DE69233487T2

DE69233487T2 - Test zur schnellen Bestimmung von ischämischen Zuständen und Testsatz dafür

Info

Publication number: DE69233487T2
Application number: DE69233487T
Authority: DE
Inventors: David Bar-Or; Clive Solomons
Original assignee: Ischemia Technologies Inc
Current assignee: Ischemia Technologies Inc
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2012-07-11
Also published as: EP0596925A4; EP0596925A1; KR100239947B1; NO940256D0; CA2113266A1; IE922421A1; AU2318792A; CA2113266C; ES2239753T3; NO313900B1; DE69233757D1; PT100724A; AU1000697A; BR9206312A; JPH06509645A; DK0596925T3; CA2520598A1; EP1411356A3; EP1411356A2; EP0596925B1

Description

Gebiet der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Schnellverfahren zur Detektion von ischämischen Zuständen sowie ein Set zur Verwendung in einem solchen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Messung von proteingebundenen Thiol-(SH-)Gruppen, um das Vorliegen oder Nichtvorliegen von Ischämie zu bestimmen.
Stand der Technik
Eine fortschreitende Herzkranzgefäßerkrankung kann bereits weit vorangeschritten sein, ohne dass dabei nennenswerte klinische Symptome, wie etwa Brustschmerz oder Atemnot, auftreten. Der plötzliche Verschluss eines Asts einer Koronararterie, der zu einem Myokardinfarkt (MI) führt, signalisiert auf dramatische Art und Weise das Vorliegen einer langjährigen Erkrankung der Arterienwand, wie etwa Verkalkung der Intima und Wand, sowie eine fortgeschrittene Stenose des Arterienlumens.
Unmittelbar nach einem ischämischen Herzvortall werden Proteine in das Blut freigesetzt. Allgemein bekannte Proteine, die nach einem ischämischen Herzvorfall freigesetzt werden, umfassen Creatin-Kinase (CK), Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (SGOT) und Lactat-Dehydrogenase (LDH). Ein allgemein bekanntes Verfahren zur Beurteilung des Auftretens zurückliegender ischämischer Herzanfälle ist die Detektion dieser Proteine im Blut des Patienten. Die US-A-4.492.753 betrifft ein ähnliches Verfahren zur Einschätzung des Risikos zukünftiger ischämischer Herzanfälle. Verletztes Herzgewebe setzt sowohl nach ischämischen als auch nach nicht-ischämischen Anfällen Proteine in den Blutstrom frei.
Patienten, die einer nichtkardialen Operation unterzogen werden, können ebenfalls an perioperativer Ischämie erkranken. Elektrokardiogramme solcher Patienten weisen Verschiebungen des ST-Segments auf, die auf einen ischämischen Vorfall zurückzuführen sind und mit dem Auftreten postoperativer unerwünschter Herzvorfälle in engem Zusammenhang stehen. Veränderungen des ST-Segments treten jedoch auch ohne Vorliegen von Ischämie auf, womit dieses Verfahren nicht zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Anfällen unterscheidet.
Ischämie wird häufig durch Arteriengefäßerkrankungen verursacht. Ein Merkmal von Arteriengefäßerkrankungen ist das Voranschreiten einer Atheromatose zu einer Sklerose, wobei es zum Eintritt großer Mengen an Calcium in die Arterienmuskulatur kommt. Im Laufe der Zeit entwickelt sich Arteriosklerose. Die Menge an intrazellulärem Calcium erhöht sich, während die Herzleistung im Grunde normal bleibt. Das intrazelluläre Calcium aktiviert die Protease Calpain, welche Xanthin-Dehydrogenase zu Xanthin-Oxidase umsetzt. Xanthin-Oxidase wirkt auf Xanthin und Hypoxanthin ein, um freie Radikale, einschließlich des Hydroxylradikals (OH·) und des Superoxidradikals (O₂·), zu bilden. Diese Radikale oxidieren ihrerseits Zellmembranen und Proteine in jenen Bereichen von Molekülen, die reich an Thiolgruppen sind. Siehe "The Role of Perfusion – Induced Injury in the Pathogenesis of the Crush Syndrome", New Engl. J. Med. 324, 1417–1422 (1991).
Es besteht Bedarf an einem Verfahren, das zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Vorfällen, insbesondere bei Herzpatienten, unterscheidet. Nach umfangreichen Forschungen wurde das auf metallproteinbindenden Wechselwirkungen basierende vorliegende Verfahren entdeckt, wodurch die Detektion von ischämischen Zuständen oder Vorfällen bei Patienten ermöglicht wird.
Es ist allgemein bekannt, dass Metallionen fähig sind, sich an metallbindende Gruppen in Proteinen zu binden ("Multiple Equilibria in Proteins", J. Steinhardt und J. Reynolds, Acad. Press, CH-VI, S. 214ff). Metallionen können kovalente Bindungen mit Proteinen oder alternativ dazu Koordinationskomplexe bilden, worin die Metallionen durch Liganden der Proteinmoleküle chelatiert werden (Enzyme and Metabolic Inhibitors, Bd. II, J. L. Webb, (1966), Acad. Press, Kapitel 4, S. 635 ff.).
