JPS5815738B2 - ケツエキシリヨウノニゴリ オ ゲンズル ホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、診断用試料を光学的に有効に決定で
きる状態にあるように処理する方法に関するものである
。

さらに詳しくは、本発明は、血清またはプラズマ試料を
ポリオキシエチル化されたラウリン酸化合物で処理して
、これら試料中の濁りを実質的に減することによってこ
れら試料を光学的に透明にする方法に関するものである
。

人間および動物の血流中に酵素および他の物質が高濃度
で存在することはしばしば成る機能不全および（または
）不調を指示するものである。

例えば、グルタミン・しゆう酸−トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）の高い濃度は重い心臓病患者の状態の重要な指
示である。

従って、体内におけるこの酵素の活性を決定することは
医者および病院職員にとって診断上の有用な手段でもあ
る。

一般に、心臓筋肉のどんな損傷でもこれがすでにあった
りまたは進行中である場合には、これはそれ自体ＧＯＴ
濃度の増大として表われる。

また、ＧＯＴの高い濃度は心臓病を指示するほかに肝硬
変、肝臓がんまたは肝炎のよのな肝臓の重い機能不全の
可能性をも指示する。

同様に、ＧＰＴの高濃度の存在は上記種類の肝臓機能不
全を表わす。

従って、肝臓病の予後および原因はＧＰＴの正確な決定
によって決められる。

上記の決定ならびに他の多くの決定においては、物理的
測定は比色計を使う光度測定によって行われる。

典型的には、比色計はフロー・セルと光電式検出器と光
源とを含む。

光電池は記録計を操作しそしてこの記録計のチャート上
に試料中の種種な物質の量が記録される。

この記録計には、種種な回路成分の抵抗可変装置を含む
零型電流比バランシング回路（ａ ｎｕｌｌ −ｔｙｐ
ｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｒａｔｉ。

ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｃｉｒｃｕｉｔ）によって操作さ
れる可動性の針があり、これによって分析記録は試料中
の種種な物質の量を直接に示す。

上記の酵素ＧＯＴおよびＧＰＴのほかに、光度測定によ
って分析することのできる血中に存在する他の物質には
ヘモグロビン、アルブミン、たん白質、ビリルビン、乳
酸塩デバイドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、
酸性ホスファターゼなどが含まれる。

本発明方法はさらにこれら物質の試験試料を光学的に透
明にするのに適用でき句実際に、本発明は比色方法によ
って分析する診断用試料を処理するために一般的に適用
できる。

光度分析は光散乱の原理に基づくから、試料が光散乱測
定を相殺するような不純物を含む場合には光学密度は誤
って決定されそして分析に誤りがあることは明白である
。

光散乱のゆがみをもたらす最大の原因は血液試料中の濁
りによる。

一般に、血清およびプラズマ試料中の濁りはトリグリセ
リドから主として成る脂質の存在による。

試料の濁りが増大すれば光学密度も増すから、疑わしい
結果が得られる。

さらに現在では複雑な診断上の測定は試料の連続流れに
ついて行なわれることが多いので、当分野でキャリー・
オーバー（ｃａｒｒｙ ｏｖｅｒ）と呼ばれる現象によ
って、濁りによる悪影響が累積してしまう。

キャリー・オーバーは、高度に濁った試料から少量であ
るが有意な汚染物の皮膜が分析系の管系内に付着する場
合に生ずる。

この管系内を次に通る試料はこの皮膜によって影響され
るから、この場合の読みは不正確になる。

今日までの所、試料の濁りの問題は希釈技術によって一
般に緩和されている。

これは、技術者が分析できるように濁りを十分に減する
べくその試料に希釈剤をさらに加える必要があることを
意味する。

この方法の主要な欠点はその主観性にあ句すなわち、そ
の十分であると考えられる量は各自の自由裁量に一任さ
れている（すなわち、診断試験における不明確な標準）
。

この希釈技術のさらにもう１つの欠点は記録された結果
に関するものである。

すなわち、過度の希釈に基づく結果は、一般的には満足
できるものであるとしても、偏差の余地が太きすぎてい
ることがあり、時を得た標準化を必要とすることがある
。

また、血液試料中の濁りを減するのに化学物質も使われ
ているが、本発明による特殊なポリオキシエチル化され
たラウリン酸成分の能力と同等のものはない。

従来使われている物質の例はラウリル硫酸ナトリウム、
アルキルアリールポリエーテルアルコール、スルホン酸
塩および硫酸塩ならびにヘキシトール無水物の脂肪酸部
分エステルのポリオキシエチレン誘導体を包含する。

