ES2239753T3 - Ensayo y equipo para la evaluacion rapida de estados isquemicos. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA DETECTAR ESTADOS ISQUEMICOS DE UN PACIENTE MEDIANTE LA PUESTA EN CONTACTO DE UNA MUESTRA DE SUERO, PLASMA, FLUIDO O TEJIDO CON UN ION DE METAL CAPAZ DE UNIRSE A LAS ZONAS DE UNION DE LOS IONES DE METAL EN LA MUESTRA PARA FORMAR UNA MEZCLA, Y DETECTANDO ENTONCES LA PRESENCIA DE LOS IONES DE METAL NO UNIDOS PARA DETERMINAR LA OCURRENCIA DE LA ISQUEMIA. LOS REAGENTES REQUERIDOS PARA LLEVAR A CABO EL METODO ESTAN INCORPORADOS EN UN EQUIPO DE PRUEBA.

Description

Ensayo y equipo para la evaluación rápida de estados isquémicos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento rápido para la detección de estados isquémicos y a un equipo para su uso en tal procedimiento. Más particularmente, la invención se refiere a la medición de grupos tiol (SH) unidos a proteína para determinar la presencia o ausencia de isquemia.

Técnica previa

La enfermedad arterial coronaria progresiva podría estar bien avanzada sin síntomas clínicos significativos, tales como el dolor en el pecho o dispnea. La repentina oclusión de una rama de una arteria coronaria que resulta en un infarto de miocardio (MI) indica dramáticamente la presencia de una antigua enfermedad de la pared arterial, tal como la calcificación de la íntima y de la pared, así como la progresiva estenosis del lumen de la arteria.

Inmediatamente después de un suceso de corazón isquémico, se liberan proteínas hacia la sangre. Las proteínas bien conocidas que se liberan después de un suceso de corazón isquémico incluyen la creatina quinasa (CK), la transaminasa de glutámico oxalacético del suero (SGOT) y la deshidrogenasa del lactato (LDH). Un procedimiento bien conocido para evaluar la ocurrencia de sucesos de corazón isquémico pasados es la detección de estas proteínas en la sangre de un paciente. La patente US-4.492.753 se refiere a un procedimiento similar para verificar el riesgo de sucesos de corazón isquémicos. El tejido cardíaco lesionado libera proteínas hacia el torrente sanguíneo tanto después de sucesos isquémicos como no isquémicos.

Los pacientes que experimentan cirugía no cardíaca podrían experimentar isquemia perioperatoria. Los electrocardiogramas de estos pacientes muestran desplazamientos del segmento ST con una causa isquémica, los cuales están altamente correlaciónados con la incidencia de sucesos cardíacos postoperatorios adversos. No obstante, los desplazamientos del segmento ST también ocurren en ausencia de isquemia y, por tanto, este procedimiento no distingue los sucesos isquémicos de los no isquémicos.

La isquemia está causada frecuentemente por enfermedad del vaso arterial. Una característica de la enfermedad del vaso arterial es la progresión desde el estado ateromatoso al estado esclerótico, en el cual grandes cantidades de calcio penetran en la musculatura arterial. Con el paso del tiempo, la arteriosclerosis progresa. La cantidad de calcio intracelular incrementa mientras que el rendimiento cardíaco permanece esencialmente normal. El calcio intracelular activa la proteasa calpaína, la cual convierte la deshidrogenasa de xantina en oxidasa de xantina. La oxidasa de xantina actúa sobre la xantina e hipoxantina para formar radicales libres, incluyendo el radical hidroxilo (OH^{-}) y el radical superóxido (O_{2}). Estos radicales libres oxidan a su vez las membranas celulares y las proteínas en las regiónes de la molécula que son ricas en grupos tiol. Ver "The Role of Perfusion-Induced Injury in the Pathogenesis of the Crush Syndrome", New Engl. J. Med., 324:1417-1422 (1991).

Existe una necesidad de un procedimiento para distinguir entre sucesos isquémicos y no isquémicos, particularmente en pacientes cardíacos. Después de una investigación sustancial, se ha descubierto el presente procedimiento, basado en interacciones de unión metal-proteína, el cual es capaz de detectar estados o sucesos isquémicos en un paciente.

