DD216806A1

DD216806A1 - Teststreifen zum nachweis von proteinen im urin

Info

Publication number: DD216806A1
Application number: DD25322683A
Authority: DD
Inventors: Jochen Lampe
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1983-07-20
Filing date: 1983-07-20
Publication date: 1984-12-19

Abstract

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Laboratoriumsdiagnostik im Bereich des Gesundheitswesens. Ziel ist ein Teststreifen zum Nachweis von Proteinen im Urin. Der Teststreifen besteht aus einem Traegermaterial, das mit einem Farbindikator und Pufferungsmitteln impraegniert ist. Gegebenenfalls sind weitere Bestandteile Mittel zur Verhinderung von Auswascheffekten wie wasserloesliche Cellulosederivate, Mittel zur Hintergrundfaerbung wie Acridinorange, Echtlichtgelb oder Dipyridamol und Tenside wie Natriumdodecylsulfat, chaotrope Substanzen wie Kaliumrhodanid oder Lithiumchlorid und Denaturantien wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid als Modifikatoren der Empfindlichkeit des Proteinnachweises. Der Teststreifen ist durch eine hohe Empfindlichkeit gekennzeichnet. Geringe Proteinkonzentrationen, d. aber bereits ueber d. normalerweise m. d. Urin ausgeschiedenen Proteinmenge liegen, werden m. einer deutlich sichtbaren Faerbung angezeigt. Mit dem Urin von gesunden Personen werden keine falsch-positiven Ergebnisse erhalten.

Description

•Teststreifen zum nachweis von Proteinen im Urin

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Teststreifen zum nachweis von Proteinen im Urin. Die Teststreifen werden in der Laboratoriumsdiagnostik angebende t. . ·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Untersuchung des Urins auf Proteine gehört,zu jeder medizinischen . Grunduntersuchung . zur frühzeitigen Erkennung von nierenkrankheiten. Der nachweis von Proteinen ist auch für die Verlaufskontrolle von Patienten mit Nierenerkrankungen sowie für. die rechtzeitige Erkennung von !Tierenschäden nach Gabe von einigen Arzneimitteln wie z. B. Antibiotika und Zytostatika von Bedeutung. '

Altere Methoden zum nachweis von Proteinen im Urin sind die heute nur noch vereinzelt durchgeführte Kochprobe mit Essigsäure und die HELLSRsche Ringprobe mit Salpetersäure. Weitverbreitet in den klinischen Laboratorien ist der SuIfosalicylsäuretest. ,Die Methode ist'ausreichend empfindlich und erfaßt alle Plasmaproteine, die im Urin vorkommen können, mi't gleicher Sensitivitat. Orale Antidiabetika, hohe Dosen von Antibiotika, p-Aminosalicylsäure und Röntgenkontrastmittel stören die Reaktion. Nachteilig ist.ein gewisser Aufwand (Zentrifugieren bzw. Filtrieren des¹Urins, Ansetzen der Reagentien, Säuberung der Glasgeräte) (P. Balint (Hrsg.) : Klinische ' Laboratoriumsdiagnostik, 3d. 1. Volk und Gesundheit, Berlin 1962, Seite 284)..

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Zum nachweis-einer Proteinurie' werden auch Teststreifen angewendet. Sie sind mit einem pH-Indikator imprägniert, der oberhalb einer definierten Proteinkonzentration mit einem Farbumschlag reagiert." Die Realctionszone ist in trockenem Zustand gelblich oder schwach, .grünlich gefärbt und soll Proteine in Abhängigkeit von ihrer Konzentration mit grüner bis blauer ,. Farbe 'anzeigen. ITach dem.Eintauchen an eine Untersuchungslösung erfolgt jedoch oftmals schon ,eine grünliche Färbung, auch wenn die Probe eiweißfrei ist. Dadurch ist es schwierig, negative von schwach positiven Reaktionen zu unterscheiden.

Ziel der Erfindung . · -.-.

