PT100724B

PT100724B - Processo de determinacao da quantidade de grupos tiol ligados em proteinas e conjunto para a deteccao de estados isquemicos

Info

Publication number: PT100724B
Application number: PT100724A
Authority: PT
Inventors: David Bar-Or; Clive Solomons
Original assignee: Diagnostic Markers Inc
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1999-07-30
Also published as: US5290519A; DE69233487T2; ATE290688T1; CA2113266A1; EP1411356B1; CA2520598A1; ATE424559T1; ES2239753T3; EP1411356A2; PT100724A; AU1000697A; WO1993003346A1; KR100239947B1; EP0596925A1; JP3194952B2; BR9206312A; AU2318792A; NO940256D0; EP0596925A4; NO313900B1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Antecedentes do invento

Campo do invento presente invento refere-se a um processo rápido para a detecção de estados isquémicos e a um conjunto para utilização nesse processo. Mais particularmente, o invento refere-se à medição da proteína ligada a grupos tiol (SH) para determinar a presença ou a ausência de isquemia.

Discussão dos antecedentes

A doença progressiva da artéria coronária pode estar bem avançada sem sintomas clínicos significativos, tais como a dor no peito ou a dispneia. A oclusão súbita de um ramo de uma artéria coronária resultando num enfarte do miocárdio (EM) assinala dramaticamente a presença de uma doença da parede arterial, há muito existente, tal como a calcificação da intima e da parede, bem como a estenose progressiva do lúmen da artéria.

Imediatamente a seguir a um incidente cardíaco isquémico, são libertadas proteínas no sangue. Após um incidente cardíaco isquémico são libertadas proteínas bem conhecidas, que incluem a creatina-quinase (CK), a transaminase glutâmica oxalacética do soro (SGOT) e a desidrogenase láctica (LDH). Um processo bem conhecido para avaliar a ocorrência de incidentes cardíacos isquémicos passados é a detecção destas proteínas no sangue de um paciente. A patente US 4 492 753 refere-se a um processo similar de avaliação do risco de incidentes cardíacos isquémicos futuros. 0 tecido cardíaco afectado liberta proteínas para a corrente sanguínea após incidentes tanto isquémicos como não isquémicos.

Os pacientes que são submetidos a cirurgia não cardíaca podem experimentar isquemia perioperativa. Os electrocardio74 117

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-3gramas destes pacientes mostram desvios do segmento ST com uma causa isquémica, que estão altamente correlacionados com a incidência de incidentes cardíacos adversos pós-operatórios. No entanto, os desvios do segmento ST ocorrem também na ausência de isquemia e, por consequência, este processo não distingue os incidentes isquémicos dos não isquémicos.

A isquemia é causada, frequentemente, por doença dos vasos arteriais. Uma característica da doença dos vasos arteriais é a progressão do estado ateromatoso para o estado esclerótico, no qual grandes quantidades de cálcio entram na musculatura arterial. A arteriosclorose progride com ,o decorrer do tempo. A quantidade de cálcio intracelular aumenta, ao passo que a saída cardíaca permanece essencialmente normal. O cálcio intracelular activa a protease calpaina, a qual converte a xantina-desidrogenase em xantina-oxidase. A xantina-oxidase actua na xantina e na hipoxantina para formar radicais livres, incluindo o radical hidroxilo (OH·) e o radical superóxido (02*). Estes radicais livres oxidam por sua vez as membranas celulares e as proteínas nas regiões da molécula, que são ricas em grupos tiol. Ver The Role of Perfusion - Induced Injury in the Pathogenesis of Crush Syndrome, New Enql. J. Med. . 324:1417-1422 (1991).

Existe a necessidade de um processo para fazer a distinção entre incidentes isquémicos e não isquémicos, particularmente em pacientes cardíacos. Após pesquisa substancial, verificou-se que o presente processo, baseado nas interacções de ligação metal-proteína, era capaz de detectar estados ou incidentes isquémicos num paciente.

É bem conhecido que os iões metálicos são capazes de se ligarem a grupos de ligação a metal nas proteínas (Multiple Equilibria in Proteins, J. Steinhard e J. Reynolds, Acad. Press, CH-VI. pág. 214 e seg.). Os iões metálicos podem formar ligações covalentes com as proteínas ou, alternativamente, formar complexos de coordenação, quando o ião metálico está quelado por ligandos da molécula de proteína (Enzvme and

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-4Methabolic Inhibitors, Vol. II. J. L. Webb, (1966), Acad. Press, capit. 4, página 635 e seg.).

