JPH04361160A - 蛋白質の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は蛋白質の測定法に関する
。より詳細には、臨床検査等の分野で用いられ、尿など
の検体中の蛋白質を測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、臨床検査等の分野では、尿、髄液
などの検体中の蛋白質の測定が頻繁に行われており、臨
床上重要な情報が得られている。例えば、尿中の蛋白質
（アルブミン、グロブリン等）は正常人でも認められる
が、腎疾患時の腎性蛋白尿、心不全等でみられる心臓性
蛋白尿、白血病、癌腫等で出現する悪液質性蛋白尿、発
熱疾患の際にみられる熱性蛋白尿、脳出血、てんかん等
のときの神経性蛋白尿、薬物中毒による中毒性蛋白尿な
どのように、各種の疾患時には尿中の蛋白質が増加する
ことが知られている。通常、正常人の蛋白質の尿中排出
量は１日１０〜１００ｍｇで、１日１５０ｍｇを超えた
場合には異常な蛋白尿と考えられており、臨床検査的に
は５〜１０ｍｇ／ｄｌ以上になると蛋白尿陽性と判断さ
れる。このように、尿中の蛋白質の測定（定性及び定量
）は臨床検査上重要な試験である。

【０００３】従来、蛋白質の測定法としては、ケルダー
ル法、ローリー法、ビュウレット法、クマシー・ブリリ
アント・ブルー法などが知られている。これらの方法に
おいて、ケルダール法は操作が複雑であり、日常のルー
チン作業に不向きである。ローリー法は検体中のアミノ
酸の影響を受け、尿中にはアミノ酸が多量に含まれてい
るので尿中の蛋白質を測定するには不適当である。ビュ
ウレット法は感度が低く、尿中の蛋白質のような微量成
分の測定には応用できない。クマシー・ブリリアント・
ブルー法は検体中の夾雑物の影響を受けやすく、また測
定できる濃度範囲が狭く、更に反応管や測定セルに青色
の付着物が残りやすいという問題があり、連続測定には
不適当である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このような従来法の問
題から、金属と色素からなる錯体（以下、便宜上、金属
−色素錯体という）を使用し、蛋白質の存在下における
当該錯体の吸収波長のシフトを用いて蛋白質を測定する
方法（以下、便宜上、金属−色素錯体法という）が提案
されている。例えば、ピロガロールレッドとモリブデン
酸塩とからなる錯体（極大吸収：４７０ｎｍ）は、蛋白
質（アルブミン等）が存在すると当該錯体の吸収波長が
長波長側（極大吸収：６０４ｎｍ）へシフトするので、
シフトした波長における吸光度を測定することにより蛋
白質を比色定量できることが報告されている（例えば、
分析化学、第３２巻、３７９頁、１９８３年参照）。

【０００５】この金属−色素錯体法は、微量の蛋白質を
高感度で測定することができ、また夾雑アミノ酸の影響
を受けず、更にセルなどの汚染も少ないという利点を有
する。しかし、この方法を尿などの検体中の蛋白質の測
定に用いると、検体中に含まれているキレート性成分（
例えば、クエン酸、シュウ酸、リン酸等）の影響を受け
、蛋白質の測定ができない。即ち、検体中のキレート性
成分により、金属−色素錯体の金属の一部が錯体から脱
離し、検体中のキレート性成分と錯体を形成する結果、
正常尿の多くの検体で吸光度が試薬ブランクよりも低値
を示し、蛋白質濃度として負値となることが認められた
。そのため、当該方法は測定感度に優れるものの実用に
供することができなかった。

