DE2327894B2 - Verfahren zur Verminderung der Trübung in einer Serum- oder Plasmaprobe - Google Patents

Description

CH₃(CHj)₁₀ — C — O — (CH₈ — CH₂ — O)_nH

Ii

ο

worin η eine ganze Zahl von 9 bis 20 ist, vermischt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vennischen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 60,5⁰C und insbeson- ao dere bei 37° C durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung in Form einer Pufferlösung mit einem pH-Weit im Bereich von 3,5 bis 11, als wäßrige Lösung oder als Salzlösung eingesetzt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polyoxyäthylierte Laurinsäure in einer M;:nge verwendet wird, die etwa 0,5 bis etwa 20\olumprozent und insbesondere 10 Volumprozen der gesamten Gemischmenge ausmacht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung der Formel

CH₃(CH^₁₀ - C-O- (CH₂ - CH₂ - O —)_ltH verwendet.

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verringerung der Trübung in einer Serum- oder Plasmaprobe für die Analyse durch Vermischen der Probe mit einem nic!<tionischem Netzmittel.

Das Vorhandensein erhöhter Konzentrationen an Enzymen und anderen Materialien im menschlichen Und tierischen Blut ist häufig ein Anzeichen für be- »timmte Funktionsstörungen und andere abnorme Zustände. Beispielsweise ist die erhöhte Konzentration ■n Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) ein wichtiger Hinweis auf den Zustand von Patienten mit schweren Herzschädigungen. Daher ist die Bestimmung der Aktivität dieses Enzyms im Körper ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel für den Mediziner.

Wenn eine Schädigung des Herzmuskels stattgefunden hat oder stattfindet, so zeigt dies in einer Erhöhung der GOT-Konzentrationen. Erhöhte GOT-Konzentrationen signalisieren aber nicht nur Herzstörungen, sondern auch die Möglichkeit schwerer Leberdisfunktionen, wie beispielsweise Zirrhose, Leberkrebs oder Hepatitis.

In ähnlicher Weise ist die erhöhte Konzentration an Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) kennzeichnend für die beschriebenen Leberdisfunktionen. Demzufolge kann die Prognose und auch die Ursache von Lebererkrankungen durch eine genaue GPT-Bestimmung ermittelt werden.

Bei den genannten Bestimmungen wird die erforderliche physikalische Messung wie bei vielen anderen Bestimmungen fotometrisch mit einem Kolorimeter durchgeführt

Da die fotometrische Analyse von dem Prinzip der Lichtstreuung abhängt, ergibt sich für den Fall, daß eine Probe Verunreinigungen enthält, die die Lichtstreuungsmessungen kompensieren, daß die erhaltene Bestimmung der optischen Dichte und damit das Analysenergebnis verfälscht ist.

Die größte Fehlerquelle für die Messung der Lichtstreuung liegt in der Trübung innerhalb der Blutprobe. Ganz allgemein ist die Trübung im Serum und im Plasma auf die Anwesenheit von Lipiden zurückzuführen, die hauptsächlich aus Triglyceriden bestehen. Mit steigender Trübung steigt auch die optische Dichte an und führt zu einem fragwürdigen Meßergebnis.

Da gegenwärtig höchst komplizierte diagnostische Bestimmungen in einem kontinuierlichen Probenstrou durchgeführt werden, kumuliert sich außerdem die nachteilige Wirkung der Trübung durch Übertragung von Verunreinigungen, das sogenannte »carry over«. Eine derartige Übertragung von Verunreinigungen tritt auf, wenn eine stark trübe Probe eine dünne, jedoch nicht vernachlässigbare Schicht von Verunreinigungen im Röhrensystem der analytischen Vorrichtung ablagert. Die nächste Probe, die durch das Röhrensystem hindurchtritt, wird durch diese Schicht beeinflußt und die Ablesung ungenau.

