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Gebiet der
Technik
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Schnellverfahren zur Detektion
von ischämischen
Zuständen
sowie ein Set zur Verwendung in einem solchen Verfahren. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung die Messung von proteingebundenen
Thiol-(SH-)Gruppen, um das Vorliegen oder Nichtvorliegen von Ischämie zu bestimmen.
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Stand der
Technik
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Eine
fortschreitende Herzkranzgefäßerkrankung
kann bereits weit vorangeschritten sein, ohne dass dabei nennenswerte
klinische Symptome, wie etwa Brustschmerz oder Atemnot, auftreten.
Der plötzliche
Verschluss eines Asts einer Koronararterie, der zu einem Myokardinfarkt
(MI) führt,
signalisiert auf dramatische Art und Weise das Vorliegen einer langjährigen Erkrankung
der Arterienwand, wie etwa Verkalkung der Intima und Wand, sowie
eine fortgeschrittene Stenose des Arterienlumens.
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Unmittelbar
nach einem ischämischen
Herzvortall werden Proteine in das Blut freigesetzt. Allgemein bekannte
Proteine, die nach einem ischämischen
Herzvorfall freigesetzt werden, umfassen Creatin-Kinase (CK), Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
(SGOT) und Lactat-Dehydrogenase (LDH). Ein allgemein bekanntes Verfahren
zur Beurteilung des Auftretens zurückliegender ischämischer
Herzanfälle
ist die Detektion dieser Proteine im Blut des Patienten. Die US-A-4.492.753
betrifft ein ähnliches
Verfahren zur Einschätzung des
Risikos zukünftiger
ischämischer
Herzanfälle.
Verletztes Herzgewebe setzt sowohl nach ischämischen als auch nach nicht-ischämischen
Anfällen
Proteine in den Blutstrom frei.
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Patienten,
die einer nichtkardialen Operation unterzogen werden, können ebenfalls
an perioperativer Ischämie
erkranken. Elektrokardiogramme solcher Patienten weisen Verschiebungen
des ST-Segments auf, die auf einen ischämischen Vorfall zurückzuführen sind
und mit dem Auftreten postoperativer unerwünschter Herzvorfälle in engem
Zusammenhang stehen. Veränderungen
des ST-Segments treten jedoch auch ohne Vorliegen von Ischämie auf,
womit dieses Verfahren nicht zwischen ischämischen und nicht-ischämischen
Anfällen
unterscheidet.
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Ischämie wird
häufig
durch Arteriengefäßerkrankungen
verursacht. Ein Merkmal von Arteriengefäßerkrankungen ist das Voranschreiten
einer Atheromatose zu einer Sklerose, wobei es zum Eintritt großer Mengen
an Calcium in die Arterienmuskulatur kommt. Im Laufe der Zeit entwickelt
sich Arteriosklerose. Die Menge an intrazellulärem Calcium erhöht sich,
während
die Herzleistung im Grunde normal bleibt. Das intrazelluläre Calcium
aktiviert die Protease Calpain, welche Xanthin-Dehydrogenase zu
Xanthin-Oxidase umsetzt. Xanthin-Oxidase wirkt auf Xanthin und Hypoxanthin
ein, um freie Radikale, einschließlich des Hydroxylradikals (OH·) und
des Superoxidradikals (O2·), zu
bilden. Diese Radikale oxidieren ihrerseits Zellmembranen und Proteine
in jenen Bereichen von Molekülen,
die reich an Thiolgruppen sind. Siehe "The Role of Perfusion – Induced
Injury in the Pathogenesis of the Crush Syndrome", New Engl. J. Med. 324, 1417–1422 (1991).
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Es
besteht Bedarf an einem Verfahren, das zwischen ischämischen
und nicht-ischämischen
Vorfällen, insbesondere
bei Herzpatienten, unterscheidet. Nach umfangreichen Forschungen
wurde das auf metallproteinbindenden Wechselwirkungen basierende
vorliegende Verfahren entdeckt, wodurch die Detektion von ischämischen
Zuständen
oder Vorfällen
bei Patienten ermöglicht
wird.
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Es
ist allgemein bekannt, dass Metallionen fähig sind, sich an metallbindende
Gruppen in Proteinen zu binden ("Multiple
Equilibria in Proteins",
J. Steinhardt und J. Reynolds, Acad. Press, CH-VI, S. 214ff). Metallionen
können
kovalente Bindungen mit Proteinen oder alternativ dazu Koordinationskomplexe
bilden, worin die Metallionen durch Liganden der Proteinmoleküle chelatiert
werden (Enzyme and Metabolic Inhibitors, Bd. II, J. L. Webb, (1966),
Acad. Press, Kapitel 4, S. 635 ff.).
