JPH04363660A - 免疫比濁分析用試薬、および分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応の結果生じる
混濁粒子を光学的に測定することによって各種成分を測
定する免疫比濁分析のための試薬、および分析方法に関
するものである。免疫分析は、特異性が高いこと、比較
的簡単な操作で高感度な分析が可能なこと等の利点を持
つ分析方法で、臨床検査の分野を中心に広く利用されて
いる。中でも免疫比濁分析（以下ＴＩＡと略す）は、酵
素免疫測定法等で必要な洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離行程）が
不要であるため自動化が容易なことから、注目されつつ
ある分析方法の１つである。ＴＩＡは免疫成分を標識す
る必要がないので、試薬の調製においても他の免疫分析
に比べ有利である。

【０００２】

【従来技術】ＴＩＡは抗原と抗体の反応生成物が不溶性
の複合体からなる懸濁粒子を定量的に形成し、この懸濁
粒子が光の透過を妨げることを利用して光学的に定量す
る分析法である。したがって、感度と分析に要する時間
は懸濁粒子の形成程度に大きく左右される。一般的に抗
原溶液とその抗原に特異的な抗体を混合した場合、１０
−３秒オーダーで抗原抗体反応が行われるが、その後、
光学的に測定可能な懸濁粒子が形成されるまでには数分
から数時間、あるいは数日間を要する。

【０００３】そこで懸濁粒子の形成を促進し高感度化、
迅速化することを目的として、ポリエチレングリコ−ル
（以下ＰＥＧと略す）共存下に免疫反応を行う方法が提
案された［クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．）２０，４：Ｐ１０７１−，１９７４年］。また
ＰＥＧと非イオン性界面活性剤の併用についての報告も
ある。（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０，４：Ｐ４１５−，
１９７４　年）。ＰＥＧの作用機序はおよそ次のように
考えられている。すなわち、ＰＥＧ存在下では水溶液の
誘電率が低下し、蛋白は分子量が大きくなるにつれて溶
解性が小さくなる。結果的に、免疫複合体の形成による
高分子化が懸濁粒子の形成につながりやすくなり、ＰＥ
Ｇが反応促進剤として作用するものと考えられている。 ＰＥＧ６０００に代表されるＰＥＧは、現在最も一般的
な反応促進剤である。

【０００４】しかしＰＥＧの反応促進作用には強すぎる
面もあり、非特異的な懸濁粒子を形成しやすい。また免
疫複合体が多量に形成された場合には測定機器の測定限
界を越えるため正確な値を得られないこともある。この
ようにＰＥＧを中心とする促進剤は、分析対象物が低濃
度の場合には測定精度が低下し、一方分析対象物が比較
的多量に存在する場合には試料を希釈しなければ分析が
行えないという問題点があった。つまりＰＥＧを中心と
する反応促進剤を使ったＴＩＡは測定範囲が狭くなりや
すいのである。

【０００５】ＰＥＧの他にも例えば特開昭５９−４３３
６２号公報には、一般式

【化１】 で表される化合物を用いることが記載されているが、低
濃度領域における測定が不正確であり、また測定感度的
にも十分なものではない。

【０００６】更に特開平２−１０３４６６号公報には、
一般式

【化２】 で表される化合物を用いることが記載されているが、高
濃度における非特異反応の回避については十分な効果が
得られないのが現状である。

【０００７】

【発明の課題】本発明は、低濃度域での免疫反応による
懸濁粒子の生成を十分に促進し、しかも高濃度域まで検
量線の直線性を保つことが可能なＴＩＡ用試薬、ならび
に分析方法を提供するものである。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、ポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレン−ブロック共重合体を含むことを特徴と
する免疫比濁分析用試薬、およびポリオキシエチレン−
ポリオキシプロピレン−ブロック共重合体の存在下で免
疫反応を行わせることを特徴とする免疫比濁分析方法で
ある。

【０００９】本発明で用いるポリオキシエチレン−ポリ
オキシプロピレン−ブロック共重合体（以下単にブロッ
ク共重合体とする）は、一般式で例示した場合

【化３】 ［式中、ｌ＋ｎが４４〜１７６、ｍが１７〜６７］で表
されるような化合物である。

【００１０】中でも分子量中に少なくとも平均４０％以
上のエチレンオキサイドを含有し、かつプロピレンオキ
サイドの平均分子量が少なくとも９５０以上であるもの
が適している。このような条件を満足するブロック共重
合体には、プルロニックＬ３４、プルロニックＬ４４、
プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１０８（いずれも
ワイアンドット・ケミカルズ製、商品名）、プロノン１
０５やプロノン２０８（いずれも日本油脂製、商品名）
、エマルゲンＰＰ２５０、エマルゲンＰＰ２９０（いず
れも花王製、商品名）等が知られている。例えばここで
例示したプルロニックＬ３４は、分子量中に約４０％の
エチレンオキサイドを含有し、約９５０のプロピレンオ
キサイド分子量を持つ。

