DE3789310T2

DE3789310T2 - Verfahren zur feststellung der entwicklungsgeschichte eines körperzustandes aus einer einzigen blutprobe.

Info

Publication number: DE3789310T2
Application number: DE3789310T
Authority: DE
Inventors: Alexander M Saunders
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-10-15
Filing date: 1987-10-14
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2007-10-15
Also published as: DE3789310D1; EP0329682A1; US4835097A; EP0329682B1; EP0329682A4; WO1988002782A1; JPH02500463A

Description

Beschreibung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und Messen eines physischen Zustandes, der aus einem Vergleich von roten Blutkörperchen verschiedenen Alters von einem Patienten erkennbar ist.

Hintergrund der Erfindung

Bisher ist eine zeitliche Aufzeichnung eines physischen Zustands nicht erhältlich gewesen, ohne daß ein Indikator des Zustands oder der Krankheit gleichzeitig mit dem Fortschreiten des Zustands oder der Krankheit gemessen worden ist.
Rote Blutkörperchen enthalten Hämoglobin, ein Komplexmolekül, das beim Transport von Sauerstoff und Kohlendioxid im Blut eine Rolle spielt. Sie treten fortlaufend aus dem Rückenmark, wo sie gebildet werden, in den Kreislauf ein. Die roten Blutkörperchen, die zuerst in den Blutstrom eintreten, werden Reticulozyten genannt, und nachdem das "Reticulum" des Nukleinsäurematerials aus den Reticulozyten entfernt ist - während der ersten zwei Tage des Kreislaufs - zirkulieren die roten Blutkörperchen in gesunden Menschen 120 Tage weiter als reife Zellen. Nach dieser Zeit werden die roten Blutkörperchen aus dem Kreislauf und aus dem Körper beseitigt.
Es ist gut bekannt, daß rote Blutkörperchen während ihrer Lebensdauer in flüssigem Plasma mit einer ständig wechselnden chemischen Zusammensetzung schwimmen. Einige Bestandteile des Plasmas bewegen sich auch frei durch die Zellmembran in die und aus den roten Blutkörperchen. Einige dieser Bestandteile üben, während sie in den roten Blutkörperchen sind, einen Einfluß auf die Molekülbestandteile der roten Blutkörperchen, insbesondere auf das Hämoglobinmolekül, aus.
Das Hämoglobin (Hb)-Molekül besteht aus Häm (ein Pigment) und Globin (ein Protein). Das Häm enthält Eisen im Eisen(II)-Zustand. Der Proteinanteil wird durch zwei alpha-Ketten (141 Aminosäuren) und zwei beta-Ketten (146 Aminosäuren) gebildet. Normales Hämoglobin wird Hämoglobin A (HbA) bezeichnet. Über 100 Aminosäuresequenzvarianten sind bekannt.
Verschiedene, chemisch modifizierte Formen des Hämoglobins sind bekannt. O&sub2; reagiert schnell und reversibel mit Hämoglobin zu Oxyhämoglobin. Wenn das Eisen des Hämoglobins zur Eisen(III)-Form oxidiert wird, wird Methämoglobin gebildet. Diese Veränderung wird durch DPNH und Methämoglobin- Reduktase rückgängig gemacht. Hb wird irreversibel durch verschiedene Mittel zu Sulfhämoglobin umgewandelt. Carboxyhämoglobin wird gebildet, wenn Kohlenmonoxid an Hämoglobin bindet. Cyanohämoglobin ist das Reaktionsprodukt aus Hb und dem Cyanidion.
Glykosylierte Hämoglobine sind bekannt. Ashby, et al., Diabetic Medicine 2 : 83-87 (1985); Mortensen, Danish Medical Bulletin, 36 : 369-328 (1985); Howard, et al., Acta Paediatr. Scand. 70 : 695-698 (l98I); Mortensen, J. Chromatogr. 182: 325-33 (1980). Glykohämoglobine üben noch die ursprüngliche Funktion des Hämoglobins aus, den Sauerstofftransport. Die gebildete Glykohämoglobinmenge ist direkt proportional zur Glukosekonzentration im zirkulierenden Plasma, welches die roten Blutkörperchen umgibt, und zur Expositionszeit.
Das Verhältnis von Glykohämoglobin zu Hämoglobin in einer Blutprobe kann gemessen werden, und diese Messung wird als chemischer Test durchgeführt, wobei das allgemeine Prinzip Gegenstand der US-Patente 4 399 227, 4 448 888, 4 438 204, 4 372 747 und 4 465 774 ist. Bei diesen Tests sind Hämoglobin und Glykohämoglobin aus Zellen verschiedenen Alters wahllos gemischt worden.
Die fünf prominentesten, glykosylierten Hämoglobine werden gemeinsam HbA&sub1; bezeichnet. Es gibt HbA&sub1;al (0,2%), HbAla&sub2; (0,2%), HbA&sub1;b (0,5%), HbA&sub1;c (4-6%) und HbAld (0,2-0,6%). HbA und HbA&sub1; machen zusammen bis ungefähr 97% des Gesamthämoglobingehalts aus.
Glykohämoglobinmessungen haben als ein möglicher Indikator für die Diäteinhaltung durch Diabetiker Aufmerksamkeit erlangt, siehe Howard, et al., Acta Pediatr. Scand., 70 : 695-98 (1981).
Hoberman, US-Patent 4 463 098, stellt zum Messen die zeitliche Durchschnittsaufzeichnung des Alkoholkonsums in einem Patienten durch Aufzeichnen der Konzentration eines Hämoglobinmoleküls, das durch eine Reaktion mit einem modifizierten Zucker, 5-Desoxy-D-xylulose-1- phosphat (DXP) zu "DXP-Hämoglobin" verändert wurde, bereit. Dieses Zuckermolekül wird aufgrund der indirekten Wirkung von Alkohol auf den normalen Abbaumechanismus des Zuckers in roten Blutkörperchen auf dem Hämoglobinmolekül zurückgehalten. Die Messungen des Hoberman-Patents sind nicht auf einer Einzelzellgrundlage gemacht worden, und sie mitteln tägliche Veränderungen der Alkoholmenge.
Es ist allgemein anerkannt, daß Erythrozyten nach ihrem Alter auf der Grundlage der relativen Dichten getrennt werden können. Van Gastel, 1968-RVI, Methods for Studying the In Vivo Aging of Red Cells, 1-32 (Blood Information Service); Schulinan, Biochim. Biophys. Acta, 148 : 251-55 (1967); Leif und Vinograd, Biochemistry, 51 : 520-28 (1964). Dies wird jedoch von Mortenson, Danish Med. Bull., 32 : 309,320 (Dezember 1985) bestritten.
Verschiedene, biochemische Veränderungen sind vermutlich mit der Erythrozytenalterung assoziiert. Phytrakul, M.S. Thesis, Age-Related Changes in Red Cell Activities of Glycolytic Enzymes, Reduced Glutathione, and Hemoglobin Denaturation, 1-85 (University of Oregon Health Sciences Center, Portland, Ore.: 1976); Keitel, et al., Blood 10 : 370-76 (1955); Bernstein, J. Clin. Invest., 38 : 1572-86 (1959); Edwards and Rigas, J. Clin. Invest., 46 : 1579-88 (1967). Polychronakos, et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 55 : 290 (1982) entdecken, daß der größte - wenn nicht sogar der ganze - Unterschied hinsichtlich der Insulinbindung, der zwischen den RBCs (red blood cells) von einem Erwachsenen und einem Neugeborenen gesehen wird, einem größeren Überwiegen jüngerer RBCs in den letzteren zuzuschreiben ist. Frühere Studien ergaben, daß ungefähr zweimal so viel Insulin von Reticulozyten als von den ältesten Zellen gebunden wurde.
Fitzgibbons, et al., J. Clin. Investig., 58 : 820-824 fanden, daß sowohl normale als auch diabetische Erythrozyten größere Mengen an Hämoglobin HbA 1a+b und HbA&sub1;c in den älteren Zellen enthielten. Ähnlich glaubte Elseweidy, et al., J. Lab. Clin. Med., 102 : 628 (1981), daß es ein Ansteigen von Glyko-Hb gibt, das mit dem Alter roter Blutkörperchen zusammenhängt.
Andererseits berichtete Mortensen, Danish Med. Bull., 32 : 309, 320 (Dezember 1985), daß die Unterschiede hinsichtlich des HbA1c-Gehalts zwischen "jungen" (langsam-sedimentierenden) und "alten" (schnell-sedimentierenden) Zellen nicht statistisch signifikant waren.
Es gibt Hinweise auf den Effekt, daß während der Lebensdauer der RBC HbA langsam und irreversibel glykosyliert wird. Maney, et al., Blood, 46:1051 (1975) (Abstract); Ashby, et al., (1985), s. o.; siehe aber Mortensen (1985), s. o. Wenn dies auf eine mathematisch voraussagbare Weise geschieht, dann ist das Verhältnis von Glyko-HbA zu HbA ein Hinweis auf das Alter der RBCs und kann verwendet werden, um altersabhängige Veränderungen hinsichtlich anderer Metabolite nachzuweisen.