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Die
Fähigkeit
von Metallionen, sich an Proteine zu binden, stellt die Basis für die Silberfärbung von Proteinen
in Polyacrylamidgelen dar. In der US-A-4.468.466 wird ein Gel mit
Dithiothreitol (DTT) vorbehandelt, bevor es mit Silberionen gefärbt wird,
um die Hintergrundfärbung
zu reduzieren. Die US-A-4.434.234 stellt eine anschließende Behandlung
mit Carbonat- oder Sulfatsalzen bereit, um unterschiedliche Färbungen
zu erzielen.
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In
manchen Fällen
reagieren Metallionen mit Proteinen und bilden einen Niederschlag.
Metallprotein-Fällungsreaktionen
sind in Verfahren eingesetzt worden, um Proteine quantitativ zu
bestimmen (US-A-4.786.605), wie auch zum vollständigen oder fraktionierten
Ausfällen
von Proteinen aus einer proteinhältigen
Lösung
(US-A-4.486.282).
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Offenbarung
der Erfindung
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Schnellverfahrens
zur Detektion von ischämischen
Zuständen
bei Patienten.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Beurteilung von rehabilitierten Patienten, die unter Ischämie (Myokardinfarkt)
leiden, um die Kreislaufleistungsfähigkeit sowohl im Ruhezustand
als auch während
körperlicher
Tätigkeit
zu bestimmen.
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Ein
weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Schnellverfahrens, das
elektrokardiographische Ergebnisse liefert, um das Auftreten echter
ischämischen
Vorfälle
zu bestimmen.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Sets zur
Verwendung in solchen Verfahren.
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Diese
und andere Ziele der Erfindung, die aus der nachstehenden Beschreibung
hervorgehen werden, sind durch das vorliegende Verfahren zur Detektion
des Auftretens von Ischämie
bei einem Patienten, wie in Anspruch 1 beschrieben, erreicht worden.
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Die
Erfindung stellt außerdem
ein Set wie in Anspruch 14 beschrieben bereit.
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Beste Art
der Ausführung
der Erfindung
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
lässt einen
schnellen Nachweis des Vorliegens von ischämischen Zuständen in
einem Patienten zu. Unter der hierin verwendeten Bezeichnung "schnell" wird eine Detektion
innerhalb einer Stunde, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten, verstanden.
Unter der hierin verwendeten Bezeichnung "ischämischer
Vorfall" ist gemeint,
dass ein Patient aufgrund von Behinderungen der Blutzfuhr zu Organen
eine lokale und temporäre
Ischämie
erlitten hat.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von ischämischen
Zuständen
mittels eines Schnellverfahrens bereit, das sich die Bindungsfähigkeit
von Metallionen an Gewebeproteine zu Nutze macht. Bei Patienten,
die bereits einen ischämischen
Vorfall erlitten haben, wird die Anzahl der Thiol-(SH-)Gruppen in den
im Serum, Plasma, Gewebe oder in der Körperflüssigkeit von Patienten enthaltenen
Proteinen aufgrund der Oxidation mittels Hydroxyl- und Superoxidradikalen
reduziert. Es wird angenommen, dass diese Oxidation dann stattfindet,
wenn intrazelluläres
Calcium die Protease Calpain aktiviert, wodurch aus Xanthin-Dehydrogenase
Xanthin-Oxidase gebildet wird. Xanthin-Oxidase wirkt auf Xanthin
und Hypoxanthin ein, um freie Radikale zu bilden, die Thiolgruppen
in Proteinen oxidieren. Die Oxidation der Thiolgruppen führt zur
Bildung von höher
oxidierten Gruppen, einschließlich
Di sulfid (S-S), SO3, und dergleichen. Die
Erfinder haben herausgefunden, dass die relative Menge an proteingebundenen
SH-Gruppen in einer Probe als Indikator für das Auftreten von Oxidation
während
der biologischen Lebensdauer des Proteins dient. Ohne an eine bestimmte
Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass das vorliegende
Verfahren die Menge an proteingebundene Thiolgruppen als Maß für den aus
einem ischämischen
Vorfall resultierenden oxidativen Schaden in einer Probe bestimmt
und dadurch den ischämischen
Vorfall detektiert.
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In
der vorliegenden Erfindung wird eine Serum-, Plasma-, Körperflüssigkeits-
oder Gewebeprobe eines Patienten mit Metallionen, üblicherweise
in Form einer wässrigen
Salzlösung,
umgesetzt, damit sich die Metallionen an metallbindende Stellen
eines in der Probe enthaltenen Proteins binden. Metallionen binden
sich an metallionenbindende Thiolstellen enthaltende Proteine, die
in den Aminosäuren,
aus denen ein Protein besteht, vorliegen. Die Zugabe von Metallionen
zur Probe kann eine geringe Menge an Metallionenkomplexen ausfällen, wobei
ein solcher Niederschlag für
das erfindungsgemäße Verfahren
weder nötig
noch förderlich
ist.
