DE2136069C3 - Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Glucose - Google Patents

Description

3 4

Form einer gemeinsamen I ösung zugesetzt einer wäßrigen Lösung von 0,2 bis 1 mMol Neo-

werden. cuproin, 0,2 bis 1 mMol Kupfersulfat, 2 bis 6 mMol

Bei Verwendung eines Analysenautomaten, der von Uranylacetat sowie gegebenenfalls Kochsalz auf einen

der Firma Technicon unter der Bezeichnung »Auto Gesamtsalzgehalt von 0,5 bis 1,5%. Bei Anwendung

Analyzer« vertrieben wird, wird üblicherweise Vollblut 5 letzteren Mittels wird durch die erhöhte Ionenakti-

mit einer wäßrigen Lösung eines Antikoagulans ver- vität das Eiweiß in besonders leicht entfernbarer Form

dünnt und ein aliquoter Teil der verdünnten Lösung denaturiert.

als Probe eingesetzt. Die Abtrennung der Eiweißstoffe Ein Beispiel für das besonders bevorzugte Mittel ist erfolgt im Gerät mittels Dialyse. In diesem Fall können eine wäßrige Lösung, die 15 mg Neocuproin · HCl, Neocuproin und Kupfersalz dei Antikoagulans-Lö- io 15 mg Kupfersulfat · 5 H₂O sowie gegebenenfalls sung zugesetzt werden. Gegenüber der bisherigen 160 mg Uranylacetat und 900 cag Natriumchlorid in Methode, bei welcher Blutproben im allgemeinen mit 100 ml enthält. Es handelt sich hierbei um eine schwachphysiologischer Kochsalzlösung verdünnt werden, der gelbgefärbte Lösung, die eine rasche Enteiweißung und Fluorid oder Heparin zugesetzt wurden, sind keinerlei Entfernung reduzierender Substanzen ermöglicht, zusätzliche Verfahrensschritte notwendig, wenn Koch- 15 Zweckmäßig wird dieses Ziel erreicht, indem die salz, Fluorid bzw. Heparin, Neocuproin und Kupfer- Probelösung mit etwa V10 Volumen der eiweißhaltigen salz in Form einer gemeinsamen Lösung zugesetzt Glucoselösung, beispielsweise also Serum, gemischt werden. wird. Das denaturierte Protein wird dann abfiltriert

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise oder abzentrifugiert, und von dem gewonnenen klaren so durchgeführt, daß je 0,05 bis 2 mMol Neocuproin «o Überstand oder Filtrat wird eine bestimmte Menge, und Kupfersalz je 1 der Lösung, in der die Bestimmung beispielsweise 0,05 bis 0,20 ml, im weiteren Testansatz durchgeführt wird, eingesetzt werden. Besonders gute eingesetzt. Bei diesem Testansatz werden die in den Ergebnisse wurden mit je 0,2 bis 1 mMol/1 erzielt. Falls Gleichungen 1 und 2 angegebenen Substanzen Glucosegleichzeitig ein Uranylsalz, vorzugsweise Uranyl- oxydase, Peroxydase, Chromogen sowie Puffersubacetat, verwendet wird, beträgt dessen Menge zweck- as stanzen zur Aufrechterhaltung eines konstanten mäßig 0,5 bis 10, vorzugsweise 2 bis 6 mMol/1. Falls pH-Wertes eingesetzt. Man erhält so eine je nach gleichzeitig ein Antikoagulans, vorzugsweise Natrium- Höhe der Glucosekonzentration mehr oder weniger fluorid, verwendet wird, beträgt dessen Menge zweck- stark gefärbte Lösung. Die Farbintensität wird nach mäßig 10 bis 30, vorzugsweise 25 mMol/1. etwa 20 bis 50 Minuten, wenn die Reaktion vollständig

Das erfindungsgemäße Verfahren wird am ein- 30 abgelaufen ist, in einem geeigneten Photometer ge-

fachsten so durchgeführt, daß einer Lösung, die messen und durch Vergleich mit einer Standardlösung

Neocuproin, Kupfersalz und gegebenenfalls Uranyl- von bekanntem Glucosegehalt der Glucosegehalt der

salz in den angegebenen Mengen enthält, eine kleine Probe berechnet.