A capacidade dos iões metálicos se ligarem a proteínas forma a base das manchas de prata para proteínas em geles de poliacrilamida. A patente US 4 468 466 pré-trata um gel com detiotreitol (DTT), antes da mancha com iões de prata reduzir a mancha de fundo. A patente US 4 434 234 proporciona um tratamento subsequente com sais carbonato ou sulfato para obter manchas de cores diferentes.

Em alguns casos, os iões metálicos reagem com as proteínas para formarem precipitados. As reacções de precipitação de metal-proteína foram utilizadas em processos para a determinação quantitativa de proteína (US 4 786 605) e na precipitação total ou fraccionária das proteínas de uma solução contendo proteínas (US 4 486 282).

Sumário do invento

Um objectivo do presente invento é proporcionar um processo rápido de detecção dos estados isquémicos num paciente.

Um objectivo adicional do invento é proporcionar um processo de avaliação de pacientes, reabilitados, que sofrem de isquemia, enfarte do miocárdio) para determinar a eficiência circulatória tanto em descanso como durante o exercício.

Um outro objectivo é proporcionar um processo rápido para suplementar os resultados electrocardiográficos na determinação da ocorrência de verdadeiros incidentes isquémicos.

Um objectivo adicional do invento é proporcionar um conjunto para utilização com estes processos.

Estes e outros objectivos do invento que se tornarão evidentes da especificação seguinte foram conseguidos pelo presente processo de detecção de isquemia num paciente, que

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-5compreende os passos de:

a) pôr em contacto uma amostra de soro, plasma, fluido ou tecido de um paciente com um ião metálico, capaz de se ligar à referida amostra num local de ligação de ião metálico, para formar uma mistura, contendo iões metálicos, ligados na amostra, e iões metálicos não ligados na amostra, e

b) detectar a quantidade dos iões metálicos não ligados na amostra.

invento proporciona também um conjunto capaz de realizar este processo.

Descrição detalhada das concretizações preferidas processo do presente invento permite que se detecte rapidamente a presença de estados isquémicos num paciente. Quando aqui utilizado o termo rápido significa que a detecção é possível numa hora, de preferência em 30 minutos. Quando aqui utilizado, o termo incidente isquémico significa que o paciente experimentou uma isquemia local e temporária devido a obstrução da circulação sanguínea para um orgão.

O presente invento proporciona um processo para detectar estados isquémicos por um processo rápido utilizando a ligação de iões metálicos a proteínas de tecido. Em pacientes que experimentaram um incidente isquémico, o número de grupos tiol (SH) nas proteínas contidas no soro, plasma, fluído ou tecido do paciente é reduzido devido à oxidação pelos radicais hidroxilo e superóxido. Acredita-se que esta oxidação ocorra, quando o cálcio intracelular activa a protease calpaína, formando assim xantina-oxidase a partir da xantina-desidrogenase. A xantina-oxidase actua na xantina e na hipoxantina para produzir radicais livres, que oxidam os grupos tiol nas proteínas. A oxidação dos grupos tiol tem como resultado a formação de grupos mais altamente oxidados incluindo o dissulfureto (S-S), S0₃, etc.. A requerente verificou que a quantidade relativa de

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-6proteína ligada aos grupos SH, numa amostra funciona como um indicador da oxidação que ocorre durante a vida biológica da proteína. Apesar de não estar ligada por qualquer teoria particular, acredita-se que o presente processo quantifica grupos tiol ligados a proteína numa amostra, como uma medida dos danos de oxidação para a amostra que resultam de um incidente isquémico, e detecta assim o incidente isquémico.

No presente processo, uma amostra de soro, plasma, fluido ou tecido de um paciente é feita reagir com iões metálicos, geralmente na forma de uma solução aquosa do sal, de modo que os iões metálicos fiquem ligados aos locais, de ligação a metal na . proteína contida na amostra. Os iões metálicos ligam-se a proteínas contendo locais de ligação de iões metálicos, tais como os grupos tiol, hidroxilo, carbonilo, amino, imidazolo, hidroximetionilo e guanidínio, presentes nos aminoácidos que constituem a proteína. A adição dos iões metálicos à amostra pode precipitar uma pequena quantidade de complexo metal-proteína, mas tal precipitação não é necessária nem desfavorável para o processo do presente invento.