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Eine
vorbestimmte überschüssige Menge
an Metallionensalz wird mit dem Protein in der Probe kontaktiert,
und die Metallionen werden an das Protein binden gelassen. Unter "überschüssig" wird eine Menge an Metallionen verstanden,
die größer als
die zur Bindung aller im Protein der Probe vorliegenden Thiolgruppen
erforderlichen stöchiometrischen
Menge ist. Ein Überschuss
an Metallionen wird zugesetzt, damit das resultierende Gemisch freie
Metallionen enthält,
die detektiert werden können,
um ein Maß der
in der Probe enthaltenen Anzahl an Thiolgruppen zu erhalten. Da
die zu Beginn zugesetzte Gesamtmenge an Metallionen bekannt ist,
stellt die Detektion der in der Probe übrig gebliebenen freien Metallionen
ein Maß für die Menge
an proteingebundenen Metallionen und somit auch für die Menge
an verfügbaren
Thiolgruppen dar.
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Die
nach der Komplexbildung von Protein-Thiol-Gruppen übrig gebliebenen
freien Metallionen können mittels
eines beliebigen Verfahrens detektiert werden. Die Ver fahren zur
Detektion freier Metallionen in einer Probe sind auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt und umfassen Verfahren, wie etwa kolorimetrische
Reaktionen unter Einsatz eines Reagens, das durch Reaktion mit den
freien Metallionen eine gefärbte
Substanz erzeugt, sowie direkte Messung der Metallionen durch Heranziehen
von Verfahren einschließlich
Atomabsorptions- oder Atomemissionsspektroskopie und dergleichen.
Es kann jedes bekannte Verfahren zur Detektion und Mengenbestimmung
von Metallionen in einer Probe herangezogen werden, um die nach
der Komplexbildung mit Protein-Thiol-Gruppen übrig gebliebenen Metallionen
zu detektieren. Vorzugsweise werden die Metallionen kolorimetrisch
detektiert, indem ein gefärbter
Komplex gebildet wird und der gefärbte Komplex unter Verwendung
eines Spektralphotometers detektiert wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des kolorimetrischen Detektionsverfahrens wird das Metallsalz-Probengemisch
mit einer aus einer Thiolverbindung bestehenden wässrigen
Lösung
kontaktiert. Die Thiolverbindung reagiert mit den freien Metallionen,
um ein gefärbtes
Produkt zu bilden. Die Intensität
des gefärbten
Produkts ist proportional zur Anzahl der im Metallsalz-Probengemisch
vorliegenden Metallionen und entspricht somit der Menge an proteingebundenen
Thiolgruppen in der Probe. Durch Messung der Farbintensität der resultierenden
gefärbten
Lösung,
kann ein Maß für die ursprünglich in
der Probe vorliegenden proteingebundenen Thiolgruppen erhalten werden.
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Es
können
natürlich
auch farbbildende Verbindungen, die keine Thiolverbindungen sind,
eingesetzt werden, um ein gefärbtes
Produkt mit freien Metallionen zu bilden, sofern das Produkt mit
nachweisbarer Färbung
unter Anwendung eines kolorimetrischen Nachweises gebildet wird.
Andere geeignete farbbildende Verbindungen umfassen Metallhydroxidlösungen,
Ammoniumhydroxidlösungen,
Metallcyanidlösungen,
Ammoniumthiocyanatlösungen
und dergleichen. Diese farbbildenden Verbindungen und andere Verbindungen,
die mit Metallionen gefärbte
Lösungen
bilden, sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und
beschrieben, wie beispielsweise in A. I. Vogel, "Qualitative Chemical Analysis", Longmans, Green
and Co., (1945); J. R. Marston und D. W. Dewey, J. Exptl. Biol.
Med. Sci. 18, 343 (1940); J. H. Yoe und C. J. Barton, Ind. Eng.
Chem., Anal. Ed. 12, 405 (1940); und D. L. Tsalev und V. K. Zaprianov, "Spectrosopy", CRC Press, Boca
Ratan FL (1983). Diese Verweise sind hierin durch Verweis aufgenommen,
um eine vollständigere
Beschreibung der darin erläuterten
Reagenzien darzulegen, die in der vorliegenden Erfindung als farbbildende
Verbindungen eingesetzt werden können.
