DE60101254T2

DE60101254T2 - Mittel zur Beseitigung von Eintrübungen in biologischen Proben

Info

Publication number: DE60101254T2
Application number: DE60101254T
Authority: DE
Inventors: Dr. Gerhard Gunzer; Dr. Tracey Dooradoyle Larkin; Dr. Annegret Pfuetzner
Original assignee: Olympus Diagnostica GmbH
Current assignee: Beckman Coulter Biomedical Ltd
Priority date: 2001-02-19
Filing date: 2001-02-19
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2021-02-20
Also published as: CA2370660C; JP3908556B2; JP2002277470A; US20020151074A1; EP1233269A1; EP1233269B1; CN1206538C; CN1372144A; CA2370660A1; US6680201B2; DE60101254D1; ATE254767T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel für die Beseitigung von Trübungen in biologischen Proben, insbesondere in Serum- oder Plasmaproben.
Trübungen treten typischerweise in Plasma- oder Serumproben (lipämischen Proben) auf, die einen erhöhten Gehalt an Triglycerid-reichen Lipoprotein-Partikeln aufweisen, z. B. Chylomikrone.
Bekannte Mittel für die Beseitigung von Trübungen sind insbesondere notwendig bei der fotometrischen Analyse lipämischer Proben in der chemischen oder klinischen Diagnose. Wenn der Bestandteil, der analysiert werden soll, bei einer Wellenlänge absorbiert, die der Absorbtionswellenlänge der Triglyceride, die die Trübung verursachen, entspricht, werden korrekte fotometrische Analysen der fraglichen Komponente schwierig, bzw. unmöglich. Dies trifft insbesondere zu, wenn die Konzentration der Komponente, die bestimmt werden soll, sehr niedrig ist, z. B. im Fall des Analyts Cell-reaktives Protein (CRP).
Aus diesem Grunde ist ein typisches Beispiel für ein fotometrisches Verfahren, in dem die Interferenz mit der Trübung ausgeschlossen werden muß, der Assay für CRP. Der Assay benutzt anti-humane CRP-Antikörper, die spezifisch reagieren mit dem CRP in der Probe und unlösliche Aggregate bilden. Der Assay wird gestartet durch die Zugabe der Antikörper und die Zunahme der CRP-Antikörper Aggregate wird fotometrisch bei 340 nm gemessen. Die Triglyceride in lipämischen Proben absorbieren ebenfalls bei dieser Wellenlänge, so dass die Gefahr besteht, dass sich die Extinktionssignale überlappen.
Um dieses Problem mit lipämischen Proben zu lösen, sind verschiedene Mittel im Stand der Technik bekannt, die hinzugefügt werden können, um die Trübung zu beseitigen. In diesem Zusammenhang offenbart das US-Patent 4708939 ein Mittel, das polyethoxyliertes Triglycerid und ein sekundäres N-Alkan-Sulfonat in wässeriger Lösung enthält. Dieses bekannte Mittel erfordert relativ hohe Detergenzienkonzentrationen, die bestimmte Assays beeinträchtigen können, insbesondere immunoturbidimetrische Assays. Darüber hinaus ist N-Alkan-Sulfonat ein aggressives Detergenz, das wiederum die interessierende Reaktion behindern kann. Das bekannte Mittel kann daher eine vollständige Klärung und eine optimale Antikörper-Antigen Reaktion nicht gewährleisten.
Das US-Patent 4282001 offenbart ein Klärungsmittel, das 1% Phenol und 3,3% Thesit (ein nicht-ionisches Tensid) aufweist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel für die Beseitigung für Trübungen bereit zu stellen, das besonders angepaßt ist an CRP-Assays, aber auch für andere Assays benutzt werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Mittel weist 0,5 bis 10 mM Phenol, 0,5% bis 2% eines polyoxyethylierten Triglycerids und 0,5% bis 2% Polyoxyethylen-10-Tridecylether und 0,5% bis 2% Polyoxyethylen (8) Isotridecylether auf.
