JP2002277470A - 生物試料中の濁りを除去するための薬剤 - Google Patents

生物試料中の濁りを除去するための薬剤

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗体−抗原反応への影響を最小限にして濁り
を有効に除去できるようにした生物試料中の濁り除去薬
剤を提供する。 【解決手段】 0.5 〜１０ｍＭフェノール、0.5 〜１５
％ポリオキシエチル化トリグリセリド、及びポリオキシ
エチル化トリグリセリドを溶解するすることが可能であ
る0.5 〜１５％の範囲にある少なくとも１種の非イオン
界面活性剤を含んで生物試料中の濁りを除去するための
薬剤を構成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、生物試料、特に
血清又は血漿試料中の濁りを除去するための薬剤に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】濁りは、通常、多量のトリグリセリド・
リッチ・リポプロテイン粒子、例えば、カイロミクロン
（乳状脂粒）を有する血漿又は血清試料（脂血試料）中
に生じる。
【０００３】濁りを除去するための公知薬剤は、特に、
化学又は臨床診断における脂血試料の測光分析において
必要である。もしも、分析すべき成分が、濁りを生じる
トリグリセリドの吸収波長と一致する波長で吸収するな
ら、当該成分の正しい測光分析は、たとえ不可能でない
としても、困難であろう。このことは、測定される成分
濃度が非常に低い場合、例えば分析物が細胞反応性タン
パク（ＣＲＰ）である場合に、特にあてはまる。
【０００４】したがって、濁りによる干渉が排除されな
ければならない測光手法のための典型的な例は、ＣＲＰ
の分析（assay)である。この分析は試料中のＣＲＰと特
異的に反応する抗ヒトＣＲＰ抗体を使用して、不溶性凝
集体を生成する。この分析は抗体の添加によって始ま
り、ＣＲＰ−抗体−凝集体の増加を 340ｎｍの測光法に
よって測定する。脂血試料中のトリグリセリドもまた、
この波長で吸収し、その結果、重複した消光シグナルの
危険性が生じる。
【０００５】脂血試料におけるこの問題を解決するため
の、濁りを除去するために添加され得る数種の薬剤が当
該技術分野では公知である。これに関して、米国特許第
4,708,939 号には、水溶液中にポリエトキシル化トリグ
リセリド及び第２級ｎ−アルカンスルフォネートを含む
薬剤が記載されている。この公知薬剤は、ある種の分
析、特に免疫濁度測定分析に影響を与え得る比較的高い
洗剤濃度を必要とする。更に、ｎ−アルカンスルフォネ
ートは、目的の反応を阻害し得る積極的な洗剤である。
したがって、この公知薬剤は、全体的な澄明化性及び最
適な抗体−抗原反応をもたらすことができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特に
ＣＲＰ分析に適用するが、他の分析にも使用し得る濁り
を除去するための薬剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明による薬剤は、0.
5 〜１０ｍＭフェノール，0.5 〜１５％のポリオキシエ
チル化トリグリセリド，及び0.5 〜１５％の少なくとも
１種の別な非イオン界面活性剤を含む。好ましくは、２
種の別な非イオン界面活性剤の組み合わせを含む。
【０００８】
【発明の実施の態様】本発明による薬剤では、試料の全
体的澄明化を得るには、ポリエトキシル化トリグリセリ
ド（トリグリセリドエトキシレート）が必要である。好
適なポリエトキシル化トリグリセリドは４〜１６の範
囲、好ましくは６のＨＬＢ（親水新油バランス）値を有
することができる。好ましい濃度範囲は0.5 〜２％であ
る。好ましいポリオキシエチル化トリグリセリドは、Mu
lsifan RT163 (Zschimmer & Schwarz GmbH & Co.) 又は
Tagat CH-40 (Goldschmidt AG)という商標名で入手可能
である。
【０００９】ポリオキシエチル化トリグリセリドは、単
独では混合物中に溶解できず、沈澱物を生じる。溶解さ
せるには、試料中のポリエトキシル化トリグリセリドの
可溶化を助ける少なくとも１種の別な非イオン界面活性
剤を必要とする。
【００１０】使用し得る非イオン界面活性剤の典型的な
例としては、Thesit、Tergitol、Triton、Brij、Nonide