【０００６】かかる問題を回避するため、ピロガロール
レッド−モリブデン錯体と、キレート剤及び／又は検体
中のキレート性成分と結合し得る金属を併用する方法（
通常、ピロガロールレッド法と称される）が実用化され
ている。しかし、ピロガロールレッド法においては、反
応が遅く、測定時間が長い（通常、２０分間程度）とい
う問題がある。本発明は上記従来技術の問題点を解消す
るためになされたもので、生体試料などの検体中の蛋白
質を高精度且つ迅速に測定する方法を提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情に
鑑み、金属−色素錯体法による蛋白質の測定法を鋭意検
討した結果、測定時に多価アルコールを存在させること
により、キレート性成分を含有する検体であっても蛋白
質を高精度且つ迅速に測定できることを見出して、本発
明を完成した。即ち、本発明の測定法は、金属と色素か
らなる錯体を使用し、蛋白質の存在下における当該錯体
の吸収波長のシフトを用いて蛋白質を測定する方法（金
属−色素錯体法）において、多価アルコールの存在下に
測定を行うことからなる。

【０００８】本発明の方法に用いられる金属−色素錯体
において、色素としては、金属と錯体を形成して着色（
又は着色度の増加）し且つ蛋白質の存在により当該錯体
の吸収波長のシフトが認められる色素であれば何れの色
素も用いることができ、例えば、ピロカテコールバイオ
レット、ピロガロールレッド、ガレイン等が好適に用い
られる。色素の使用量としては、通常、測定試料液中の
色素濃度が０．０００５〜０．１（Ｗ／Ｖ）％［以下、
特に明示のない限り、％は（Ｗ／Ｖ）を示す］、好まし
くは０．００１〜０．０５％となるように調整して用い
られる。

【０００９】また、金属としては、上記の色素と錯体を
形成して着色（又は着色度の増加）するものであれば各
種の金属を用いることができ、例えば、モリブデン、ス
ズ、鉄等が挙げられる。これらの金属は、通常、酸素酸
塩、ハロゲン化物、錯塩、有機又は無機酸塩の形態で用
いられ、例えば、モリブデン酸塩（アルカリ金属塩、ア
ンモニウム塩等）、スズ酸塩（アルカリ金属塩、アンモ
ニウム塩等）、塩化スズ、硫酸スズ、鉄酸塩（アルカリ
金属塩、アンモニウム塩等）、塩化鉄等が挙げられる。 金属の使用量としては、通常、測定試料液中の金属イオ
ン濃度が０．０００５〜０．１％、好ましくは０．００
１〜０．０５％となるように調整して用いられる。

【００１０】本発明で用いられる多価アルコールとして
は、グリコール類、糖アルコール類などの各種の多価ア
ルコールを用いることができ、例えば、マンニトール、
ソルビトール、ズルシトール、グリセロール、ポリグリ
セロール等が挙げられる。これらの多価アルコールは２
種以上を併用してもよい。多価アルコールの使用量は、
検体中のキレート性成分の含量などに応じて適宜調整す
ることができ、通常、測定試料液中の濃度が０．１〜１
０％程度、好ましくは０．５〜５％程度となるように調
整して用いられる。多価アルコールの使用量が０．１％
未満では添加効果が認められず、また１０％を超えて添
加しても問題はないが、１０％までで十分な効果が得ら
れる。本発明においては、多価アルコールは測定時に存
在しておればよく、金属−色素錯体を含有する試薬液に
多価アルコールを添加してもよく、また尿などの検体に
多価アルコールを添加してもよく、更に、試薬液と検体
の混合時に多価アルコールを添加してもよい。好適には
、金属−色素錯体を含有する試薬液に多価アルコールを
予め添加しておくのがよい。

【００１１】本発明の方法は、測定に際して多価アルコ
ールの存在下に行う以外は従来法と同様にして行うこと
ができる。その一例を示すと、まず、適当な溶媒（例え
ば、グリシン緩衝液等）に前記の色素と金属を所定量添
加して金属−色素錯体を形成させ、必要に応じてｐＨ調
整をすることにより、当該錯体を含有する試薬液を調製
する。この試薬液と、蛋白質を含有する検体（必要に応
じて、適宜希釈した希釈試料）とを混合して測定試料液
とし、室温程度で一定時間（例えば、１〜１０分間程度
）放置する。蛋白質により金属−色素錯体の吸収波長は
シフトするので、シフトした波長における吸光度を測定
する。一方、検体の代りに、蛋白質濃度既知の標準試料
液を用いて、同様な操作を行い、シフトした波長におけ
る吸光度を測定し、検量線を作成する。この検量線と、
上記の検体で得られた吸光度とを対比することにより、
検体中の蛋白質濃度を求めることができる。なお、本発
明は上記の方法に限定されるものではなく、金属−色素
錯体法の何れの方法にも適用できるものである。

