JP2749615B2 - 新規な指示薬化合物、その製造法及び鉄分析系における該化合物の使用 - Google Patents

新規な指示薬化合物、その製造法及び鉄分析系における該化合物の使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般式（Ｉ） 式中、R1は水素、ハロゲン又はC1−C4アルキルを表わ
し、R2はC1−C4アルキル、アリールもしくはヘテロアリ
ール、あるいは置換されたC1−C4アルキル、アリールも
しくはヘテロアリールを表わす、 で示される化合物、及びその製造方法に関する。これ等
の化合物は鉄分分析系に用いることができる。
鉄の代謝の種々の変化はこの元素の欠乏症及び過多症
の両方として表われる。鉄欠乏症は広く浸透しており明
らかに栄養不良の人々の他に高度に発展した国々の人々
にも影響を及ぼしている。鉄欠乏症は主といて月経に伴
う大きな鉄の損失の為に婦人に影響を及ぼし、増大した
鉄の要求の為に妊婦をむしばみ、更に潰瘍もしくは他の
急性又は慢性出血が原因の患者をむしばんでいる。ま
た、新生児は特にこの病気にかかりやすい。
鉄欠乏の診断、炎症疾患中の低血中鉄と鉄欠乏症の区
別及び治療の監視の為には正確でかつ再現性のよい試験
所用のテスト方法が要求されている。
この分野における試験室の診断は次に示すものの測定
を本質的に利用している。すなわち、 血中鉄 血中トランスフェリン 血中フェリチン 血球容積及びヘモグロビン 遊離赤血球プロトポルフィリンである。
他のすべての試験方法は診療所においてほとんど確立
されているが、遊離赤血球プロトポルフィリン試験は現
在実験段階から診療所における日常テスト用に発展しつ
つある。
ここで血中鉄という用語は血漿中に現実に運ばれる鉄
分の濃度、従ってトランスフェリンに結合した鉄の濃度
をいう。それは体の鉄分の含量の確実な指標ではないけ
れども、鉄イオン分析は貯蔵された鉄の量の状態を推定
する為に価値のあるものである。鉄欠乏症もしくは過多
症をひきおこしうる主たる原因は次の表１で示される。
表１ 血中鉄の変化の原因 減少の原因 食物中の鉄の不十分な摂取 （乳幼児、菜食主義者） 吸収の欠陥、 （全体的なあるいは部分的な胃切除術、無塩酸症、慢
性下痢症及び脂肪性下痢症） 長期にわたる血液損失 （胃潰瘍、十二指腸潰瘍その他による慢性出血） 要求量の増大 （妊娠、授乳） RE系の細胞中の鉄分の貯蔵 （慢性もしくは他の感染症） 増加の原因 赤血球分解の増大 （溶血性貧血、オートアンチコルパル貧血（autoanti
corpal amenia）） ヘモグロビン合成の量 （悪性貧血、シデロアクレスティック貧血（sideroac
hrestic amaemia）） 急性肝臓疾患 （ウイルス性肝炎、毒性肝炎） 血鉄症 ヘモクロマトージス（血色素沈着症） 鉄欠乏は通常の貧血症に到る前に種々の段階を経て徐
々に進行するのが一般的である。ここで注意すべきは低
血中鉄濃度は必ずしも鉄欠乏の状態の存在を反映しない
ということである。血中鉄はさらに貯蔵された鉄量の飽
和の状態の変化が顕著になった時に初めて正常な状態か
ら著しくそれる。
血中鉄はかなり変化しやすいパラメーターである。そ
れは、１日の中でも又日によってもかなり変化するもの
であり、その変化はよく知られている。
種々の研究者が24時間周期の血中鉄分の存在量につい
て記しているが、それによればピークは午前８時から10
時の間にあり夕刻遅くになって低い値を示す。特に興味
深いことは、夜間に働くとより高い値が午後にシフトす
ることであり、これは睡眠と活動のサイクルに符号して
おり、その結果リズムは逆になるように思われる。
文献に報告されているレファレンスインターバルも
（reference intervals）また異なる。すなわち中でも
正常値は年令（新生児においてより高い値が示され成人
においてより低い値が示される）及び性（男性において
わずかに高い値が示される）のような生理学的な要因に
よっても影響をうける。
血中鉄が生物学的に変わりやすいということ及び細胞