Menge der zu untersuchenden Glucoselösung züge- Ein Beispiel für das besonders bevorzugte Mittel bei setzt, gegebenenfalls vom denaturierten Eiweiß in 35 Verwendung des Analysenautomaten ist eine wäßrige üblicher Weise, beispielsweise durch Zentrifugieren, Lösung, die 15 mg Neocuproin · HCl, 15 mg Kupfergetrennt wird und von der so erhaltenen Lösung, also sulfat · 5 H₂O, gegebenenfalls 100 mg Natriumfluorid dem klaren Überstand bzw. Filtrat, eine bestimmte und 900 mg Natriumchlorid in 100 ml enthält. Es Menge in üblicher Weise für die Glucosebestimmung handelt sich hierbei um eine schwachgelbgefärbte eingesetzt wird. Bei Verwendung des Analysenauto- 40 Lösung. Zur Anwendung wird die Probelösung mit maten wird der Antikoagulans enthaltenden Neo- etwa ¹I₁₀ Volumen der eiweißhaltigen Glucoselösung, cuproin-Kupfersalz-Lösung eine kleine Menge der zu beispielsweise also Serum oder Vollblut, gemischt. untersuchenden GIucose-Lösung zugesetzt. Eine ali- Von der erhaltenen Mischung wird eine bestimmte quote Menge der Mischung wird unmittelbar im Auto- Menge, beispielsweise 0,1 bis 0,4 ml, vom Automaten maten gemessen. 45 eingezogen. Im Automaten erfolgt mittels Dialyse die

Als zweiwertiges Kupfer enthaltendes Salz eignen Trennung von Glucose und Eiweiß sowie anschließend sich die wasserlöslichen Kupfersabc, deren Anion die enzymkatalysierte Reaktion von Glucose mit im Rahmen der Reaktion nicht stört Heispiele hierfür Sauerstoff, verbunden mit der vom Chromogen hersind die Kupferhalogenide, Kupfernitrat sowie Kupfer- rührenden Farbentwicklung,
sulfat, welches bevorzugt wird. so Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine

Unter den Uranylsalzen wird wegen seiner kommer- Glucosebestimmung in Gegenwart reduzierender Sub-

ziellen Vorteile das leicht zugängliche Uranylacetat stanzen auf einfache Weise und mit hoher Genauig-

bevorzugL Es können aber auch andere Uranylsalze keit. Die erhaltenen Werte stimmen sehr gut mit den

mit nicht störendem Anion, beispielsweise Uranyl- nach der Hexokinasemethode erhaltenen Werten

sulfat, Uranylhalogenid oder Uranylnitrat sowie die 55 überein. Die Durchführung des Verfahrens ist jedoch

Uranylsalze anderer organischer Säuren verwendet wesentlich einfacher als bei der Hexokinasemethode.

werden. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

Unter den Antikoagulantien wird wegen seiner weiter.
kommerziellen Vorteile das leicht zugängliche Natriumfluorid bevorzugt. Es können aber auch andere ^6o Beispieleibis 12
Antikoagulantien wie Heparin, Citrat, Oxalat,
Äthylendiamin-tetra-acetat verwende» werden. 0,1 ml Vollblut mit den in der nachstehenden Tabelle

Ein Mittel zur Durchführung a'es erfindungsge- angegebenen wechselnden Harnsäurewerten wurden mäßen Verfahrens besteht aus einer wäßrigen Lösung mit je 1,0 ml einer Lösung, die 15 mg Neocuproin-

mit einem Gehalt von 0,05 bis 2 mMol Neocuproin, 65 hydrochlorid, 15 ml Kupfersulfatpentahydrat, 160 mg

0,05 bis 2 mMol Kupfer(II)-salz sowie gegebenenfalls Uranylacetat und 900 mg Natriumchlorid je 100 ml

0,5 bis 10 mMol Uranylsalz. Gemäß einer besonders enthielt, gemischt. Das denaturierte Protein wurde

bevorzugten Ausführungsform besteht das Mittel aus abzentrifugiert. Vom klaren Überstand wurden 0,20 ml

in üblicher Weise zur Durchführung der GOD-Methode verwendet.

In einer Parallelbestimmung wurde das gleiche Verfahren durchgeführt, jedoch der Zusatz an Neocuproin und Kupfer(ll)-salz weggelassen. In einer dritten Vergleichsversuchsreihe wurden die Proben nach der Hexokinasemethode bestimmt. Die Ergebnisse der Versuche zeigt die folgende Tabelle.

