JPH0453265B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、蛋白、特に尿蛋白の微量比色定量法
に関する。 健康な人でも毎日尿中に20〜80mgの蛋白質を排
泄するといわれているが、この排泄される蛋白質
は通常粒子が小さく糸球体を通過し易いアルブミ
ンが主体である。一方、溶血がひどく血漿内に赤
血球のヘモグロビンが多量に遊出しこれが腎糸球
体から漏れたり、あるいは腎臓や尿路に炎症があ
る場合などには白血球を尿中に放出するので、グ
ロブリンを主体とする尿蛋白となる。尿蛋白は一
般に次のような場合に高値となり腎疾患の重要な
指針となる。 (1) 急性、および慢性腎炎、ネフローゼ。 (2) 心不全による腎の鬱血、その他。 (3) 熱性蛋白尿。 (4) 化学薬品中毒、細菌性中毒。 (5) 白血病、紫斑病。 (6) 狭窄、結石、腫瘍による尿管の閉塞。 (7) 脳腫瘍、癲癇、その他中枢神経系疾患、精神
感動。 (8) 膿、血液、精液などの混入。 (9) 卵など分子量の小さい蛋白質の多量摂取。 (10) 激しい運動、熱い湯又は冷水に長時間つかつ
た後に限われる一過性のもの。 (11) 体位相および若年性蛋白尿。 現在、一般に行なわれている尿蛋白測定を主体
とする微量蛋白定量法としては下記の如き方法が
ある。 (1) スルホサリチル酸法（鋭敏度 0.002％） （透明尿４〜５ml＋スルホサリチル酸20W／Ｖ
％溶液２〜３滴→白色混濁又は沈澱を生ずれば
蛋白陽性） (2) 煮沸試験法（鋭敏度 約0.005％） （透明尿５mlを１〜２分間煮沸し、混濁を生じ
たならば熱時５％酢酸、又は70％硝酸を１〜３
滴添加し、混濁が不変又は増加した場合は蛋白
陽性） (3) Robers法（鋭敏度 0.003％） （試料と硫酸マグネシウムの硝酸溶液とを等容
混合し境界面に白輪が生ずれば蛋白陽性） (4) 試験紙法（鋭敏度 0.03％） （テトラブロムフエノールブルーの蛋白呈色性
を利用） (5) クマシ−ブリリアントブルー法 （鋭敏度 0.001％） （色素と蛋白の結合による高感度測定法で、試
料50μ＋CBB−G250溶液３ml→595nｍの吸
光度を測定） (6) トリクロル酢酸沈澱によるビウレツト法 （検体（原尿）２ml＋蒸溜水２ml＋トリクロル
酢酸（10％溶液）混和後3000rpmで５分以上遠
心後上清を捨てる。沈澱にビウレツト試薬
（NaOH4％、酒石酸カリウムナトリウム結晶
4.5％、CuSO₄・5H₂O0.5％、ヨウ化カリウム
0.5％）２ml＋蒸溜水２ml混和後、37℃、30分
間加温し540nｍで比色） これらの内、スルホサリチル酸法、煮沸試験
法、Robers法は、比濁法又はそれに準ずる方法
で多量の試料を必要とし、しかも定量分析に適用
するには精度的に限界がある。一方クマシ−ブリ
リアントブルー法は比色法であるが、検量線が湾
曲することや、セル、試験管等の汚染があること
などから多数検体を連続処理するにはそぐわない
ものとされている。 又、トリクロル酢酸沈澱によるビウレツト法
は、沈澱分離操作を必要とするので操作が繁雑で
あり実用的ではない。 一方、分析化学Vol.32 379〜386（1983）によれ
ば、ピロガロールレツドとモリブデン酸塩混合物
（PR−モリブデン錯体）に蛋白（アルブミン）を
添加するとλmaxが長波長側にシフトし蛋白を高
感度で比色定量することが可能であるとの記載が
ある。しかしながら、文献記載の試薬に試料とし
て健常人の尿（スルホサリチル酸法で陰性）を使
用して蛋白濃度を測定すると殆んどの検体で吸光
度が試薬ブランクより低値となり蛋白濃度として
負値が算出される現象に遭遇する。従つて、この
方法をそのまま人尿検体を試料とした尿蛋白の測
定に適用することは不可能である。 かかる状況に鑑み、本発明者らはモリブデンと