Ziel der Erfindung ist es, die Eindeutigkeit der Farbreaktion beim Hachweis-von Proteinen im Urin mittels Teststreifen zu verbessern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Teststreifen mit einem saugfähigen Träger für den Farbindikator zu entwickeln. ' ·. '

Die Aufgäbe wird erfindungsgemäß durch einen Teststreifen zum nachweis von Proteinen im Urin auf der Basis saugfähiger Materialien wie Papier oder Vliese gelöst.. Der erfindungsgemäße Teststreifen ist'dadurch gekennzeichnet, daß er als Farbindikator eine Verbindung der allgemeinen Formel I (vgl. Anlage) ,und Pufferungsmittel enthält, wobei als Puffer Citronensäure/ Phosphat, Citronensäure/UaOH ,oder Bernsteinsäure/I¹TaOH verwendet wurden. -Weiterhin werden dem Streifen gegebenenfalls !Mittel zur Verhinderung von Auswascheffekten wie wasserlösliche Cellulosederivate, gegebenenfalls Farbstoffe zur Hintergrundfärbung sowie gegebenenfalls Tenside, ohaotrope Substanzen oder Denaturantien zur Modifizierung der Empfindlichkeit zugesetzt.

Bei einer durch eine liephropathie bedingten Proteinurie werden vorwiegend Albumine ausgeschieden. 7/eiterhin_v liegen in wesent-¹ lieh geringerer Konzentration die Antikörper IgM, IgG und IgA, Lambda- und Kappa-Ketten, Transferrin, Haptoglobin,- Lysozym sowie mehrere Globulinfraktionen vor. Für die Diagnose und Differentialdiagnose von liephropathien reicht es aus_,· wenn das Albumin als -Hauptbestandteil der Proteine im Urin nach-

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gewiesen wird und die Globuline und die anderen Proteinfrak- ' ^: tionen nur in einem geringeren Ausmaß erfaßt werden, da die Ausscheidung von Albumin sich in den meisten Fällen proportional zum Gesamtprotein verhält.

Die Proteine, hauptsächlich aber das Albumin, binden Farbindikatoren der allgemeinen Formel I (vgl. Anlage) in ihrer anionischen Form. Bei dieser Bindung zeigen die Färbindikatoren einen Farbumschlag in Richtung auf die Salaform, obwohl der pH-Wert des Milieus konstant bleibt (Indikatorfehler). Es werden.solche Farbindikatoren gewählt, die einen deutlichen Farbumschlag zeigen. Die im Urin vorkommenden Salze dürfen dabei die Färbung nicht beeinflussen.

Der -pH-Wert des zur Imprägnierung verwendeten Puffers richtet ' -sich nach dem Umschlagspunkt des Färbindikators der allgemeinen Formel I '(vgl, Anlage). Vorzugsweise 7/erden solche Färbstoffe in den Träger eingearbeitet, deren beide Umschlagspunkte sich im sauren.pH-Bereich befinden. Erfindungsgemäße Beispiele für die FärbIndikatoren sind m-Cresolpurpur, p-Zylenolblau, Thymolblau, Bromchlorphenolblau, Bromphenolblau, Bromcresolgrün, Ghlorphenolrot, Bromphenolrot, Bromcresolpurpur und Bromthymoiblau. Der pH-Wert des Puffers soll in der ITähe des .sauren Umschlagspunktes des Färb indika tors liegen.

Sin saurer pH-Bereich wird auch deshalb gewählt, weil die Farbindikatoren eine maximale Bindung an die Proteine im sauren "Hilieü zeigen. Von Vorteil ist hierbei Weiterhin, daß eventuell an Albumin gebundenes und mit dem Urin ausgeschiedenes Bilirubin bei sauren pH-Werten freigesetzt wird, so daß Farbindikator und Bilirubin nicht um die Bindungsstellen am Proteinmolekül konkurrieren, _λ

Der Puffer muß eine starke Pufferungskapazität haben. Durch die Pufferungs wird verhindert, daß die 0H~- und H -Ionen im Urin den pH-Wert des imprägnierten Trägers, nach dem An- feuchten verändern und eventuell schon einen Umschlag des Färbindikators hervorrufen, obwohl kein Protein im Urin vorhanden ist. . .