Bisher hat man das Problem der Probentrübung gewöhnlich durch Verdünnungsmaßnahmen gemildert. Dies bedeutet, daß der Probe ein Verdünnungsmittel zugesetzt werden mußte, um die Trübung so weit zu verringern, daß die Analyse durchgeführt werden konnte. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens Hegt in der Subjektivität, mit der es ausgeführt wird. Der als ausreichend angesehene Betrag wird allein der Entscheidung eines Menschen überlassen, was für eine diagnostische Untersuchung von äußerst zweifelhaftem Weit ist. Ein weiterer Nachteil der Verdünnungstechnik hängt mit dem aufgezeichneten Ergebnis zusammen. Eine Überverdünnung führt nämlich zu einem Ergebnis, das zwar allgemein befriedigend ist, jedoch Abweichungen zu viel Raum läßt, und es kann eine rechtzeitige Standardisierung erforderlich sein.

Zur Verringerung der Trübung in Blutproben sind auch schon chemische Substanzen verwendet worden, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat, Alkylarylpolyätheralkohole, Sulfonate und Sulfate sowie Polyoxyäthylenderivate von partiellen Estern von Hexitanhydriden mit Fettsäuren. Diese Stoffe sind jedoch in ihrer Wirkung nicht ausreichend.

Weiter ist aus der Literaturstelle H. U. B e r gm e y e r, 2. Auflage 1970, Band 1 S. 547 bis 549 und 759 bis 763, die Verwendung von polyäthoxyliertem Laurinalkohol zur Trübungsverminderung in Blutproben bekannt. Wie jedoch die im Anschluß an die Beispiele aufgeführter. Vergleichsversuche zeigen, sind auch diese polymeren Substanzen in ihrer trübungs-

«enkenden Wirkung nicht zufriedenstellend, obwohl Die Analyse von GOT, GPT, LDH, Hämoglobin,

rie strukturell den erfinduo^gemäß eingesetzten nahe- Albumin and Bilirubin wird in praktisch neutralen

«tehen. Lösungen durchgeführt

Aufgabe der Erfindung ist daher die Beseitigung Das Vermischen von Probe und polyoxyäthylierter oder beträchtliche Verringerung der Trübung in Blut- S Laurinsäure wird gewöhnlich in einem Temperaturproben, so daß genaue Analysen ermöglicht werden bereich von 20 bis etwa 60,5⁰C durchgeführt, wobei und eine unerwünschte Übertragung von Verunreini- eine Temperatur von 37° C bevorzugt wird gungen vermieden wird. Die Proben, in denen die Trübung nach dem erfin-

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren des ein- dungsgemäßen Verfahren praktisch beseitigt worden

gangs genannten dadurch gelöst, daß man die Probe io ist, lassen sich der spektrofotometrischen Analyse

mit einer polyoxyäthylierten Laurinsäureverbindung unterwerfen, der Formel

Beispiel I

CH₃(CHj)₁₀ — C — O — (CH₂ — CHj — O)_nH 15 0,2 ml einer trüben Serumprobe wurden mit 3,0 ml 1! einer lOvolumprozentigen Lösung von polyoxyäthy-

O lierter Laurinsäure (n = 14) in 0,lmolarem Phosphat

puffer vom pH-Wert 7,4 vermischt. Das Vennischen dauerte etwa 1 min bei einer Temperatur von 37° C, worin η rine ganze Zahl von 9 bis 20 ist, vermischt. ^ao danach wurde die GPT-Aktivität der optisch geklärten

Bevorzugte Durchführungsformen des erfindungs- Probe im Autoanalyzer bestimmt,
gemäßen Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet, Wurden 0,2 ml der gleichen Serumprobe ohne vor-

daß eine polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung der herige Behandlung analysiert, bewegte sich der obigen Formel verwendet wird, bei der « 14 ist; eine Schreibstift von der Anzeigefläche auf einen Wert Mischtemperatur von etwa 37° C eingehalten wird und ²5 jenseits einer meßbaren Absorption,
die polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung in Form

einer wäßrigen, salzhaltigen oder Pufferlösung züge- Beispiel II

setzt wird, wobei ihre Menge im Bereich von etwa 0,5

bis etwa 20 Volumprozent und insbesondere 10 Vo- Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit vergleich-

lumprozent des Gesamtgemisches liegt. 3o baren Ergebnissen für die GOT-Bestimmung wieder-