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Die
erfindungsgemäße Probe
umfasst jede beliebige Gewebe-, Serum-, Plasma- oder Körperflüssigkeitsprobe, die Proteine
enthält,
welche zur Bindung von Metallionen fähig sind. Die Gewebeproben
können aus
Körperorganen
entnommen werden, um das Auftreten eines das Organ betreffenden
ischämischen
Vorfalls nachzuweisen. Geeignete Organe umfassen jedes beliebige
Organ, das eine Blutzufuhr oder eine Proteinmatrix aufweist, die
zur Oxidation fähig
ist, einschließlich
Herz, Nieren, Darm, Arterien, Venen, Leber, etc. Die Probe kann
ebenso Blutplasma oder Serum sowie andere Körperflüssigkeiten, wie etwa Lymphe
oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
Speichel, etc., sein. Die Probe kann mittels eines allgemein bekannten
herkömmlichen
Biopsie- und Flüssigkeitsabnahmeverfahrens
erhalten werden.
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Beim
Einsatz von kolorimetrischer Detektion sollte die Probe keine anderen
metallbindenden Verbindungen enthalten, welche die nicht probengebundenen
Metallionen binden oder chelatieren, wodurch die kolorimetrische
Reaktion beeinträchtigt
wird. Metallbindende Verbindungen, die der Probe nicht zugesetzt
werden oder darin vorliegen sollten, umfassen Citrat, Oxalat, Borat,
Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) und dergleichen, die als Antikoagulationsmittel, Stabilisatoren
oder in Pufferlösungen
verwendet werden.
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Optimale
Ergebnisse werden mit Proben erzielt, die eine große Menge
an Proteinen mit Thiolgruppen enthalten, welche zur Bindung mit
Metallionen verfügbar
sind. Blutplasma und Serum werden bevorzugt, da diese Proben beträchtliche
Mengen Albumin enthalten, das sich als besonders wirksam bei der
Bindung von Metallionen erwiesen hat. Obwohl Blutplasma und Serum
bevorzugte Proben darstellen, kann in der vorliegenden Erfindung
jede beliebige Probe verwendet werden, die eine beträchtliche
Menge an Proteinen mit verfügbaren
Thiolgruppen enthält.
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Proteine,
die keine verfügbaren
Thiolgruppen zum Binden von Metallionen aufweisen, beeinträchtigen das
vorliegende Verfahren nicht. Eine Probe, die nur Proteine enthält, welche
keine verfügbaren
Thiolgruppen aufweist, wird jedoch keine Bindungen von Metallionen
bewirken können
und ist für
vorliegendes Verfahren deshalb unwirksam. Das Vorhandensein oder
Nichtvorhandensein von Thiolgruppen in einem Protein kann mittels
bekannter Verfahren routinemäßig festgestellt
werden. Proteine, die zwar enthalten sein können, Metallionen zur Verwendung
in vorliegendem Verfahren jedoch nicht in ausreichendem Ausmaß binden,
umfassen Hämoglobin,
Myoglobin, γ-Globulin,
Transferrin, Ferritin, Glutathion (in oxidierter Form) und Putrescin. Ähnlich verhält es sich
mit anderen Substanzen, die zwar vorliegen, jedoch keine Metallionen
binden und somit das vorliegende Verfahren nicht beeinflussen. Solche
nicht beeinflussenden Substanzen umfassen Liponsäure, Nitroglycerin, Natriumnitrit,
Cystin, Homocystin und Homocystein (in geringen Mengen, wie von
Genest et al. beschrieben). Die Nichtbeeinflussung seitens Homocystein
ist überraschend,
da Homocystein eine verfügbare
Thiolgruppe aufweist und dafür
bekannt ist, bei Patienten mit vorzeitigen Arterienerkrankungen
vorzuliegen (J. J. Genest et al., J.A.C.C. 16, 1114–1119 (1990)).
Es wurden Plasmamengen von Homocystein in einer Größenordnung
von 10 Nanomol pro ml detektiert. Diese Konzentration ist jedoch
derart gering, dass keine messbare Beeinträchtigung der Bindung von Metallionen
festgestellt werden kann. Deshalb beeinflussen diese Verbindungen
das vorliegende Verfahren nicht, wenn sie in freier Form oder in
proteingebundener Form enthalten sind.
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Die
in der Probe mit dem Protein umsetzbaren Metallionen umfassen alle
beliebigen Metallionen, die zur Bindung an metallionenbindende Thiolstellen
eines Proteins fähig
sind. Wenn kolorimetrische Detektion herangezogen wird, müssen die
Metallionen zusätzlich
zur Bildung eines gefärbten
Produkts fähig
sein. Die Bestimmung der Bindung von Metallionen an Proteine und
die Bildung von gefärbten
Metallionen-Produkten wird
routinemäßig durchgeführt und
ist unter Anwendung bekannter Ver fahren einfach auszuführen. Die
Bildung gefärbter
Produkte wird bestimmt, indem eine Verdünnungsreihe einer gewünschten
farbbildenden Verbindung, beispielsweise eines Thiols, in Wasser
hergestellt und ein ausgewähltes
Metallion (als Metallsalz) dem Serum oder der Pufferlösung zugesetzt
wird. Die Farbentwicklung wird visuell bestimmt. Die Fähigkeit
von Metallionen zur Bindung mit Proteinen in der Probe kann mittels
bekannter Verfahren bestimmt werden.