Es bien conocido que los iones metálicos son capaces de unirse a grupos unidores de metales en proteínas ("Multiple Equilibria in Proteins", J. Steinhardt y J. Reynolds, Acad. Press, Capítulo VI, p. 214 y siguientes). Los iones metálicos podrían formar enlaces covalentes con las proteínas o, alternativamente, formar complejos de coordinación en los que el ión metálico es quelado por ligandos de la molécula de proteína ("Enzyme and Metabolic Inhibitors", Vol. II, J. L. Webb, (1966), Acad. Press, Capítulo 4, página 635 y siguientes).

La capacidad de los iones metálicos para unirse a proteínas forma la base de las tinciones con plata para proteínas en geles de poliacrilamida. La patente estadounidense nº 4.468.466 pre-trata un gel con ditiotreitol (DTT) antes de la tinción con iones de plata para reducir la tinción de fondo. La patente estadounidense nº 4.434.234 proporciona un tratamiento subsiguiente con sales de carbonato o sulfato para obtener tinciones con diferentes colores.

En algunos casos, los iones metálicos reaccionan con proteínas para formar precipitados. Las reacciones de precipitación de metal-proteína se han usado en procedimientos para la determinación cuantitativa de proteínas (US-4.786.605) y en la precipitación total o fraccional de proteínas a partir de una solución que contiene proteínas (US-4.486.282).

Descubrimiento de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento rápido para detectar estados isquémicos en un paciente.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un procedimiento para evaluar pacientes rehabilitados que padecen de isquemia (infarto de miocardio) para determinar la efectividad circulatoria tanto en reposo como durante el ejercicio.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento rápido para complementar los resultados en la determinación de la ocurrencia de verdaderos sucesos isquémicos.

Un objeto ulterior de la invención es proporcionar un equipo para usar con estos procedimientos.

Estos y otros objetos de la invención, los cuales se harán evidentes a partir de las especificaciones siguientes, se han alcanzado mediante el presente procedimiento para detectar la ocurrencia de isquemia en pacientes, tal como se establece en la reivindicación 1.

La invención también proporciona un equipo, tal como se establece en la reivindicación 14.

Mejor forma para realizar la invención

El procedimiento de la presente invención permite detectar rápidamente la presencia de estados isquémicos en un paciente. Tal como se usa en ésta, el término "rápido" significa que la detección es posible antes de una hora, preferiblemente antes de 30 minutos. Tal como se usa en ésta, el término "suceso isquémico" significa que el paciente ha experimentado una isquemia local y temporal debida a la obstrucción de la circulación de sangre hacia un órgano.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar estados isquémicos mediante un proceso rápido utilizando la unión de iones metálicos a proteínas del tejido. En pacientes que han experimentado un suceso isquémico, el número de grupos tiol (SH) en las proteínas contenidas en el suero, plasma, fluido o tejido del paciente está reducido debido a su oxidación por parte de radicales hidroxilo y superóxido. Se cree que la oxidación ocurre cuando el calcio intracelular activa la proteasa calpaína, formando de ese modo oxidasa de xantina y deshidrogenasa de xantina. La oxidasa de xantina actúa sobre la xantina e hipoxantina para rendir radicales libres que oxidan los grupos tiol en las proteínas. La oxidación de grupos tiol resulta en la formación de grupos más altamente oxidados, incluyendo disulfuros (S-S), SO_{3}, etc. Los solicitantes han descubierto que la cantidad relativa de grupos SH unidos a proteína en una muestra funciona como un indicador de la oxidación durante la vida biológica de la proteína. Aunque no nos atamos a una teoría particular, se cree que el presente procedimiento cuantifica los grupos tiol unidos a proteína en una muestra como una medición del daño oxidante de la muestra a consecuencia de un suceso isquémico, y, por tanto, detecta el suceso isquémico.

En el presente procedimiento, se hace reaccionar una muestra de suero, plasma, fluido o tejido procedente de un paciente, con iones metálicos, generalmente en forma de una solución acuosa de sal, de forma que los iones metálicos pasan a estar unidos a los sitios de unión de metales sobre la proteína contenida en la muestra. Los iones metálicos se unen a proteínas que contienen sitios de tiol unidores de metales presentes en los aminoácidos que constituyen la proteína. La adición de los iones metálicos a la muestra podría precipitar una pequeña cantidad del complejo metal-proteína, pero tal precipitación no es necesaria ni perjudicial para el proceso de la presente invención.