Die Fähigkeit von Metallionen, sich an Proteine zu binden, stellt die Basis für die Silberfärbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen dar. In der US-A-4.468.466 wird ein Gel mit Dithiothreitol (DTT) vorbehandelt, bevor es mit Silberionen gefärbt wird, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Die US-A-4.434.234 stellt eine anschließende Behandlung mit Carbonat- oder Sulfatsalzen bereit, um unterschiedliche Färbungen zu erzielen.
In manchen Fällen reagieren Metallionen mit Proteinen und bilden einen Niederschlag. Metallprotein-Fällungsreaktionen sind in Verfahren eingesetzt worden, um Proteine quantitativ zu bestimmen (US-A-4.786.605), wie auch zum vollständigen oder fraktionierten Ausfällen von Proteinen aus einer proteinhältigen Lösung (US-A-4.486.282).
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Schnellverfahrens zur Detektion von ischämischen Zuständen bei Patienten.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Beurteilung von rehabilitierten Patienten, die unter Ischämie (Myokardinfarkt) leiden, um die Kreislaufleistungsfähigkeit sowohl im Ruhezustand als auch während körperlicher Tätigkeit zu bestimmen.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Schnellverfahrens, das elektrokardiographische Ergebnisse liefert, um das Auftreten echter ischämischen Vorfälle zu bestimmen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Sets zur Verwendung in solchen Verfahren.
Diese und andere Ziele der Erfindung, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen werden, sind durch das vorliegende Verfahren zur Detektion des Auftretens von Ischämie bei einem Patienten, wie in Anspruch 1 beschrieben, erreicht worden.
Die Erfindung stellt außerdem ein Set wie in Anspruch 14 beschrieben bereit.
Beste Art der Ausführung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt einen schnellen Nachweis des Vorliegens von ischämischen Zuständen in einem Patienten zu. Unter der hierin verwendeten Bezeichnung "schnell" wird eine Detektion innerhalb einer Stunde, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten, verstanden. Unter der hierin verwendeten Bezeichnung "ischämischer Vorfall" ist gemeint, dass ein Patient aufgrund von Behinderungen der Blutzfuhr zu Organen eine lokale und temporäre Ischämie erlitten hat.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von ischämischen Zuständen mittels eines Schnellverfahrens bereit, das sich die Bindungsfähigkeit von Metallionen an Gewebeproteine zu Nutze macht. Bei Patienten, die bereits einen ischämischen Vorfall erlitten haben, wird die Anzahl der Thiol-(SH-)Gruppen in den im Serum, Plasma, Gewebe oder in der Körperflüssigkeit von Patienten enthaltenen Proteinen aufgrund der Oxidation mittels Hydroxyl- und Superoxidradikalen reduziert. Es wird angenommen, dass diese Oxidation dann stattfindet, wenn intrazelluläres Calcium die Protease Calpain aktiviert, wodurch aus Xanthin-Dehydrogenase Xanthin-Oxidase gebildet wird. Xanthin-Oxidase wirkt auf Xanthin und Hypoxanthin ein, um freie Radikale zu bilden, die Thiolgruppen in Proteinen oxidieren. Die Oxidation der Thiolgruppen führt zur Bildung von höher oxidierten Gruppen, einschließlich Di sulfid (S-S), SO₃, und dergleichen. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die relative Menge an proteingebundenen SH-Gruppen in einer Probe als Indikator für das Auftreten von Oxidation während der biologischen Lebensdauer des Proteins dient. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass das vorliegende Verfahren die Menge an proteingebundene Thiolgruppen als Maß für den aus einem ischämischen Vorfall resultierenden oxidativen Schaden in einer Probe bestimmt und dadurch den ischämischen Vorfall detektiert.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Serum-, Plasma-, Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe eines Patienten mit Metallionen, üblicherweise in Form einer wässrigen Salzlösung, umgesetzt, damit sich die Metallionen an metallbindende Stellen eines in der Probe enthaltenen Proteins binden. Metallionen binden sich an metallionenbindende Thiolstellen enthaltende Proteine, die in den Aminosäuren, aus denen ein Protein besteht, vorliegen. Die Zugabe von Metallionen zur Probe kann eine geringe Menge an Metallionenkomplexen ausfällen, wobei ein solcher Niederschlag für das erfindungsgemäße Verfahren weder nötig noch förderlich ist.
Eine vorbestimmte überschüssige Menge an Metallionensalz wird mit dem Protein in der Probe kontaktiert, und die Metallionen werden an das Protein binden gelassen. Unter "überschüssig" wird eine Menge an Metallionen verstanden, die größer als die zur Bindung aller im Protein der Probe vorliegenden Thiolgruppen erforderlichen stöchiometrischen Menge ist. Ein Überschuss an Metallionen wird zugesetzt, damit das resultierende Gemisch freie Metallionen enthält, die detektiert werden können, um ein Maß der in der Probe enthaltenen Anzahl an Thiolgruppen zu erhalten. Da die zu Beginn zugesetzte Gesamtmenge an Metallionen bekannt ist, stellt die Detektion der in der Probe übrig gebliebenen freien Metallionen ein Maß für die Menge an proteingebundenen Metallionen und somit auch für die Menge an verfügbaren Thiolgruppen dar.