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Die
Metallionen werden der Probe im Allgemeinen als in einer wässrigen
Lösung
gelöste
Metallsalze zugesetzt. Bevorzugte Metallionen sind Übergangsmetallionen
der Gruppen 1b bis 7b und 8 des Periodensystems. Noch bevorzugtere
Metallionen umfassen V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg,
Cd, Fe, Pb, Au und Ag. Die besonders bevorzugten Metallionen sind
Ni, Fe, Mn und Co. Falls gewünscht
können
auch Gemische dieser Metallionen eingesetzt werden.
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Die
Metallionen werden der Probe vorzugsweise als wässrige Lösung zugesetzt. Die Lösungen können hergestellt
werden, indem ein Metallionensalz einfach in Wasser gelöst wird,
um die gewünschte
Metallionenkonzentration zu erhalten. Es kann jedes beliebige Gegenanion
für das
Metallion verwendet werden, sofern das Gegenion weder den Vorgang
des Bindens der Metallionen an die Proteine noch die Bildung des
gefärbten
Metallionen-Produkts unter Verwendung kolorimetrischer Detektionsmittel
beeinträchtigt.
Geeignete Anionen umfassen Nitrat, Nitrit, Chlorid, Sulfat und Carbonat.
Besonders bevorzugt wird Cobaltchlorid.
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Das
Binden von Metallionen an Proteine ist pH-abhängig. Der optimale pH-Wert
zum Binden ändert sich
je nach dem für
das Verfahren jeweils verwendeten Metallion. Ein geeigneter pH-Wert
zum Binden von Metallionen an Proteine kann erhalten werden, indem
ein pH-Puffer zur Steuerung des pH-Werts der Probe in einem optimalen
pH-Bereich zum Binden
von Metallionen an Proteine eingesetzt wird. Beispielsweise findet das
Binden von Cobalt im Allgemeinen in einem pH-Bereich von 5 bis 10,5,
vorzugsweise 6,8 bis 7,8, insbesondere bei einem pH-Wert von etwa
7,4, statt. Die Verwendung von Cobalt ist eine bevorzugte Ausführungsform
vorliegender Erfindung, da Serum über eine ausreichende Pufferleistung
in dem engen bevorzugten pH-Bereich zum Binden von Cobalt (6,8 bis
7,8) verfügt,
wodurch zusätzliches
Puffern nicht erforderlich ist. Wenn jedoch Proben und Metallionen
verwendet werden, die ein Puffern erfordern, kann der Probe ein
Puffer zugesetzt werden, um den pH-Wert auf den gewünschten
optimalen Bereich zum Binden einzustellen. Solche Puffer sind allgemein
bekannt und im Handel erhältlich.
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Das
Binden von Metallionen an Proteine ist im Wesentlichen nicht temperaturempfindlich.
Das vorliegende Verfahren kann bei Temperaturen durchgeführt werden,
die von Raumtemperatur (20°C)
bis und über 50°C reichen.
Vorzugsweise wird das Verfahren bei etwa 20 bis 25°C durchgeführt. Falls
die Probe gekühlt oder
gefroren war, wird die Probe vor dem Testvorgang bei Umgebungstemperatur
zum Auftauen stehengelassen.
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Falls
die freien Metallionen unter Verwendung eines Verfahrens wie etwa
Atomabsorptionsspektroskopie direkt detektiert werden, kann eine
für die
Analyse geeignete Probe direkt aus der Probe hergestellt werden.
Bei der Verwendung solcher Verfahren werden die Metallionen der
Probe vorzugsweise in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt, die nach dem
Binden der Metallionen an die Thiolgruppen eines Proteins eine ungebundene
Metallionen enthaltende Probenlösung
bereitstellt. Es können
zusätzliche
Probenherstellungsschritte, wie etwa Filtrieren, ausgeführt werden,
um allfällige
restliche Niederschläge
zu entfernen.
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Das
direkte Detektionsverfahren (Atomabsorptionsspektroskopie) lässt eine
qualitative und quantitative Bestimmung der Gegenwart und der Menge
an enthaltenen freien Metallionen zu. Falls die anfängliche Menge
an Metallionen in der wässrigen
Lösung
bekannt ist, stellt die Detektion der in der Lösung vorliegenden freien Metallionen
nach der Bindung an ein Protein eine Messung der Anzahl an freien
Protein-Thiol-Gruppen und
folglich eine Messung der Thiolgruppenoxidation bereit. Es ist zweckdienlich,
standardisierte Metallionenlösungen
zu verwenden, die eine bekannte Menge an Metallionen enthalten.