Una cantidad en exceso predeterminada de sal de ión metálico se pone en contacto con la proteína en la muestra, y se deja que los iones metálicos se unan a la proteína. Por "exceso" se quiere significar una cantidad de iones metálicos mayor que la que se requiere estequiométricamente para unir todos los grupos tiol disponibles en la proteína de la muestra. Se añade un exceso de iones metálicos, de forma que la mezcla resultante contendrá iones metálicos libres, los cuales podrían detectarse para obtener una medición del número de grupos tiol presentes en la muestra. Puesto que se conoce la cantidad total de iones metálicos añadidos inicialmente, la detección de los iones metálicos que permanecen en la muestra proporciona una medición de la cantidad de iones metálicos unidos a la proteína, y, por tanto, la cantidad de grupos tiol disponibles.

Los iones metálicos que permanecen libres después de la complejación de los grupos tiol de la proteína podrían detectarse mediante cualquier medio apropiado. Los procedimientos para detectar los iones metálicos libres en una muestra son conocidos en la técnica, e incluyen tales procedimientos como las reacciones colorimétricas que usan un reactivo que produce una sustancia coloreada a partir de la reacción de los iones metálicos libres, así como la medición directa de los iones metálicos usando procedimientos que incluyen la espectroscopia de absorción atómica, la espectroscopia de emisión atómica, etc. Podría usarse cualquier procedimiento conocido de detección y cuantificación de iones metálicos en una muestra para detectar los iones metálicos que permanecen después de la complejación con los grupos tiol de la proteína. Preferiblemente, los iones metálicos se detectan colorimétricamente mediante la formación de un complejo coloreado y detectando espectrofotométricamente el complejo coloreado.

En una realización preferida del proceso de detección colorimétrico, la mezcla de sal de metal/muestra se pone en contacto con una solución acuosa de un compuesto de tiol. El compuesto de tiol reacciona con los iones metálicos libres para formar un producto coloreado. La intensidad del producto coloreado es proporcional a la cantidad de iones metálicos presentes en la mezcla sal de metal/muestra y, por tanto, se relaciona con la cantidad de grupos tiol unidos a proteína en la muestra. Midiendo la intensidad de color de la solución coloreada resultante, se puede obtener una medición de los grupos tiol unidos a proteína inicialmente presentes en la muestra.

Obviamente, podrían usarse compuestos formados de color distintos de los compuestos de tiol para formar un producto coloreado con los iones metálicos libres, con tal que se forme un producto que tenga color detectable cuando se emplea la detección colorimétrica. Otros compuestos formadores de color apropiados incluyen las soluciones de hidróxidos de metales, la soluciones de hidróxido de amonio, la soluciones de cianuro de metales, las soluciones de tiocianato de amonio, etc. Estos compuestos formadores de color, y otros compuestos que forma soluciones coloreadas con iones metálicos, son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en A. I. Vogel, "Qualitative Chemical Analysis", Longmans, Green and Co., (1945); J. R. Marston y D. W. Dewey, J. Exptl. Biol. Med. Sci., 18:343 (1940); J. H. Yoe y C. J. Barton, Ind. Eng. Chem., Anal. Ed., 12:405 (1940); y D. L. Tsalev y V. K. Zaprianov, "Spectroscopy", CRC Press, Boca Raton, Fla. (1983).

La muestra que podría usarse en la presente invención incluye cualquier tejido, suero, plasma, o muestra de fluido, que contenga proteínas que sean capaces de unir iones metálicos. Podrían obtenerse muestras de tejidos a partir de órganos del cuerpo para detectar la ocurrencia de un suceso isquémico que afecta al órgano. Los órganos apropiados incluyen cualquier órgano que tenga un aporte de sangre o una matriz proteica capaz de oxidar, incluyendo el corazón, riñón, intestino, arterias, venas, hígado, etc. La muestra podría ser también plasma y suero sanguíneo, así como otros fluidos corporales como la linfa, el fluido cerebroespinal, la saliva, etc. La muestra podría obtenerse mediante técnicas de muestreo de biopsias y fluidos convencionales y bien conocidas. Las muestras preferidas son el plasma y suero sanguíneo.

Cuando se usa la detección colorimétrica, la muestra no debería contener otros compuestos unidores de metal que unan o quelen los iones metálicos no unidos a la muestra. Los compuestos unidores de metales que no deberían añadirse o estar presentes en la muestra incluyen el citrato, oxalato, borato, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), etc., usados como anticoagulantes, estabilizadores, o en soluciones tamponantes.