Die nach der Komplexbildung von Protein-Thiol-Gruppen übrig gebliebenen freien Metallionen können mittels eines beliebigen Verfahrens detektiert werden. Die Ver fahren zur Detektion freier Metallionen in einer Probe sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Verfahren, wie etwa kolorimetrische Reaktionen unter Einsatz eines Reagens, das durch Reaktion mit den freien Metallionen eine gefärbte Substanz erzeugt, sowie direkte Messung der Metallionen durch Heranziehen von Verfahren einschließlich Atomabsorptions- oder Atomemissionsspektroskopie und dergleichen. Es kann jedes bekannte Verfahren zur Detektion und Mengenbestimmung von Metallionen in einer Probe herangezogen werden, um die nach der Komplexbildung mit Protein-Thiol-Gruppen übrig gebliebenen Metallionen zu detektieren. Vorzugsweise werden die Metallionen kolorimetrisch detektiert, indem ein gefärbter Komplex gebildet wird und der gefärbte Komplex unter Verwendung eines Spektralphotometers detektiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des kolorimetrischen Detektionsverfahrens wird das Metallsalz-Probengemisch mit einer aus einer Thiolverbindung bestehenden wässrigen Lösung kontaktiert. Die Thiolverbindung reagiert mit den freien Metallionen, um ein gefärbtes Produkt zu bilden. Die Intensität des gefärbten Produkts ist proportional zur Anzahl der im Metallsalz-Probengemisch vorliegenden Metallionen und entspricht somit der Menge an proteingebundenen Thiolgruppen in der Probe. Durch Messung der Farbintensität der resultierenden gefärbten Lösung, kann ein Maß für die ursprünglich in der Probe vorliegenden proteingebundenen Thiolgruppen erhalten werden.
Es können natürlich auch farbbildende Verbindungen, die keine Thiolverbindungen sind, eingesetzt werden, um ein gefärbtes Produkt mit freien Metallionen zu bilden, sofern das Produkt mit nachweisbarer Färbung unter Anwendung eines kolorimetrischen Nachweises gebildet wird. Andere geeignete farbbildende Verbindungen umfassen Metallhydroxidlösungen, Ammoniumhydroxidlösungen, Metallcyanidlösungen, Ammoniumthiocyanatlösungen und dergleichen. Diese farbbildenden Verbindungen und andere Verbindungen, die mit Metallionen gefärbte Lösungen bilden, sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und beschrieben, wie beispielsweise in A. I. Vogel, "Qualitative Chemical Analysis", Longmans, Green and Co., (1945); J. R. Marston und D. W. Dewey, J. Exptl. Biol. Med. Sci. 18, 343 (1940); J. H. Yoe und C. J. Barton, Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 12, 405 (1940); und D. L. Tsalev und V. K. Zaprianov, "Spectrosopy", CRC Press, Boca Ratan FL (1983). Diese Verweise sind hierin durch Verweis aufgenommen, um eine vollständigere Beschreibung der darin erläuterten Reagenzien darzulegen, die in der vorliegenden Erfindung als farbbildende Verbindungen eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäße Probe umfasst jede beliebige Gewebe-, Serum-, Plasma- oder Körperflüssigkeitsprobe, die Proteine enthält, welche zur Bindung von Metallionen fähig sind. Die Gewebeproben können aus Körperorganen entnommen werden, um das Auftreten eines das Organ betreffenden ischämischen Vorfalls nachzuweisen. Geeignete Organe umfassen jedes beliebige Organ, das eine Blutzufuhr oder eine Proteinmatrix aufweist, die zur Oxidation fähig ist, einschließlich Herz, Nieren, Darm, Arterien, Venen, Leber, etc. Die Probe kann ebenso Blutplasma oder Serum sowie andere Körperflüssigkeiten, wie etwa Lymphe oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Speichel, etc., sein. Die Probe kann mittels eines allgemein bekannten herkömmlichen Biopsie- und Flüssigkeitsabnahmeverfahrens erhalten werden.
Beim Einsatz von kolorimetrischer Detektion sollte die Probe keine anderen metallbindenden Verbindungen enthalten, welche die nicht probengebundenen Metallionen binden oder chelatieren, wodurch die kolorimetrische Reaktion beeinträchtigt wird. Metallbindende Verbindungen, die der Probe nicht zugesetzt werden oder darin vorliegen sollten, umfassen Citrat, Oxalat, Borat, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und dergleichen, die als Antikoagulationsmittel, Stabilisatoren oder in Pufferlösungen verwendet werden.