t P-40、Tween 20 (Sigma-Aldrich Ltd.）が挙げられ
る。
【００１１】必要とする非イオン界面活性剤は、１０〜
１８個の炭素原子を有する、オキシエチル化数が小さい
（分子当たり２〜１０個のオキシエチレン単位）直鎖又
は分岐ポリオキシエチレンエーテルである。
【００１２】別な非イオン界面活性剤は、好ましくは、
Genapol X 080 という商標名で入手可能であるポリオキ
シエチエレン（８）イソトリデシルエーテルである。こ
の非イオン界面活性剤は反応混合物中に溶解するが、単
独では澄明化効果を示さない。（上述したように）ポリ
エトキシル化トリグリセリドを可溶化することが必要で
ある。非イオン界面活性剤が使用され得る好ましい濃度
範囲は、0.5 〜２％である。
【００１３】別な好ましい非イオン界面活性剤は、Sigm
a から購入することができるポリオキシエチレン−１０
−トリデシルエーテルである。この界面活性剤もまた、
反応混合物中に溶解して、ポリエトキシル化トリグリセ
リドの溶解を助ける。好ましい濃度範囲は、0.5 〜２％
である。
【００１４】好ましい実施の形態では、ポリオキシエチ
レン（８）イソトリデシルエーテルとポリオキシエチレ
ン−１０−トリデシルエーテルとの組み合わせが、使用
される。このような組み合わせは、ポリオキシエチル化
トリグリセリドの非常に効果的な溶解を可能とし、それ
によって、本発明に係る薬剤の澄明化作用を向上させ
る。
【００１５】フェノールは、結局脂質に対して溶解作用
を有さないが、界面活性剤と相乗的に作用して澄明化作
用を増加させ、濁りを除去する。フェノールの存在は、
必要とする界面活性剤の有効濃度を減少させることを助
ける。フェノールが存在しないと、より高い濃度の界面
活性剤を必要として、余りにも高い粘度を有する試料を
生じさせるであろう。
【００１６】本発明による薬剤中の各成分は、先行技術
分野で公知である濁り除去剤として既に使用されている
公知物質である。
【００１７】相乗的作用成分としてのフェノールの使用
は、ＥＰ0004857 から公知である。ＥＰ0004857 から、
非イオン界面活性剤としてGenapol を使用することも公
知である。別な非イオン性界面活性剤の使用は、上記引
用した米国特許4,708,939 号から公知である。しかしな
がら、先行技術は単一成分又はそのサブコンビネーショ
ンの使用を開示しているに過ぎない。それらのいずれ
も、本発明による薬剤のように、これらの全てを組み合
わせることを示していない。
【００１８】本発明による薬剤に含まれる成分の全て
は、驚くべきことに、可能性ある抗体−抗原反応への影
響を最小限にして、濁りを有効に除去するために必要で
あることが判明した。理論的には、Genapol はポリオキ
シエチレン−１０−トリデシルエーテルと共に澄明化に
有効である。しかしながら、澄明化に必要とする濃度が
非常に高いから、いかなる抗体−抗原反応も全体として
阻害される。本発明では、もしもMulsifan及びフェノー
ルが添加されるなら、Genapol 及びポリオキシエチレン
−１０−トリデシルエーテルの濃度を、免疫学的反応に
影響を与えることなく、澄明化を可能とする濃度まで低
下させることができる。
【００１９】基本的には、本発明による薬剤は、高脂血
症に寄与する相互作用の可能性が存在する全ての免疫分
析法に使用され得る。
【００２０】（実施例）以下に示す実施例は、免疫濁度
測定法を使用する。当業者はラテックス増強分析、磁気
粒子化学発光免疫分析、免疫蛍光分析（偏光及び非偏
光）、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assa
y : 酵素連鎖免疫吸収剤分析）、免疫クロマトグラフィ
分析、又は脂血及び／又は他の関連した非特異的結合問
題を減少させることを必要とする全ての分析法（これら
に限定されない）を含む他の方法においても、同様な利
点を有することに気づくであろう。これらの方法では、
抗体結合特性の有益な維持が、本発明の反応物質の組み
合わせによって生じる。
【００２１】次に、ＣＲＰ検出分析法に使用される本発
明による澄明化用剤の一般的な処方を記載する。更に、
本発明に係る薬剤によって脂血試料において効果が示さ
れた濁り除去を示す実施例を追加する。