の壊死過程（急性肝臓疾患）によって増大する可能性が
あるということならびに炎症症状（トランスフェリンと
の結合によって）の故に減少する可能性があるというこ
とはこの測定の診断上の価値を損っている。
更に詳しい情報を得る為には例えば［鉄の臨床上の意
義及び試験方法（Iron Clinical Significance and Met
hod of Assfy）］（1986年発行、マイルスイタリアーナ
（Miles Italiana）S.p.A.のエームスディブジョン（Am
es Division）によって編纂）を参照することができ
る。
鉄分析の最も重要な問題は分析対象物の濃度が低いと
いうこと特に病気の場合にそうであるということであ
る。更に鉄とトランスフェリンとの強固な結合は、鉄を
この担体蛋白から遊離せしめる為に過激な反応条件（分
析系における）が要求される。例えば銅によってひきお
こされる干渉も又重大な問題である。
本発明はここに新規な化合物を提供するがこれは鉄分
析系において指示薬化合物として非常に有用なものであ
る。本発明化合物と鉄との錯体は高い感受性を示すばか
りでなく、低いpH領域においても非常に高い安定性を示
す。低いpHにおける鉄−指示薬錯体の安定性は非常に望
ましいことである。というのはこれが安定であると蛋白
トランスフェリンの担持から鉄を遊離せしめるのに過激
な条件が必要とされないからである。
本発明は一般式（Ｉ） 式中、R1は水素、ハロゲンもしくはアルキルを表わ
し、R2はC1−C4アルキル、アリールもしくはヘテロアリ
ール又は置換されたC1−C4アルキル、アリールもしくは
ヘテロアリールを表わす、 で示される化合物に関するものである。
好ましい化合物は、式（Ｉ）で表わされる化合物にお
いて、R1が水素を表わし、R2がC1−C4アルキル、アリー
ルもしくはチエニルを表わす場合であって、これ等の基
がC1−C4アルキル、水素、ハロゲンもしくはSO3Hによっ
て置換されていてもよい化合物である。
より好ましいものは、R1が水素を表わし、R2がメチ
ル、エチル、プロピル、フェニル、トリルもしくはチエ
ニルを表わす式（Ｉ）の化合物である。
特に本発明は、R1が水素を表わしR2が式 式中R11は水素、メチル又は塩素を表わす で示される基を表わす式（Ｉ）の化合物に関するもので
ある。
最も好ましい化合物は次式 で示される化合物である。
本発明は更にこれ等の化合物の１つを含む、試料中鉄
分の検出もしくは定量試験の為の分析系に関するもので
ある。
好ましい態様においては、この鉄分析系は更に式 で示される還元性化合物を含む。
従って本発明は、又鉄の分析にこの化合物を使用する
ことにも関する。このキノリン化合物は鉄分析系におい
て必要なFe+++からFe++への還元の為に非常に有用であ
ることがわかった。従来技術において知られているアス
コルビン酸や他の還元剤もまた本発明のこの新しい指示
薬を共に用いることができるが上記のキノリン化合物は
還元の目的の為に好ましいものである。従って本発明は
また鉄分の測定のための分析系において還元剤として３
−ヒドロキシ−1,2,3,4−テトラヒドロ−ベンゾ（ｈ）
−キノリンを使用することにも関する。
この鉄分析系は更に、例えば緩衝剤、湿潤剤、安定剤
のようなものと反応しない物質を含むことができる。
試薬の組み合わせは上記の化合物から調製することが
できる。試薬組成物は溶液の形をとることもできるし、
あるいは粉体の形をとることもできあるいは錠剤の形を
とることもできあるいは凍結乾燥品の形をとることもで
きる。試薬組成物（未だ溶液の形をとっていない場合に
は）は、水もしくは他の適当な溶媒に溶かし試薬溶液を
調製する。試薬の組み合わせが個々の成分からなる場合
には、これ等はたがいに混合されるべきである。試料
（例えば血液、血清、血漿、又は尿）を試薬混合物の一
定量と混合した後生じた色を光度計で測定し、モル吸光
係数及び加えられた試薬及び試料の体積からあるいは鉄
の標準水溶液から計算される。
鉄分析計は更に緩衝計と共に、あるいは適当な湿潤剤