Uma quantidade em excesso predeterminada de sal de ião metálico é posta em contacto com a proteína na amostra e os iões metálicos são deixados ligar à proteína. Por excesso entende-se uma quantidade de iões metálicos maior do que a que é estequiometricamente requerida para ligar todos os grupos tiol disponíveis na proteína da amostra. Ê adicionado um excesso de iões metálicos, de modo que a mistura resultante contenha iões metálicos livres, que possam ser detectados para se obter uma medida do número de grupos tiol presentes na amostra. Uma vez que é conhecida a quantidade total dos iões metálicos inicialmente adicionados, a detecção dos iões metálicos livres remanescentes na amostra proporciona uma medida da quantidade dos iões metálicos ligados à proteína e, consequentemente, a quantidade de grupos tiol disponíveis.

Os iões metálicos livres remanescentes após a complexação dos grupos tiol proteicos podem ser detectados por quaisquer

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-7meios convenientes. Os processos de detecção de iões metálicos livres numa amostra são conhecidos na arte e incluem métodos tais como as reacções colorimétricas utilizando um reagente que produz uma substância colorida resultante da reacção com os iões metálicos livres, bem como a medição directa dos iões metálicos, utilizando processos que incluem a espectroscopia de absorção atómica, a espectroscopia de emissão atómica, etc.. Pode ser aplicado qualquer processo de detecção e de quantificação de iões metálicos conhecido numa amostra, para detectar os iões metálicos remanescentes após complexação com grupos tiol proteicos. De preferência, os iões metálicos são detectados colorimetricamente através da formação de.um complexo colorido e da detecção do complexo colorido espectrofotometricamente.

Numa concretização preferida do processo de detecção colorimétrica, a mistura sal metálico/amostra é feita contactar com uma solução aquosa de um composto tiol. O composto tiol reage com os iões metálicos livres para formar um produto colorido. A intensidade do produto colorido é proporcional à quantidade dos iões metálicos presentes na mistura sal metálico/amostra e, consequentemente relaciona-se com a . quantidade de grupos tiol ligados à proteína na amostra. Medindo a intensidade da cor da solução colorida resultante é possível obter uma medida dos grupos tiol ligados à proteína presentes originalmente na amostra.

Obviamente, os compostos formadores de cor diferentes dos compostos tiol podem ser utilizados para formarem um produto colorido com os iões metálicos livres, desde que seja formado um produto tendo cor detectável, quando for empregue a detecção colorimétrica. Outros compostos formadores de cor adequados incluem soluções de hidróxido de metal, soluções de hidróxido de amónio, soluções de cianeto de metal, soluções de tiocianato de amónio, etc.. Estes compostos formadores de cor e outros compostos que formam soluções coloridas com iões metálicos são bem conhecidos na arte e descritos, por exemplo, em A. I. Vogel, Quantitative Chemical Analysis, Longmans, Green and Co., J. R. Marston e D. W. Dewey, J. Exptl. Biol. Med. Sei., 18:343 (1940);

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J. H. Yoe e C. J. Barton, Ind. Enq. Chem., Anal. Ed., 12:405 (1940) e D. L. Tsalev e V. K. Zaprianov, Spetroscopy, CRC Press, Boca Ratan FL (1983). Estas referências são aqui incorporadas por referência para uma descrição completa dos reagentes aqui descritos, que podem ser utilizados como o composto formador de cor no presente invento.

A amostra que pode ser utilizada no presente invento inclui qualquer amostra de tecido, soro, plasma ou fluido, contendo proteínas que sejam capazes de se ligar a iões metálicos. As amostras de tecidos podem ser obtidas dos órgãos corporais para a detecção da ocorrência de um incidente .isquémico que afecte o órgão. Os órgãos adequados incluem qualquer órgão que tenha um fornecimento de sangue ou uma matriz proteica capaz de oxidação, incluindo o coração, as artérias, as veias, o fígado, etc.. A amostra pode ser também plasma sanguíneo e soro bem como outros fluidos corporais tais como linfa, fluido cerebroespinal, saliva, etc.. A amostra pode ser obtida por biópsia e técnicas da amostragem de fluidos, convencionais, bem conhecidas. As amostras preferidas são o plasma e o soro sanguíneos.