【００２２】 ＣＲＰ分析における澄明化用緩衝液（Ｒ１）の処方 試薬 範囲 機能 純水 Tris(100mM)/Liter 50〜300 ｍＭ 緩衝液 NaCl(100mM)/Liter 50〜150 ｍＭ 澄明化及び反応補助 PEG6000(2%)(w/w) １〜３％ 反応速度の最適化用必須成分 フェノール(2mM)(Liter) 0.5 〜10ｍＭ 脂質澄明化用成分 ポリオキシエチレン- 0.5 〜２％ 脂質澄明化用成分 10- トリデシルエーテル(1.0%)(v/v) Genapol X 80 (1.0%)(v/v) 0.5 〜２％ 脂質澄明化用成分 Mulsifan RT 163 (1.1%)(v/v) 0.5 〜２％ 脂質澄明化用成分 NaN3 抗菌剤 ４M HCl ｐＨ試薬（7.5 ） ゲンタマイシン硫酸塩溶液 安定剤
【００２３】緩衝液Ｒ１はｐＨ7.5 （可能範囲ｐＨ３〜
９）に調整し、好ましくは温度３７℃（可能範囲１５〜
４０℃）にて使用する。
【００２４】ＣＲＰ分析では、250 μｌのＲ１を１８μ
ｌの試料と混合する。次いで、３０μｌの抗血清溶液
（Ｒ２；抗ＣＲＰ抗体を含む）を添加する。試料とＲ１
緩衝液およびＲ２抗血清溶液を混合した後、試料中のＣ
ＲＰがＲ２の抗ヒトＣＲＰ抗体と特異的に反応し、不溶
性凝集体を生成する。これらの凝集体の吸光度は、試料
中のＣＲＰ濃度に比例する。
【００２５】Ｒ１緩衝液の目的は、脂血試料中の脂質を
溶解し、免疫学的反応に最適の条件を提供することにあ
る。
【００２６】脂血試料中の濁りの除去 この試験では、澄明化用緩衝液（Ｒ３）を、次の処方で
使用した：ＨＣｌでｐH 7.5 に調整した 100ｍＭのTris
緩衝液， 100ｍＭのＮａＣｌ，２％ポリオキシエチレン
グリコール(PEG)6000 ，２ｍＭのフェノール， 1.0％ポ
リオキシエチレン−１０−トリデシルエーテル， 1.0％
Genapol X 80，及び 1.0％Mulsifan RT 163 。
【００２７】キュベット中で、１８μｌの強脂血血清を
250μｌのＲ３と共に３７℃で混合した。 340ｎｍでの
吸光度変化を経時的に測定した。その結果を図１に示
す。
【００２８】図１に示される吸光度変化の経過が示すよ
うに、試料／試薬の割合が１８μｌ： 250μｌである場
合、試薬ブランクと対比すれば、約1.5 の濁りが吸光度
0.1の澄明化レベルまでに約1.5 分間で減少した。した
がって、1.5 分間後には濁りの完全な除去が達成されて
いる。
【図面の簡単な説明】
【図１】脂血試料から濁りを除去する態様を示すグラフ
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トラセイ ラーキン アイルランド国， リメリック， ドーラ ドィル，ハンツフィールド， ザ クロー ズ ６ (72)発明者 アンネグレット プフェツネル アイルランド国， クレア州， エニス, カサック ロード， ビクトリア コー ト 35 Ｆターム(参考） 2G045 BA02 BB29 CA26 DA36 FB03

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 0.5 〜１０ｍＭフェノール、0.5 〜１５
    ％ポリオキシエチル化トリグリセリド、及びポリオキシ
    エチル化トリグリセリドを溶解するすることが可能であ
    る0.5 〜１５％の範囲にある少なくとも１種の非イオン
    界面活性剤を含む生物試料中の濁りを除去するための薬
    剤。
  2. 【請求項２】 前記非イオン界面活性剤は、ポリオキシ
    エチレン−１０−トリデシルエーテル及びポリオキシエ
    チレン（８）イソトリデシルエーテルを含む群から選択
    されることを特徴とする請求項１に係る薬剤。
  3. 【請求項３】 前記試薬は、ポリオキシエチレン−１０
    −トリデシルエーテルとポリオキシエチレン（８）イソ
    トリデシルエーテルとの組み合わせを含むことを特徴と
    する請求項２に係る薬剤。
  4. 【請求項４】 前記非イオン界面活性剤の濃度は、0.5
    〜２％であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか
    １項に係る薬剤。
  5. 【請求項５】 前記ポリオキシエチル化トリグリセリド
    の濃度は、0.5 〜２％であることを特徴とする請求項１
    に係る薬剤。
  6. 【請求項６】 ＣＲＰを検出する分析に使用されること
    を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に係る薬剤。
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