ ３．７ ３．５ ＊・・・測定キュベツト中の混濁 ＲＡ−１００分析機で使っｆ：試薬： ブロモクレゾールグリーン　０　、３９ｍ　ｍｏｌ＃緩
衝液　　　　　　　　　　　　ｐＨ４，２０測定製剤： ２．５μａ　試料 ３８５μも　試薬 実施例　４ 血清およびヘパリン血漿試料中の塩化物濃度の測定。

試薬の調製 試薬　１　（空試薬） イミノ尿素塩酸塩１０８ｇを２回蒸留した水２００ｍ１
中に溶解する。イミノ尿素を溶解して、溶液を室温にし
た後、メタンスルポン酸５■とＴｒｉ　ｔｏｎＸ　−ｉ
　ｏ　ｏ■６．２５１ｇとをそこに溶解する。凡ての構
成成分を溶解後、２回蒸留した水を加えて全体を２５０
ｍ１にする。

試薬　２　（着色試薬〉 硝酸鉄（Ｉｌｌ）９水和物２５０ＪＪを試薬（１）空試
薬２０ｍ１中に溶解する。

病理学的蛋白質画分をもつ血漿試料を、ＴｅＣｈｎｉＣ
Ｏｎ社の自動分析装置ＣＩＩＥ）ｉ　１　（カプセル化
学〉およびＲＡＸＴを使って測定する。

結果は次のとおりである。

ＣＨＥＪＶＩ　　　　１ ［ｍ　ｍｏｌ／ｄＪ）　］ １　　　　　　　　１０１ ２　　　　　　　　１０８ ３　　　　　　　　　９６ ４　　　　　　　　　　９９ ５　　　　　　　　　　９８ ６　　　　　　　　　　】０１ ７　　　　　　　　１０６ ＲＡ−ＸＴ ［ｍ　ｍｏｌ／ｄｊ　］ ０２ ０７ ７ ８ ９ ００ ＸＸＸ＊ １１ ７ ５ ０９ ７ ９ ＊・・・測定キュベツト中の混濁 ＲＡ−ＸＴ分析機で使った試薬： 硝酸水銀　　　　　　　　　０゜ チオシアン酸カリウム　　　ｌ。

塩化鉄（Ｉ［ｌ）　　　　　　　３５゜硝酸　　　　　
　　　　１１０゜ 測定製剤： １０μｍ　試料 ３８３μｍ　試薬 ８０ｍｍ０１／ｊ！ １９ｍ　ｍｏｌ／Ｎ ００ｎ　ｍｏｌ／Ｊ ００Ｉ１ｍｏｌ＃！

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）血清、血漿または溶液状蛋白質を含む他の液体の
   試料に界面活性剤を添加することにより該試料における
   混濁を低減しまたは実質的に防止するにあたり、該試料
   にさらに尿素または尿素誘導体を添加することを特徴と
   する、該試料における混濁を低減しまたは実質的に防止
   する方法。
2. （２）尿素誘導体としてグアニジンまたはその酸付加塩
   を用いる、前項（１）に記載の方法。
3. （３）界面活性剤と尿素または尿素誘導体とを各各含有
   し、そして必要に応じてさらに１種またはそれ以上の添
   加剤を含有する試薬混合物を試料に添加する、前項（１
   ）に記載の方法。
4. （４）該試料を前項（１）〜（３）のいずれかに記載の
   方法によりまず処理して該試料における混濁を低下また
   は防止することを特徴とする、血清、血漿または溶液状
   蛋白質を含む他の液体の試料中の成分の濃度を手動分析
   法、不連続分析法、連続流れによる分析法またはカプセ
   ル化学による分析法により測定する方法。
5. （５）界面活性剤と尿素または尿素誘導体とを含み、そ
   して必要に応じて１種またはそれ以上の添加剤剤をさら
   に含む、そして試薬混合物は必要に応じて水溶液状であ
   つてよい、前項（３）に記載の方法に使用する試薬。
6. （６）尿素誘導体としての塩化グアニジウム、還元剤、
   銅マスキング剤、および必要に応じて緩衝剤および（ま
   たは）トリアジン誘導体を含む、鉄の比色直接測定のた
   めの、前項（５）に記載の試薬。
7. （７）尿素誘導体としてのチオ尿素、硫酸およびモリブ
   デン酸アンモニウムを含む、リン酸塩の比色直接測定の
   ための、前項（５）に記載の試薬。
8. （８）ブロモクレゾールグリーンを含む、アルブミンの
   比色直接測定のための、前項（５）に記載の試薬。
9. （９）尿素誘導体としての塩化グアニジウム、メタンス
   ルホン酸、および必要に応じて硝酸鉄（III）を含む、
   塩化物の比色直接測定のための、前項（５）に記載の試
   薬。
10. （１０）血清、血漿または溶液状蛋白質を含む他の液体
    の試料中の成分の濃度を手動分析法、不連続分析法、連
    続流れによる分析法またはカプセル化学による分析法に
    より測定するための前項（５）〜（９）のいずれかに記
    載の試薬の用途。