なお、本発明では先に定義したラウリン酸化合物だけに
制限されることは興味がある。

すなわちその分子を僅かでも変化すると、その能力は非
常に低下するかまたは失われる。

例えば、そのラウリン酸部分の炭素鎖の長さを延長また
は短縮する場合には有効性が減少するかまたは失われる
。

また、２重結合または３重結合を挿入すると同様の結果
が観察される。

さらに、ポリオキシエチレン部分も非常に重要である。

すなわち、ｎの値が９より小さいかまたは２０より大き
い場合は有効性のより低い物質が生成される。

従って、本発明は、正確に分析できそして望ましくない
キャリー・オーバーを防止するために、血液試料中の濁
りを除去または実質的に減少することに係わるものであ
る。

すなわち、本発明は、血液試料を式 ％式％） （この式でｎは９〜２０の整数である） で表わされるポリオキシエチル化されたラウリン酸化合
物と上記試料が光学的に透明になるまで混合することか
ら成る光度分析用の血液試料中の濁りを減する方法に関
するものである。

本発明方法の好ましい具体化は次の点に特徴がある。

（５）式 （この式でｎは９〜２０そして好ましくは１４である） で表わされるポリオキシエチル化されたラウリン酸化合
物。

（Ｂ） 混合温変約３７℃。

（Ｃ） 上記ポリオキシエチル化されたラウリン酸化
合物を水溶液、食塩水中溶液または緩衝溶液として加え
、その量を全混合物の約０．５〜２０係（ｖ／ｖ）の範
囲とするが、１０係（ｖ／ｖ）が好ましい。

（Ｉ） 上記の方法を、光度測定によって物質を分相
する任意の診断方法に採用する。

血液試料中のＧＯＴおよびＧＰＴのような酵素を決定す
るには本発明による濁り減少方法が有利である。

本発明方法によれば、ＧＰＴおよびＧＯＴ以外に比色的
に測定できる他の酵素または物質例えはヘモグロビン、
アルブミン、たん白質、ビリルビン、乳酸塩デバイドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよび酸性ホスフ
ァターゼを含む試料を処理することができる。

本発明による分光光度分析用血液試料から濁りを実質的
に除去する方法は、血液試料と式（この式でｎは９〜２
０の整数である） で表わされるポリオキシエチル化されたラウリン酸化合
物とを、こうして得られる試料が最短時間内で光学的に
透明になるまで混合そしてかきまぜる混合段階から成る
。

既に述べたように、この濁りは脂質殊にトリグリセリド
の累積による最終結果である。

この不透明化のために、試料は比色的に決定する分析に
役立たない。

この濁りが除去されなければ、記録された結果は無意味
である。

普通分析する血液試料は血清またはプラズマ試料である
。

このような試料を光度分析する場合にはその濁りを除去
する必要がある。

本発明者は、式 （この式でｎは９〜２０好ましくは１４であるで表わさ
れる化合物を加えることによって、血液試料中の濁りを
容易にそして有効に除去できることを知った。

この化合物を一般に水性配合物の形で被験材料と混合す
る。

この水性配合物は水溶液食塩水中溶液または緩衝溶液で
あることができ、そのｐＨは３．５〜１１の範囲である
。

この緩衝溶液のｐＨは一般に約７である。

というのは、このｐＨで大抵の分析を行うからである。

しかし、酸性ホスファターゼの決定におけるように酸性
のｐＨで分析する場合には、くえん酸塩やりん酸塩のよ
うな酸性緩衝剤を使う。

反対に、アルカリ性ホスファターゼの決定におけるよう
に塩基性のｐＨを必要とする場合にはカフェインまたは
２−アミノ−２−メチルプロパツールのような塩基性緩
衝剤を使う。

ＧＯＴ 、ＧＰＴ 、ＬＤＨ、ヘモグロビン、アルブミ
ンおよびビリルビンを分析するには本質的に中性の溶液
を使う。

全混合物中のポリオキシエチル化されたラウリン酸化合
物の量は０．５〜２０％（ｖ／ｖ）の範囲であるが、１
０％（■／■）の濃度が好ましい。

前記混合段階を一般に約２０〜６０．５°Ｃで行うが、
３７°Ｃが最も好ましい。

こうして本発明方法によって濁りが実質的に除去された
試料は分光光度分析できる状態にある。

次に実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。

例１ 高脂肪血症のヒトの非常に濁った血清試料０．２ｍｌず
つ４本を、リン酸塩緩衝剤溶液（０，１Ｍ、１）Ｈ７６
４）中のポリオキシエチル化（ｎ＝１４）されたラウリ
ン酸の１，２，５および１０係（ｖ／ｖ）（全混合物に
対する濃度）溶液３．０ｍｌずつとそれぞれ混合する。