Quando é utilizada a detecção colorimétrica, a amostra não deve conter outros compostos de ligação a metal que liguem ou ou originem quelação dos iões metálicos não ligados na amostra, interferindo assim com a reacção colorimétrica. Os compostos de ligação a metal que não devem ser adicionados à amostra ou estar presentes na mesma incluem o citrato, o oxalato, o borato, o ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), etc. usados como anticoagulantes, estabilizadores ou em soluções tampão.

Os resultados óptimos são obtidos com amostras contendo uma grande concentração de proteínas tendo grupos tiol disponíveis para ligação de ião metálico. O plasma sanguíneo e o soro são preferidos, uma vez que estas amostras contêm quantidades substanciais de albumina, o que se verificou serem particularmente eficazes para ligarem iões metálicos. Apesar do plasma sanguíneo e o soro serem amostras preferidas, pode ser usada no presente invento qualquer amostra contendo uma

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-9concentração substancial de proteínas tendo grupos tiol disponíveis.

As proteínas que não têm grupos tiol disponíveis para a ligação de ião metálico não interferem com o presente processo. No entanto, uma amostra contendo apenas proteínas que não têm grupos tiol disponíveis não serão eficazes na ligação de iões metálicos e, consequentemente, ineficazes no presente processo. A presença ou a ausência dos grupos tiol numa proteína pode ser ensaiada rotineiramente por processos conhecidos. As proteínas que podem estar presentes, mas não se ligam suficientemente aos iões metálicos para utilização no presepte processo incluem a hemoglobina, a mioglobina, a 'tí-globulina, a transferina, a ferritina, a glutationa (forma oxidada) e a putrescina. Similarmente, a presença de outras substâncias, que não se ligam aos iões metálicos não interferem com o presente processo. Tais substâncias que não interferem incluem o ácido lipoico, a nitroglicerina, o nitrato de sódio, a cistina, a homocistina, e a homocisteína (em baixas concentrações como relatado por Genest et al). A não interferência da homocisteína é surpreendente, visto que a homocisteína tem um grupo tiol disponível e sabe-se que está presente em pacientes com doença arterial prematura (J.J. Genest et al. J.A.C.C., 1990, 16:1114-1119). Foram detectados níveis plasmáticos da homocisteína da ordem de 10 nanomolar por mililitro. No entanto, esta concentração é tão baixa que é incapaz de afectar de modo mensurável a ligação de ião metálico. Consequentemente, estes compostos não interferem com o presente processo, quando os mesmos estão presentes na forma livre ou na forma ligada a proteína.

Os iões metálicos, que podem entrar em reacção com a proteína na amostra, incluem qualquer ião metálico que seja capaz de ligação a um local de ligação de ião metálico numa proteína. Quando é utilizada a detecção colorimétrica, o ião metálico deve também ser capaz de formar um produto colorido. A determinação da ligação de ião metálico a proteínas e a formação de produtos coloridos de ião metálico são conseguidas rotineira e facilmente utilizando processos conhecidos. A formação de

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-10produtos coloridos é determinada pela preparação de uma série de diluição de um composto de formação de cor desejado, por exemplo, um tiol, em água e adicionando o ião metálico escolhido (como o sal metálico) em soro ou solução tamponada. 0 desenvolvimento da cor é determinado visualmente. A capacidade de um ião metálico se ligar com as proteínas na amostra pode ser determinada por meios conhecidos.

Os iões metálicos são geralmente adicionados à amostra como sais metálicos dissolvidos numa solução aquosa. Os iões metálicos preferidos são os metais de transição dos grupos lb-7b e 8 da Tabela Periódica dos Elementos. Os iões metálicos particularmente preferidos incluem V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg, Cd, Fe, Pb, Au, e Ag. Os iões metálicos mais preferidos são Ni, Fe, Mn e Co. Se desejado, podem ser usadas misturas destes iões metálicos.

Os iões metálicos são adicionados de preferência à amostra como soluções aquosas. As soluções podem ser preparadas dissolvendo simplesmente um sal de ião metálico em água para obter a concentração de iões metálicos desejada. Qualquer contra-anião pode ser utilizado para o ião metálico desde que o contra-ião não interfira com a ligação ião metálico-proteína ou a formação do produto colorido de ião metálico, quando são utilizados meios de detecção colorimétricos. Os aniões adequados incluem o nitrato, o nitrito, o cloreto, o sulfato e o carbonato. É, particularmente preferido, o cloreto de cobalto.