錯体を形成し、更に蛋白の存在で波長がシフトす
る色素を用いる尿蛋白の測定法の実用化について
鋭意研究を重ねた結果、色素及びモリブデンを主
成分とする測定試薬中に予めモリブデンと結合し
得るキレート剤を添加するか、又は前記色素とは
反応せず、試料中に共存が予想されるシユウ酸、
クエン酸、リン酸、及びこれらの塩と結合し得る
金属イオンを添加することにより、その目的を達
成し得ることを見出し本発明を完成するに到つ
た。 即ち、本発明はモリブデンと錯体を形成し、さ
らに蛋白の存在で波長がシフトする色素を使用し
た微量蛋白定量法に於て、試薬中にあらかじめモ
リブデンと結合するキレート剤を添加するか、又
は前記色素とは反応せず、試料中に共存が予想さ
れるシユウ酸、クエン酸、リン酸及びこれらの塩
と結合し得る金属イオンを添加することを特徴と
する微量蛋白定量法である。 本発明は、ピロガロールレツド、ピロカテコー
ルバイオレツト等の色素がモリブデンと錯体を形
成し、この錯体が蛋白と結合して波長が長波長側
にシフトすることを利用して蛋白、特に尿蛋白の
比色定量を行うに当り、試料中に存在し、負値の
原因となるキレート剤、即ち有機酸又は／及びリ
ン酸塩類、又はこれらと同じ作用をもつキレート
剤を予め試薬中に添加しておくか、又は前記色素
とは反応せず、試料中に共存が予想されるシユウ
酸、クエン酸、リン酸、及びこれらの塩と結合し
得る金属イオンを添加しておくことにより、正常
尿が負値を示す現象を回避し、極めて高精度に尿
中蛋白の測定を行うことを可能ならしめたもので
ある。 即ち、ピロガロールレツド、ピロカテコールバ
イオレツト等の色素類は、モリブデンと錯体を形
成して着色する（或いは着色が増す）が、モリブ
デンと結合力のある他のキレート剤が存在する
と、モリブデンの一部はこれら色素類との結合か
ら離れ他のキレート剤と結合し、この為試薬盲検
値が低下する。試薬中にキレート剤を徐々に添加
していくと盲検値は添加量に従つて徐々に低下
し、ある添加量を越えると試料に由来するキレー
ト剤が混入されてきてももはやそれ以上に低下す
る現象が殆んど認められなくなり負値を示さなく
なる。又同様に試薬中にアルミニウムイオン、セ
リウムイオン等を添加すると試料中のキレート剤
（シユウ酸、クエン酸、リン酸等）はアルミニウ
ムイオン、セリウムイオン等と結合してモリブデ
ンとは結合しなくなり（又は結合する割合が少な
くなり）負値を回避することができる。従つて、
測定試薬中に予めモリブデンと結合し得るキレー
ト剤、若しくはアルミニウムイオン、セリウムイ
オン等の金属イオンを添加しておくことにより、
正常尿が負値を示す現象は解消されると同時に、
モリブデンと結合するキレート剤やアルミニウム
イオン、セリウムイオン等を含んだ試薬を用いて
高濃度の蛋白含有試料についても測定しても正確
な測定が可能となる。 本発明者らは、モリブデンと錯体を形成し、更
に蛋白の存在で波長がシフトする色素を使用した
尿蛋白の定量法に於て、これまで解明されていな
かつた正常尿が負値を示す原因について究明し、
その解決方法として、本発明者ら独自の知見に基
いて上記結論を導き出し本発明に到達した。 本発明の方法によれば、正常尿が負値を示すこ
ともなく、検量線は直線性に優れ定量性が良好で
あり再現性も良好である。又、クマシ−ブリリア
ントブルー法のように、セルや試験管等を汚染す
るようなこともないので多数検体を連続処理する
のにも適しており、自動分析装置への適用が可能
であり、又試験紙に適用することも可能である。 本発明に於て用いられるキレート剤としては、
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ヒドロキシ
エチルエチレンジアミン三酢酸（EDTA−OH）、
エチレンジアミン二酢酸（EDDA）、イミノ二酢