Optimale Ergebnisse werden mit Proben erzielt, die eine große Menge an Proteinen mit Thiolgruppen enthalten, welche zur Bindung mit Metallionen verfügbar sind. Blutplasma und Serum werden bevorzugt, da diese Proben beträchtliche Mengen Albumin enthalten, das sich als besonders wirksam bei der Bindung von Metallionen erwiesen hat. Obwohl Blutplasma und Serum bevorzugte Proben darstellen, kann in der vorliegenden Erfindung jede beliebige Probe verwendet werden, die eine beträchtliche Menge an Proteinen mit verfügbaren Thiolgruppen enthält.
Proteine, die keine verfügbaren Thiolgruppen zum Binden von Metallionen aufweisen, beeinträchtigen das vorliegende Verfahren nicht. Eine Probe, die nur Proteine enthält, welche keine verfügbaren Thiolgruppen aufweist, wird jedoch keine Bindungen von Metallionen bewirken können und ist für vorliegendes Verfahren deshalb unwirksam. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Thiolgruppen in einem Protein kann mittels bekannter Verfahren routinemäßig festgestellt werden. Proteine, die zwar enthalten sein können, Metallionen zur Verwendung in vorliegendem Verfahren jedoch nicht in ausreichendem Ausmaß binden, umfassen Hämoglobin, Myoglobin, γ-Globulin, Transferrin, Ferritin, Glutathion (in oxidierter Form) und Putrescin. Ähnlich verhält es sich mit anderen Substanzen, die zwar vorliegen, jedoch keine Metallionen binden und somit das vorliegende Verfahren nicht beeinflussen. Solche nicht beeinflussenden Substanzen umfassen Liponsäure, Nitroglycerin, Natriumnitrit, Cystin, Homocystin und Homocystein (in geringen Mengen, wie von Genest et al. beschrieben). Die Nichtbeeinflussung seitens Homocystein ist überraschend, da Homocystein eine verfügbare Thiolgruppe aufweist und dafür bekannt ist, bei Patienten mit vorzeitigen Arterienerkrankungen vorzuliegen (J. J. Genest et al., J.A.C.C. 16, 1114–1119 (1990)). Es wurden Plasmamengen von Homocystein in einer Größenordnung von 10 Nanomol pro ml detektiert. Diese Konzentration ist jedoch derart gering, dass keine messbare Beeinträchtigung der Bindung von Metallionen festgestellt werden kann. Deshalb beeinflussen diese Verbindungen das vorliegende Verfahren nicht, wenn sie in freier Form oder in proteingebundener Form enthalten sind.
Die in der Probe mit dem Protein umsetzbaren Metallionen umfassen alle beliebigen Metallionen, die zur Bindung an metallionenbindende Thiolstellen eines Proteins fähig sind. Wenn kolorimetrische Detektion herangezogen wird, müssen die Metallionen zusätzlich zur Bildung eines gefärbten Produkts fähig sein. Die Bestimmung der Bindung von Metallionen an Proteine und die Bildung von gefärbten Metallionen-Produkten wird routinemäßig durchgeführt und ist unter Anwendung bekannter Ver fahren einfach auszuführen. Die Bildung gefärbter Produkte wird bestimmt, indem eine Verdünnungsreihe einer gewünschten farbbildenden Verbindung, beispielsweise eines Thiols, in Wasser hergestellt und ein ausgewähltes Metallion (als Metallsalz) dem Serum oder der Pufferlösung zugesetzt wird. Die Farbentwicklung wird visuell bestimmt. Die Fähigkeit von Metallionen zur Bindung mit Proteinen in der Probe kann mittels bekannter Verfahren bestimmt werden.
Die Metallionen werden der Probe im Allgemeinen als in einer wässrigen Lösung gelöste Metallsalze zugesetzt. Bevorzugte Metallionen sind Übergangsmetallionen der Gruppen 1b bis 7b und 8 des Periodensystems. Noch bevorzugtere Metallionen umfassen V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg, Cd, Fe, Pb, Au und Ag. Die besonders bevorzugten Metallionen sind Ni, Fe, Mn und Co. Falls gewünscht können auch Gemische dieser Metallionen eingesetzt werden.
Die Metallionen werden der Probe vorzugsweise als wässrige Lösung zugesetzt. Die Lösungen können hergestellt werden, indem ein Metallionensalz einfach in Wasser gelöst wird, um die gewünschte Metallionenkonzentration zu erhalten. Es kann jedes beliebige Gegenanion für das Metallion verwendet werden, sofern das Gegenion weder den Vorgang des Bindens der Metallionen an die Proteine noch die Bildung des gefärbten Metallionen-Produkts unter Verwendung kolorimetrischer Detektionsmittel beeinträchtigt. Geeignete Anionen umfassen Nitrat, Nitrit, Chlorid, Sulfat und Carbonat. Besonders bevorzugt wird Cobaltchlorid.