Stillman, US-Patent 3 864 571 beschreibt einen Fluoreszenzaktivierten Zellzähler, der getrennt Lymphozyten, polymorphkernige Neutrophile, Eosinophile, Monozyten, Basophile, Blutplättchen und Reticulozyten auf der Grundlage einer selektiven Färbung ihre Kerne und des Zytoplasmas zählt. Wheeler, Jr., US-Patent 3 497 690, unterscheidet normale Zellen von carcinogenen Zellen durch den Nukleinsäuregehalt, der durch ein Fluorchrom-Färbemittel bestimmt wird. Kamentsky, US-Patent 3 413 464 betrifft Verfahren zum Verstärken dieser Unterscheidung. Färben wird auch angewendet durch Groner, US-Patent 3 740 143. Siehe auch Parker, US-Patent 2 875 666; Fulwyler, US-Patent 3 893 767; Adams, US-Patent 3 883 247; Kamentsky, US-Patent 3 662 176; Elkin, US-Patent 3 661 460; Ehrlich, US-Patent 3 699 336; Tyrer, US-Patent 4 172 227; Bouton, US-Patent 3 873 974; Miller US-Patent 3 827 804; und Miller, US-Patent 3 832 687.
Fulwyler, US-Patent 4 499 052 unterscheidet Zellen mit unterschiedlichen, relativen Aufnahmefähigkeiten für zwei verschiedene Markierungsagenzien durch das Verhältnis der zwei an die Zelle gebundenen Markierungsagenzien (z. B. mit Fluoreszein und Rhodamin markierte Partikel).
Rogers, US-Patent 4 416 778 beschrieb ein Verfahren zum Herstellen von mit unreifen Leukozyten (Neozyten) angereichertem Blut zur Verwendung bei Bluttransfusionen. Neozyten (junge RBCs) wurden durch Zentrifugation von Gerozyten (alte RBCs) auf der Grundlage ihrer Dichteunterschiede getrennt.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Verfahren zum Nachweisen und Messen eines Zustandes in einem Patienten (Mensch oder Tier) durch Zeitreihenanalyse aus einer Einzelblutprobe wird beschrieben. Eine Blutprobe wird vom Patienten genommen, Zellen der Blutprobe werden für jeden zu messenden Bestandteil gefärbt, die gefärbten Zellen werden auf Einzelzellgrundlage quantitativ gemessen, und die Messungen und/oder berechneten Verhältnisse werden numerisch geordnet. Die numerisch geordneten Zellen werden in eine Zeitreihe gemäß der Lebensdauer der gemessenen Zelle unterteilt, wodurch eine zeitliche Aufzeichnung des Zustands erhalten wird.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Zeitreihenanalyse eines Zustands aus einer einzelnen Blutprobe bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, die Blutgehalte an Glykohämoglobin und Hämoglobin auf einer Einzelzellgrundlage zu vergleichen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zum Erhalten einer zeitlichen Aufzeichnung des zurückliegenden Verlaufs eines physischen Zustands bereitzustellen.
Die Tabellen 1a und 1b zeigen die Patientenchemie bei einem normalen Patienten.
Die Tabellen 2a und 2b zeigen die Patientenchemie in einem "außer Kontrolle geratenen" Diabetiker.
Die Tabellen 3, 4 und 5 zeigen die Patientenchemie für den Patienten der Tabelle 2 bei verschiedenen Behandlungsstadien.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Rote Blutkörperchen werden fortlaufend in den Blutstrom freigesetzt und verbleiben 120 Tage lang im Kreislauf unter dem Einfluß zahlreicher, normalerweise und abnormalerweise vorhandener Chemikalien im Blutplasma. Einige dieser Chemikalien lassen ein "Protokoll" ihrer Gegenwart und Konzentration in den Hämoglobinmolekülen der roten Blutkörperchen zurück. Da das "Protokoll" kumulativ und irreversibel ist, erlaubt eine geeignete Messung solcher Konzentrationen auf einer Einzelzellgrundlage die Anordnung der Zellen in eine Zeitreihe, die zu einer zeitlichen Aufzeichnung des Verlaufs eines physischen Zustands wird. Zu den vielen Anwendungen dieses Verfahrens gehören: die Kontrolle des Zuckergebrauchs bei Diabetes, die Aufzeichnung des Alkoholkonsums oder -mißbrauchs und die Aufzeichnung des Einnehmens therapeutischer Arzneimittel oder anderer diätetischer Maßnahmen. Das Verfahren kann ebenso verwendet werden, um eine Aufzeichnung einer abnormalen Zerstörung von Blutkörperchen bereitzustellen. Weitere Zwecke umfassen: Aufstellen oder Bestätigen einer Diagnose der Patientenkrankheit, Aufzeichnen des Verlaufs einer Patientenkrankheit oder -behandlung, Durchsuchen nach allgemeinen Krankheiten und Aufstellen einer Patientengrundlinie, auf die später Bezug genommen werden kann. Viele wichtige Tests werden normalerweise in Zeitabständen wiederholt, wodurch eine Zeitreihe für einen Patienten aufgestellt wird, die verwendet werden kann, um diagnostische und therapeutische Entscheidungen zu beeinflussen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Zeitreihenergebnis auf der Grundlage einer Einzelprobe bereit, die auf einer Einzelzellgrundlage auf zeitliche Daten hin analysiert wird. Das Zeitreihenergebnis wird in Tabellen- und/oder graphischem Format für die zu analysierenden Blutbestandteile bereitgestellt. Folglich wird das Altern der roten Blutkörperchen in Rückschau untersucht.
Die Kenntnis der Beziehungen zwischen Hämoglobin, Glucose und der Lebensdauer roter Blutkörperchen hat die Entwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens beeinflußt, in dem die Durchschnittsaufzeichnung der Glucosekonzentration über die Lebensdauer der roten Blutkörperchen hinweg durch die Analyse des Verhältnisses von Hämoglobin, welches zu Glykohämoglobin umgewandelt worden ist, zu Gesamthämoglobin gemessen wird. Dies wird als chemischer Test durch Aufbrechen der roten Blutkörperchen in einer Probe, Trennen des reagierten Hämoglobins vom nicht-reagierten Hämoglobin und Messen beider Bestandteile durch Licht, das durch den Pigmentanteil des Hämoglobinmoleküls absorbiert wird, durchgeführt. Die Messung von Hämoglobin und Glykohämoglobin in Zellysaten ist im Stand der Technik bekannt.
Mehrere solcher Reaktionen zusätzlich zu der Reaktion von Glucose oder anderen Zuckern mit Hämoglobin zu Glykohämoglobinen sind bekannt. Folglich kann vorausgesagt werden, daß verschiedene Mittel entweder direkt oder indirekt solche Reaktionen eingehen werden. Solche Reaktionsprodukte können jedoch in nur kleinen Mengen vorhanden sein und sind deshalb durch die zur Zeit verwendeten Trennungstechniken schwierig zu messen. Solche Reaktionen werden nachstehend berücksichtigt werden.
Erfindungsgemäß wird die Analyse von Hämoglobin oder verändertem Hämoglobin, wie z. B. Glykohämoglobin, auf einer Einzelzellgrundlage durchgeführt. Dies wird dadurch erreicht, daß quantitative Färbereaktionen für jeden Bestandteil in Zellsuspensionen oder an auf einen Glasobjektträger ausplattierten Zellen durchgeführt werden oder durch jedes andere geeignete Verfahren. Die Zellen werden danach optisch auf die Färbungen hin getestet, und mehrere Instrumente für eine solche Messung existieren. Beispiele für solche Instrumente werden in den Patenten von Fulwyler, US-Patent 3 893 767, Stillman, US-Patent 3 864 571, Elkind, US-Patent 3 661 460, Groner, US-Patent 3 740 143 und Kamentsky, US-Patent 3 413 464 gefunden. Patente auf Objektträgermeßinstrumente umfassen diejenigen von Miller, US-Patente 3 832 687 und 3 827 804. Bacus, US-Patent 4 209 548 beschreibt ein Mustererkennungsinstrument.
Die Zellen können zur Bestimmung ihres Alterns nicht nur gefärbt werden, sondern sie können auch physikalisch auf der Grundlage der Dichte in Altersgruppen getrennt werden. Die Verwendung eines Färbemittels ist jedoch bevorzugt.