Los resultados óptimos se obtienen con muestras que contienen una elevada concentración de proteínas que tienen grupos tiol disponibles para la unión de iones metálicos. Se prefieren el plasma y el suero sanguíneo porque estas muestras contienen cantidades sustanciales de albúmina, la cual se ha hallado que es particularmente efectiva para unir iones metálicos. Aunque el plasma y el suero sanguíneo son las muestras preferidas, cualquier muestra que contenga una concentración sustancial de proteínas que tengan grupos tiol disponibles podría usarse en la presente invención.

Las proteínas que no tienen grupos tiol disponibles para unir iones metálicos no interfieren con el presente procedimiento. No obstante, una muestra que sólo contenga proteínas que no tienen grupos tiol disponibles no será efectiva para unir iones metálicos y, por tanto, será inútil en el presente procedimiento. La presencia o ausencia de grupos tiol en una proteína puede ensayarse rutinariamente mediante procedimientos conocidos. Las proteínas que podrían estar presentes pero que no unen suficientemente iones metálicos para su uso en la presente invención incluyen la hemoglobina, mioglobina, \gamma-globulina, transferrina, ferritina, glutatión (forma oxidada) y la putrescina. De forma similar, la presencia de otras sustancias que no unen iones metálicos no interfiere con el presente procedimiento. Tales sustancias que no interfieren incluyen el ácido lipoico, la nitroglicerina, el nitrito sódico, la cistina, la homocistina y la homocisteína (en bajas concentraciones, tal como informaron Genest et al.). La no interferencia de la homocisteína es sorprendente puesto que la homocisteína tiene un grupo tiol disponible y se sabe que está presente en pacientes con una enfermedad arterial prematura (J. J. Genest et al., J.A.C.C., 16:1114-1119 (1990)). Se han detectado niveles en plasma de homocisteína del orden de 10 nanomoles por mililitro. Sin embargo, esta concentración es tan baja que es incapaz de afectar de forma medible la unión de iones metálicos. Por tanto, estos compuestos no interfieren con el presente procedimiento cuando están presentes en forma libre o en forma unida a proteína.

Los iones metálicos que podrían reaccionar con la proteína en la muestra incluyen cualquier ión metálico que es capaz de unirse a un sitio tiol unidor de iones metálicos sobre una proteína. Cuando se usa la detección colorimétrica, el ión metálico deber ser capaz también de formar un producto coloreado. La determinación de la unión de iones metálicos a proteínas y la formación de productos coloreados por iones metálicos se consigue rutinaria y fácilmente usando procedimientos conocidos. La formación de productos coloreados se determina preparando una serie de diluciones de un compuesto formador de color deseado, por ejemplo, un tiol, en agua y añadiendo el ión metálico escogido (como la sal del metal) en suero o en una solución tamponada. El desarrollo del color se determina visualmente. La capacidad de un ión metálico para unirse a proteínas en la muestra podría determinarse mediante otros procedimientos conocidos.

Los iones metálicos se añaden generalmente a la muestra como sales de metales disueltas en una solución acuosa. Los iones metálicos preferidos son los metales de transición de los Grupos 1b-7b y 8 de la Tabla Periódica de los Elementos. Los metales particularmente preferidos incluyen el V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg, Cd, Fe, Pb, Au y Ag. Los iones metálicos más preferidos son Ni, Fe, Mn y Co. Si se desea, podrían usarse mezclas de estos iones metálicos.

Los iones metálicos se añaden preferiblemente a la muestra como solución acuosa. Las soluciones podrían prepararse simplemente disolviendo una sal de ión metálico en agua para obtener la concentración de ión metálico deseada. Podría usarse cualquier contra-anión para el ión metálico con tal que el ión no interfiera con la unión del ión metálico-proteína, o con la formación del producto coloreado por el ión metálico cuando se usen medios de detección colorimétrica. Los aniones apropiados incluyen el nitrato, nitrito, cloruro, sulfato y carbonato. El cloruro de cobalto es particularmente preferido.