Das Binden von Metallionen an Proteine ist pH-abhängig. Der optimale pH-Wert zum Binden ändert sich je nach dem für das Verfahren jeweils verwendeten Metallion. Ein geeigneter pH-Wert zum Binden von Metallionen an Proteine kann erhalten werden, indem ein pH-Puffer zur Steuerung des pH-Werts der Probe in einem optimalen pH-Bereich zum Binden von Metallionen an Proteine eingesetzt wird. Beispielsweise findet das Binden von Cobalt im Allgemeinen in einem pH-Bereich von 5 bis 10,5, vorzugsweise 6,8 bis 7,8, insbesondere bei einem pH-Wert von etwa 7,4, statt. Die Verwendung von Cobalt ist eine bevorzugte Ausführungsform vorliegender Erfindung, da Serum über eine ausreichende Pufferleistung in dem engen bevorzugten pH-Bereich zum Binden von Cobalt (6,8 bis 7,8) verfügt, wodurch zusätzliches Puffern nicht erforderlich ist. Wenn jedoch Proben und Metallionen verwendet werden, die ein Puffern erfordern, kann der Probe ein Puffer zugesetzt werden, um den pH-Wert auf den gewünschten optimalen Bereich zum Binden einzustellen. Solche Puffer sind allgemein bekannt und im Handel erhältlich.
Das Binden von Metallionen an Proteine ist im Wesentlichen nicht temperaturempfindlich. Das vorliegende Verfahren kann bei Temperaturen durchgeführt werden, die von Raumtemperatur (20°C) bis und über 50°C reichen. Vorzugsweise wird das Verfahren bei etwa 20 bis 25°C durchgeführt. Falls die Probe gekühlt oder gefroren war, wird die Probe vor dem Testvorgang bei Umgebungstemperatur zum Auftauen stehengelassen.
Falls die freien Metallionen unter Verwendung eines Verfahrens wie etwa Atomabsorptionsspektroskopie direkt detektiert werden, kann eine für die Analyse geeignete Probe direkt aus der Probe hergestellt werden. Bei der Verwendung solcher Verfahren werden die Metallionen der Probe vorzugsweise in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt, die nach dem Binden der Metallionen an die Thiolgruppen eines Proteins eine ungebundene Metallionen enthaltende Probenlösung bereitstellt. Es können zusätzliche Probenherstellungsschritte, wie etwa Filtrieren, ausgeführt werden, um allfällige restliche Niederschläge zu entfernen.
Das direkte Detektionsverfahren (Atomabsorptionsspektroskopie) lässt eine qualitative und quantitative Bestimmung der Gegenwart und der Menge an enthaltenen freien Metallionen zu. Falls die anfängliche Menge an Metallionen in der wässrigen Lösung bekannt ist, stellt die Detektion der in der Lösung vorliegenden freien Metallionen nach der Bindung an ein Protein eine Messung der Anzahl an freien Protein-Thiol-Gruppen und folglich eine Messung der Thiolgruppenoxidation bereit. Es ist zweckdienlich, standardisierte Metallionenlösungen zu verwenden, die eine bekannte Menge an Metallionen enthalten. Dies ermöglicht beispielsweise Routineanalyse von Proben in einem medizinischen Labor.
Die Menge an freien Metallionen in der Probe kann auch durch kolorimetrische Verfahren detektiert werden. Nachdem die Probe mit Metallionen kontaktiert worden ist, wird das Gemisch mit einer wässrigen Lösung einer farbbildenden Verbindung (Thiol) kontaktiert, die mit jeglichen ungebundenen Metallionen reagiert. Die farbbildende Verbindung sollte in einer Konzentration in Wasser löslich sein, die ausreicht, um mit allen verfügbaren ungebundenen Metallionen zu reagieren. Zudem sollte die farbbildende Verbindung beim Nichtvorhandensein von Metallionen kein Licht in jenem Wellenlängenbereich absorbieren, bei dem das gefärbte Metallionen-Produkt detektiert wird. Im Allgemeinen ist es erwünscht, dass die freie farbbildende Verbindung beim Nichtvorhandensein von Metallionen Licht in einem Detektionswellenlängenbereich von etwa 400 bis 900 nm nicht absorbiert. Die farbbildende Verbindung sollte ebenso gegen jegliche Zersetzung seitens in der Probe vorliegender biologischer Komponenten stabil sein und dies unter den verfahrensgemäßen pH-Wert- und Temperaturbedingungen.
Obwohl alle mit den oben erläuterten Eigenschaften ausgestatteten farbbildenden Verbindungen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Thiole bevorzugt und umfassen C_2-6-Alkylthioalkohole, wie etwa Mercaptoethanol, 2,3-Dimercaptopropanol, Dithioerythrit und Dithiothreit; C_2-6-Alkylthioamine, wie etwa Mercaptoethylamin, Mercaptopropylamin, und dergleichen; C_2-10-Alkylthiomonocarbonsäuren und zweiwertige Säuren, wie etwa Dimercaptobernsteinsäure, Mercaptopropansäure, Mercaptoessigsäure und Mercaptomalonsäure; C_2-10-Alkyldithiodicarbonsäure; Di-C_1-6-alkyldithiocarbaminsäuren, wie etwa Dimethyldithiocarbaminsäure, Diethyldithiocarbaminsäure und dergleichen; thiolhältige Aminosäuren und Peptide, wie etwa Cystein, β-Mercaptoisoleucin, Glutathion, und dergleichen; und thiolhältige Enzyme, wie etwa Papain, Phosphoenolpyruvat, Carboxykinase, 3-Phosphoglycerinaldehyd-Dehydrogenase, Propionyl-CoA-carboxylase, Streptokokkenprotease und thiolhältige Carboxypeptidasen. Als andere geeignete Thiole kommen 1,3,4-Thiadiazol-2,5-dithiol, 4'-Phosphopantethein aus Coenzym A und Penicillamin in Frage.