【００１１】本発明におけるブロック共重合体の使用量
は、最終濃度が３〜１５重量％、好ましくは３〜８重量
％程度となるように添加量を調節する。ブロック共重合
体は、抗血清含有試薬や希釈液などの試料処理液に添加
しておくことができ、要は最終的な免疫反応の場に必要
量のブロック共重合体が存在するようにすればよいので
ある。本発明におけるブロック共重合体の使用量が、反
応液中で３重量％以下の場合には高濃度域において良好
な直線性が得られなかったり、あるいは実用的な感度を
確保できなかったりすることがある。一方１５重量％以
上の場合には反応液の粘度が非常に高くなるので、特に
自動分析機を用いるときにはサンプリングを正確に行い
難くなる。本発明におけるブロック共重合体は、単独で
用いてもよいし複数種を合わせて用いることもできる。

【００１２】また他の促進成分との併用も可能である。 例えばＡＳＯ（アンチ・ストレプトリジンＯ）価の分析
のように高感度な反応が必要となるときには、ブロック
共重合体とともにデキストラン硫酸を用いるとよい成績
が得られる。デキストラン硫酸としては分子量５，００
０〜５００，０００のものが適しており、その使用量は
反応液中約０．００１〜１．０００重量％、中でも０．
０１〜０．５０重量％程度が好ましい。デキストラン硫
酸を用いる場合は、金属イオンが存在すると非特異的な
沈澱を生じることがあるので０．１〜５．０ｍＭ程度の
ＥＤＴＡやＣＹＤＴＡ等のキレ−ト剤と併用すれば良好
な成績が得られる。

【００１３】また試料中の脂質成分や非特異的な沈降物
による干渉を安定化するために適当な非イオン系界面活
性剤を添加することもできる。好ましい非イオン性界面
活性剤としては、ポリオキシエチレン第２級アルキルエ
−テル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ−テル
、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。この非イ
オン系界面活性剤の添加量は、反応液中で約０．０１〜
５．００重量％とすればよい。

【００１４】本発明によるＴＩＡ用試薬、ならびに分析
方法におけるブロック共重合体以外の成分は、従来公知
のものを利用すれば良い。すなわち、緩衝系としてはリ
ン酸緩衝液、あるいはＨＥＰＥＳやＰＯＰＳＯ等のＧＯ
ＯＤ’Ｓバッファ−が利用できる。試薬中には必要に応
じてパラベンやアジ化ナトリウム等の防腐剤、あるいは
塩等の安定化剤を添加しておいてもよい。

【００１５】本発明によるＴＩＡ用試薬、ならびに分析
方法は、イムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｄ、ト
ランスフェリン、補体Ｃ３　、Ｃ４　、アポリポ蛋白Ａ
−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ
−ＩＩＩ　、Ｅ、Ｈ、βリポ蛋白、Ｌｐ（ａ）、ＣＲＰ
、ＡＳＯ、プラスミノ−ゲン、尿中アルブミン等の測定
に応用できる。

【００１６】

【作用】本発明におけるブロック共重合体は、免疫反応
による懸濁粒子の形成を促進する作用を有する。その作
用機序は不明であるが、懸濁粒子形成の促進作用は、従
来のＰＥＧを用いた促進剤よりも穏やかな上、広い濃度
範囲におよび、従来必要としていた抗体あるいは抗原濃
度を低くすることができる。またデキストラン硫酸や非
イオン性界面活性剤との併用によって、更に高感度化・
高精度化することも可能である。以下、実施例により本
発明を更に詳しく説明する。

【００１７】

【実施例】

実施例１．ブロック共重合体としてプルロニックＦ６８
を使ったアポＣ−ＩＩＩ　のＴＩＡ０．９％ＮａＣｌを
含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に８．０重量％の
プルロニックＦ６８（ワイアンドット・ケミカルズ製）
を溶解した水溶液３２０μｌに対し、アポＣ−ＩＩＩ　
含有検体の希釈系列１２μｌ　を添加・混和し、５分間
温置した。次いで抗ヒト・アポＣ−ＩＩＩ　血清含有Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液を８０μｌ　加え、添加後５分間の３４
０ｎｍにおける吸光度変化量（ΔＯＤ）を測定した。測
定は、日立７１５０形自動分析機を用い、抗ヒト・アポ
Ｃ−ＩＩＩ　血清は、常法によりアポＣ−ＩＩＩ　をヤ
ギに免疫し得られたものを用いた。同時にプルロニック
Ｆ６８にかえてＰＥＧ６０００を４．０重量％含む試薬
を対照として同様の測定を行って両者を比較したところ
、図１に示すとおり本発明による試薬は対照に優る性能
を示した。