Los unión de iones metálicos a proteínas depende del pH. El pH óptimo para una unión variará con el ión metálico individual usado en el procedimiento. Un pH apropiado para la unión de ión metálico a la proteína podría obtenerse usando un tampón de pH para controlar que el pH de la muestra esté en el rango de pH óptimo para la unión del ión metálico a la proteína. Por ejemplo, la unión del cobalto generalmente ocurre a lo largo de un rango de pH de 5-10,5, con un rango de unión preferido a pH 6,8-7,8, siendo el más preferido aproximadamente de 7,4. El uso del cobalto es una realización preferida de la presente invención, puesto que el suero tiene suficiente capacidad tamponante a lo largo del estrecho rango de pH de unión preferido del cobalto (6,8-7,8), de tal forma que es innecesario el tamponamiento adicional. No obstante, si se usan una muestra e iones metálicos que requieren tamponamiento, podría añadirse un tampón a la muestra para ajustar el pH al del rango de unión óptima deseado. Tales tampones son bien conocidos y están disponibles comercialmente.

La unión de ión metálico-proteína no es sustancialmente sensible a la temperatura. El presente proceso podría realizarse a temperaturas que oscilan desde la temperatura ambiente (20ºC) hasta y por encima de 50ºC. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo a aproximadamente 20-25ºC. Si la muestra se ha enfriado o congelado, se deja que la muestra se descongele hasta la temperatura ambiente antes de ensayarla.

Cuando se detectan directamente los iones metálicos usando un procedimiento tal como la espectroscopia de absorción atómica, podría prepararse una muestra apropiada para el análisis directamente a partir de la muestra. Cuando se usan tales procedimientos, es preferible añadir los iones metálicos a la muestra en forma de una solución acuosa, la cual, después de la unión de los iones metálicos a los grupos tiol de la proteína, proporciona una solución de muestra que contiene iones metálicos no unidos. Podrían realizarse pasos adiciónales de preparación de la muestra, tales como la filtración, para retirar cualesquier precipitados residuales.

El procedimiento de detección directa (espectroscopia de absorción atómica) permite determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia y cantidad de iones metálicos libres presentes. Si se conoce la cantidad inicial de iones metálicos en la solución acuosa, la detección de los iones metálicos libres presentes en la solución después de la unión a la proteína proporciona una medida del número de grupos tiol de proteína libres y, por tanto, una medida de la oxidación de grupos tiol. Es conveniente usar soluciones de iones metálicos estandarizadas que contienen una cantidad conocida de iones metálicos. Esto permite el análisis rutinario de muestras en, por ejemplo, un laboratorio médico.

La cantidad de iones metálicos libres en la muestra también podría detectarse mediante procedimientos colorimétricos. Una vez se ha puesto en contacto la muestra con los iones metálicos, se pone en contacto la mezcla con una solución acuosa de compuesto formador de color (tiol), el cual reacciona con cualesquier iones metálicos no unidos. El compuesto formador de color debería ser soluble en agua en una concentración suficiente para reaccionar con todos los iones metálicos no unidos disponibles. Adicionalmente, el compuesto formador de color no debería absorber luz en ausencia de iones metálicos en el rango de longitudes de onda en el que se detecta el producto de ión metálico coloreado. Generalmente, es deseable que el compuesto formador de color libre no absorba luz en ausencia de iones metálicos en el rango de longitudes de onda de detección de aproximadamente 400-900 nm. El compuesto formador de color también debiera ser estable frente a cualquier degradación por parte de componentes biológicos presentes en la muestra, y debiera ser estable en las condiciones de pH y temperatura del procedimiento.

Aunque en el presente procedimiento podría usarse cualquier compuesto formador de color que tuviera las propiedades mencionadas más arriba, los preferidos son los tioles, e incluyen los C_{2-6} alquiltioalcoholes tales como el mercaptoetanol, el 2,3-dimercaptopropanol, el ditioeritritol y ditiotreitol; las C_{2-6} alquiltioaminas, tales como la mercaptoetilamina, mercaptopropilamina, etc.; los ácidos y diácidos C_{2-10} alquiltiomonocarboxílicos, tales como el ácido dimercaptosuccínico, el ácido mercaptopropiónico, el ácido mercaptoacético y el ácido mercaptomalónico; los ácidos C_{2-10} alquilditiodicarboxílicos y los ácidos di-C_{1-6} alquilditiocarbámicos, tales como el ácido dimetilditiocarbámico, el ácido dietilditiocarbámico, etc.; los aminoácidos y péptidos que contienen tiol, tales como la cisteína, la \beta-mercaptoisoleucina, el glutatión, etc; y los enzimas que contienen tioles, tales como la papaína, el fosfoenolpiruvato, la carboxiquinasa, la deshidrogenasa de 3-fosfogliceraldehído, la carboxilasa del propiónil-coenzima-A, la proteasa estreptococal, y las carboxipeptidasas que contienen tiol. Otros tioles apropiados incluyen el 1,3,4-tiadiazol-2,5-ditiol, la coenzima-A 4'-fosfopanteteína, y la penicilamina.