Andere verwendbare farbbildende Verbindungen umfassen Pyridin-2-azo-p-dimethylanilin, α-Nitroso-β-naphthol, β-Nitroso-α-naphthol, Dithiooxamid, Thiosemicarbazid, C_1-6-Alkylthiosemicarbazide, wie etwa 2-Methyl-3-thiosemicarbazid, 4-Methyl-3-thiosemicarbazid, 4-Methyl-3-thiosemicarbazid und 4-Ethyl-3-thiosemicarbazid, Formaldehydtryptophan, Salicylaldehyd, Chinoxalin-2-carbosaldehyd-2-chloracetylaminomethylbenzimidazol und Proflavinsalze, wie etwa Proflavinhemisulfat und -hydrochlorid.
Insbesondere bevorzugte Verbindungen sind Dithiothreitol, Cystein und Glutathion.
Die farbbildende Verbindung kann als wässrige Lösung in einer Konzentration hergestellt werden, die ausreicht, um mit allen verfügbaren ungebundenen Metallionen zu reagieren. Wenn die Menge an farbbildenden Verbindungen zu groß ist, kann sich eine große Menge an Niederschlag mit Metallionen bilden. Wenn die Lösung zu verdünnt ist, wird die Detektion des gefärbten Produkts erschwert. In der Praxis wird die Lösungskonzentration so eingestellt, dass eine ausreichend gefärbte Lösung bereitgestellt wird, um die Lichtabsorption unter Verwendung eines Spektralphotometers oder eines ähnlichen Detektionsgeräts nachweisen zu können. Die Optimierung der Menge an farbbildender Verbindung kann routinemäßig bestimmt werden.
Die der Probe zugesetzte Menge an Metallionen muss ausreichen, um alle verfügbaren proteingebundenen Thiolgruppen zu binden und einen Überschuss an detektierbaren Metallionen bereitzustellen.
Bei der Anwendung von kolorimetrischer Detektion sollte die Menge an zugesetzten Metallionen ausreichen, um ein gefärbtes Produkt bereitzustellen, dass mittels eines Detektionsgeräts, wie beispielsweise eines Spektralphotometers, detektiert werden kann. Die Konzentration der Metallionenlösung beträgt vorzugsweise etwa 0,001 bis 0,100 M, noch bevorzugter 0,002 bis 0,01 M. Die Menge an zugesetzten Metallionen in der Probe ist unterschiedlich und kann routinemäßig-eingestellt werden, sofern die ungebundenen Metallionen gefärbte Produkte in ausreichender Menge bilden, um diese zuverlässig detektieren zu können. Wenn zu viele Metallionen zugesetzt werden, ist die resultierende Farbintensität zu stark, um vom Detektionsgerät genau bestimmt werden zu können. Bei einer zu geringen Menge an Metallionen (einer zu hohen Menge an Serum) werden lange Äquilibrierungszeiten erforderlich und die Farbausbeute fällt zu gering aus. Die relativen Mengen dieser Reagenzien können routinemäßig bestimmt werden, um optimale Absorptionsmessdaten mittels eines Spektralphotometers oder eines anderen Detektionsgeräts bereitzustellen.
Je nach Bedarf kann der Probe eine mit Blut isosmotische Salzlösung nach Zugabe des Thiolreagens zugesetzt werden, um eine verdünnte Lösung mit einer für die Detektion geeigneten Farbintensität bereitzustellen. Die Verdünnung mit isosmotischen Lösungen verringert den Proteinniederschlag und Trübungen. Als bevorzugte isosmotische Lösungen gelten Lösungen, die aus Natriumchlorid hergestellt werden, wobei andere Salze, wie etwa Kaliumchlorid und Lithiumchlorid ebenfalls geeignet sind. Falls die Zugabe der Thiollösung eine für die Detektion ausreichende Farbintensität bereitstellt, sind weitere Verdünnungen mit der isosmotischen Lösung nicht erforderlich.