	Harn	a)	b)	c)
	säure	Glucose		Ent- eiweißung
Beispiel		nach HK-	Erfin-	ohne
		Methode1)	dungs-	Entfernung
	mg/100ml	mg/100 ml	gemäO	der redu
	Probe	(Vergleich)		zierenden
	3,9			Substanzen
1	4,0	127	127	119
2	4,3	138	135	132
3	5,9	87	85	77
4	7,1	67	65	58
5	9,3	95	93	84
6	10,9	105	107	90
7	13,7	88	90	70
8	14,1	93	90	73
9	15,1	110	105	89
10	14,0	115	113	92
11	12,0	99	92	77
12	105	103	87

·) = Hexokinase-Methode.

Beispiel 13

5 Blutproben von gleichem Glucosegehalt, aber von verschiedenem Harnsäuregehalt, wurden einmal ohne Kupfer-Neocuproin-Zusatz (Proben 1, 2, 3, 4, 5) und einmal mit Kupfer-Neocuproin-Zusatz (Proben 1", 2~, 3-, 4~, 5~) am Analysenautomaten, analysiert. Die Zeichnung gibt die Registrierkurve der Messung wieder, die Gipfelhöhe ist ein direktes Maß des Glucosegehaltes der Probe.

Probe St. ist ein Eichstandard, Proben 1 und Proben 1- sind identisch und haben keinen Harnsäure-(HS)-Zusatz.

Es ist deutlich erkennbar, daß ohne Zusatz von Kupfer-Neocuproin-Reagens zur Probe um so weniger Glucose gemessen wird, je mehr Harnsäure in der Probe enthalten ist. Beim Zusatz von Kupfer-Neo-♦o cuproin-Reagens tritt der Effekt nicht ein, es wird stets die gesamte Glucosemenge gemessen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

1. Ein insbesondere bei Untersuchung von Körper-Patentansprüche: flüssigkeiten, z. B. Vollblut, Serum, Plasma, auftretender Nachteil dieser Bestimmung besteht darin,

   5 Verfahren zur optischen Bestimmung von daß stark reduzierende Substanzen, wie Harnsäure, Glucose in wäßriger Lösung mittels Glucoseoxy- 5 Vitamin C, Glutathion usw., erheblich stören. Der- «iase, Peroxydase und ABTS als Chromogen in artige reduzierende Substanzen verbrauchen nämlkh Gegenwart von reduzierenden Substanzen, d a- einen Teil des nach Reaktion 1 gebildeten Wasserstoffdurch gekennzeichnet, daß der glu- peroxyds, so daß dieses nach Reaktion 2 nicht mehr in cosehaltigen Lösung vor Zugabe der Enzyme einer der Glucosekonzentration äquivalenten Menge Neocuproin und ein zweiwertiges Kupfer ent- io zur Verfügung steht und daher zu geringe Glucosebaltendes Salz zugesetzt wird. konzentrationen gefunden werden. Denn das Chro-
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- mögen DH als gefärbte Substanz, deren Konzentration teichnet, daß zusätzlich ein Uranylsalz, insbeson- optisch bestimmt wird, bildet sich aus einer farblosen dere Uranylacetat, zugesetzt wird. Form DH₂ natürlich nur in dem Maße, wie H₂O₂ für
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 15 diese Reaktion zur Verfügung steht.

   zeichnet, daß zusätzlich ein Antikoagulans, ins- Aus der USA.-Patentschrift 3 411 887 ist bereits ein

   besondere Natriumfluorid, zugesetzt wird. Verfahren zur Bestimmung von Glucose mit Glucose-
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, oxydase und Peroxydase sowie Orthotoluidin als Farbdadurch gekennzeichnet, daß bei Bestimmung in reagens bekannt, bei welchem störende reduzierende Körperflüssigkeiten je 0,05 bis 2, vorzugsweise 0,2 ao Begleitstoffe durch Zusatz von Mercuriacetat ausgebis 1 mMol/1 Neocuproin und Kupfersalz zugesetzt schaltet werden sollen. Versuche haben jedoch gezeigt, werden. daß sich auf diese Weise die in der Praxis wichtigsten
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch Störungen durch Harnsäure und Ascorbinsäure nicht gekennzeichnet, daß 0,5 bis 10, vorzugsweise 2 bis ausschalten lassen.