及び活性化剤ならびに他の補助剤と共に吸収性試薬担体
例えば鉄やフリースのような物に含浸せしめることがで
きる。この為に１もしくはそれ以上の含浸用溶液を、そ
れ等の試薬もしくは補助剤がどのように溶解するかによ
り水性溶液、有機性溶液もしくは混合溶液の形で調製す
ることができる。吸収性もしくは膨潤性の担体、好まし
くはろ紙又はガラスもしくはプラスチック性の吸収性フ
リースがこれ等の溶液で含浸されるかもしくは噴霧され
る。そしてこの担体は次に乾燥される。かくして調製さ
れた試薬担体は液体中（例えば血液、尿もしくはだ液の
ような体液中、例えば果汁、ミルクのような食物中）の
分析対照物の含量の直接測定用の迅速診断具としても用
いることができる。これ等の液体はこの試薬担体に直接
塗布されるかもしくはこれを体液柱にちょっと浸せきす
る。比較の標準色を、このようにして形成された色と対
比することによって半定量分析が可能である。定量的な
評価は反射分光分析によって行うことができる。
本発明の試験剤を注型溶液から調製される担体マトリ
ックスに導入することも可能である。可能な実例は、セ
ルロース、セルロース誘導体ゼラチン、ゼラチン誘導体
又はポリウレタン類及びポリアクリルアミドのようなプ
ラスチックスである。この試験剤及び、有用ならば他の
必要な試薬類をこの注型溶液に直接加えることもここで
は有利である。このことは担体と試薬からなる試験具を
１つの操作で製造することが可能であることを意味す
る。
吸収性担体から水又は緩衝液又は結品を用いて上述し
た試薬類を溶出せしめることにより、試薬溶液を調製す
ることができ、これを用いて上述したように分光計のセ
ルの中で分析対照物もしくは酵素類を測定することがで
きる。
湿潤剤は、特に陰イオン性及び陽イオン性、非イオン
性もしくは両性の湿潤剤である。
適切であると思われる他の補助剤は、他の色原体を用
いる対応する試験法において知られているような、通常
の増粘剤、可溶化剤、乳化剤、光学的増白剤、コントラ
スト媒体のようなものである。
本発明の化合物の製造法は次のような例によって示す
ことができる。
必要な出発物質は文献［例えば：Acta．Chem．Scan
d.,23,1087ページ以下（1969）；Ｊ．Amer．Chem．So
s.,75,1115ページ（1953）;Organikum,Organish,Chemis
ches Grundpraktikum,325ページ以下（1970］に知られ
ている。
調製例 実施例１ 6.44gの３−（２−ピリジル）−5,6−ビス（２−チエ
ニル）−1,2,4−トリアジンを０℃で力価25％の発煙硫
酸25ml中に入れた。得られた反応混合物を放置して室温
にもどしさらに24時間かきまぜた。次に、このスルフォ
ン化混合物を約100gの氷の中に注ぎ、少量のNaOHで平衡
化せしめ、沈澱を減圧下でろ過した。8.4gの黄色粉が単
離されたがこれは水中で鉄（II）イオンと青色（λmax
＝593nm、Ｃ＝34000）を形成する。NMRスペクトルから
この粉体が次に示す可能な異性体の１つであることが明
らかである 参考例１ 実施例１で必要とされる３−（２−ピリジル）−5,6
−ビス（２−チエニル）−1,2,4−トリアジンを次のよ
うにして調製した。
すなわち、13.6gピコリンアミドラゾンおよび22.2gの
テニールを室温下125mlのエタノール中でかきまぜた。2
4時間後反応混合物をロータリーエバポレータで濃縮
し、残渣を無水アルコールから再結晶化せしめた。Ｃ−
13NMRのデーターは次の通りである。
Ｃ−1:150.40D Ｃ−2:125.33D Ｃ−3:139.01D Ｃ−4:124.04D Ｃ−5:160.04D Ｃ−6:152.63S Ｃ−7:149.54aS Ｃ−8:＊＊＊＊a.S Ｃ−9:136.89S Ｃ−10:131.73D Ｃ−11:129.60D Ｃ−12:128.83D Ｃ−13:137.11D Ｃ−14:128.27D Ｃ−15:129.81D Ｃ−16:132.32D 参考例２ 284gの５酸化リンを2500mlのトルエンと250mlチオフ