A ligação de ião metálico às proteínas está dependente do pH. 0 pH óptimo para ligação variará com o ião metálico individual utilizado no processo. Um pH apropriado para a ligação de ião metálico à proteína pode ser obtido pela utilização de um tampão de pH para controlar o pH da amostra para a gama de pH óptimo para ligação de ião metálico à proteína. Por exemplo, a ligação de cobalto ocorre geralmente numa gama de pH de 5-10,5, com uma gama de ligação preferida a pH 6,8-7,8, mais preferivelmente cerca de 7,4. A utilização de cobalto é uma concretização preferida do presente invento, uma

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-11vez que o soro tem um poder de tamponagem na gama estreita de pH de ligação preferida do cobalto (6,8-7,8), é desnecessária tamponagem adicional. No entanto, se forem utilizados amostra e iões metálicos que requerem tamponagem, deve ser adicionado um tampão à amostra para ajustar o pH para a gama de ligação óptima desejada. Tais tampões são bem conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

A ligação ião metálico-proteína não é substancialmente sensível à temperatura. O presente processo pode ser conduzido a temperaturas que variam desde a temperatura ambiente (20°C) até e acima* de 50°C. De preferência, o processo é conduzido a cerca de 20-25°C. Se a amostra for arrefecida ou congelada, a amostra é deixada descongelar até à temperatura ambiente antes do teste.

Quando os iões metálicos livres são detectados directamente utilizando um processo, tal como a espectroscopia de absorção atómica, uma amostra adequada para análise, pode ser preparada directamente a partir da amostra. Quando se utilizam tais processos, é preferível adicionar os iões metálicos à amostra na forma de uma solução aquosa que, após a ligação do metal aos grupos tiol da proteína, proporciona uma solução de amostra contendo iões metálicos não ligados. Os passos de preparação de amostra adicionais, tais como por exemplo, a filtração, podem ser realizados para remover quaisquer precipitados residuais.

O processo de detecção directo (espectroscopia de absorção atómica) permite que se determine qualitativa e quantitativamente a presença e quantidade dos iões metálicos livres presentes. Se é conhecida a quantidade inicial de iões metálicos na solução aquosa, a detecção dos iões metálicos livres presentes na solução após a ligação à proteína proporciona uma medida do número dos grupos tiol da proteína livres e portanto uma medida da oxidação dos grupos tiol. É conveniente utilizar soluções de iões metálicos padronizadas, contendo uma quantidade de iões metálicos conhecida. Isto permite, por exemplo, a análise de rotina das amostras num laboratório médico.

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-12A quantidade de iões metálicos livres na amostra pode ser também detectada por meios colorimétricos. Após a amostra ter sido posta em contacto com os iões metálicos, a mistura é posta em contacto com uma solução aquosa de composto de formação de cor (tiol), que reage com quaisquer iões metálicos não ligados. O composto de formação de cor deve ser solúvel em água a uma concentração suficiente para reagir com quaisquer iões metálicos não ligados disponíveis. Adicionalmente, o composto de formação de cor não deve absorver luz na ausência dos iões metálicos na gama de comprimentos de onda em que o produto colorido de ião metálico é detectado. Geralmente, é desejável que o composto de formação de cor livre não absorva luz ,na ausência dos iões metálicos na gama de comprimentos de onda de detecção de cerca de 400-900nm. 0 composto de formação de cor deve também ser estável a qualquer degradação devida aos componentes biológicos presentes na amostra e deve ser estável nas condições de pH e temperatura do processo.

Apesar de qualquer composto de formação de cor, tendo as propriedades salientadas atrás, poder ser utilizado no presente processo, são preferidos os tiois e incluem alquilC₂_₆tioalcoois, tais como por exemplo, mercaptoetanol, 2,3-dimercaptopropanol, ditioeritritol e ditiotreitol; alquilC₂_₆tioaminas, tais como mercatoetiloamina, mercaptopropilamina, etc.; ácidos e diácidos alquilC₂_2Q tiomonocarboxílico, tais como ácido dimercaptossuccínico, ácido mercaptopropiónico, ácido mercaptoacético e ácido mercaptomalónico; ácidos dialquilC^_gditiocarbâmicos, tais como ácido dimetilditiocarbâmico, ácido dietilditiocarbâmico, etc.; aminoácidos e péptidos contendo tiol tais como por exemplo cisteína, beta-mercapto-isoleucína, glutationa, etc.; e enzimas contendo tiol tais como papaína, fosfoenol-piruvato, carboxiquinase,

3-fosfogliceraldeído-desidrogenase, propionil-coenzima A-carboxilase, protease de estreptococos e carboxipeptidases contendo tiol. Outros tiois adequados incluem 1,3,4-tiadiazolo-2,5-ditiol, coenzima-A 4'-fosfopanteteína e penicilamina.