   6 mMol/1 Uranylsalz zugesetzt werden. »5 Bei Verwendung von 2,2'-Azino-di-(3-äthylbenzthia-
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch zolon)-6'-sulfonat (ABTS) als chromogener Substanz gekennzeichnet, daß 10 bis 30, vorzugsweise DH₂ tritt eine weitere Störung durch die reduzierenden 25 mMol/1 Natriumfluorid zugesetzt werden. Substanzen dadurch ein, daß das gefärbte Chromogen-
7. 7. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach reaktionsprodukt DH, ein Radikalkation, wieder durch Anspruch 2, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß 30 die reduzierenden Substanzen zu der Form DH, unter es in wäßriger Lösung 0,05 bis 2 mMol/1 Neo- teilweise Entfärbung reduziert wird. Hieraus resultiert cuproin, 0,05 bis 2 mMol/1 Kupfer(II)-salz und wiederum eine zu geringe Bestimmung der Glucosegegebenenfalls 0,5 bis 10 mMol/1 Uranylsalz ent- konzentration, die sich mit dem Fehler durch direkte hält. Reaktion von H₂O₂ mit den reduzierenden Substanzen
8. 8. Mittel nach Anspruch 7, bestehend aus einer 35 addiert.

   wäßrigen Lösung von 0,2 bis 1 mMol/1 Neocuproin, Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde,

   0,2 bis 1 mMol/1 Kupfersulfat, 2 bis 6 mMol/1 die GOD-Methode bei Verwendung von ABTS als Uranylacetat und gegebenenfalls Kochsalz auf Chromogen so zu verbessern, daß die reduzierenden einen Gesamtsalzgehalt von 0,5 bis 1,5% . Substanzen das Meßergebnis nicht mehr nachteilig
9. 9. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach 40 beeinflussen können.

   Anspruch 3, 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß da-

   es in wäßriger Lösung 0,05 bis 2 mMol/1 Neo- durch, daß der glucosehaltigen Lösung vor Zugabe der

   cuproin, 0,05 bis 2 mMol/1 Kupfer(II)-salz und Enzyme Neocuproin und ein zweiwertiges Kupfer ent-

   gegebenenfalls 10 bis 30 mMol/1 Natriumfluorid haltendes Salz zugesetzt wird,

   enthält. 45 Es wurde überraschend gefunden, daß bei Anwen-
10. 10. Mittel nach Anspruch 9, bestehend aus einer dung des obengenannten Verfahrens die störenden wäßrigen Lösung von 0,2 bis 1 mMol/1 Neo- Einflüsse von reduzierenden Substanzen beseitigt cuproin, 0,2 bis 1 mMol/1 Kupfersulfat, 10 bis werden und die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der 30 mMol/1 Natriumfluorid und 150 mMol/1 Na- GOD-Methode deutlich verbessert wird. Dies war triumchlorid. 50 nicht zu erwarten, da Kupferionen zusammen mit

    Neocuproin ein bekanntes Mittel zur Oxydation von

    Glucose zu Gluconsäure darstellen und daher zumindest eine Verringerung der gefundenen Glucose-

    Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel werte zu befürchten war.

    lur optischen Bestimmung von Glucose in wäßriger 55 Falls eiweißhaltige Probelösungen zur Glucose-Lösung mittels Glucoseoxydase, Peroxydase und bestimmung eingesetzt werden, muß eine Enteiweißung ABTS als Chromogen in Gegenwart von reduzierenden vor Durchführung der Bestimmung erfolgen. Gemäß Substanzen. einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung

    Die unter der Bezeichnung »GOD«-Methode be- werden die Enteiweißung und die Entfernung der redukannte Bestimmung verläuft im Prinzip nach folgenden 60 zierenden Substanzen gleichzeitig durchgeführt, indem Gleichungen: zusätzlich ein Uranylsalz, insbesondere Uranylacetat,

    zugesetzt wird. Bei dieser Ausführungsform der Erfin-

    niii^ncp α. η j- η π . r,iiirr.nQäiin» 4- H π ^dun8 ^werden die störenden reduzierenden Substanzen

    IjIucof^ ■+· U₂ -+- HnC > oiuconsaure ■+- n.«u» , . , ... _. .„ .· . _ _,

    ²² J° gleichzeitig mit dem Eiweiß entfernt, so daß gegenüber

    ' ) 65 der bisherigen Methode, bei der im allgemeinen durch

    POD Zusatz von Trichloressigsäure enteiweißt wurde,

    H₂O₂ + DH₂ > DH + H₂O keinerlei zusätzliche Verfahrensschritte erforderlich

    farblos gefärbt (2) sind, wenn Neocuproin, Kupfersalz und Uranylsalz in