ェンの混合物中で撹拌した。次に、300gのトリル酢酸を
少しずつ80℃で加えた。続いて、得られた混合物を５時
間かきまぜ、次に表の中に注いだ。得られた有機層を分
離し、乾燥しロターリエバポーレータで濃縮した。残渣
を水性エタノールから再結晶化せしめると326gの次式 JR＝1660cm-1（Ｃ＝０） が得られた。
参考例３ 27.75gの二酸化セレンを250mlジオキサンと20mlの水
の混合物中に懸濁せしめた。参考例２のチオニルケトン
54.0gをこの懸濁液に加え得られた混合物を次に還流下
６時間加熱した後減圧下でろ過して残渣をのぞき得られ
た反応混合物をロータリーエバポレータで濃縮した。
で示される褐色の油49.2gが得られたこれは精製するこ
となくさらに次の工程に附した。
参考例４ 参考例３で調製されたジケトン23.0gを100mlのエタノ
ール中のピコリンアミドラゾン13.6gと共に還流下で加
熱した。生成したトリアジンは、沸騰加熱下でもうすで
に結晶化していた。１時間後混合物を冷却し、減圧下で
ろ過した。
融点191℃の黄色粉33.9gが単離された。スペクトルか
らは、生成物は次に示される２つの異性体のうちの１あ
るいは他方であると明確には言い切ることはできない。
参考例５ 参考例４のトリアジンを実施例１で記載された方法に
従って力価25％の発煙硫酸と反応させるとモノスルホン
化された化合物が得られるが、これは次に示す構造の１
つを有するものとすることができる。
計算価;C,52.77;H,3.03;N.12.96; O,11.1;S,14.83;Na,5.31. 実測価;C,52.3;H,3.1;N.13.0; S,15.0. 実施例２ 6.44gの３−（２−ピリジル）−5,6−ビス（２−チエ
ニル）−1,2,4−トリアジンをスルホン化された１水化
物50ml中で50℃で７時間かきまぜ、得られた混合物を実
施例１に記載された様にして処理すると融点が250℃以
上の次に示す化合物が3.2g得られた。
参考例６ ピリジニルチオフェンを参考例４に記載されたように
ピコリンアミドラゾンと反応させると、次に示す２つの
可能なトリアジンのうちの１つが収率80％［JR;1385cm
-1（−CH3）］で得られた。
参考例７ 参考例６のトリアジン誘導体を、50℃の温度で１水塩
中でスルホン化した。後処理後、次式の１に対応する黄
色粉が収率65％で得られた。
元素分析 計算価:C,43.82;H.2.55;N.15.72; O,13.47;S,17.99;Na,6.45. 実測価;H,44.00;H,2.45;S,18.2. 試験例 次の鉄分試験においては、実施例１の化合物を指示薬
として用いた。
試験の原理 ヒト血清中の鉄分を賛成媒体中で担体蛋白であるトラ
ンスフェリンから遊離せしめ、同時に還元剤により二価
の鉄の形に還元せしめる。指示薬と二価の鉄イオンのキ
レートは安定な青色の錯体を形成するがその593nm（ナ
ノメーター）における分光光度計による読みの吸光度は
鉄分含量に比例する。脱蛋白は必要ではない。血清マト
リックス効果を保障する為に試料ブランクが必要であ
る。
材料及び方法 実験（方式の最適化、直線性、比較研究その他）は次
の仕様に従って行われた。
試料：（病院の日常業務の中から得られたヘパリンを加
えたヒト血漿もしくはヒト血清（そのままのものもしく
は鉄イオンを添加したもの）を用いた。鉄分の水溶液
を、硝酸を用いて金属鉄（NBS剤code937）を溶かし蒸留
水を用いて適当な濃度に希釈することにより調製した。
装置：ダブルビーム型分光光度計（モデル ラムダ５、
パーキン エルマー社製）を用いた。
材料：鉄分の指示薬は実施例１の化合物であり、他のす
べての化合物は試薬グレードの材料であった。実際に用
いる溶液は、緩衝剤、還元剤、チオ尿素（存在する可能
性がある銅による干渉を抑制するため）及び指示薬化合
物を含んでいる。指示薬化合物を含まない溶液も試料ブ
ランク用に調製した。比較試験の為にセラパック鉄分試