Otros compuestos formadores de color que podrían usarse incluyen la piridina-2-azo-paradimetil-alinina, el \alpha-nitroso-\beta-naftol, el \beta-nitroso-\alpha-naftol, la ditioxamida, la tiosemicarbazida, las C_{1-6} alquil tiosemicarbazidas, tales como la 2-metil-3-tiosemicarbazida, 4-metil-3-tiosemicarbazida, 4-etil-3-tiosemicarbazida, el formaldehído-triptófano, el salicilaldehído, la quinoxalina-2-carbosaldehído-2-cloroacetil-aminometil-bencimidazol, y las sales de proflavina tales como el hemisulfato y hidrocloruro de proflavina.

Los compuestos particularmente preferidos son el ditiotreitol, la cisteína y el glutatión.

El compuesto formador de color podría prepararse en una solución acuosa que tenga una concentración suficiente para reaccionar con todos los iones metálicos no unidos disponibles. Si la concentración del compuesto formador de color fuera demasiado elevada, podría formarse una elevada cantidad de precipitado con iones metálicos. Si la solución está demasiado diluida, la detección del compuesto coloreado es difícil, en la práctica, la concentración de la solución se ajusta para proporcionar una solución suficientemente coloreada, de forma que la absorción de luz pueda detectarse usando un espectrofotómetro o dispositivo de detección similar. La optimización de la concentración del compuesto formador de color puede determinarse rutinariamente.

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La cantidad de ión metálico añadido a la muestra debe ser suficiente para unir todos los grupos tiol unidos a proteína disponibles, y proporcionar un exceso de iones metálicos detectables.

Cuando se usa la detección colorimétrica, la cantidad de iones metálicos añadida debe ser suficiente para proporcionar un producto coloreado, el cual puede detectarse mediante un detector tal como un espectrofotómetro. La concentración de la solución de ión metálico es preferiblemente de aproximadamente 0,001-0,100 M, más preferiblemente de 0,002-0,010 M. La cantidad de iones metálicos añadida a la muestra variará y podría ajustarse rutinariamente a condición de que los iones metálicos no unidos formen suficiente producto coloreado como para ser detectado exactitud. Si se añade demasiado ión metálico, la intensidad de color resultante es demasiado elevada como para se determinada con precisión por el detector. Si la cantidad de ión metálico es demasiado baja (la cantidad de suero es demasiado elevada) son necesarios largos periodos de equilibrado y el rendimiento de color es demasiado bajo. Las cantidades relativas de estos reactivos podrían determinarse rutinariamente para proporcionar lecturas de absorbancia óptimas con un espectrofotómetro u otro detector.

Si es necesario, podría añadirse a la muestra una solución salina isoosmótica con la sangre, después de la adición del reactivo de tiol, para proporcionar una solución diluida que tenga una intensidad de color apropiada para la detección. La dilución con soluciones isoosmóticas minimiza la precipitación de proteínas y la turbidez. Las soluciones isoosmóticas preferidas son las soluciones preparadas a partir de cloruro sódico, aunque también son apropiadas otras sales, tales como el cloruro potásico y el cloruro de litio. Si la adición de solución de tiol proporciona una intensidad de color adecuada para la detección, la dilución adicional con solución isoosmótica no es necesaria.

Después de la adición de la solución de compuesto formador de color a la mezcla de ión metálico-proteína, y la dilución subsiguiente, si es necesaria, la intensidad de color del producto resultante podría medirse con un espectrofotómetro convencional. La absorbancia del producto coloreado se mide generalmente a la longitud de absorción máxima para el producto coloreado que se produce. Obviamente, el producto coloreado dependerá del compuesto formador de color y del ión metálico concreto que se usen en el procedimiento. La longitud de onda con absorbancia óptima puede determinarse rutinariamente mediante procedimientos conocidos.