Das Auswaschen des Pufferungsmittels und des Färbindikators wird dadurch verhindert, daß der Imprägnierlösung gegebenen-

falls wasserlösliche Cellulosederivate wie z.B. Cellulosesulfat oder Carboxymethylcellulose zugesetzt werden. Dadurch bleibt die Pufferkapazität des imprägnierten Trägers nach·dem Eintauchen in den Urin konstant und es, wird vermieden, daß·,· ausgewaschene Pufferbestandteile und der Farbindikator weitere Untersuchungen, die mit der gleichen Urinprobe nach dem Prοteinnachweis erfolgen sollen, stören. ·

Die Konzentration des Färbindikators der allgemeinen Formel I (vgl. Anlage) hängt vom pH-7/ert' des Pufferungsmittels und dem verwendeten Trägermaterial ab. Bei einem Träger mit einer relativ starken Schichtdicke,'z. 3. Chromatographiepapier, und bei einem pH-Wert in der Nähe des sauren Umschlagspunktes kann die Imprägnierung mit einer niedrigeren. Farbindikatorkonzentration erfolgen. In diesem,Fall ergibt proteinfreier Urin bzw. Urin von gesunden Personen mit einer sehr geringen Proteinkonzentration· eine eindeutig negative Reaktion. Ein eventuell entstehender'Farbumschlag wird dann, sicher erkannt und ist. auf eine höhere (pathologische) Proteinkonzentration¹ zurückzuführen, · Wählt man dagegen eine höhere Farbindikatorkonzentration und eine geringere Schichtdicke des Trägers·,' so , tritt auch'bei einer niedrigen Proteinkonzentration schon eine leichte Färbung auf,. die sich bei Anstieg der Proteinmenge verstärkt. Unterschiedliche Intensitäten eines Farbtons sind jedoch schwieriger zu differenzieren als ein Farbumschlag von einem Farbton in einen anderen.. . ^! , '

Deshalb JLst die Zusammensetzung der Imprägnierlösung von dem Aufnahmevolumen des Trägermaterials und vom. Indikatorfehler des Färbindikators abhängig. Die günstigste Variante ist ein Träger mit hohem Aufnahmevolumen, der mit einer_%Imprägnierlösung von geringer Farbindikatorkonzentration behandelt worden ist. '

Gegebenenfalls kann zusammen mit der Imprägnierung oder im Anschluß daran noch eine Hintergrundfärbung des Papiers mit gelben Farbstoffen erfolgen. Bewährt haben sich Echtlichtgelb, Acridinorange sowie Dipyridamol. Durch die Hintergrundfärbung wird die Unterscheidbarkeit zwischen negativen und schwach · positiven Reaktionen zusätzlich verbessert.

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Die Empfindlichkeit des Teststreifens kann dadurch gesteigert werden, daß der Imprägnierlösung Verbindungen, die Wasserstoffbrücken schwachen oder" lösen, zugesetzt werden«, Dazu gehören Tenside wie ITatriumdodecylsulf at, chaotrope Substanzen wie.-.. Kaliuinrhodanid und Lithiumchlorid und die Denaturantien Harnstoff und Guanidin. Durch diese Verbindungen kommt es konzentrationsabhängig zu einer Auffaltung bzw. Denaturierung der Proteine und die Anzahl der Bindungsstellen für die Farbindikatormoleküle nimmt zu. Daraus resultiert eine intensivere Färbung auch schon'bei geringer Proteinkonzentration im. Urin.'

Der erfindungsgemäße Teststreifen zeichnet sich durch eine deutlich unterschiedliche Färbung in Abhängigkeit von der Prov· teinkonzentration im Urin aus. Durch den Zusatz von Denaturantien sowie von Tensiden und chaotropen Substanzen steigt,die Empfindlichkeit der Teststreifen um etwa 50 % an. Es wurden keine falsch-positiven Ergebnisse mit dem Urin von gesunden Personen erhalten. · ' '

Ausführungsbeispiel

1". 20 mg Bromphenolblau werden in 100 ml Citronensäure/Phosphat-Puffer nach Mcllvain mit einem pH-V/ert von 2,7 gelöst. In diese Lösung wird entsprechend zugeschnittenes Chromatographiepapier gelegt und nach dem Herausnehmen und Abtropfen bei Raumtemperatur getrocknet. Das getrocknete Papier ist gelb gefärbt..

Das imprägnierte. Papier wird in Längsstreifen mit einer ·. Breite von 1 cm geschnitten und auf eine Kunststoffolie geklebt. Diese wird in Streifen von 0,5 cm Breite geschnitten. Jeder Teststreifen hat eine Reaktionszone von 0,5 x 1 cm.