験用キット（SERA−PAK Iron kit）（エームス デビジ
ョン、マイルスイタリアーナS.p.A.のFerene−Ｓによ
る）を用いた。
試験操作 波 長:593nm（570〜610） キュベット：光路長1cm 温 度：室温 読 み：試薬ブランクに対する標準試料及び 試料について；蒸留水に対する試料ブラ
ンクについて ピペットによる試験管中への採取： 混合し室温で５分間放置する。蒸留水に対する試料ブラ
ンク（Asb）の吸光度及び試薬ブランクに対する試料（A
s）及び標準（Ast）の吸光度を読とる。
最適化の研究 pHの最適化 次に示す成分を含む配合物を用いて出発する。
指 示 薬 3.5mmol/L チ オ 尿 素 63mmol/L アスコルビン酸 10mmol/L 緩 衝 剤 180mmol/L; pH領域0.5−5.0 濃度が薬200、500及び100μg/dlの３種類の鉄イオン
水溶液及び約300μg/dlの鉄分を含む２種類のヒト血漿
試料を用いて鉄分試験に対するpHの効果を調べた。所定
のpH範囲をカバーする為に異なったタイプの緩衝剤を用
いた。
pH0.5−1.0−1.5−2.0に対し KCl/HCl pH2.0−2.5−3.5に対し クエン酸/NaOH pH3.0−4.5−5.0に対し 酢酸/NaOH 発色を593nmで監視し、室温で５分後（反応の終点）
吸光度を測定した（Fig.1参照）。３種類の鉄分の水溶
液及び２種類の血漿材料に対する平均の吸光度を計算
し、pHに対してプロットした（Fig.1）。
これ等のデーターから本発明の指示薬化合物はトラン
スフェリンからの鉄分の遊離を促進する為にpHが１ない
しそれ以上、好ましくは約１において用いることができ
る。
緩衝剤の選択 pH1において緩衝溶液を与えることができる化合物を
選択した。例えば、緩衝剤としてKCl/HCl又はクエン酸
又はマロン酸を用い、pH1.0で試験を行い、鉄分0.3mol/
Lの水溶液とヒト血漿を用いた。吸光度応答及び反応時
間に差は認められなかった。試験された全ての化合物
は、ヒト血清に対し同じ緩衝能を有することが判った。
還元剤の選択及び最適化 アスコルビン酸は、三価鉄イオンを還元するために一
般的に用いられる還元剤であるが、残念なことに、この
化合物は、それを溶液にした場合、ほんの2,3時間安定
であるにすぎない。したがって、一般に、市販の鉄用キ
ットにおいては、アスコルビン酸は、試験溶液に手で添
加さるべく粉の形で供給される（Sera−Pak鉄用キット
を参照）。即座で使用可能な溶液を得るために、研究が
行われより安定で適切な還元剤が見出された。
３−ヒドロキシ−1,2,3,4−テトラヒドロ−ベンゾ
（ｈ）キノリン（HTBQ）： が、酸錯体、アスコルビン酸中で三価鉄イオンを二価イ
オンに還元し、トランスフェリンからの鉄の遊離を促進
するために大変適していることが判った。
次に示す成分： HCl/KCl緩衝液、pH1.0; 100mmol/L 指示薬 3.5mmol/L チオ尿素 63mmol/L を含有する配合物を用いて出発した。
HTBQを０〜25mmol/Lの範囲の濃度で加え、反応５分後
593nmに対する吸光度応答を、鉄分の水溶液及び２種の
ヒト血漿材料を用いて、記憶した。Fig.2のデータは、
最少量５−10mmol/LのHTBQが必要であり、約10mmol/Lの
濃度が好ましいことを示している。
指示薬の最適化 HCl/KCl緩衝液、pH1.0 200mmol/L チオ尿素 63mmol/L HTBQ 20mmol/L を含む配合物から出発した。
これに指示薬を0.5〜10mmol/Lの濃度範囲で加え、５
分間の反応後593nmにおける吸光度応答を、鉄分の水溶
液及び２種の異なったヒト血漿試料を用いて、監視し
た。Fig.3のデータは、最少限2.5−3mmol/Lの指示薬が
必要であり、約3.5mmol/Lの濃度が好ましいことを示し
ている。
行われた最適化の研究から、次の事柄が判った。
1.pH:この系は、１〜５のpH範囲で作動するが、pH＝１
が鉄のトランスフェリンからの解離を促進するために好