混合時間は約３７°Ｃで約１分間である。

この時間の後に、吸光度を測定する。

吸光度はギルフォード分光光度計を使い３４０ｎｍにお
ける値を測定する（この分光光度計は吸光度２．０まで
測定可能である）。

２，５および１０係溶液で処理した混合物の吸光度は０
．１８にまで減少した。

１％溶液で処理した混合物の場合は同じ混合時間内では
吸光度はこれらと同じ程度にまで減少しなかったが、さ
らに混合を続けるかまたは温度を上げるかすると、吸光
度は０．１８にまで減少した。

こうして、この後に行う試料中の分析成分たとえばＧＰ
Ｔの分析が妨害されない程度にまで、各試料の吸光度は
減少した。

例２ 高脂肪血症のヒトの非常に濁った血清試料０．２ｍｌず
つ３本を次の３種類の溶液［、（７） 、 （イ）およ
び（つ）〕３．０ｒｒＬｌずつと３７℃で１分間混合し
たのち、その溶液の３４０ ｎｍにおける吸光度をギル
フォード２６０分光光度計を使って測定する。

（７） リン酸塩緩衝剤溶液（０，１Ｍ、ｐＨ７，４
）これはコントロール用で界面活性剤を含んでいない〔
後記の溶液（イ）、（つ）の溶媒でもある〕。

この溶液（７）を使って前記のように混合処理した溶液
の吸光度は０．６６であった。

（イ）ポリオキシエチル化されたラウリルアルコールの
リン酸塩緩衝剤溶液 式 で表わされるアルコール〔商品名Ｂｒ１ｊ３５〕（ポリ
オキシエチル化されたラウリン酸と似た構造であるが、
エステル結合ではなくエーテル結合を持つ点で異なる）
を溶液（７）中に１０％（ｖ／ｖ−’）溶かした溶液を
使って同様な測定を行う。

得られた吸光度は０．５５であり、コントロールの溶液
（力と比べて、吸光度を有意に減少させるものではなか
った。

（勿 ポリオキシエチル化されたラウリン酸のリン酸塩
緩衝剤溶液 式 で表わされるポリオキシエチル化されたラウリン酸〔商
品名Ｐｅｇｏｓｐｅｒｓｅ〕を溶液（７Ｔ）中に□。

％（ｖ／ｖ）溶かした溶液を使って同様な測定を行う。

得られる吸光度は著しく低く、０．０９であった。

このように透明になった溶液はこの後にＧＰＴ活性につ
いてオートアナライザー■（米国テクニコン・インスト
ルメンツ・コーポレーションの商品名）で測定するのに
適している。

前記の溶液（７） 、 （イ）または（勿による混合物
処理を行なわないと、前記分光光度計では、測定可能な
吸光度の範囲からはみだすため吸光度を測定することが
できない。

例３ ポリオキシエチル化（ｎ＝１４）されたラウリン酸を例
２の溶液（７）中に１０ ％ （ｖ ／ ｖ ）溶かし
た溶液の代わりに、１％（ｖ／ｖ ）溶かした溶液を使
うことのほかは、例２の（１″７）と同じ操作を行う。

吸光度は０．１３２であった。

同じ血清試料を使い、ポリオキシエチル化されたラウリ
ン酸溶液の代わりにラウリル硫酸ナトリウムを水に３％
（Ｗ／Ｖ）溶かした溶液を使って同じ操作を行なう。

吸光度は０．９１６であって、有意な減少はおこらなか
った。

なお、ポリオキシエチル化（ｎ＝１４）されたラウリン
酸を例２の溶液（７）に１％（Ｖ／Ｖ）溶かした溶液だ
けの吸光度は０．０７０であり、ラウリル硫酸ナトリウ
ムを水に３％（ｗ／ｖ）溶かした溶液だけの吸光度は０
．０７１であった。

従って、これら溶液の溶媒および濃度の違いによる吸光
度への影響は無視できる。

例４ （ａ）濁った血清試料０．２ｍｌを、下記（１）のＧＰ
Ｔ検定用溶液中のポリオキシエチル化（ｎ＝１４）され
たラウリン酸の１０受（ｖ／ｖ ）溶液２．６ｍｌに加
え、さらに下記（２）のα−ケトグルタル酸溶液０．２
ｍｌを加えた。