Die Ergebnisse der Messungen auf Einzelzellgrundlage stellen quantitative Maße eines unveränderten Bestandteils von Blutzellen, wie Hämoglobin, und eines veränderten Bestandteils, wie Glykohämoglobin (auch bekannt als glykosyliertes Hämoglobin), bereit. Ein Verhältnis des veränderten Bestandteils zum unveränderten Bestandteil (wie Glykohämoglobin zu Hämoglobin) wird auf einer Einzelzellgrundlage erstellt, und die Verhältnisse werden in eine numerische Anordnung gebracht. Da Hämoglobin kontinuierlich und irreversibel mit Glucose, die im Blutplasma zirkuliert, reagiert, ist dieses Verhältnis größer in älteren roten Blutkörperchen als in jüngeren Blutkörperchen. Folglich stellt die geordnete Verhältnisreihe das relative Alter der Zellen, von denen die Verhältnisse abgeleitet worden sind, dar. Dadurch, daß diese Verhältnisse in Anordnungen gleicher Größenordnungen oder gleicher Konzentrationen des veränderten Bestandteils gebracht werden, kann eine echte Zeitreihe abgeleitet werden, da bekannt ist, daß die Lebensdauer eines roten Blutkörperchens 120 Tage beträgt.
Wenn die Veränderung konstant verläuft und von einiger Größe ist, wie im Fall der Veränderung von Hämoglobin zu Glykohämoglobin, kann angenommen werden, daß die Zeitreihen ein Auflösungsäquivalent von 2 bis 7 Tagen aufweisen. Wenn die Veränderung gering und weniger konstant ist, können die Zeitreihen nicht durch das vorstehend beschriebene Grundverfahren direkt und zuverlässig abgeleitet werden. Dadurch, daß eine kombinierte Analyse mit denselben Zellen auf Einzelzellgrundlage auf Hämoglobin, Glykohämoglobin und weiteren zu analysierenden Bestandteilen durchgeführt wird, können die für Glykohämoglobin abgeleiteten Zeitreihen verwendet werden, um auch Zeitreihen für die weiteren zu messenden Bestandteile aufzustellen. Dadurch kann auch eine zeitliche Aufzeichnung solcher weiterer Bestandteile erhalten werden. Jedes weitere Modifizierungsverfahren von vergleichsweise zuverlässiger Natur kann verwendet werden, um eine Bezugszeitlinie für einen Vergleich mit variableren Prozessen aufzustellen. Weitere Verfahren zum Bestimmen des Zellalters, wie die Zellsedimentierungsrate oder die stationäre Zersetzung nicht-stabiler, endogener Bestandteile roter Blutkörperchen können zusätzlich zu Eichzwecken verwendet werden.
Zusätzlich zum Verhältnis von Glyko-Hb zu Hb werden weitere Determinanten des Zellalters von der Erfindung berücksichtigt. Die stationäre, graduelle Verminderung der Insulinbindung und Zersetzung glykolytischer Enzyme können durch Färbung und Messung bestimmt werden.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung bei der Diagnose und der therapeutischen Krankheitsüberwachung sind klar offensichtlich. Z.B. kann bei Diabetes, bei der der Patient die normale Kontrolle über den Stoffwechsel des Zuckermoleküls (Glucose) verloren hat und daher eine externe Modifizierung einer solchen Kontrolle durch Verabreichung von Insulin, durch eine andere medizinische Behandlung oder durch eine strenge Diätkontrolle benötigt, die tageweise Zuckerkontrolle rückblickend für die vorausgegangenen 120 Tage durch Analyse einer einzelnen Blutprobe untersucht werden. Wenn dies in Zeiträumen von 3 oder 4 Monaten durchgeführt wird, kann eine fortlaufende Aufzeichnung erhalten werden, und eine solche Aufzeichnung kann verwendet werden, um eine tageweise Kontrolle zu etablieren. Eine durch früher bekannte Verfahren durchgeführte Chargenprüfung hat nur eine Zeitauflösung von 120 Tagen an einem einzelnen Datenpunkt im Gegensatz zu dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die 120-tägigen Lebensdauer der roten Blutkörperchen in beispielsweise wöchentliche Zeiträume durch eine Zeitreihenanalyse einer einzelnen Probe, analysiert auf einer Einzelzellgrundlage, unterteilt werden kann, wobei die einzelne Probe am Ende der 120-tägigen Zeitspanne genommen wird. Während der 120 Tage kann es einige Zeiträume hoher und andere Zeiträume niedriger Zuckerkonzentration im Blutplasma des Patienten geben. Unter Verwendung früher bekannter Verfahren werden solche separate Episoden zu einem Wert gemittelt, wodurch sich Fehler gegenseitig ausgleichen können, was möglicherweise zu einem normalem Ergebnis für die Chargenprüfung führt. Ausgleichende Fehler werden durch die erfindungsgemäßen Verfahren größtenteils vermieden, da eine historische in kurze Zeiträume unterteilte Zeitreihe mit größter Wahrscheinlichkeit solche Fehler beseitigt.
Obwohl es bevorzugt ist, daß die Reaktion, die überwacht wird, um das Zellalter zu bestimmen, vollständig irreversibel ist, reicht es, daß die Reaktion nur langsam reversibel ist. Wenn sie langsam reversibel ist, wird die "Historie", die durch die ältesten Blutkörperchen bewahrt wird, verloren gehen.
Es ist ebenso bevorzugt, daß die Reaktion konstant verläuft. Wenn sich jedoch ihre Rate in einer gleichmäßigen und vorhersagbaren Weise ändert, kann das Alter durch die anderen Mittel bestimmt werden, um die Beziehung des Verhältnisses von Substrat zu Produkt zum Zellalter herzustellen.
Es ist weiterhin wünschenswert, daß die Reaktion über die Zellebensdauer hinweg verläuft. Wenn sie jedoch während eines begrenzten Teils der Zellebensdauer abläuft, kann sie immer noch verwendet werden, um Zeitreihendaten bereitzustellen, dann jedoch nur über einen begrenzteren Zeitraum.
Nicht-toxische Analoga zum Zuckermolekül können ebenso als unabhängige Markierungsagenzien verwendet werden. Solche unabhängige Markierungsagenzien können mit einer Medikation durch pharmazeutische Firmen gemischt werden, wobei die Mischung ein konstantes Verhältnis des Markierungsagens zur Medikation aufweist. Das Markierungsagens ist vorzugsweise eine Substanz, die mit einem Zellbestandteil, wie Hämoglobin, irreversibel und zu einer konstanten Rate reagiert. Auf eine solche Weise kann eine zeitliche Aufzeichnung des Verbrauchs eines jeden Mittels bereitgestellt werden. Eine Aufzeichnung dieser Natur kann verwendet werden, um das Einhalten eines Arzneimitteltherapieschemas zu bestimmen, und sie kann als Aufzeichnung einer versehentlichen oder nicht vorgeschriebenen Einnahme der Medikation verwendet werden.
Vorzugsweise sind die verwendeten Markierungsagenzien seltene Zucker, die nicht in normaler Nahrung gefunden werden, wie Rhamnose und Xylose. Cook und Menzies, Digestion, 33:109-116 (1986) verwendeten "nicht-metabolisierte" Marker, um die Darmabsorption zu testen. Siehe auch Ford, et al., J. Ped. Gastroent. δ Nutr., 4 : 568-74 (1985).
Bei einem nicht-diabetischen Patienten kann die gleiche auf Einzelzellgrundlage durchgeführte Glykohämoglobinanalyse auch eine zeitliche Aufzeichnung der Lebensdauer der roten Blutkörperchen im Kreislauf zum Zeitpunkt, an dem die Probe genommen wurde, bereitstellen. Wenn z. B. die maximale Konzentration in einer einzelnen Zelle nur 1/10 von derjenigen ist, die in einer normalen Probe gefunden wird, beträgt die Lebensdauer der roten Blutkörperchen in diesem Patienten nur 12 Tage, anstatt 120 Tage. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt Mittel zum Verbessern des diagnostischen Genauigkeitsgrades hinsichtlich Krankheiten, bei denen rote Blutkörperchen zerstört werden, im Vergleich zu Krankheiten, durch die aufgrund von Blutungen Blut verloren wird, bereit. Die Bestimmung der RBC-Zerstörung in einem diabetischen Patienten ist auch möglich.