【００１８】実施例２．ブロック共重合体としてプルロ
ニックＦ６８使用し、更にデキストラン硫酸を併用した
場合のＡＳＯ価のＴＩＡ０．９％ＮａＣｌを含むＰＯＰ
ＳＯ緩衝液（ｐＨ８．５）に６．０重量％のプルロニッ
クＦ６８（ワイアンドット・ケミカルズ製）、０．０５
重量％のデキストラン硫酸（平均分子量約８０００）、
２．０ｍＭのＣＹＤＴＡを溶解した水溶液３２０μｌ　
に対し、ＡＳＯ含有検体の希釈系列２０μｌ　を添加・
混和し、５分間温置した。次いでストレプトリジンＯ含
有ＰＯＰＳＯ緩衝液を８０μｌ　加え、添加後５分間の
３４０ｎｍにおける吸光度変化量（ΔＯＤ）を測定した
。測定には東芝ＴＢＡ３０Ｒ形自動分析機を用いた。同
時にデキストラン硫酸無添加（プルロニックＦ６８のみ
添加）の場合について測定を行い、両者を比較した。図
２に示したようにデキストラン硫酸の添加により、十分
な感度が得られることが確認された。また比較のためプ
ルロニックＦ６８にかえてＰＥＧ６０００を４．５重量
％、デキストラン硫酸を０．０５重量％含む試薬によっ
て同様の測定を行ったところ、非特異的な反応が大きく
ブランクが測定可能吸光度以上となり、測定そのものが
行えなかった。

【００１９】実施例３．ブロック共重合体としてプルロ
ニックＬ４４を使ったアポＢのＴＩＡ０．９％ＮａＣｌ
を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に４．０重量％
のプルロニックＬ４４（ワイアンドット・ケミカルズ製
）を溶解した水溶液３２０μｌに対し、アポＢ含有検体
の希釈系列４μｌ　を添加・混和し、５分間温置した。 次いで抗ヒト・アポＢ血清含有ＨＥＰＥＳ緩衝液を８０
μｌ　加え、添加後５分間の３４０ｎｍにおける吸光度
変化量（ΔＯＤ）を測定した。測定には、日立７１５０
形自動分析機を用い、抗ヒト・アポＢ血清は、常法によ
りアポＢをヤギに免疫し得られたものを用いた。同時に
プルロニックＬ４４にかえてＰＥＧ６０００を４．０重
量％含む試薬を対照として同様の測定を行って両者を比
較したところ、図３に示すとおり本発明による試薬は対
照に優る性能を示した。

【００２０】実施例４．ブロック共重合体としてプルロ
ニックＦ１０８使用し、更にデキストラン硫酸と非イオ
ン系界面活性剤を用いたＣＲＰのＴＩＡ０．９％ＮａＣ
ｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に１０．０重
量％のプルロニックＦ１０８（ワイアンドット・ケミカ
ルズ製）、０．０５重量％のデキストラン硫酸（平均分
子量約８０００）、２．０ｍＭのＣＹＤＴＡ、０．６重
量％のアデカト−ルＳＯ１２０（旭電化工業製、商品名
）を溶解した水溶液３２０μｌ　に対し、ＣＲＰ含有検
体の希釈系列１６μｌ　を添加・混和し、５分間温置し
た。次いで抗ヒトＣＲＰ血清含有ＨＥＰＥＳ緩衝液を８
０μｌ　加え、添加後５分間の３４０ｎｍにおける吸光
度変化量（ΔＯＤ）を測定した。抗ヒトＣＲＰ血清は、
ＣＲＰを常法によりヤギに免疫して調製したものを用い
た。測定には東芝ＴＢＡ３０Ｒ形自動分析機を用いた。 同時にプルロニックＦ１０８にかえてＰＥＧ６０００を
４．０重量％含む試薬を対照として同様の測定を行って
両者を比較したところ、図４に示すとおり本発明による
試薬は対照に優る性能を示した。また非イオン系界面活
性剤であるアデカト−ルＳＯ１２０を添加しなかった場
合には非特異的な凝集が認められ正確な測定ができなか
った。アデカト−ルＳＯ１２０の添加によってより正確
な測定が可能なことが確認された。