Nach Zugabe der farbbildenden Verbindungslösung zum Metallionen-Protein-Gemisch und anschließender Verdünnung, kann die Farbintensität des resultierenden Produkts, je nach Bedarf, unter Verwendung eines herkömmlichen Spektralphotometers gemessen werden. Das Absorptionsvermögen der gefärbten Produkte wird im Allgemeinen bei maximaler Absorptionswellenlänge des hergestellten gefärbten Produkts gemessen. Natürlich hängt das gefärbte Produkt von der jeweiligen farbbildenden Verbindung und den im Verfahren eingesetzten Metallionen ab. Die optimale Absorptionswellenlänge kann mittels allgemein bekannter Verfahren routinemäßig bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set zur Verwendung bei der Durchführung oben beschriebenen Verfahrens bereit. Das erfindungsgemäße Set umfasst ein Metallsalz, eine wie in Anspruch 14 definierte farbbildende Verbindung und, je nach Bedarf, eine Lösung, die mit Blutplasma oder Serum isosmotisch ist. Die wässrigen Lösungen des Metallsalzes und der farbbildenden Verbindung können gebildet werden, indem den im Set enthaltenen Verbindungen lediglich Wasser zugesetzt wird, um die gewünschten Lösungen zu erhalten. Alternativ dazu kann das Set die wässrigen Lösungen des Metallsalzes und der farbbildenden Verbindung direkt enthalten. Das Set kann darüber hinaus ein Testgefäß zum Vermischen der Testprobe mit den oben angeführten drei Komponenten enthalten. Die schnelle Detektion von ischämischen Zuständen ist durch Vermischen der Probe mit der Lösung des Metallsalzes möglich, wodurch die Menge an freien Metallionen detektiert wird.
Proben, die normalen Patienten ohne zurückliegende ischämische Vorfälle abgenommen wurden, ergeben Probenlösungen mit einer geringen Konzentration an detektierbaren Metallionen und ein geringeres Absorptionsvermögen (weniger Farbintensität) als Proben, die Patienten mit ischämischen Vorfällen abgenommen wurden. Proben, die beispielsweise Patienten abgenommen wurden, die nichtkardiale Brustschmerzen haben, enthalten wesentlich weniger detektierbare Metallionen als Proben von Patienten mit ischämischen Vorfällen, wie etwa einem Myokardinfarkt oder einer instabilen Angina erlitten haben. Die vorliegende Erfindung lässt zu, dass Proben von Patienten getestet werden können, die über Brustschmerzen klagen, und ermöglicht eine schnelle Bestimmung, ob die Brustschmerzen mit einem ischämischen Vorfall in Zusammenhang stehen oder auf nichtkardiale Brustschmerzen zurückzuführen sind. Auf ähnliche Weise kann der Genesungsverlauf eines Patienten mit zurückliegendem ischämischen Vorfall, wie etwa einem Myokardinfarkt, bewertet werden, indem dem Patienten in regelmäßigen Abständen Gewebeproben entnommen werden, um die Kreislaufleistungsfähigkeit und das Nachlassen von ischämischen Zuständen zu bewerten.
Andere erfindungsgemäße Merkmale werden im Zuge nachstehender Beschreibungen von exemplarischen Ausführungsformen ersichtlich, die zur Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen sind.
BEISPIELE
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde Cobalt ausgewählt, um mit proteingebundenen Thiolgruppen zu reagieren. Nichtumgesetztes Cobalt wurde mittels Dithiothreitol detektiert, das zusammen mit Cobaltionen ein braun gefärbtes Produkt bildet. Das braun gefärbte Produkt wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers bei einer Wellenlänge von 470 nm detektiert.
Beispiel 1
Materialien:
Cobaltlösung: 200 mg CoCl₂·6H₂O wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Zur Verwendung wurde diese Lösung 100fach verdünnt.
Dithiothreitollösung: 15 mg Dithiothreitol wurde in 10 ml destilliertem Wasser gelöst.
Salzlösung: 0,9 g Natriumchlorid wurden in 100 ml Wasser gelöst.
Serum: 2 bis 10 ml Blut wurden mittels Periphervenenpunktion erhalten und gerinnen gelassen. Das Röhrchen wurde bei 3.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und das überstehende Serum in ein gesondertes Glas oder in einen Plastikbehälter übertragen.
Plasma: 2 bis 10 ml Blut wurden in einen heparinisierten Vacutainer gezogen. Das Röhrchen wurde bei 3.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und das überstehende Plasma in ein gesondertes Glas oder in einen Plastikbehälter übertragen.
Es wurden Seren von 22 Patienten erhalten, die einen Myokardinfarkt oder einen ischämischen Vorfall erlitten hatten. Zu 0,2 ml Serum oder Plasma jedes dieser Patienten wurden in einem Teströhrchen oder einer Küvette 50 μl CoCl₂·6H₂O zugesetzt und das Gemisch 10 Minuten lang stehen gelassen. Jedem Röhrchen wurden 50 μl Dithiothreitol zugesetzt und anschließend vermischt. Die Röhrchen wurden sodann 2 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Bildung des gefärbten Produkts zu ermöglichen. Jedem Röhrchen wurde anschließend 1 ml 0,9%iges NaCl zugesetzt, gefolgt von Vermischen, wonach das Absorptionsvermögen jedes einzelnen Röhrchens unter Verwendung eines Spektralphotometers bei 470 nm abgelesen wurde. Es wurden Kontrollröhrchen hergestellt und durch Zugabe von identischem Serum, Cobaltchloridlösung und Natriumchloridlösung, jedoch keiner Dithiothreitollösung, Tests durchgeführt. Das Absorptionsvermögen der Kontrollröhrchen wurde ebenfalls bei 470 nm abgelesen und vom Testergebnis abgezogen.