Um das erfindungsgemäße Verfahren zu verwenden, wird eine Flüssigprobe von einer Person (oder von einem Tier) genommen und auf eine von zwei allgemeine Weisen behandelt:
(1) Die flüssige Blutprobe wird auf eine flache Oberfläche, beispielsweise einen Glasobjektträger, ausplattiert. Dies kann durch eine konventionelle, manuelle Technik geschehen, oder durch eine Blutschleudertechnik, wie beschrieben in US-Patent 4 209 548. Die ausplattierte Probe kann entweder fixiert werden, während sie noch feucht ist, wie beschrieben in den US-Patenten 4 209 548 und 4 483 882, oder man läßt die plattierte Probe auf dem Objektträger trocknen und fixiert danach durch konventionelle Methanol-Immersion oder andere konventionelle Techniken.
(2) Ein alternatives Verfahren zum Behandeln der Probe ist, diese in flüssiger Form zu halten und die roten Blutkörperchen sich vom Plasma absetzen zu lassen. Zentrifugation kann verwendet werden, um diesen Absetzungsprozeß zu beschleunigen. Die obere Plasmaschicht wird entfernt und durch eine Pufferlösung mit Eigenschaften, die so ausgewählt sind, daß die Form der roten Blutkörperchen erhalten wird, ersetzt. Das Absetzen (und die Zentrifugation) werden wiederholt, und ein zweites Volumen an Puffer wird aufgebracht, wodurch die Zellen gewaschen werden. Nach dem Waschschritt können die Zellen wieder auf eine der zwei Art und Weisen behandelt werden, d. h. sie können entweder auf eine flache Oberfläche, wie allgemein beschrieben in (1) oben ausplattiert oder während des Färbeschrittes in Suspension gehalten werden.
Wenn die Zellen bei dem Färbeschritt in Suspension gehalten werden, müssen die Zellen fixiert werden, damit sie ihre Form behalten und um das Eindringen des Färbemittels und anderer Reagenzien zu erlauben. Eine solche Fixierung kann durch Verwenden von verdünnten Lösungen, wie beispielsweise Ethanol im Puffer oder Formaldehyd im Puffer erreicht werden. Nach der Fixierung werden die Zellen nochmals gewaschen, um einen Einfluß des Fixierungsreagenzes zu beseitigen. Im Fall von Aldehyd-Fixierungsmitteln kann jedoch eine weitere Zugabe eines Reagenzes, wie Dimedon, durch Neutralisieren des Fixierungsmittels das gleiche Ziel wie Waschen bewerkstelligen.
Die Proben, die auf eine flache Oberfläche ausplattiert worden sind, können auf ähnliche Weise gewaschen werden, außer, daß dies durch Eintauchen der flachen Oberfläche in eine klare Lösung erreicht wird. Ein Zweck des Waschschrittes ist es, von außen zugefügte Zuckermoleküle oder ein anderes Markierungsreagens, welche noch nicht gebunden sind, von den roten Blutkörperchen zu entfernen.
Nachdem die roten Blutkörperchen entweder in Suspension oder auf einer flachen Oberfläche gewaschen und fixiert worden sind, werden sie als nächstes gefärbt, so daß ein oder mehrere Unterscheidungsmerkmale gemessen werden können. Da das Hämoglobinmolekül ein Pigment ist und charakteristische Lichtabsorptionseigenschaften aufweist, wenn es fixiert ist, mag es nicht notwendig zu sein, eine weitere Identifizierung dieses Moleküls durchzuführen. Es ist jedoch auch möglich, Hämoglobin mittels konventioneller Proteinfärbemittel, wie Fluoreszeinisothiocyanat oder Diaminonaphthalinsulfonsäurechlorid, zu färben. Eine Anzahl von Reagenzien verschiedener Fluoreszenzfarben und verschiedener Anregungswellenlängen sind zu diesem Zweck ohne Schwierigkeiten erhältlich. Obwohl Hämoglobin nicht das einzige in roten Blutkörperchen vorhandene Protein ist, ist es in solch großen Anteilen im Überschuß über andere Proteine vorhanden, daß die Berechnung deren Menge das Ergebnis nicht beeinflußt.
Zusätzlich zum Färben des Hämoglobins werden auch andere Bestandteile, wie z. B. Glykohämoglobin (an das Hämoglobinmolekül gebundene Glucose), in der Probe gefärbt. Weitere Markierungsagenzien können ebenso angewendet werden, wie vorstehend diskutiert und wie in den nachstehenden spezifischen Beispielen beschrieben. Nach jedem Färbungsschritt kann es notwendig sein, Waschschritte durchzuführen, um die Wirkung der Reagenzien auf nachfolgende Verfahrensschritte zu beseitigen.
Nach Beendigung des Färbens wird die Probe durch ein Verfahren auf Einzelzellgrundlage gemessen. Ein Apparat für eine solche Messung ist z. B. in den US-Patenten 3 413 464 und 3 893 767 beschrieben. Die genaue Natur der für die Messung verwendeten Farbfilter hängt von der genauen Ausführung ab, mit der die Probe gefärbt wird.
Glykohämoglobine können auf mehrere Arten detektiert werden. Enzyme können verwendet werden, die auf die Kohlenhydratanteile wirken und aktive Spezies freisetzen, die an einem Signal erzeugenden System teilnehmen. Markierte Lectine oder Kohlenhydrat-spezifische Antikörper können an Glykohämoglobin gebunden werden, und der resultierende Komplex wird danach detektiert.
Für jede Zelle werden mindestens zwei Bestandteile gemessen, und die resultierenden Daten aus solchen Messungen werden in dem Instrumentspeicher zu einer weiteren Analyse gespeichert, bis die Endergebnisse ausgegeben werden. Dieser Prozeß läßt sich leicht durch eine Analyse mittels Computerverfahren nachahmen. Die Berechnungen umfassen das Erhalten des Verhältnisses der wenigstens zwei Bestandteile, die gemessen worden sind, immer noch auf Einzelzellgrundlage. Die Verhältnisergebnisse werden in aufsteigender Anordnung aufgelistet und in einem Histogramm oder einer anderen Art einer graphischen Darstellung ausgewertet. Die quantitative Messung der wenigstens zwei Bestandteile auf einer Einzelzellgrundlage kann irgendwann, entweder gleichzeitig oder nacheinander, an derselben Zelle stattfinden.
Dieselben Daten der geordneten Verhältnisse werden auch für die folgende Berechnung verwendet. Beginnend an dem einen Ende der Anordnung wird eine konstante Fraktion der Gesamtanzahl gezählter Zellen abgezählt, und ihr Verhältnis wird gemittelt, wobei der Durchschnitt entweder manuell oder in einem Computerspeicher aufgezeichnet wird. Ähnlich konstante Fraktionen werden wiederholt abgezählt, ihre Verhältnisse gemittelt und gespeichert, bis das andere Ende der Anordnung erreicht wird. Die Anzahl solcher konstanten Fraktionen stellt ein Teilzeitinkrement der Gesamtlebensdauer der individuellen roten Blutkörperchen dar. Die exakte Natur dieses Zeitinkrements wird von einer weiteren Kenntnis des Individuums, von welchem die Probe genommen wird, abhängen. Als ein Beispiel wird eine Probe von einem normalen Menschen mit einer Lebensdauer der roten Blutkörperchen von 120 Tagen, dessen geordnete Probe in 60 konstante Fraktionen aufgeteilt worden ist, Fraktionen ergeben, die jeweils 2 Tage repräsentieren. Es ist verständlich, daß einige Ungenauigkeiten in einer solchen Darstellung vorkommen werden, die von der biologischen Variation, z. B. der Anzahl roter Blutkörperchen, die an jedem Tag der vorangegangenen 120 Tage produziert wurden, abhängen. Daher werden gewöhnlich größere Fraktionen, die längere Zeitintervalle repräsentieren, auf Kosten der Auflösung eine größere Genauigkeit besitzen.