Dies ermöglicht
beispielsweise Routineanalyse von Proben in einem medizinischen
Labor.
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Die
Menge an freien Metallionen in der Probe kann auch durch kolorimetrische
Verfahren detektiert werden. Nachdem die Probe mit Metallionen kontaktiert
worden ist, wird das Gemisch mit einer wässrigen Lösung einer farbbildenden Verbindung
(Thiol) kontaktiert, die mit jeglichen ungebundenen Metallionen
reagiert. Die farbbildende Verbindung sollte in einer Konzentration
in Wasser löslich
sein, die ausreicht, um mit allen verfügbaren ungebundenen Metallionen
zu reagieren. Zudem sollte die farbbildende Verbindung beim Nichtvorhandensein
von Metallionen kein Licht in jenem Wellenlängenbereich absorbieren, bei
dem das gefärbte Metallionen-Produkt
detektiert wird. Im Allgemeinen ist es erwünscht, dass die freie farbbildende
Verbindung beim Nichtvorhandensein von Metallionen Licht in einem
Detektionswellenlängenbereich
von etwa 400 bis 900 nm nicht absorbiert. Die farbbildende Verbindung
sollte ebenso gegen jegliche Zersetzung seitens in der Probe vorliegender
biologischer Komponenten stabil sein und dies unter den verfahrensgemäßen pH-Wert- und Temperaturbedingungen.
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Obwohl
alle mit den oben erläuterten
Eigenschaften ausgestatteten farbbildenden Verbindungen in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind Thiole bevorzugt und umfassen C2-6-Alkylthioalkohole, wie
etwa Mercaptoethanol, 2,3-Dimercaptopropanol, Dithioerythrit und
Dithiothreit; C2-6-Alkylthioamine, wie etwa
Mercaptoethylamin, Mercaptopropylamin, und dergleichen; C2-10-Alkylthiomonocarbonsäuren und zweiwertige Säuren, wie
etwa Dimercaptobernsteinsäure,
Mercaptopropansäure,
Mercaptoessigsäure
und Mercaptomalonsäure;
C2-10-Alkyldithiodicarbonsäure; Di-C1-6-alkyldithiocarbaminsäuren, wie etwa Dimethyldithiocarbaminsäure, Diethyldithiocarbaminsäure und
dergleichen; thiolhältige
Aminosäuren
und Peptide, wie etwa Cystein, β-Mercaptoisoleucin,
Glutathion, und dergleichen; und thiolhältige Enzyme, wie etwa Papain,
Phosphoenolpyruvat, Carboxykinase, 3-Phosphoglycerinaldehyd-Dehydrogenase,
Propionyl-CoA-carboxylase, Streptokokkenprotease und thiolhältige Carboxypeptidasen.
Als andere geeignete Thiole kommen 1,3,4-Thiadiazol-2,5-dithiol,
4'-Phosphopantethein
aus Coenzym A und Penicillamin in Frage.
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Andere
verwendbare farbbildende Verbindungen umfassen Pyridin-2-azo-p-dimethylanilin, α-Nitroso-β-naphthol, β-Nitroso-α-naphthol,
Dithiooxamid, Thiosemicarbazid, C1-6-Alkylthiosemicarbazide,
wie etwa 2-Methyl-3-thiosemicarbazid, 4-Methyl-3-thiosemicarbazid,
4-Methyl-3-thiosemicarbazid und 4-Ethyl-3-thiosemicarbazid, Formaldehydtryptophan,
Salicylaldehyd, Chinoxalin-2-carbosaldehyd-2-chloracetylaminomethylbenzimidazol
und Proflavinsalze, wie etwa Proflavinhemisulfat und -hydrochlorid.
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Insbesondere
bevorzugte Verbindungen sind Dithiothreitol, Cystein und Glutathion.
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Die
farbbildende Verbindung kann als wässrige Lösung in einer Konzentration
hergestellt werden, die ausreicht, um mit allen verfügbaren ungebundenen
Metallionen zu reagieren. Wenn die Menge an farbbildenden Verbindungen
zu groß ist,
kann sich eine große
Menge an Niederschlag mit Metallionen bilden. Wenn die Lösung zu
verdünnt
ist, wird die Detektion des gefärbten
Produkts erschwert. In der Praxis wird die Lösungskonzentration so eingestellt,
dass eine ausreichend gefärbte
Lösung
bereitgestellt wird, um die Lichtabsorption unter Verwendung eines
Spektralphotometers oder eines ähnlichen
Detektionsgeräts
nachweisen zu können. Die
Optimierung der Menge an farbbildender Verbindung kann routinemäßig bestimmt
werden.