Die Bestimmung von Enzymen, wie GOT und GPT, holt,
in Blutproben bedient sich mit Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verringerung der Trübung. Beispiel III

Außer GPT und GOT können andere Enzyme oder

Substanzen, wie Hämoglobin, Albumin, Prctein, 35 Das Verfahren von Beispiel I wurde mit einer trüben Bilirubin, Lactatdehydrogenase, alkalische und saure Piasmaprobe mit vergleichbaren Ergebnissen wieder-Phosphatase, die kolorimetrisch bestimmbar sind, holt.

nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Proben Beispiel IV

bestimmt werden.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah- 40 Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abrens wird nach dem Vermischen der Blutpnbe mit der weichung wiederholt, daß die polyoxyäthylierte Lauobengenannten polyoxyäthylierten Laurinsäurekompo- rinsäure (« = 14) in Form einer Salzlösung vorlag, nente anschließend zweckmäßigerweise gerührt, bis Es wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt,
die Probe optisch klargeworden ist; dies geschieht
in einer äuüerst geringen Zeit. *5

Wie bereits erwähnt, ist die Trübung das Ergebnis Vergleichsversuche

einer Anhäufung von Lipiden, hauptsächlich von

Triglyceriden. Wegen der dadurch hervorgerufenen Bei Vergleichsversuchen zwischen den anmeldungs-

Lichtundurchlässigkeit eignet sich die Probe nicht für gemäß verwendeten polyäthoxyliercen Laurinsäurekolorimetrische Bestimmungen, da das gemessene 5<> Verbindungen und dem aus der obenerwähnten Lite-Ergebnis unbrauchbar ist, wenn die Trübung nicht nturstelle bekannten Produkt »Brij 35« (polyäthoxybeseitigt wurde. lierte Laurinalkohole) sowie einem weiteren, aus der

Die normalerweise analysierten Blutproben sind US-PS 32 60 648 bekannten ungesättigten Produkt entweder Serum- oder Plasmaproben. wurde derart vorgegangen, daß zunächst das Spektro-

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwen- 55 fotometer mit Luft bei 340 nm auf 0 eingestellt, dete polyoxyäthylierte Laurinsäure kann in Form danach in die Küvette eine bestimmte Menge des zu einer wäßrigen Lösung, einer Salzlösung oder einer untersuchenden Trübungsverringerers (angegeben in Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bis 11 vor- Volumprozent) einpipetiert und die dadurch erhaltene liegeii. Im allgemeinen beträgt der pH-Wert der ge- Absorption abgelesen, daß drittens jeweils eine Menge pufferten Lösung etwa 7, da bei diesem pH-Wert die ⁶° von 2,0 ml stark trüben Serumgemisches zugegeben meisten Analysen durchgeführt werden. Wenn jedoch und unmittelbar darauf bei der Zeit t = 0 die Absorpdie Analyse einen sauren pH-Wert verlangt, wie bei tion abgelesen und schließlich nach 5 min (i = 5) der Bestimmung der sauren Phosphase, wird ein saurer erneut die Absorption abgelesen wurde.
Puffer, wie Citrat oder Phosphat, verwendet. Wenn Die Ergebnisse für die Versuchsmaterialien gemäß

andererseits ein basischer pH-Wert erforderlich ist, 65 dem Stand der Technik und zwei der Verbindungen, wie bei der Bestimmung der alkalischen Phosphatase, wie sie anmeldungsgemäß verwendet werden (n = 9 wird ein basischer Puffer, wie Koffein oder 2-Amino- und η = 14), sind in der folgenden Tabelle zusammen-2-methylpropanol, verwendet. gestellt:

Konzen- Absorptionen

tration des <}_{κ re}inen der Svumprobe

Versuchs- Versuchs- zur Zeit

materials Materials
in Volumprozent / = ο i = 5 min %Änderuflg

(A) Brij 35

CH₃(CHj)₁₁ — O — (CH₈ — CH, — O)₂₃H

(B) Polyoxyäthylierte Laurinsäure (9 METO)
CH₃(CHj)₁₀ — C — O — (CHi — CH_tO)_eH

3,0 0,048 1,319 1,307 — I

1,0 1,757 — 1,776 *)

(Q Polyoxyäthylierte Laurinsäure (14 METO)
CH₃(CHj)₁₀ — C — O — (CH₈CH, — O)₁₁H

Il

1,0

0,070 — 0,132 ♦)

= CH(CHs)₇C-O(CHsCHsI-O)₉H 0,2

1,22 1,84 18O₁

nach US-PS 32 60 648

·) Anmetkung für die Tabelle: Für die Substanz Brij 35 betrug die Verringerung der Trübung 1 %. Für die Verbindungen B und C war die Verringerung zur Zeit I = 0 trotz ihres Einsatzes mit geringeren Konzentrationen derart rasch erfolfet, d. h., die Absorption hatte derartig schnell abgenommen, daß zur Zeit t = 0 eine genaue Messung nicht vorgenommen werden konnte. Man erkennt aber zumindestens bei der Substanz B, daß die Absorption nach t = 5 min seit Zugabe der Serumprobe fast den gleichen niedrigen Wert besaß wie die Absorption des reinen Versuchsmaterials vor Zugabe des trüben Serums. Für die Probe C ergab eine kompliziertere Messung eine Trübungsänderung von —86,3%.

Als Serum wurde in sämtlichen Fällen eine Probe der gleichen Serumcharge von auf Grund von Hyperlipidämie getrübtem Serum verwendet.

Aus den Versuchen ergibt sich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen trotz Einsatzes in geringeren Konzentrationen die Trübung einer Serumprobe wesentlich rascher und vollständiger verringern als sowohl die als Vergleichssubstanz herangezogene Verbindung Brij 35 wie auch mehr als 100 weitere untersuchte Verbindungen, darunter auch die als Verbindung D in der Tabelle angeführte Verbindung gemäß der US-PS 32 60 648, bei der die höchstkonzentrierte brauchbare Lösung wegen der starken Eigentrübung des Präparats nur 0,2 Volumprozent betrug, was jedoch dadurch korrigiert wurde, daß nur 0,2 ml getrübtes Serum zugegeben wurden.

Sämtliche Versuche wurden bei 37,5° C in einer O.lmolaren Phosphatpufferlösung vom pH = 7,4 so durchgeführt.

Beispiel V

Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß statt der polyoxyäthylierten Laurinsäure mit η = 14 analoge Verbindungen mit « = 9 und η — 20 verwendet wurden. Es wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten.

Beispiel VI

Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß das Vermischen bei 30 bzw. 45° C durchgeführt wurde.

B e i s ρ i e 1 VII

Eine trübe Serumprobe, die auf alkalische Phosphatase hin analysiert werden sollte, wurde praktisch so behandelt, wie in Beispiel I beschrieben, mit der Abweichung, daß statt des Phosphatpuffers isin Aminomethylpropanolpuffer verwendet wurde, der einen pH-Wert von 10,25 herstellte.

Beispiel VIII

Eine trübe Serumprobe, die auf saure Phosphatase hin analysiert werden sollte, wurde im wesentlichen, wie in Beispiel I beschrieben, behandelt, mit der Abweichung, daß statt des Phosphatpuffers ein Citratpuffer, der einen pH-Wert von 6,0 ergab, verwendet wurde.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Verringerung der Trübung in einer Serum- oder Plasmaprobe für die Analyse durch Vermischen drr Probe mit einem nichtionischen Netzmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einer polyoxyäthylierten Laurinsäureverbindung der Formel