ましい。3.0を超えるpHを選択する場合には、試験溶液
に界面活性剤を加えて、起りうる試料の濁りを防止する
のが好ましいが、この目的のためにTritonX−100又はTw
een10を濃度0.5％で使用することができる。５を超える
pHについては試験していないが、トランスフェリンから
鉄を解離せしめる適切な成分を用いればこの系は作動可
能であると思われる。
2.緩衝剤：種々のタイプの化合物を用いることができる
（例えば、クエン酸、マロン酸、HCl/KCl）。
3.モーラル濃度（Molarity）：起りうるヒト試料の濁り
を防ぐために、400mmol/L未満、好ましくは約200mmol/L
の緩衝液のモーラル濃度が好ましいが、適切な界面活性
剤を用いれば、400mmol/Lを超えるモーラル濃度も使用
することができる。
4.還元剤:HTBQでアスコルビン酸を置き換えるのが好都
合である。5mmol/Lを超える濃度が提案されるが、約20m
mol/Lの濃度が好ましい。
5.指示薬化合物:2.5mmol/Lを超える濃度が提案される
が、約3.5mmol/Lの濃度が好ましい。
6.チオ尿素:pH1.0の配合物を用いる場合には、この成分
は必要ではなく、その使用を避けることができる。この
pH値を超える場合には、銅による干渉を抑制するため63
mmol/Lの濃度が満足すべきものである（データは示され
ていない）。
性能の確認 先に報告した試験操作及び次に示す成分： HCl/KCl干渉液、pH1.0 200mmol/L 指示薬 3.5mmol/L HTBQ 20mmol/L を含む配合物を用いて、性能の確認を行った。
直線性のテスト 金属鉄（NBS材）を硝酸に溶かして調製し、蒸留水を
用いて適当な濃度に希釈した三価鉄イオンの標準水溶液
を三回試験した。Fig.4は、少なくとも100μg/dlの鉄分
まで直接性を示している。
比較研究 Sera−Pak鉄用キットと本発明の配合物を用いて比較
試験を行った。25個のヘパリン添加ヒト血漿を試料とし
て用いた。
得られた結果を、線型法によって統計的に精緻にした
ものをFig.5に示した。二つの方法の相関は大変良い。
【図面の簡単な説明】
第１図は、鉄分水溶液及び血漿試料の、pHと593nmにお
ける平均吸光度の関係を示すグラフである。 第２図は、HTBQ（還元剤）の添加量と測定サンプルの吸
光度（593nm）の関係を示すグラフである。 第３図は、指示薬の濃度と測定サンプルの吸光度（593n
m）の関係を示すグラフである。 第４図は、鉄分量と吸光度（593nm）の関係を示すグラ
フである。 第５図は、セラ・パック（SERA−PAK）と本発明の指示
薬配合物を用いたときの相関を示すグラフである。 第６図及び第７図は、波長と吸光度の関係を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルベルト・フグル ドイツ連邦共和国、ディー‐5060 ベル グ・グラッドバッハ ２、ゲマルケンヴ ェーク ９ (72)発明者 クラウス・ヴェーリング ドイツ連邦共和国、ディー‐5060 ヴッ ペルオル １、アム・ローム 121 (56)参考文献 特開 昭57−58680（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（Ｉ） （式中、R1は水素、ハロゲン又はC1−C4アルキルを表わ
    す）で示される化合物又はその塩。
  2. 【請求項２】R1が水素を表わす、請求項１記載の化合物
    又はその塩。
  3. 【請求項３】式 で示される化合物又はその塩。
  4. 【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物
    又はその塩を含む、試料中の鉄分の検出もしくは定量分
    析のための分析試薬。
  5. 【請求項５】さらに、式 で示される化合物を含む、請求項４記載の分析試薬。
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