【００１２】本発明においては、反応管、測定セル等の
汚染を防止するために、界面活性剤（例えば、ラウリル
硫酸ナトリウム、トリトンＸ−４０５等）を用いるのが
好ましい。界面活性剤は、好ましくは、金属−色素錯体
を含有する試薬液に予め添加され、界面活性剤の使用量
は試薬液中の界面活性剤濃度が０．１〜２％程度となる
ように調整すればよい。

【００１３】本発明の測定法は、尿、髄液などの検体中
の蛋白質の測定に用いられ、特に短時間（通常、１〜１
０分程度）に測定が終了するので自動分析装置を用いた
測定に好適である。また、試験紙法による蛋白質の測定
にも適用することができる。

【００１４】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 検量線の作成 　　精製水に下記の試薬を配合し、塩酸にてｐＨを２．
２に調整して下記の組成からなる試薬液を調製した。 試薬：　　グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１００ｍＭモリブデン酸アン
モニウム　　　　　　　　　　　　　　０．００６％ピ
ロカテコールバイオレット　　　　　　　　　　　　０
．００５％マンニトール　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１．０％トライトンＸ−４０
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％蛋白
標準液として、ヒト血清アルブミンを用いて、３００ｍ
ｇ／ｄｌとなるよう調製した。この標準液を使い、３０
、６０、９０、１５０、２４０、３００ｍｇ／ｄｌの希
釈系列を調製した。この検体５μｌに試薬液２００μｌ
を添加し、２５℃における５分後の６７５ｎｍの吸光度
を測定した。上記の検体の代りに精製水を用いて同様な
操作を行い、アルブミン濃度０ｍｇ／ｄｌにおける吸光
度を求めた。各アルブミン濃度に対して吸光度をプロッ
トして、検量線を作成した。その結果を図１に示す。図
１から明らかなように、広い濃度範囲にわたって直線性
を有する良好な検量線が得られた。

【００１５】実施例２ ヒト尿中の蛋白質の測定 　　実施例１と同様の操作で、ヒト尿検体１０例につい
て、蛋白質濃度の測定を行った。その結果を表１に示す
。表１に示されるように、本発明の方法によれば負値を
示さず、良好な測定値が得られた。また、比較例として
、同じ検体の蛋白質濃度を、従来法のピロガロールレッ
ド法（市販試薬を使用）により測定した。その結果を表
１に併せて示した。本発明方法と従来法との相関係数は
０．９６５（回帰式Ｙ＝０．９５１Ｘ−０．００５）で
あり、良好な相関性を示した。

【００１６】表１

【００１７】

【発明の効果】以上のように、本発明の蛋白質の測定法
においては、検体中のキレート性成分の影響を受けるこ
とがないので、測定値が負値を示すことがない。また、
短時間に測定を行うことができる。従って、本発明の方
法によれば、検体中の微量の蛋白質であっても高精度且
つ迅速に測定することができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定法による検量線を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　　　　　金属と色素からなる錯体を使
   用し、蛋白質の存在下における当該錯体の吸収波長のシ
   フトを用いて蛋白質を測定する方法において、多価アル
   コールの存在下に測定を行うことを特徴する蛋白質の測
   定法。
2. 【請求項２】　　　　　　多価アルコールが、マンニト
   ール、ソルビトール、ズルシトール、グリセロール及び
   ポリグリセロールから選ばれた１種又は２種以上を用い
   る請求項１記載の蛋白質の測定法。
3. 【請求項３】　　　　　　色素が、ピロカテコールバイ
   オレット又はピロガロールレッドである請求項１又は２
   記載の輸液製剤。
4. 【請求項４】　　　　　　金属が、モリブデン、スズ又
   は鉄である請求項１から３の何れかに記載の輸液製剤。