In dem erfindungsgemäßen Mittel ist das polyethoxyliertes Triglycerid (Triglyceridethoxylat) notwendig, um eine totale Klärung der Probe zu erreichen. Ein geeignetes polyethoxyliertes Triglycerid kann einen HLB-Wert im Bereich zwischen 4–16 haben, vorzugsweise 6. Der Konzentrationsbereich liegt zischen 0,5% und 2%. Bevorzugte polyoxyethylierte Triglyceride sind erhältlich unter den Handelsnamen Mulsifan RT 163 (Zschimmer & Schwarz GmbH & Co.) oder Tagat CH-40 (Goldschmidt AG).
Die polyoxyethylierten Triglyceride können sich alleine im Reaktionsgemisch nicht lösen, was zu einem Präzipitat führt. Für eine Lösung sind Polyoxyethylen-10-Tridecylether und Polyoxyethylen (8) Isotridecylether erforderlich, die die Solubilisierung des polyethoxylierten Triglycerids in der Probe unterstützen.
Die erforderlichen nicht-ionischen Tenside sind Polyoxyethylen-10-Tridecylether und Polyoxyethylen (8) Isotridecylether.
Das nicht-ionische Tensid Polyoxyethylen (8) Isotridecylether ist erhältlich unter dem Handelsnamen Genapol X 80. Dieses nicht-ionische Tensid löst sich im Reaktionsgemisch, aber hat alleine noch keinen klärenden Effekt. Es ist erforderlich für die Solubilisierung des polyethoxylierten Triglycerids (wie oben erwähnt). Der Konzentrationsbereich, in dem dieses nicht-ionische Tensid verwendet werden kann, liegt zwischen 0,5% und 2%.
Das nicht-ionische Tenside Polyoxyethylen-10-Tridecylether kann bei Sigma gekauft werden. Auch dieses Tensid löst sich im Reaktionsgemisch und unterstützt die Solubilisierung des polyethoxylierten Triglycerids. Der Konzentrationsbereich liegt zwischen 0,5% und 2%.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist eine Kombination von Polyoxyethylen (8) Isotridecylether und Polyoxyethylen-10-Tridecylether vorgesehen. Eine solche Kombination erlaubt eine sehr effektive Lösung des polyoxyethylierten Triglycerids und verbessert dadurch den klärenden Effekt des erfindungsgemäßen Mittels.
Phenol wiederum hat keinen lösenden Effekt auf die Lipide, aber agiert synergistisch mit den Tensiden, um deren klärenden Effekt zu erhöhen und die Trübung zu beseitigen. Die Anwesenheit von Phenol hilft, die effektiven Konzentrationen der benötigten Tenside zu reduzieren. In Abwesenheit von Phenol wären höhere Tensid Konzentrationen erforderlich, was zu Proben mit zu hoher Viskosität führen würde.
Die Bestandteile des erfindungsgemäßen Mittels sind bekannte Substanzen, die bereits in Mitteln für die Beseitigung für Trübungen aus dem Stand der Technik verwendet werden.
Die Verwendung von Phenol als synergistisch wirkende Komponente ist bekannt aus der EP 0004857 . Aus der EP 0004857 ist auch bekannt, Genapol als nicht-ionisches Tensid zu verwenden. Die Verwendung von weiteren nicht-ionischen Tensiden ist bekannt aus dem oben erwähnten US-Patent 4708939. Der Stand der Technik offenbart jedoch nur die Verwendung einzelner Komponenten oder Unterkombinationen davon. Keine der Schriften zeigt die Kombination aller Komponenten, wie in dem Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung.
Es stellte sich überraschend heraus, dass alle Komponenten, die in dem Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten sind, erforderlich sind, um eine Trübung effizient zu entfernen bei minimalen Auswirkungen auf eine mögliche Antikörper-Antigen-Reaktion. Theoretisch könnten Genapol und Polyoxyethylen-10-Tridecylether zusammen eine Klärung bewirken. Jedoch sind die Konzentra tionen, die für eine Klärung erforderlich sind, so hoch, dass jede Antikörper-Antigen-Reaktion vollkommen unterbunden wird. Wenn gemäß der Erfindung Mulsifan und Phenol hinzugefügt werden, kann die Konzentration von Genapol und Polyoxyethylen-10-Tridecylether reduziert werden, was eine Klärung erlaubt, ohne die immunologischen Reaktionen zu beeinträchtigen.