La presente invención también proporciona un equipo a usar en la realización del procedimiento descrito más arriba. El equipo de ensayo de la presente invención contiene una sal de metal, un compuesto formador de color, tal como se define en la reivindicación 14, y, si es necesario, una solución isoosmótica con el plasma o suero sanguíneo. Las soluciones acuosas de la sal del metal y del compuesto formador de color podrían formarse simplemente mediante la adición de agua a los compuestos contenidos en el equipo de ensayo para obtener las soluciones deseadas. El equipo también contiene un recipiente de ensayo para mezclar la muestra de ensayo con los tres componentes mencionados más arriba. La detección rápida de los estados isquémicos es posible mezclando una muestra con la solución de sal de metal, y detectando la cantidad de iones metálicos libres.

Las muestras obtenidas de pacientes normales que no han experimentado un suceso isquémico producen soluciones de muestras que tienen una baja concentración de iones metálicos detectables, y una absorbancia inferior (menos intensidad de color) que las muestras obtenidas de pacientes que han experimentado un suceso isquémico. Las muestras obtenidas de pacientes que han experimentado dolor pectoral no cardiogénico, por ejemplo, contienen sustancialmente menos iones metálicos detectables que los pacientes que han experimentado un suceso isquémico tal como un infarto de miocardio o una angina inestable. El presente procedimiento permite ensayar muestras procedentes de un paciente que se queja de dolor pectoral y determinar rápidamente si este dolor pectoral está asociado con un suceso isquémico o es simplemente un dolor pectoral no cardiogénico. De forma similar, el progreso de un paciente que se recupera de un episodio isquémico tal como un infarto de miocardio podría evaluarse muestreando el tejido del paciente a intervalos regulares para evaluar la efectividad circulatoria y la desaparición de las condiciones isquémicas.

Otras características de la invención se harán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de realizaciones ejemplares, las cuales se proporcionan para ilustrar la invención y no se pretende que sean limitantes de la misma.

Ejemplos

En una realización preferida, se seleccionó el cobalto para reaccionar con los grupos tiol unidos a proteína. El cobalto sin reaccionar se detectó con ditiotreitol, el cual forma un producto de color marrón con los iones cobalto. El producto de color marrón se detectó usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 470 nm.

Ejemplo 1 Materiales

Solución de cobalto: se disolvieron 200 mg de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O en 2 ml de agua destilada. Para su uso, esta solución se diluyó 100 veces.

Solución de ditiotreitol: se disolvieron 15 mg de ditiotreitol en 10 ml de agua destilada.

Solución salina: se disolvieron 0,9 g de cloruro sódico en 100 ml de agua.

Suero: se obtuvieron 2-10 ml de sangre mediante punción en vena periférica y se dejaron coagular. Se centrifugó el tubo a 3000 r.p.m. durante 5 minutos, y el suero sobrenadante se transfirió a un contenedor de vidrio o plástico distinto.

Plasma: se aspiraron 2-10 ml de sangre en un Vacutainer heparinizado. Se centrifugó el tubo a 3000 r.p.m. durante 5 minutos, y el plasma sobrenadante se transfirió a un contenedor de vidrio o plástico distinto.

Los sueros se obtuvieron de 22 pacientes que se sabía habían tenido un infarto de miocardio o un episodio isquémico. A 0,2 ml de suero o plasma procedente de cada uno de estos pacientes, en un tubo o cubeta, se les añadieron 50 \mul de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, y se dejó reposar la muestra durante 10 minutos. Se añadieron 50 \mul de solución de ditiotreitol a cada tubo, seguidos por su mezclado. A continuación se dejaron reposar los tubos a temperatura ambiente durante 2 minutos para permitir la formación del producto coloreado. Entonces se añadió 1 ml de NaCl al 0,9% peso/volumen a cada tubo, seguido por mezclado, y se leyó la absorbancia de cada tubo usando un espectrofotómetro a 470 nm. Se prepararon tubos de control y se ensayaron añadiendo el mismo suero, solución de cobalto y solución de cloruro sódico, pero no la solución de ditiotreitol. La absorbancia de los tubos de control también se leyó a 470 nm, y se restó de los resultados del ensayo.

Se halló que los 22 pacientes, que se sabía habían tenido un infarto de miocardio o un episodio isquémico, tenían un valor medio y una desviación estándar de 0,62 \pm 0,15 (n = 22). Los controles tenían una media y desviación estándar de 0,27 \pm 0,05 (n = 11). Las medias fueron estadísticamente significativas según el t-test de Student. Los pacientes normales con dolor pectoral no cardiogénico tenían un valor medio de 0,32 \pm 0,05 (n = 15). Los pacientes con una angina inestable tenían un valor medio de 0,61 \pm 0,22 (n = 8). Ver la Tabla 1.