Bei den 22 Patienten mit zurückliegendem Myokardinfarkt oder ischämischem Vorfall wurden ein Mittelwert und eine Standardabweichung von 0,62 ± 0,15 (n = 22) ermittelt. Die Kontrollen wiesen einen Mittelwert und eine Standardabweichung von 0,27 ± 0,05 (n = 11) auf. Der t-Test nach Student ergab, dass die Mittelwerte als statistisch signifikant galten. Normale Patienten mit nichtkardialen Brustschmerzen wiesen einen Mittelwert von 0,32 ± 0,05 (n = 15) auf. Bei Patienten mit instabiler Angina betrug der Mittelwert 0,61 ± 0,22 (n = 8). Siehe Tabelle 1.
Tabelle 1
Diese Ergebnisse machen deutlich, dass das vorliegende Verfahren zur Detektion von ischämischen Zuständen eingesetzt werden kann. Das vorliegende Verfahren ist als wirksames Verfahren zur Unterscheidung zwischen ischämischen kardialen Brustschmerzen von nichtkardialen Brustschmerzen zu sehen.

Claims

Verfahren zur Detektion des Auftretens von Ischämie in einem Patienten, folgende Schritte umfassend: (a) Kontaktieren von Blut, einer von Blut stammenden Körperflüssigkeitsprobe, einschließlich einer Serum- oder Plasmaprobe oder Gewebeprobe, des Patienten mit Metallionen, die zur Bindung an metallionenbindende Thiolsteilen eines Proteins in dieser Probe fähig sind, um ein Gemisch herzustellen, das proteingebundene Metallionen und nicht proteingebundene Metallionen enthält, und (b) Detektieren der Menge an nicht proteingebundenen Metallionen unter Verwendung eines Verfahrens, das freie Metallionen detektiert, wobei die Menge an freien Metallionen ein Maß für die Menge an verfügbaren metallionenbindenden Thiolstellen des Proteins und die Menge an oxidativ geschädigten metallionenbindenden Thiolstellen ist, wodurch das Auftreten oder Nichtauftreten eines ischämischen Zustandes in der Probe angezeigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Detektionsschritt die direkte Detektion der Menge der nicht proteingebundenen Metallionen mithilfe von Atomabsorptions- oder Atomemissionsspektroskopie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Detektionsschritt die kolorimetrische Detektion der Menge an nicht proteingebundenen Metallionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, umfassend das Kontaktieren des Gemischs mit einer wässrigen Lösung einer farbbildenden Verbindung, um eine gefärbte Lösung zu erhalten, und das Detektieren der Farbintensität der gefärbten Lösung, um die Menge an nicht proteingebundenen Metallionen zu detektieren.
Verfahren nach Anspruch 4, das weiters das Verdünnen der gefärbten Lösung mit einer wässrigen Lösung, die isoosmotisch mit Blutserum oder -plasma ist, vor dem Detektionsschritt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe Serum oder Plasma ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die farbbildende Verbindung C_2-6-Alkylthioalkohol, C_2-6-Alkylthioamin, C_2-10-Alkylthiomonocarbonsäure, C_2-10-Alkylthiodicarbonsäure, C_2-10-Alkyldithiodicarbonsäure, Di-C_1-6-Alkyldithiocarbaminsäure, thiolhältige Aminosäure, thiolhältiges Peptid oder thiolhältiges Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die farbbildende Verbindung Dithiothreit, Cystein oder Glutathion ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metallion ein Übergangsmetallion der Gruppen 1b–7b oder 8 des Periodensystems ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metallion aus der aus V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg, Cd, Fe, Pb, Au und Ag bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Metallion Cobalt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Detektionsschritt in einem pH-Bereich von 5,0–10,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Detektionsschritt unter Verwendung eines Spektrophotometers durchgeführt wird.
Set zur Detektion des Vorhandenseins eines ischämischen Vorfalls in einem Patienten, wobei das Set ein Metallsalz und eine farbbildende Verbindung, die zur Bildung einer gefärbten Verbindung mit diesem Metallsalz fähig ist, umfasst, worin die farbbildende Verbindung aus der aus C_2-6-Alkylthioalkohol, C_2-6-Alkylthioamin, C_2-10-Alkylthiomonocarbonsäure, C_2-10-Alkylthiodicarbonsäure, C_2-10-Alkyldithiodicarbonsäure, Di-C_1-6-Alkyldithiocarbaminsäure, thiolhältiger Aminosäure, thiolhältigem Peptid oder thiolhältigem Enzym bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Set nach Anspruch 14, worin zumindest eines aus dem Metallsalz und der farbbildenden Verbindung in Form einer wässrigen Lösung vorliegt.
Set nach Anspruch 14, das außerdem eine Salzlösung umfasst, die isoosmotisch mit Blutplasma oder -serum ist.
Set nach Anspruch 14, das außerdem ein Testgefäß zum Vermischen des Metallsalzes und der farbbildenden Verbindung umfasst.