【００２１】実施例５．ブロック共重合体としてプルロ
ニックＦ１０８を使ったアポＡ−ＩのＴＩＡ０．９％Ｎ
ａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に２．０
重量％、または４．０重量％のプルロニックＦ１０８（
ワイアンドット・ケミカルズ製）を溶解した水溶液３２
０μｌ　に対し、アポＡ−Ｉ含有検体の希釈系列３μｌ
　を添加・混和し、５分間温置した。次いで抗ヒトアポ
Ａ−Ｉ血清含有ＨＥＰＥＳ緩衝液を８０μｌ　加え、添
加後５分間の３４０ｎｍにおける吸光度変化量（ΔＯＤ
）を測定した。抗ヒト・アポＡ−Ｉ血清は、常法により
アポＡ−Ｉをヤギに免疫し得られたものを用いた。測定
には日立７１５０形自動分析機を用いた。図５に示すよ
うに、プルロニックＦ１０８を用いることによって直線
性が著しく向上する。使用量に関しては、２．０重量％
の場合の比べ４．０重量％ではかなり高感度な分析が可
能となる。 また同時にプルロニックＦ１０８にかえてＰＥＧ６００
０を４．０重量％含む試薬を対照として同様の測定を行
って両者を比較したところ、図６に示すように本発明に
よる試薬が非常に良好な直線性を示したのに対して、対
照では高濃度域での直線性が不十分であった。更に４．
０重量％のＰＥＧを用いてプルロニックＦ１０８と同等
の直線性を得ようとする場合、２．５倍以上の抗血清濃
度を要した。プルロニックＦ１０８を用いることによっ
て抗血清使用量を大幅に減少することができることが証
明された。

【００２２】

【発明の効果】本発明によれば、低濃度域における感度
の改善のみならず、高濃度域での直線性が向上するので
、結果として従来のＴＩＡに比べ非常に広い濃度範囲の
測定が可能になる。ことに高濃度域での反応促進効果が
ＰＥＧと比較して穏やかなためにプロゾ−ン現象（分析
対象が試薬に対して過剰に存在する場合に観察される、
見かけの光学的測定値が低値を示す現象）を起こしにく
いので、従来は希釈が必要であった検体まで希釈するこ
となく測定することが可能となる。また本発明における
ブロック共重合体は、懸濁粒子の形成促進作用がＰＥＧ
よりも穏やかなため、非特異的な反応に対しても抑制効
果を持つ。

【００２３】更に本発明による試薬、ならびに分析方法
は、高感度化についてはデキストラン硫酸の併用によっ
て、また濁りの除去や非特異凝集防止については他の非
イオン系界面活性剤の併用によって更にその効果を増強
できる。ことに濁りの除去については、非イオン系界面
活性剤を単独で利用した場合よりもよい結果が得られる
。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１のアポＣ−ＩＩＩ　分析結果
を示すグラフである。縦軸は３４０ｎｍにおける吸光度
変化量（ΔＯＤ）を、横軸は検体の濃度を示す。

【図２】図２は、実施例２のＡＳＯ価分析結果を示すグ
ラフである。縦軸は３４０ｎｍにおける吸光度変化量（
ΔＯＤ）を、横軸は検体の濃度を示す。

【図３】図３は、実施例３のアポＢ分析結果を示すグラ
フである。縦軸は３４０ｎｍにおける吸光度変化量（Δ
ＯＤ）を、横軸は検体の濃度を示す。

【図４】図４は、実施例４のＣＲＰ分析結果を示すグラ
フである。縦軸は３４０ｎｍにおける吸光度変化量（Δ
ＯＤ）を、横軸は検体の濃度を示す。

【図５】図５は、実施例５におけるプルロニックＦ１０
８使用量とアポＡ−Ｉ分析結果の関係を示すグラフであ
る。縦軸は３４０ｎｍにおける吸光度変化量（ΔＯＤ）
を、横軸は検体の濃度を示す。

【図６】図６は、実施例５のアポＡ−Ｉ分析結果を示す
グラフである。縦軸は３４０ｎｍにおける吸光度変化量
（ΔＯＤ）を、横軸は検体の濃度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体を含むことを特徴とする免疫比濁
   分析用試薬 【請求項２】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体を反応の場に３〜１５重量％存在
   するように含むことを特徴とする請求項１の免疫比濁分
   析用試薬 【請求項３】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体の存在下で免疫反応を行わせるこ
   とを特徴とする免疫比濁分析方法 【請求項４】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体を反応の場に３〜１５重量％存在
   させることを特徴とする請求項３の免疫比濁分析方法【
   請求項５】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
   −ブロック共重合体とともにデキストラン硫酸およびキ
   レ−ト化合物の存在下で免疫反応を行わせることを特徴
   とする特許請求項３の免疫比濁分析方法。 【請求項６】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体とともにデキストラン硫酸０．０
   ０１〜１．０００重量％、およびキレ−ト剤０．１〜５
   ．０ｍＭ存在下で免疫反応を行わせることを特徴とする
   請求項５の免疫比濁分析方法 【請求項７】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体とともに非イオン系界面活性剤の
   存在下で免疫反応を行わせることを特徴とする請求項３
   の免疫比濁分析方法 【請求項８】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
   ン−ブロック共重合体とともに非イオン系界面活性剤０
   ．０１〜５．００重量％存在下で免疫反応を行わせるこ
   とを特徴とする請求項７の免疫比濁分析方法。