Im Prinzip kann das erfindungsgemäße Mittel in allen Immunoassay-Formaten verwendet werden, in denen die Möglichkeit der Interaktion mit Lipämie besteht.
Das unten aufgeführte Beispiel verwendet ein immunoturbidimetrisches Format. Der Fachmann würde die damit hergehenden Vorteile auch für andere Formate erkennen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Latex-verstärkte Assays, chemilumineszente Immunoassays mit magnetischen Partikeln, Immunofluoreszenzassays (polarisiert und nicht polarisiert), ELISA's, immunochromatographische Assays oder jedes andere Assay-Format, das eine Reduzierung von lipämischen und/oder anderen, damit einhergehenden nicht spezifischen Bindungsproblemen erfordert, wobei die vorteilhafte Erhaltung der Antikörper-Bindungscharakteristiken durch die Kombination von Reagenzien aus der vorliegenden Erfindung erzielt wird.
Im folgenden ist eine typische Zusammensetzung eines Klärungsmittels gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben, das in einem Assay für die Detektion von CRP verwendet wird. Darüber hinaus ist ein Beispiel beigefügt, das die Beseitigung der Trübung durch ein erfindungsgemäßes Mittel in lipämischen Proben zeigt.
Zusammensetzung eines Klärungspuffers (R1) für einen CRP-Assay:
Der Puffer R1 wird auf einen pH von 7.5 eingestellt (möglicher Bereich: pH 3– 9) und vorzugsweise bei einer Temperatur von 37°C verwendet (möglicher Bereich: 15–40°C).
Für das CRP-Assay werden 250 μl von R1 mit 18 μl der Probe gemischt. Dann werden 30 μl einer Antiserum-Lösung (R2; enthält Anti-CRP-Antikörper) hinzugefügt. Nach Mischen der Probe mit R1 Puffer und R2 Antiserum-Lösung reagiert das CRP der probe spezifisch mit den Anti-Human-CRP-Antikörpern aus R2 und bildet unlösliche Aggregate. Die Absorption dieser Aggregate ist proportional zur CRP-Konzentration in der Probe.
Der Zweck des R1-Puffers ist es, die Lipide in lipämischen Proben zu lösen und optimale Bedingungen für die immunologische Reaktion zu schaffen.
Beseitigung von Trübungen in lipämischen Proben
In diesem Test wurde ein Klärungspuffer (R3) mit der folgenden Zusammensetzung verwendet:
100 mM Tris Puffer, eingestellt auf pH 7.5 mit HCl, 100 mM NaCl, 2% Polyoxyethylenglycol 6000, 2 mM Phenol, 1.0% Polyoxyethylen-10-Tridecylether, 1.0% Genapol X 80 und 1.0% Mulsifan RT 163.
In einer Küvette wurden 18 μl stark lipämischen Serums bei 37°C mit 250 μl R3 gemischt. Die Änderung der Absorption bei 340 nm wurde gegen die Zeit bestimmt. Die Ergebnisse sind graphisch in 1 dargestellt.
Der Verlauf der in 1 dargestellten Absorptionsänderung zeigt, dass im Falle eines Probe/Reagenz-Verhältnisses von 18 μl : 250 μl eine Trübung von ungefähr 1.5 innerhalb von 1.5 Minuten auf ein geklärtes Niveau einer ungefähren Absorption von 0.1 im Verhältnis zu einer Probe, die nur Reagenz enthält, reduziert wird. Daher wird nach 1.5 Minuten eine komplette Beseitigung der Trübung erzielt.

Claims

Mittel für die Beseitigung von Trübungen in biologischen Proben, mit 0,5– 10 mM Phenol sowie zwei nicht-ionischen Tensiden in Konzentrationen von jeweils 0,5–2%, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-ionischen Tenside Polyoxyethylen-10-Tridecylether und Polyoxyethylen (8) Isotridecylether sind, und das Mittel weiterhin Polyoxyethyliertes Triglycerid in einer Konzentration von 0,5–2% aufweist.
Verwendung eines Mittels gemäß Anspruch 1 in Assays für die Bestimmung von C-reaktivem Protein (CRP).