Os compostos particularmente preferidos são o ditiotreitol,

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-13cisteína e glutationa.

Os compostos de formação de cor podem ser preparados como uma solução aquosa, tendo uma concentração suficiente para reagirem com todos os iões metálicos não ligados disponíveis. Se a concentração do composto de formação de cor for demasiado alta, pode ser formada uma grande quantidade de precipitado com os iões metálicos. Se a solução for demasiado diluída, é difícil a detecção do produto colorido. Na prática, a concentração da solução é ajustada de modo a proporcionar uma solução suficientemente colorida, para que a absorção da luz possa ser detectada utilizando um espectrofotómetro.ou equipamento similar de detecção. A optimização da concentração do composto de formação de cor pode ser determinada de modo rotineiro.

A quantidade de ião metálico adicionado à amostra deve ser suficiente para ligar todos os grupos tiol ligados à proteína, disponíveis, e proporciona um excesso de iões metálicos detectáveis.

Quando é utilizada a detecção colorimétrica, a quantidade de iões metálicos adicionados deve ser suficiente para proporcionar um produto colorido, que pode ser detectado por um detector tal como um espectrofotómetro. A concentração da solução de iões metálicos é, de preferência, de cerca de 0,001-0,100M, mais preferencialmente 0,002-0,010M. A quantidade de iões metálicos adicionados à amostra variará e pode ser ajustada de modo rotineiro, desde que os iões metálicos não ligados formem produto suficientemente colorido para ser detectado de forma segura. Se forem adicionados demasiados iões metálicos a intensidade de cor resultante é demasiado alta para ser determinada com exactidão pelo detector. Se a quantidade de iões metálicos for demasiado baixa (a quantidade de soro é muito alta) são necessários longos períodos para equilíbrio e a produção de cor é muito pequena. As quantidades relativas destes reagentes podem ser determinadas de modo rotineiro para proporcionarem leituras de absorvância óptimas, com um espectrofotómetro ou outro detector.

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-14Se necessário, pode ser adicionada uma solução salina isosmótica com o sangue à amostra após a adição do reagente tiol para proporcionar uma soluçãa diluída, tendo uma intensidade de cor adequada para a detecção. A diluição com soluções isosmóticas minimiza a precipitação de proteína e a turvação. As soluções isosmóticas preferidas são soluções preparadas a partir do cloreto de sódio, apesar de outros sais tais como por exemplo o cloreto de potássio e o cloreto de lítio serem também adequados. Se a adição da solução de tiol proporcionar uma intensidade de cor adequada para a detecção, não é necessária diluição adicional com a solução isosmótica.

Após a adição da solução do composto de formação de cor à mistura ião metálico-proteína e diluição subsequente, se necessário, a intensidade de cor do produto resultante pode ser medida com um espectrofotómetro convencional. A absorvância do produto colorido é, geralmente medida no comprimento de onda de absorvância máximo para o produto colorido que é produzido. Obviamente, o produto colorido dependerá do composto de formação de cor particular e do ião metálico que são utilizados no processo. 0 comprimento de onda de absorvância óptimo pode ser determinado de modo rotineiro, por processos conhecidos.

O presente invento proporciona também um conjunto para utilização na realização do processo atrás descrito. 0 conjunto de teste do presente invento contém um sal metálico, um composto de formação de cor e, se necessário, uma solução isosmótica com plasma sanguíneo ou soro. Podem ser formadas soluções aquosas do sal metálico e do composto de formação de cor, adicionando água aos compostos contidos no conjunto de teste para se obter as soluções desejadas. Alternativamente, o conjunto pode conter directamente soluções aquosas do sal metálico e do composto de formação de cor. 0 conjunto pode conter também um recipiente de teste para se misturar a amostra de teste com os três componentes atrás salientados. A detecção rápida de estados esquémicos é possível através da mistura de uma amostra com a solução do sal metálico, e a detecção da quantidade dos iões metálicos livres.