Als ein sekundärer Test auf die Validität der konstanten Fraktionen, die konstante Zeitintervalle repräsentieren, kann das Instrument eine Standardabweichung und/oder weitere einfache statistische Berechnungen mit jedem Satz von Verhältnissen innerhalb einer konstanten Fraktion durchführen. Beginnend mit einer Fraktion, die in der Nähe der Mitte liegt, wird die Fraktion in einer systematischen Art und Weise vergrößert und verkleinert, und eine Standardabweichung wird wiederum berechnet. Durch schnelle Iteration dieses Verfahrens wird folglich die beste Anpassung für jedes Intervall definiert, der Durchschnitt für das neue Intervall wird berechnet und verwendet, um die ursprünglich gespeicherten Werte für das Intervall zu ersetzen. Die Differenz zwischen jedem Durchschnittswert und dem in der Anordnung als nächstes voranstehenden Durchschnittswert wird berechnet. Diese Berechnung stellt ein Inkrement des Markierungsagens, das während des durch den Durchschnittswert repräsentierten Zeitintervalls in den roten Blutkörperchen angehäuft wurde, dar.
Auf diese Weise werden sowohl das relative Alter jedes gemessenen Blutkörperchens als auch die Menge des in jedem Zeitintervall angehäuften Markierungsagens definiert. Für verschiedene Probearten kann es notwendig sein, weitere Berechnungsanpassungen durchzuführen. Solche Anpassungen können die Mittel zum Definieren der Zeitintervalle verbessern, wenn die Historie des Zellüberlebens besser bekannt ist. Beispielsweise wird, wenn rote Blutkörperchen gewöhnlich 120 Tagelang leben, jedoch in bekannten Zeitintervallen Episoden stattfinden, an denen rote Blutkörperchen verlorengehen, wie bei Frauen in deren Menstruationszyklus, ein geeigneter Korrekturfaktor angewendet werden.
Ähnlich ist auch dann Vorsicht geboten, wenn bekannt ist, daß der Patient eine Bluttransfusion erhalten hat, da die Glykohämoglobinmengen in den übertragenen Zellen wenigstens zum Teil die Glucosemengen in dem Donor und nicht in dem Patienten wiederspiegeln.
Zusätzlich zu den bereits beschriebenen zwei Messungen können auch weitere Messungen durchgeführt werden. Ein Zweck weiterer Messungen an jeder Zelle ist es, noch ein weiteres Markierungsagens zu bestimmen, welches sich zur selben Zeit in dem Individuum anhäuft, von dem die Probe genommen wird.
Ein anderer Zweck weiterer Messungen an jeder Zelle ist es, eine bessere Abgrenzung des zu untersuchenden Zeitintervalls zu erreichen. Beispielsweise können durch Messen der Menge an Ribonukleinsäure (RNA) in jeder Zelle, wie im US-Patent 3 864 571 beschrieben, die letzten zwei Tage der Lebensdauer des roten Blutkörperchens untersucht werden, da RNA nur innerhalb der ersten zwei Tage der Zellebensdauer in einem roten Blutkörperchen vorhanden ist. Durch eine Begrenzung der Messung des Markierungsagens und des Verhältnisses der Markierungsagenzien auf nur diese einen Tag alten und zwei Tage alten Zellen (bekannt als Reticulozyten) wird die unmittelbar vorausgegangene Historie des Markierungsverfahrens in dem Individuum bestimmt. Wenn die Zellen gefärbt worden sind und Hämoglobin, Glykohämoglobin und ebenso RNA gemessen worden ist, wobei die Messungen alle auf einer Einzelzellgrundlage durchgeführt worden sind, kann die Glukosekontrolle für jeden der zwei Tage vor dem Tag, an dem die Probe genommen wurde, untersucht werden. Wenn zudem ein weiteres Markierungsagens auf diesen Zellen auf einer Einzelzellgrundlage zu derselben Zeit gemessen wird - z. B. kann Alkohol oder eine bestimmte Droge markiert und gemessen werden - kann die Einnahme des Alkohols oder der Droge während jedes der zwei vorangegangenen Tage untersucht werden, da die betreffenden Zellen für diese Tage durch die zusätzliche Gegenwart von RNA in diesen Zellen identifiziert worden sind.
Ein einfaches Modell, das die Verwendung der Erfindung zeigt, ist nachstehend dargestellt. Die Tabelle 1a zeigt einen Aufbau einer Inkrementtabelle, welche die Zahlen und Regeln des Modells zeigt. Die Spalte 1 stellt Zeitinkremente, z. B. Wochen, dar; die Spalte 2 stellt einen Basislinienzusatz für jedes Zeitintervall dar, wobei die Basislinie repräsentativ für die Rate ist, mit der rote Blutkörperchen im Kreislauf in einem normalen Individuum modifiziert werden; die Spalte 3 stellt ein konstantes, abnormales Inkrement dar, welches mit dem Krankheitsprozeß des Patienten in Beziehung steht (in Tabelle 1 ist dies 0 für einen normalen Patienten); die Spalte 4 stellt nicht-konstante Inkremente dar, die mit zeitlichen Veränderungen hinsichtlich des chemischen Status des Patienten innerhalb nur eines Zeitintervalls in Beziehung stehen (0 in einem normalen Patienten); die Spalte 5 stellt die Summe innnerhalb eines Zeitintervalls der Spalten 2, 3 und 4 dar; die Spalte 6 stellt eine Gesamtzahl dar, basierend aufalle Zeitintervalle vom ersten Intervall oder der ersten Reihe bis zu dem letzten Intervall oder der letzten Reihe. Am Ende der Spalte 6 wird das Durchschnittsinkrement oder der Mittelwert dargestellt. Dieser Mittelwert wird durch Teilen der zusammengezählten Werte der Spalte 6 durch die Anzahl der Zeitinkremente abgeleitet. Die Zahlen im Modell der Tabelle 1a sind in einer solchen Weise ausgedacht, daß das Durchschnittsinkrement den normalen Gesamtglykohämoglobinwert simuliert, wenn nur die Basislinienwerte an der Summation teilnehmen.
Die Tabelle 1b stellt eine auf der Spalte 6 der Tabelle 1a basierende Summenverteilungskurve dar. Die Tabelle 1a veranschaulicht, wie sich das veränderte Hämoglobinmolekül mit der Zeit in roten Blutkörperchen verschiedenen Alters, wie in Spalte 1 dargestellt, anhäuft; ebenso in Spalte 6 der Tabelle 1 tabellarisch aufgeführt.
Der dritte Bestandteil der Tabelle 1 stellt graphisch die inkrementale Modifizierung von Hämoglobin in jedem einzelnen Zeitintervall dar. Dies ist das Diagramm, welches für einen Arzt bei der Behandlung der Patienten mit beispielsweise Diabetes am interessantesten sein würde. Dieses Diagramm stellt auch die Menge der modifizierenden Substanz dar, welche im Plasma in dem Zeitintervall zirkuliert, dargestellt für jedes einzelne Zeitintervall.
Die Tabellen 2 bis 5 sind ähnlich zu der vorstehend beschriebenen Tabelle 1. In der Tabelle 2 simulieren die Werte einen schweren Diabetiker, dessen Zuckerkonzentration ständig außer Kontrolle ist, durch ein konstantes Inkrement, welches identisch mit dem Basislinieninkrement ist, d. h. der Wert des zirkulierenden Zuckers ist ständig doppelt so hoch wie normal. Die Werte in Tabelle 2a sind in Tabelle 2b graphisch dargestellt, welche den Grad des Kontrollverlustes über die Zuckerkonzentration zeigt.
Ähnlich kann Drogengebrauch aufgezeichnet werden. So ist Morphinsucht mit erhöhten Glykohämoglobinmengen assoziiert. Giugliane, Diabetologia, 22 : 379 (1982).
Die Tabelle 3 zeigt Ergebnisse einer therapeutischen Behandlung des hypothetischen Patienten der Tabelle 2 für das erste der drei Zeitintervalle (gezeigt in den Tabellen 3, 4 und 5). Dies wird aufgrund der Wirkungen der Medikation, wie z. B. Insulin, durch ein negatives Inkrement dargestellt. Die Wirkung dieser Therapie ist graphisch in der Tabelle 3b dargestellt. In den Tabellen 4 und 5 sind weitere Perioden der Insulintherapie für denselben Patienten nachgebildet und in den Tabellen 4b und 5b graphisch dargestellt. Der Erfolg der Therapie ist dadurch gezeigt, daß die inkrementale Kurve in Richtung der in Tabelle 1 gezeigten normalen Kurve zurückgeht. Die Tatsache, daß die Werte dieses Patienten nicht vollständig auf normale Werte zurückgehen, ist durch die Abweichung der inkrementalen Kurve in Tabelle 5 gezeigt.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele weiter dargestellt:

BEISPIEL 1

Eine flüssige Blutprobe wird von einem diabetischen Mann genommen, von dem bekannt ist, daß er während der vorausgegangenen 120 Tage keinen wesentlichen Blutverlust erlitt. Ein Teil der Probe wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 gewaschen und durch ein Schleuderverfahren auf einen Mikroskopobjektträger aufgebracht. Die Probe wird luftgetrocknet, durch Eintauchen in trockenes Methanol für 30 Sekunden fixiert und nochmals luftgetrocknet.
Die luftgetrocknete Probe wird für 2 Minuten in destilliertes Wasser und danach für 20 Minuten in eine Lösung von 0,5%-iger Perjodsäure eingetaucht. Danach wird dieselbe Probe für 10 Minuten in laufendes Wasser eingetaucht und für weitere 20 Minuten in eine Schiff'sche Lösung eingebracht. Die Schiff'sche Lösung ist zusammengesetzt aus 0,5 g gelb-fluoreszierendem (540 nm) Acriflavinhydrochlorid, 20 ml 1 N Salzsäure und 1 g Natriummetabisulfit in 200 ml destilliertem Wasser. Diese Lösung läßt man einen Tag lang altern, nach welchem sie zusammen mit aktivierter Kohle filtriert wird, und das klare bernsteinfarbene Filtrat wird bei 4ºC gelagert. Eine letzte Spülung in Leitungswasser beseitigt überschüssiges Reagens.
Die erhaltene Probe wird in rot-fluoreszierendem (620 nm) Bromphenolblau 0-2 g% in Methanol gefärbt, dreimal in Methanol gewaschen und luftgetrocknet. Nach gründlichem Trocknen wird die Probe mit einem Deckglas unter Verwendung eines nicht-fluoreszierenden Befestigungsmediums bedeckt.
Individuelle Messungen auf Einzelzellgrundlage werden mittels eines Fluoreszenzmikroskops durchgeführt, das ähnlich zu demjenigen ist, welches von Fulwyler, US-Patent 3 893 767, beschrieben wurde. 10000 rote Blutkörperchen werden gemessen und zur Analyse in eine Datenbank eingegeben. Die Verhältnisse gelber zu roter Fluoreszenz werden gemessen, und die Ergebnisse der Größe nach vom geringsten zum größten Verhältnis geordnet. Die geordneten Zellen werden in Gruppen zu ungefähr 600 Zellen, beginnend beim niedrigsten Verhältnis, unterteilt, und die Ergebnisse werden gemittelt. Jeder Durchschnittswert wird vom nächst höheren Durchschnittswert subtrahiert, und die Reste werden graphisch in ein Histogramm, welches eine wöchentliche Historie der Blutzuckerkontrolle des Patienten repräsentiert, eingetragen. Die Ergebnisse werden von einem Arzt mit Kenntnis normaler Schwankungen verglichen.

BEISPIEL 2

Eine flüssige Blutprobe wird von einer bekannten Diabetikerin in einer Unfallstation genommen, wohin sie bewußtlos eingeliefert wurde. Die Blutprobe wird zweimal mit PBS gewaschen, und danach werden 100 ul, enthaltend ungefähr zwei Millionen Zellen der Probe, mit einer 0,5%-igen Lösung von Formaldehyd in PBS gemischt. Nach 5 Minuten werden die Zellen nochmals zweimal mit klaren PBS-Portionen gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden mit einer Lösung von mit TRITC markiertem Concanavalin A (Con A) gemischt. Con A besitzt die Eigenschaft, an Glucosemoleküle binden zu können, welche selbst an Hämoglobinmoleküle gebunden sind. Diese Lösung wird in PBS und einer 0,1%-igen nicht-anionischen Detergenslösung (Tween®20) hergestellt. Nachdem man diese Lösung für 20 Minuten auf die Zellen einwirken gelassen hat, werden die Zellen nochmals gewaschen, und die Suspension wird auf eine Endkonzentration von ½ Million Zellen pro cm³ gebracht. Diese letztliche Zellsuspension läßt man durch ein Durchflußzytometer, wie dem Becton Dickinson FACS-Analysator, unter Verwendung von Anregungsfiltern, die die Wellenlänge auf 545 +/- 20 Nanometer begrenzen, fließen. Die Fluoreszenzfilter werden so verwendet, daß zwei Fluoreszenzfarben gemessen werden, eine über 620 Nanometer und eine unter 580 Nanometer. Kreuzinterferenz zwischen den zwei Fluoreszenzfarben wird experimentell bestimmt und korrigiert. 24000 Zellen werden gemessen und die Daten in einem "list mode" im Computerspeicher des Instruments akkumuliert.
Die Verhältnisse werden wie in Beispiel 1 berechnet, und die Ergebnisse werden in Zwei-Tages-Intervalle aufgeteilt. Die Standardabweichungen im Computer werden verwendet, um die Durchschnittswerte in einer iterativen Weise zu testen, bis die beste Anpassung der Daten für jedes Intervall erreicht wird. Die täglichen Anhäufungsinkremente werden wie im Beispiel 1 berechnet, und die Ergebnisse berichteten über die Glucosekontrollhistorie dieses Patienten.

BEISPIEL 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wird durchgeführt, außer daß die gewaschene Zellsuspension mit einer Lösung von 0,4% Neumethylenblau (NMB) und 1% Kaliumoxalat gemischt wird, bevor diese mit der Formaldehydlösung behandelt wird. Nach 4 Minuten wird ein gleiches Volumen an Formaldehydlösung zugefügt und nach weiteren 2 Minuten wird die Suspension wie in Beispiel 2 gewaschen. Alle weiteren Färbungsschritte sind wie in Beispiel 2, jedoch enthalten alle Schritte einschließlich des ersten Waschschrittes 0,2% Cetylpyridiniumchlorid (CPC).
Die Messung wird ebenso wie im Beispiel 2 durchgeführt, jedoch wird zusätzlich die Weitwinkel-Lichtstreuung jeder Zelle gemessen und zusammen mit den anderen zwei Messungen im "list mode" aufgezeichnet. NMB wird eine Aggregation oder Präzipitation von RNA in Reticulozyten verursacht haben. Die Präzipitate werden durch die Zugabe von CPC zu allen Lösungen innerhalb der Zellen als Feststoffe mit höherem Brechungsindex erhalten. Da CPC nicht-fluoreszierend ist, wird es nicht mit den anderen Messungen interferieren. Es wird jedoch einen signifikanten Anstieg der Lichtstreuung in Reticulozyten verursachen.
Die Datenanalyse erfolgt wie in Beispiel 2. Eine getrennte Datenanalyse wird für diejenigen Zellen, die große Lichtstreuungsresultate ergeben, durchgeführt. Diese Zellen werden in zwei gleiche numerische Gruppen unterteilt. Diejenigen mit dem größten Lichtstreuungswert repräsentieren den Tag, bevor die Probe genommen wurde. Solche mit geringerer Lichtstreuung repräsentieren den Tag vor demjenigen. Auf diese Weise kann die Historie der Glucosekontrolle für die zwei Tage vor dem Notfall spezifisch bestimmt werden.

BEISPIEL 4

Das verwendete Verfahren wird wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, jedoch wird die hergestellte Probe auf einen Glasobjektträger aufgebracht und unter einem Mikroskop unter Verwendung von drei Analysefarben gemessen.