Zur Prüfung des Urins auf Proteine wird der Teststreifen einige Sekunden in die Untersuchungslösung getaucht und der nicht aufgesaugte Urin durch Abstreifen der seitlichen Kante am Gefäßrand entfernt. Die Reaktion wird nach. 30 bis 60 Sekunden abgelesen. Sine leichte Blaufärbung tritt, bei Anwesenheit von etwa 30 mg Serumprotein/100 ml Urin auf. Höhere Konzentrationen verursachen eine intensivere Blaufärbung. .

2. 100 ng Bromcresolgrün-Natriumsalz werden'in 100 ml einer 0,25 molaren Citronensäurelösung, die mit ITaOH auf einen pH-Y/ert von 3,5 eingestellt wurde, gelöst. Das weitere Vorgehen bei der Imprägnierung und Herstellung der Teststrei- . \ fen erfolgt wie unter Beispiel 1 beschrieben. Der Test- ' .streifen hat auch ähnliche Eigenschaften,

3. 80 mg Bromcresolpurpur v/erden in 100 ml einer 0,10'molaren Bernsteinsäurelösung, die mit HaOH, auf einen pH-Wert von 4»7 eingestellt wurde, gelost. .Das nach der Imprägnierung getrocknete Papier ist gelb gefärbt und schlägt nach dem ,.Eintauchen in proteinhaltigen Urin in Abhängigkeit von der Prpteinkonsentration nach purpur um.

4. Der Streifen wird hergestellt wie unter Beispiel'1· beschrieben, jedoch werden der Imprägnierlösung außerdem 500 mg' Cellulosesulfat, zugesetzt. Der auf diese Weise erhaltene Streifen zeigt eine leichte Farbverstärkung beim Eintauchen in proteinhaltigen Urin, da der Farbindikator und der'Puffer nicht in'die Untersuchungsprobe diffundieren.

5v Der Streifen wird hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben, jedoch werden der Imprägnierlösung außerdem _:50 mg.,' Acridinorange zugesetzt> Der auf diese Weise erhaltene "Streifen.ist stark gelb gefärbt, so daß eine deutliche Unterscheidung gegenüber der Färbung, die'bei einer Proteiiikpnzentration von etwa 25 mg/100 ml Urin auftritt, möglich ist. . .. ' . . . .

,6. Der Streifen wird hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben, jedoch werden der Imprägnierlösung außerdem 2g' Xaliumrhodanid zugesetzt. Der,auf diese Weise erhaltene Streifen ist gelblich gefärbt und zeigt eine Proteinkon,-zentration von etwa 15 mg/100 ml Urin an, : '

7. D:er Streifen wird hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben, jedoch werden.der Imprägnierlösung außerdem 30 g ^G-uanidinhydrochlorid zugesetzt. Der auf diese Weise erhaltene Streifen ist leicht gelblich gefärbt und zeigt eine rroteinkonzentration von etwa 15 ing/100 ml Urin mit blauer Farbe an. ·, . \ '

Anlage ,

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R₁ = R_Q = H, Alkyl

R₂ = R₅ = Rg = R₃ = H, Cl, Br,,Alkyl, Isopropyl

H,' OH . · ;.

-R₇ = H, -.01, .Bi,. Alkyl. ·.-' = Ξ,' GOOH,_r SO₃H = H, OH .· .

R₃ = R₄ =

Claims

Erfindungsanspruch ,

1. Teststreifen zum ITachweis von Proteinen im Urin auf der Basis saugfähiger Materialien wie Papier und Vliese ge- . \ kennzeichnet dadurch, daß der Streifen als I?arbindikator eine Verbindung der allgemeinen Formel I (vgl. Anlage), Pufferungsmittel, gegebenenfalls Mittel zur Verhinderung von Auswascheffekten wie wasserlösliche Cellulosederivate, gegebenenfalls Mittel zur Hintergrundfärbung wie Schtlichtgelb, Acridinorange oder Dipyridamol und gegebenenfalls Tenside wie ITatriumdodecylsulfat, chaotrope .Substanzen 7;ie Kaliumrhodanid oder Lithiumchlorid sowie Denaturantien , . wie Guanidin oder Harnstoff zur Modifizierung der Empfindlichkeit enthält. .
2. Teststreifen nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß als Pufferungsmittel insbesondere Citronensäure/Phosphat, Citronensäure/IJaOH oder Bernsteinsäure/3aOH enthalten · sind. . '