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-15As amostras retiradas de pacientes normais, que não sofreram um incidente esquémico, produzem soluções de amostra, tendo uma concentração baixa de iões metálicos detectáveis e uma absorvância mais baixa (menos intensidade de cor) do que as amostras retiradas dos pacientes que sofreram um incidente isquémico. As amostras retiradas dos pacientes que, por exemplo, sofreram dores no peito não cardíacas, contêm substancialmente menos iões metálicos detectáveis do que pacientes que soferam um incidente isquémico, tal como por exemplo, enfarte do miocárdio ou angina instável. O presente processo permite testar amostras de um paciente, que se queixa de dores no peito, e determinar rapidamente se esta dor no peito está associada a um incidente isquémico ou é simplesmente dor no peito não cardíaca. De modo semelhante, pode ser avaliado o progresso de um paciente que recupera de um episódio isquémico, tal como por exemplo, enfarte do miocárdio, pela amostragem de tecidos do paciente em intervalos regulares para avaliar a eficiência circulatória e o abaixamento das condições isquémicas.

Serão evidentes outras características do invento no decurso das descrições que se seguem de concretizações exemplificativas, que são dadas para ilustração do invento e não se destinam a limitá-lo.

Numa concretização preferida, foi seleccionado cobalto para reagir com grupos tiol ligados a proteína. O cobalto que não reagiu foi detectado com ditiotreitol, que forma um produto de cor castanha com os iões de cobalto. 0 produto de cor castanha foi detectado utilizando um espectrofotómetro num comprimento de onda de 470 nm.

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Exemplo 1

Materiais:

Solução de cobalto: dissolveram-se 200mg de CoCl₂’6H₂o em 2 ml de água destilada. Para utilização, esta solução foi diluída 100 vezes.

Solução de ditiotreitol: dissolveram-se 15 mg de ditiotreitol em 10 ml de água destilada.

Solução salina: dissolveram-se 0,9 g de cloreto de sódio em 100 ml de água.

Soro: obtiveram-se 2-10 ml de sangue por venipunctura periférica e deixou-se coagular. O tubo foi centrifugado a 3 000 rpm durante 5 minutos e o soro sobrenadante foi transferido para um recipiente de vidro ou plástico separado.

Plasma: retiraram-se 2-10 ml de sangue para um recipiente de vácuo heparinizado. 0 tubo foi centrifugado a 3 ooo rpm durante 5 minutos e o plasma sobrenadante foi transferido para um recipiente de vidro ou plástico separado.

Obtiveram-se soros de 22 pacientes, conhecidos como tendo tido um enfarte do miocárdio ou incidente isquémico. Foram adicionados 50 μΐ de CoCl₂*6H₂0 a 0,2 ml de soro ou plasma de cada um destes pacientes, num tubo ou receptáculo de teste, e a mistura foi deixada repousar durante 10 minutos. Foram adicionados 50 μΐ de solução de ditiotreitol a cada tubo seguidos de mistura. Os tubos foram deixados repousar à temperatura ambiente durante 2 minutos para permitir a formação do produto colorido. Foi então adicionado 1 ml de NaCl a 0,9 % em peso/vol. a cada tubo, seguindo-se mistura e foi lida a absorvância de cada tubo utilizando um espectrofotómetro a 470 nm. Foram preparados tubos de controlo e testados por adição de soro, solução de cloreto de cobalto e solução de cloreto de sódio idênticas, mas não de solução de ditiotreitol. Foi também

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-17lida a absorvância dos tubos de controlo a 470 nm e subtraída do resultado do teste.

Verificou-se que 22 pacientes, conhecidos como tendo tido um enfarte do miocárdio ou incidente isquémico, tinham um valor médio e um desvio padrão de 0,62 ± 0,15 (n = 22). Os controlos tinham uma média e um desvio padrão de 0,27 ± 0,05 (n = 11). As médias eram estatisticamente significativas pelo teste-t de Student. Os pacientes normais com dor no peito não cardíaca tinham um valor médio de 0,32 ± 0,05 (n = 15). Os pacientes com angina instável tinham um valor médio de 0,61 ± 0,22 (n = 8). Ver tabela 1.