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Die
der Probe zugesetzte Menge an Metallionen muss ausreichen, um alle
verfügbaren
proteingebundenen Thiolgruppen zu binden und einen Überschuss
an detektierbaren Metallionen bereitzustellen.
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Bei
der Anwendung von kolorimetrischer Detektion sollte die Menge an
zugesetzten Metallionen ausreichen, um ein gefärbtes Produkt bereitzustellen,
dass mittels eines Detektionsgeräts,
wie beispielsweise eines Spektralphotometers, detektiert werden
kann. Die Konzentration der Metallionenlösung beträgt vorzugsweise etwa 0,001
bis 0,100 M, noch bevorzugter 0,002 bis 0,01 M. Die Menge an zugesetzten
Metallionen in der Probe ist unterschiedlich und kann routinemäßig-eingestellt
werden, sofern die ungebundenen Metallionen gefärbte Produkte in ausreichender
Menge bilden, um diese zuverlässig
detektieren zu können.
Wenn zu viele Metallionen zugesetzt werden, ist die resultierende
Farbintensität
zu stark, um vom Detektionsgerät
genau bestimmt werden zu können.
Bei einer zu geringen Menge an Metallionen (einer zu hohen Menge
an Serum) werden lange Äquilibrierungszeiten
erforderlich und die Farbausbeute fällt zu gering aus. Die relativen
Mengen dieser Reagenzien können
routinemäßig bestimmt
werden, um optimale Absorptionsmessdaten mittels eines Spektralphotometers
oder eines anderen Detektionsgeräts
bereitzustellen.
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Je
nach Bedarf kann der Probe eine mit Blut isosmotische Salzlösung nach
Zugabe des Thiolreagens zugesetzt werden, um eine verdünnte Lösung mit
einer für
die Detektion geeigneten Farbintensität bereitzustellen. Die Verdünnung mit
isosmotischen Lösungen
verringert den Proteinniederschlag und Trübungen. Als bevorzugte isosmotische
Lösungen
gelten Lösungen,
die aus Natriumchlorid hergestellt werden, wobei andere Salze, wie
etwa Kaliumchlorid und Lithiumchlorid ebenfalls geeignet sind. Falls
die Zugabe der Thiollösung eine
für die
Detektion ausreichende Farbintensität bereitstellt, sind weitere
Verdünnungen
mit der isosmotischen Lösung
nicht erforderlich.
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Nach
Zugabe der farbbildenden Verbindungslösung zum Metallionen-Protein-Gemisch
und anschließender
Verdünnung,
kann die Farbintensität
des resultierenden Produkts, je nach Bedarf, unter Verwendung eines
herkömmlichen
Spektralphotometers gemessen werden. Das Absorptionsvermögen der
gefärbten
Produkte wird im Allgemeinen bei maximaler Absorptionswellenlänge des
hergestellten gefärbten
Produkts gemessen. Natürlich
hängt das
gefärbte
Produkt von der jeweiligen farbbildenden Verbindung und den im Verfahren
eingesetzten Metallionen ab. Die optimale Absorptionswellenlänge kann
mittels allgemein bekannter Verfahren routinemäßig bestimmt werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Set zur Verwendung bei der
Durchführung
oben beschriebenen Verfahrens bereit. Das erfindungsgemäße Set umfasst
ein Metallsalz, eine wie in Anspruch 14 definierte farbbildende
Verbindung und, je nach Bedarf, eine Lösung, die mit Blutplasma oder
Serum isosmotisch ist. Die wässrigen
Lösungen
des Metallsalzes und der farbbildenden Verbindung können gebildet
werden, indem den im Set enthaltenen Verbindungen lediglich Wasser
zugesetzt wird, um die gewünschten
Lösungen
zu erhalten. Alternativ dazu kann das Set die wässrigen Lösungen des Metallsalzes und
der farbbildenden Verbindung direkt enthalten. Das Set kann darüber hinaus
ein Testgefäß zum Vermischen
der Testprobe mit den oben angeführten
drei Komponenten enthalten. Die schnelle Detektion von ischämischen
Zuständen
ist durch Vermischen der Probe mit der Lösung des Metallsalzes möglich, wodurch
die Menge an freien Metallionen detektiert wird.
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Proben,
die normalen Patienten ohne zurückliegende
ischämische
Vorfälle
abgenommen wurden, ergeben Probenlösungen mit einer geringen Konzentration
an detektierbaren Metallionen und ein geringeres Absorptionsvermögen (weniger
Farbintensität)
als Proben, die Patienten mit ischämischen Vorfällen abgenommen
wurden. Proben, die beispielsweise Patienten abgenommen wurden,
die nichtkardiale Brustschmerzen haben, enthalten wesentlich weniger
detektierbare Metallionen als Proben von Patienten mit ischämischen Vorfällen, wie
etwa einem Myokardinfarkt oder einer instabilen Angina erlitten
haben. Die vorliegende Erfindung lässt zu, dass Proben von Patienten
getestet werden können,
die über
Brustschmerzen klagen, und ermöglicht
eine schnelle Bestimmung, ob die Brustschmerzen mit einem ischämischen
Vorfall in Zusammenhang stehen oder auf nichtkardiale Brustschmerzen
zurückzuführen sind.