BEISPIEL 5

Rote Blutkörperchen werden durch Waschen in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) wie in Beispiel 2 präpariert. Die roten Blutkörperchen werden wie im Beispiel 1 auf Objektträger ausplattiert. Zwei Objektträger werden hergestellt und durch zwei getrennte Färbeverfahren behandelt.
Objektträger A wird wie in Beispiel 1 gefärbt.
Beim Objektträger B wird der Salzsäure-Schritt des Beispiels 1 durch Eintauchen des Objektträgers in eine Lösung, enthaltend drei Einheiten Galactose-Oxidase pro ml, ein aus dem Organismus Polyporus circinatus oder Dactillium dendroides isoliertes Enzym, welches von Sigma Chemical Company erhältlich ist, ersetzt. Diese Lösung enthält auch ein nicht-ionisches Detergens, 0,1% Tween®20, und 10 Einheiten Catalase pro ml und auf pH 6,0 eingestellten verdünnten Puffer. Galactose-Oxidase besitzt die Eigenschaft, den Zucker- Galactose oder endständige Galactose in polymeren Zuckern zu einer Verbindung mit einem Dialdehyd, die ähnlich zu derjenigen ist, die durch Salzsäure hergestellt wird, zu oxidieren; jedoch ist das Enzym spezifisch für Galactose und für mehrere verwandte Zucker, wie Galactosamin, Raftinose und Stachyose; es wird nicht mit Glucose reagieren. Catalase wird zugefügt, um das in der Reaktion gebildete und von den Zellen wegdiffundierende überschüssige Wasserstoffperoxid auf zubrauchen.
Nach Behandlung mit der Galactoseoxidase-Lösung und Waschen in destilliertem Wasser wird der Objektträger B wie in Beispiel 1 mit Acriflavin-Schiff'scher Lösung und auch wie in Beispiel 1 mit Bromphenolblau behandelt.
Eine quantitative Bestimmung der zwei fluoreszierenden Farben auf Einzelzellgrundlage wie in Beispiel 1 ermöglicht die Berechnung der Verhältnisse und die Aufstellung des Kalenders mit Objektträger A.
In einer normalen Person wird Objektträger B keine Inkremente zeigen, von denen aus ein Kalender berechnet werden könnte. Bei einem an Galactosämie leidenden Patienten wird das Ergebnis jedoch eine Kalenderisierung mit Inkrementen sein, die von der vom Patienten aufgenommenen Galactosemenge abhängen.
Daher macht der Test, bei dem Salzsäure durch Galactose- Oxidase ersetzt wird, die Reaktion spezifisch für durch Galactose verändertes Hämoglobin. Ein solcher Test kann verwendet werden, um die Diät eines Patienten mit Galactosämie aufzuzeichnen und er kann ebenso verwendet werden, um die Interferenz von Galactose bei den Glucose-Inkrementen abzuschätzen.
Siehe Bradley A. Schulte und Samuel S. Spicer, "Light Microscopic Histochemical Detection of Terminal Galactose or N-acetyl Galactosamine in Rodent Complex Carbohydrates, Using a Galactose Oxidase - Schiff Seguence." J. Histochemistry and Cytochemistry, Band 31, S. 19-24, 1983; N.J. Howard, H. Monaghan udn J. M. Martin "Hemoglobin Al in Galactosemia, a Possible Role in Monitoring Dietary Compliance." Acta Paediatr. Scand., Band 70, S. 695-698, 1981.

BEISPEL 6

Eine Gesamtblutprobe wird gewaschen, auf Objektträger ausplattiert und wie in Beispiel 1 fixiert.
Der Objektträger wird danach mit einer Lösung aus 0,1% Tween 20, 3 Einheiten Galactose-Oxidase pro ml, 5 Einheiten Meerrettichperoxidase pro ml und 2 mg des Reagenzes 4-Chlor-1-naphthol für 10 Minuten behandelt. Die resultierenden roten Blutkörperchen werden eine dunkelblaue bis schwarze Färbung annehmen, die quantitativ von der Menge an in der Zelle vorhandenem Galactose-modifiziertem Hämoglobin abhängt.
Die Messung wird in diesem Fall durch Lichtabsorption bei 410 Nanometer für den Hämoglobinbestandteil und bei 600 Nanometer für das von der Gegenwart der Galactose abhängige Reaktionsprodukt durchgeführt. Die resultierende Quantifizierung und Kalenderisierung wird jedoch wie in den vorstehenden Beispielen durchgeführt, und die Interpretation dieses Beispiels ist ähnlich zu derjenigen des Beispiels 5. Es ist gewöhnlich nicht möglich, Lichtabsorption für die Bestimmung des Hämoglobinpigments nach Reaktionen mit Salzsäure wie in den voranstehenden Beispielen auszunutzen, weil Salzsäure die Pigmentnatur des Hämoglobins zerstört. In diesem Beispiel wird jedoch Salzsäure durch eine Enzymreaktion ersetzt, die das Hämoglobinpigment nicht zerstört. Daher ist das Pigment einer direkten Messung zugänglich.

BEISPIEL 7

Eine Gesamtblutprobe wird gewaschen, ausplattiert und wie in Beispiel 1 auf Objektträger fixiert.
Die Objektträger werden in einer Lösung, enthaltend 0,1% Tween®20 und 0,1 mg/ml des Peroxidasederivats vom Lectin, Maclura pominifera-Agglutinin (MPA), welches spezifisch an alpha-D-Galactosylderivate bindet, behandelt. Nach einem kurzen Waschschritt mit destilliertem Wasser wird der Objektträger als nächstes mit einer Lösung aus 0,03% Wasserstoffperoxid und 0,2 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol behandelt. Nach einem kurzen Waschschritt mit destilliertem Wasser wird der Objektträger weiterhin mit einer Lösung aus 0,5% Wasserstoffperoxid behandelt, um das in diesem Teil der Reaktionsfolge verwendete Peroxidase-Enzym zu inaktivieren.
Nach einem weiteren kurzen Waschschritt in destilliertem Wasser wird der Objektträger weiterhin mit dem Peroxidasederivat des Lectins, Pisum sativum-Agglutinin (PEA), welches spezifisch an Derivate der Glucose und der Mannose bindet, behandelt. Nach einem weiteren kurzen Waschschritt mit destilliertem Wasser wird der Objektträger mit 0,03% Wasserstoffperoxid und 0,2 mg/ml 3-Amino-9-ethylcarbazol, einem in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid und dem Enzym Peroxidase ein rotes Reaktionsprodukt produzierendes Chromogen, behandelt. Ein letzter Waschschritt mit destilliertem Wasser wird durchgeführt, und der Objektträger wird für die Messung unter einem Deckglas eingespannt.
Der mit den Lectinen, wie vorstehend beschrieben, behandelte Objektträger wird einer Messung auf Einzelzellgrundlage bei 3 Lichtwellenlängen ausgesetzt. 410 nm für die Messung des Gesamthämoglobins, 600 nm für die Messung der Reaktionsprodukte des 4-Chlor-1-naphthols, welches die Menge an Galactose-modifiziertem Hämoglobin repräsentiert, und 550 nm für die Messung des Reaktionsprodukts von 3-Amino-9-ethylcarbazol, welches die Menge an Glucose-modifiziertem Hämoglobin repräsentiert.
Die Ergebnisse der Zellmessungen werden in Verhältnissen des Glucose-modifizierten Hämoglobins zu Gesamthämoglobin und von Galactose-modifiziertem Hämoglobin zu Gesamthämoglobin ausgedrückt. Diese zwei Verhältnisse für jede Zelle werden in gemeinsamen Listen aufgeführt, so daß die Zellen, die schon einmal entsprechend dem Verhältnis des Glucose-modifizierten Hämoglobins geordnet und kalenderisiert worden sind, auch die Zellen entsprechend dem Verhältnis des Galactose-modifizierten Hämoglobins kalenderisieren werden. Diese Kombination der Verhältnisse ist verwendbar, wenn die zweite Hämoglobinveränderung, wie in diesem Fall Galactose, in solch geringen Mengen vorhanden ist, daß es schwierig sein würde, davon unabhängig einen Kalender aufzustellen.
Die in diesem Beispiel verwendeten Lectine und anderen Reagenzien sind von verschiedenen Quellen, wie z. B. von Polysciences, Inc., 400 Valley Road, Warrington, PA 18976 erhältlich.

BEISPIEL 8

Unterschiede hinsichtlich der Insulinbindung zwischen Neozyten und Gerozyten können verwendet werden, um das Alter eines Blutkörperchens auf einer Einzelzellgrundlage zu bestimmen. Eine Blutprobe wird mit Insulin inkubiert, gewaschen und mit einem Insulin-bindenden Protein (z. B. einem Antikörper), das in irgendeiner Weise markiert ist, wie z. B. mit Fluoreszein, inkubiert. Die Probe wird gewaschen, mit verdünntem Formal in oder Paraformaldehyd fixiert und nochmals gewaschen. Die Probe wird mit einem Rhodamin-Konjugat des Lectins von Streptomyces 2755 in 0,2% Tween®20 inkubiert. Dieses Lectin besitzt ungewöhnlich große Affinität für L-Rhamnose. Wenn L-Rhamnose in einer Kapsel oder Tablette in einem festgelegten Anteil zu einem Mittel zugeführt wird, wird es durch das Lectin gebunden werden. Zellen, die großen Mengen des Mittels ausgesetzt sind, werden entsprechend höhere Mengen Rhamnose inkorporieren und dadurch mehr markiertes Lectin binden. Das Alter der Zellen wird durch Messen der Intensität des Markierungsagens an dem Anti-Insulin-Antikörper und durch Vergleichen dieser Intensität mit der Intensität der Insulin-Fluoreszenz bestimmt. Tabelle 1(a) MODELL DES KUMULATIVEM INKREMENTS IN DER ZEIT Zeit Grundwert Minimum Konst. System Fehler Temp. Inkr. Zeit Summe Kumul. Summe Mittelwert Tabelle 1(b) HISTORIE DER PATIENTENCHEMIE (Wochen) Zeit Kumulatives Histogramm Inkrement Histogramm Mittelw. Diagnose Normal Tabelle 2(a) MODELL DES KUMULATIVEN INKREMENTS IN DER ZEIT Zeit Grundwert Minimum Konst. System Fehler Temp. Inkr. Zeit Summe Kumul. Summe Mittelwert Tabelle 2(b) Historie der Patientenchemie (Wochen) Zeit Kumulatives Histogramm Inkrement Histogramm Mittelw. Diagnose Normal Tabelle 3(a) MODELL DES KUMULATIVEN INKREMENTS IN DER ZEIT Zeit Grundwert Minimum Konst. System Fehler Temp. Inkr. Zeit Summe Kumul. Summe Zeit Mittelwert Tabelle 3(b) Historie der Patientenchemie (Wochen) Zeit Kumulatives Histogramm Inkrement Histogramm Mittelw. Diagnose Diabetes 3 Wochen RX Tabelle 4(a) MODELL DES KUMULATIVEN INKREMENTS IN DER ZEIT Zeit Grundwert Minimum Konst. System Fehler Temp. Inkr. Zeit Summe Kumul. Summe Mittelwert Tabelle 4(b) Historie der Patientenchemie (Wochen) Zeit Kumulatives Histogramm Inkrement Histogramm Mittelw. Diagnose Diabetes 6 Wochen RX Tabelle 5(a) MODELL DES KUMULATIVEN INKREMENTS IN DER ZEIT Zeit Grundwert Minimum Konst. System Fehler Temp. Inkr. Zeit Summe Kumul. Summe Mittelwert Tabelle 5(b) Historie der Patientenchemie (Wochen) Zeit Kumulatives Histogramm Inkrement Histogramm Mittelw. Diagnose Diabetisch, eine Periode außer Kontrolle