Tabela 1

Absorvância	Enfarte do miocárdio (%)	Angina instável (%)	Dor no peito não cardíaca (%)	Normal (%)
0,2-0,29	—	—	20,0	72,8
0,3-0,39	4,5	12,5	80,0	27,3
0,4-0,49	18,0	12,5	—	—
0,5-0,59	22,6	37,5	—	—
0,6-0,69	18,1	12,5	—	—
0,7-0,79	18,0	—	—	—
0,8-0,89	18,0	—	—	—
0,9-0,99	—	25,0	—	—
X ± D.P.*	0,62 ± 0,15	0,61 ± 0,22	0,32 ± 0,047	0,27 ± 0,048
t = 6,9 p < 0,0001	+	—	+
t = 9,3 p < 0,0001	+	-	-	+
t = 0,13 p < 0,5	+	+	—	—

*

D.P. = desvio padrão

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-18Estes resultados indicam que o presente processo pode ser utilizado para detectar estados isquémicos. O presente processo é eficaz na distinção entre dor no peito cardíaca isquémica e dor de peito não cardíaca.

Obviamente, são possíveis numerosas modificações e variações do presente invento à luz dos ensinamentos atrás proporcionados. Deve, consequentemente, ser compreendido que dentro do âmbito das reivindicações anexas, o invento pode ser posto em prática de modo diferente do descrito especificamente aqui.

Claims

REIVINDICACÕES

1 - Processo de determinação da quantidade de grupos tiol ligados em proteínas e detecção de um incidente isquémico num paciente, caracterizado por compreender os passos de

a) pôr em contacto uma amostra de soro, plasma, fluido ou tecido retirado do paciente, com iões metálicos capazes de se ligarem aos grupos tiol da referida amostra para formar uma mistura contendo iões metálicos ligados na amostra e iões metálicos não ligados na amostra e,

b) detectar a quantidade dos iões metálicos não ligados na amostra, para determinar a quantidade dos referidos grupos tiol na amostra.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido passo de detecção compreender a detecção directa da quantidade dos referidos iões metálicos não ligados na amostra.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida detecção directa compreender espectroscopia de absorção atómica ou de emissão atómica.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido passo de detecção compreender a detecção colorimétrica da quantidade dos iões metálicos não ligados na amostra.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender pôr em contacto a referida mistura com uma solução aquosa de um composto formador de cor, para formar uma solução colorida, e detectar a intensidade de cor da referida solução colorida, para detectar a quantidade dos referidos iões metálicos não ligados na amostra.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender adicionalmente diluir a referida solução colorida com uma solução aquosa isosmótica com soro ou plasma

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-20sanguineo, antes do referido passo de detecção.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida amostra ser soro ou plasma.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido composto formador de cor ser um tioálcool alquílico C₂_₆, alquilC₂_₆tioamina, ácido alquilC₂_₁₀tiomonocarboxilico, ácido alquilC₂_₁₀tiodicarboxílico, ácido alquilC₂_₁₀ditiodicarboxílico, ácido di-alquilC-j__g-ditiocarbâmico, aminoácido contendo tiol, péptido contendo tiol ou enzima contendo tiol.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido composto formador de cor ser ditiotreitol, cisteina ou glutationa.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido composto formador de cor ser ditiotreitol.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ião metálico ser um ião de metal de transição dos grupos lb-7b ou 8 da tabela periódica de elementos.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ião metálico ser seleccionado do grupo que consiste em V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg, Cd, Fe, Pb, Au, e Ag.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ião metálico ser cobalto.
14 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido passo de detecção ser conduzido numa gama de pH de 5 - 10,5.

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15 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido passo de detecção ser conduzido utilizando um espectrofotómetro.
16 - Conjunto para a detecção da presença de um incidente isquémico num paciente, caracterizado por o referido conjunto compreender um sal metálico e um composto formador de cor, capaz de formar um composto colorido com o sal metálico.
17 - Conjunto de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por, pelo menos, ou o referido sal metálico ou o composto formador de cor estar na forma de uma solução aquosa.
18 - Conjunto’ de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente uma solução de sal isosmótica com o plasma ou soro sanguíneos.
19 - Conjunto de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender adicionalmente um recipiente de teste para misturar o referido sal metálico e o composto formador de cor.
20 - Conjunto de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido composto formador de cor ser um tioálcool alquílicoC₂_6, alquilC₂_etioamino, ácido alquilC₂_₁₀tiomonocarboxílico, ácido alquilC₂_₁₀tiodicarboxílico, ácido alquilC₂_i()ditiodicarboxílico, ácido di-alquilCQ__g-ditiocarbâmico, aminoácido contendo tiol, pêptido contendo tiol ou enzima contendo tiol.