これを約１分間３７°Ｃで混合した。

こうして透明になった試料の３４０ ｎｍにおける吸光
度をギルフォード２６０分光光度計で測定した。

吸光度は０．３５であった。（１）ＧＰＴ検定用溶液・
・・Ｌ−アラニン３．４ｇ。

ＮＡＤＨ２３■およびＬＤＨ１５２ユニットをリン酸塩
緩衝剤溶液（０，１Ｍ 、 ｐＨ７，４） １００−と
して含む溶液。

（２） ＱＣ−ケトグルタル酸溶液・・・遊離のα−
ケトグルタル酸３ｇを、リン酸塩緩衝剤溶液（０，１Ｍ
。

ｐＨ７，４） １００ｍｌとして含む溶液。

（ｂ）上記（１）のＧＰＴ検定用溶液の代わりに下記（
３）のＧＯ材灸定用溶液中にポリオキシエチル化（ｎ−
１４）されたラウリン酸を含む溶液を使うことのほかは
、（ａ）と同じ操作を行った。

吸光度は０．５１であった。

（３）ＧＯＴ検定用溶液・・・Ｌ−アスパラギン酸３．
８＆ 、 ＮＡＤＨ２３ｒｎ９およびＭＤＨ１５０−１
−ニット以上を、リン酸塩緩衝剤溶液（０，１Ｍ、ｐＨ
７，４） １００ｍｌとして含む溶液。

例５ 濁った血清試料の代わりに、ＧＰＴを含む濁った血しよ
う試料を使うことのほかは、例４の（ａ）と同じ操作を
行なった。

吸光度は０．４５であった。例６ 例４の（１）のＧＰＴ検定用溶液の代わりにＧＰＴ検定
用物質を含まない生理食塩水を使い、例４の（２）のα
−ケトグルタル酸溶液を加えないことのほかは、例４の
（ａ）と同じ操作を行った。

吸光度は０．０１であった。

例７ ポリオキシエチル化（ｎ＝１４）されたラウリン酸の代
わりに、ポリオキシエチル化（ｎ＝９）されたラウリン
酸を使い、３７°Ｃの代わりに２５℃で混合し、そして
例４の（２）のα−ケトグルタル酸溶液を加えないこと
のほかは、例４の（ａ）と同じ操作を行った。

吸光度は０．９１であった。ポリオキシエチル化（ｎ＝
１４）されたラウリン酸の代わりに、ポリオキシエチル
化（ｎ＝２０されたラウリン酸を使い、３７℃の代わり
３０℃で混合し、そしてα−ケトグルタル酸溶液を加え
ないことのほかは、例４の（ａ）と同じ操作を行つ誤吸
光度は０．５１であった。

例８ ３７℃の代わりに３０°Ｃおよび４５°Ｃで混合するこ
とのほかは、例４の（ａ）と同じ操作を行った。

吸光度はそれぞれ０．５０および０．４２であった。

以上、本発明の詳細な説明したが本発明の構成の具体例
を要約すれば次のようである。

（１）約２０〜６０．５℃で混合する前記特許請求の範
囲に記載の方法。

（２）３７℃で行う前項（１）に記載の方法。

（３）ポリオキシエチル化されたラウリン酸化合物を水
溶液として混合する前記特許請求の範囲に記載の方法。

（４）ポリオキシエチル化されたラウリン酸化合物を食
塩水中溶液として混合する前記特許請求の範囲に記載の
方法。

（５）ポリオキシエチル化されたラウリン酸化合物をｐ
Ｈ３，５〜１１の緩衝された溶液として混合する前記特
許請求の範囲に記載の方法。

（６）ポリオキシエチル化されたラウリン酸化合物を全
混合物中に１０％（■／■）の量で含む前記特許請求の
範囲に記載の方法。

（７）式 で表わされるポリオキシエチル化されたラウリン酸化合
物を使う前記特許請求の範囲に記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分析用の血清またはプラズマ試料を調製するにあた
   り、式 （この式でｎは９〜２０の整数である） で表わされるポリオキシエチル化されたラウリン酸化合
   物を全体の約０．５〜約２０ ％ （ｖ ／ ｖ ）の
   量存在させ、全体を混合して光学的に透明化することか
   ら成る、分析用の血清またはプラズマ試料中の濁りを減
   する方法。