Auf ähnliche
Weise kann der Genesungsverlauf eines Patienten mit zurückliegendem
ischämischen
Vorfall, wie etwa einem Myokardinfarkt, bewertet werden, indem dem
Patienten in regelmäßigen Abständen Gewebeproben
entnommen werden, um die Kreislaufleistungsfähigkeit und das Nachlassen
von ischämischen
Zuständen
zu bewerten.
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Andere
erfindungsgemäße Merkmale
werden im Zuge nachstehender Beschreibungen von exemplarischen Ausführungsformen
ersichtlich, die zur Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung der
Erfindung zu verstehen sind.
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BEISPIELE
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wurde Cobalt ausgewählt,
um mit proteingebundenen Thiolgruppen zu reagieren. Nichtumgesetztes
Cobalt wurde mittels Dithiothreitol detektiert, das zusammen mit Cobaltionen
ein braun gefärbtes
Produkt bildet. Das braun gefärbte
Produkt wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers bei einer
Wellenlänge
von 470 nm detektiert.
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Beispiel 1
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Materialien:
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Cobaltlösung: 200
mg CoCl2·6H2O
wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Zur Verwendung wurde diese
Lösung
100fach verdünnt.
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Dithiothreitollösung: 15
mg Dithiothreitol wurde in 10 ml destilliertem Wasser gelöst.
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Salzlösung: 0,9
g Natriumchlorid wurden in 100 ml Wasser gelöst.
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Serum:
2 bis 10 ml Blut wurden mittels Periphervenenpunktion erhalten und
gerinnen gelassen. Das Röhrchen
wurde bei 3.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und das überstehende
Serum in ein gesondertes Glas oder in einen Plastikbehälter übertragen.
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Plasma:
2 bis 10 ml Blut wurden in einen heparinisierten Vacutainer gezogen.
Das Röhrchen
wurde bei 3.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und das überstehende
Plasma in ein gesondertes Glas oder in einen Plastikbehälter übertragen.
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Es
wurden Seren von 22 Patienten erhalten, die einen Myokardinfarkt
oder einen ischämischen
Vorfall erlitten hatten. Zu 0,2 ml Serum oder Plasma jedes dieser
Patienten wurden in einem Teströhrchen
oder einer Küvette
50 μl CoCl2·6H2O zugesetzt und das Gemisch 10 Minuten lang
stehen gelassen. Jedem Röhrchen wurden
50 μl Dithiothreitol
zugesetzt und anschließend
vermischt. Die Röhrchen
wurden sodann 2 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen,
um die Bildung des gefärbten
Produkts zu ermöglichen.
Jedem Röhrchen
wurde anschließend
1 ml 0,9%iges NaCl zugesetzt, gefolgt von Vermischen, wonach das
Absorptionsvermögen
jedes einzelnen Röhrchens
unter Verwendung eines Spektralphotometers bei 470 nm abgelesen
wurde. Es wurden Kontrollröhrchen
hergestellt und durch Zugabe von identischem Serum, Cobaltchloridlösung und
Natriumchloridlösung,
jedoch keiner Dithiothreitollösung,
Tests durchgeführt.
Das Absorptionsvermögen
der Kontrollröhrchen
wurde ebenfalls bei 470 nm abgelesen und vom Testergebnis abgezogen.
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Bei
den 22 Patienten mit zurückliegendem
Myokardinfarkt oder ischämischem
Vorfall wurden ein Mittelwert und eine Standardabweichung von 0,62 ± 0,15
(n = 22) ermittelt. Die Kontrollen wiesen einen Mittelwert und eine
Standardabweichung von 0,27 ± 0,05
(n = 11) auf. Der t-Test nach Student ergab, dass die Mittelwerte als
statistisch signifikant galten. Normale Patienten mit nichtkardialen
Brustschmerzen wiesen einen Mittelwert von 0,32 ± 0,05 (n = 15) auf. Bei Patienten
mit instabiler Angina betrug der Mittelwert 0,61 ± 0,22
(n = 8). Siehe Tabelle 1.
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Diese
Ergebnisse machen deutlich, dass das vorliegende Verfahren zur Detektion
von ischämischen Zuständen eingesetzt
werden kann. Das vorliegende Verfahren ist als wirksames Verfahren
zur Unterscheidung zwischen ischämischen
kardialen Brustschmerzen von nichtkardialen Brustschmerzen zu sehen.