酸（IDA）、ニトリロプロピオン酸（NTP）、ニ
トリロ三酢酸（NTA）、ヒドロキシエチルイミ
ノ二酢酸（HIDA）、クエン酸、酒石酸、シユウ
酸、１−ヒドロキシエタン１，１−ジホスホン
酸、ピロリン酸、ヘキサメタリン酸、トリポリリ
ン酸、メタリン酸等が挙げられる。その添加量は
添加するキレート剤により異なるが、通常0.001
〜１％の範囲で蛋白測定条件下でのそのキレート
剤のキレート生成定数や溶解度を考慮して適宜選
択すれば良い。又、これらは単独で用いても２種
類以上の混合物で用いても良く、又溶解性を増す
為にこれらをナトリウム、カリウム、リチウム等
のアルカリ金属塩やアンモニウム塩等として塩の
型で添加してもよい。 又本発明に使用可能の金属イオンとしては、ア
ルミニウムイオン、セリウムイオン（、）等
が適当である。本発明に於て使用可能な色素とし
ては、モリブデンの存在下アルブミンと定量的に
錯体を形成するピロガロールレツド（PR）、ブロ
ムピロガロールレーツド、ピロカテコールバイオ
レツト（PV）、ｏ−ヒドロキシヒドロキノンフタ
レン、ガレイン等の色素が挙げられる。これら色
素類の使用量は通常0.0005〜0.1％である。又こ
れら色素類と錯体を形成するモリブデンは、通常
モリブデン酸のアンモニウム塩、若しくはアルカ
リ金属塩として用いられるがこれらに限定される
ものではない。その使用量は例えばモリブデン酸
塩の場合、モリブデン酸イオンの濃度として通常
0.0005〜0.1％程度が用いられる。 表１にPR−MoO₄処方に於けるキレート剤の
添加効果を示す。キレート剤の添加により正常尿
での測定値が負値より正値となることが判る。
又、キレート剤種や添加量を選択すれば、アルブ
ミンに対する感度も上昇しさらにアルブミンとグ
ロブリンの発色比も改善される。

【表】 試液〓

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ モリブデンと錯体を形成し、さらに蛋白の存
   在で波長がシフトする色素を使用した微量蛋白定
   量法に於て、試薬中にあらかじめモリブデンと結
   合するキレート剤を添加するか、又は前記色素と
   は反応せず、試料中に共存が予想されるシユウ
   酸、クエン酸、リン酸及びこれらの塩と結合し得
   る金属イオンを添加することを特徴とする微量蛋
   白定量法。 ２ 微量蛋白が尿蛋白である、特許請求の範囲第
   １項記載の定量法。 ３ キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸
   （EDTA）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン
   三酢酸（EDTA−OH）、エチレンジアミン二酢
   酸（EDDA）、イミノ二酢酸（IDA）、ニトリロプ
   ロピオン酸（NTP）、ニトリロ三酢酸（NTA）、
   ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（HIDA）、クエ
   ン酸、酒石酸、シユウ酸、１−ヒドロキシエタン
   １，１−ジホスホン酸、ピロリン酸、ヘキサメタ
   リン酸、トリポリリン酸、メタリン酸、及びこれ
   らの塩類の内、１種又は２種以上である特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の定量法。 ４ 金属イオンがアルミニウムイオン又は／及び
   セリウムイオンである特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の定量法。 ５ 色素がピロガロールレツド又はピロカテコー
   ルバイオレツトである特許請求の範囲第１項〜第
   ４項のいずれかに記載の定量法。