TABLA 1

1

Estos resultados indican que el presente procedimiento puede usarse para detectar estados isquémicos. El presente procedimiento es efectivo para distinguir entre el dolor pectoral cardiogénico isquémico y el dolor pectoral no cardiogénico.

Claims (17)

1. Procedimiento de detección de la ocurrencia de isquemia en un paciente, que comprende los pasos de:

(a)

poner en contacto una muestra de sangre, muestra de fluido corporal derivada de la sangre, incluyendo una muestra de suero o plasma, o muestra de tejido de dicho paciente con iones metálicos capaces de unirse a los sitios tiol de proteína unidora de metal en dicha muestra, para formar una mezcla que contiene iones metálicos unidos a proteína y iones metálicos no unidos a proteína, y

(b)

detectar la cantidad de iones metálicos no unidos a proteína usando un procedimiento que detecta iones metálicos libres, en donde la cantidad de iones metálicos libres es una medición de la cantidad de sitios tiol de proteína unidora de iones metálicos disponibles, y la cantidad de sitios tiol unidores de iones metálicos dañados oxidativamente, indicando de esta manera la ocurrencia o no ocurrencia de un estado isquémico en dicha muestra.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho paso de detección comprende detectar directamente la cantidad de dichos iones metálicos no unidos a proteína por medio de absorción atómica o espectroscopia de emisión atómica.

3. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho paso de detección comprende detectar colorimétricamente la cantidad de iones metálicos no unidos a proteína.

4. Procedimiento de la reivindicación 3, que comprende poner en contacto dicha mezcla con una solución acuosa de compuesto formador de color para formar una solución coloreada, y detectar la intensidad de color de dicha solución coloreada para detectar la cantidad de dichos iones metálicos no unidos a proteína.

5. Procedimiento de la reivindicación 4, que además comprende diluir dicha solución coloreada con una solución acuosa isoosmótica con el suero o plasma sanguíneo antes de dicho paso de detección.

6. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicha muestra es suero o plasma.

7. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde dicho compuesto formador de color es un alquiltioalcohol C_{2-6}, alquiltioamina C_{2-6}, ácido C_{2-10} alquiltiomonocarboxílico, ácido C_{2-10} alquiltiodicarboxílico, ácido C_{2-10} alquilditiodicarboxílico, ácido di-C_{1-6} alquilditiocarbámico, aminoácido que contiene tiol, péptido que contiene tiol, o enzima que contiene tiol.

8. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde dicho compuesto formador de color es ditiotreitol, cisteína o glutatión.

9. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho ión metálico es un ión de metal de transición de los Grupos 1b-7b u 8 de la Tabla Periódica de los Elementos.

10. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho ión metálico se selecciona del grupo consistente en V, As, Co, Sb, Cr, Mo, Mn, Ba, Zn, Ni, Hg, Cd, Fe, Pb, Au y Ag.

11. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde dicho ión metálico es cobalto.

12. Procedimiento de la reivindicación 3, en donde dicho paso de detección se realiza en un rango de pH de 5,0-10,5.

13. Procedimiento de la reivindicación 3, en donde dicho paso de detección se realiza usando un espectrofotómetro.

14. Equipo para detectar la presencia de un suceso isquémico en un paciente, comprendiendo dicho equipo una sal de metal y un compuesto formador de color capaz de formar un compuesto coloreado con dicha sal de metal, en donde dicho compuesto formador de color se selecciona de entre un grupo que consiste en por C_{2-6} alquiltioalcohol, C_{2-6} alquiltioamina, ácido C_{2-10} alquiltiomonocarboxílico, ácido C_{2-10} alquiltiodicarboxílico, ácido C_{2-10} alquilditiodicarboxílico, ácido di-C_{1-6} alquilditiocarbámico, aminoácido que contiene tiol, péptido que contiene tiol, o enzima que contiene tiol.

15. Equipo de la reivindicación 14, en donde al menos uno de dicha sal de metal y dicho compuesto formador de color está en forma de solución acuosa.

16. Equipo de la reivindicación 14, que comprende además una solución salina isoosmótica con el plasma o suero sanguíneo.

17. Equipo de la reivindicación 14, que comprende además un recipiente de ensayo para mezclar dicha sal de metal y dicho compuesto formador de color.