Claims

1. Verfahren zum Feststellen eines Körperzustandes, der durch eine Veränderung hinsichtlich des relativen Überwiegens roter Blutkörperchen verschiedenen Alters angezeigt wird, welches umfaßt: (a) Bereitstellen von roten Blutkörperchen aus einem Patienten; (b) Messen des Gehalts eines Substratbestandteils und des Gehalts eines Produktbestandteils der Zelle auf Einzelzellgrundlage; (c) Bestimmen des Verhältnisses der gemessenen Mengen der Bestandteile auf Einzelzellgrundlage, wobei der Substratbestandteil und der Produktbestandteil dadurch in Beziehung stehen, daß der Substratbestandteil im wesentlichen irreversibel im Laufe eines ausgewählten Teils der Lebensdauer der Blutzelle in den Produktbestandteil umgewandelt wird; (d) Vergleichen des Verhältnisses mit den Bezugsverhältnissen, die für rote Blutkörperchen bekannten Alters bestimmt wurden, um die tatsächliche Altersverteilung der Zellen zu erhalten, und (e) Vergleichen dieser Verteilung mit einer Bezugsverteilung.

2. Verfahren zum Feststellen eines Zustandes in einem Patienten, welches umfaßt: (a) Bereitstellen von roten Blutkörperchen; (b) Bestimmen des Alters der Zellen auf Einzelzellgrundlage; (c) Messen des Gehalts eines Indikatorbestandteils in jeder Zelle; und (d) Bestimmen der Abhängigkeit des gemessenen Gehalts des Indikatorbestandteils vom Alter des roten Blutkörperchens für die Zellen, wobei der Indikatorbestandteil als ein Bestandteil charakterisiert ist, dessen Gehalt in einem roten Blutkörperchen abhängig vom Alter der Zelle ist und diese Abhängigkeit verändert ist, wenn der Zustand vorhanden ist.

3. Verfahren zum Bestimmen des zeitlichen Mengenverlaufs einer Substanz im Blutstrom im Laufe einer bestimmten Zeitdauer aus einer einzelnen Analysenprobe roten Blutes, welches umfaßt (a) Bereitstellen einer Analysenprobe roter Blutkörperchen; (b) Bestimmen des Alters der roten Blutkörperchen auf Einzelzellgrundlage; (c) Messen des Gehalts eines Indikatorbestandteils in jeder Zelle; (d) und Vergleichen des Gehalts des Indikatorbestandteils der roten Blutkörperchen mit dem Alter der roten Blutkörperchen auf Einzelzellgrundlage, wobei die Zeitdauer die Lebensdauer der roten Blutkörperchen nicht überschreitet, und worin der Indikatorbestandteil als ein Bestandteil roter Blutkörperchen charakterisiert ist, dessen Gehalt in der Zelle quantitativ durch den Gehalt der Substanz im Blutstrom beeinflußt wird.

4. Verfahren zum Erhalten einer fortlaufenden Aufzeichnung eines Zustandes in einem Patienten aus Analysenproben roter Blutkörperchen, die nach längeren als Monatszeiträumen entnommen werden, welches umfaßt (a) Bereitstellen von Analysenproben roter Blutkörperchen wenigstens alle vier Monate; (b) Bestimmen des Alters jeden roten Blutkörperchens; (c) Messen des Gehalts eines Indikatorbestandteils in jeder Zelle; und (d) Vergleichen des Alters der roten Blutkörperchen mit dem Gehalt eines Indikatorbestandteils der Zellen, welcher für den Zustand des Patienten in einem bestimmten Stadium im vergangenen Lebensabschnitt der Zelle indizierend ist, auf Einzelzellgrundlage, wobei der Indikatorbestandteil als ein Bestandteil roter Blutkörperchen charakterisiert ist, dessen Gehalt in der Zelle auf den Zustand reagiert.

5. Verfahren zum Feststellen, ob ein Patient eine Diät oder therapeutische Maßnahme eingehalten hat, welches umfaßt (a) Bereitstellen einer Analysenprobe roter Blutkörperchen; (b) Bestimmen des Alters eines jeden roten Blutkörperchens; (c) Messen des Gehalts eines Indikatorbestandteils in jeder Zelle; und (d) Vergleichen des Gehalts eines Indikatorbestandteils mit dem Alter der Zelle auf Einzelzellgrundlage, wobei der Indikatorbestandteil als ein Bestandteil roter Blutkörperchen charakterisiert ist, dessen Gehalt in der Zelle auf die Maßnahme reagiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, welches weiterhin das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfaßt, die ein Arzneimittel, welches von der therapeutischen Maßnahme verlangt wird, in einem festgelegten Verhältnis zu einem nichttoxischen Indikator umfaßt, wobei der Indikator zu einem Bestandteil roter Blutkörperchen wird oder einen solchen modifiziert, um den Indikatorbestandteil bereitzustellen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Indikator ein Zucker ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Zucker im wesentlichen nicht Teil der normalen Diät ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Zucker L-Rhamnose oder Xylose ist.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 5, worin das Alter der Zelle bestimmt wird durch (i) Messen des Gehalts eines Substratbestandteils und des Gehalts eines Produktbestandteils auf Einzelzellgrundlage; (ii) Berechnen des Verhältnisses der gemessenen Mengen auf Einzelzellgrundlage, worin der Substratbestandteil im wesentlichen irreversibel im Laufe eines ausgewählten Teils der Lebensdauer der Zelle in den Produktbestandteil umgewandelt wird, und (iii) Vergleichen des Verhältnisses mit dem in Zellen bekannten Alters erhaltenen Verhältnis.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 3, 4, 5 oder 10, worin das Alter jeder Zelle aus der Aktivität glykolytischer Enzyme jeder Zelle ermittelt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Umwandlung zu einer im wesentlichen konstanten Rate erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Substratbestandteil ein Hämoglobin ist, und worin der Produktbestandteil ein Glykohämoglobin ist.

14. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Produktbestandteil ein Glykohämoglobin ist, welches durch eine Markierung mit einer Affinität für Glukose nachgewiesen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Produktbestandteil ein Galactohämoglobin ist, welches durch eine Markierung mit einer Aftinität für Galactose nachgewiesen wird.

16. Verfahren zum Bestimmen des Alters der roten Blutkörperchen in einer Analysenprobe auf Einzelzellgrundlage, welches umfaßt (a) Bereitstellen einer Analysenprobe roter Blutkörperchen; (b) Messen des Gehalts eines Substratbestandteils und des Gehalts eines Produktbestandteils der Zellen auf Einzelzellgrundlage und Berechnen des Verhältnisses der Mengen auf Einzelzellgrundlage, worin der Substratbestandteil im wesentlichen irreversibel im Laufe eines ausgewählten Teils der Lebensdauer des roten Blutkörperchens in den Produktbestandteil umgewandelt wird; und (c) Vergleichen des Verhältnisses in den Zellen unbekannten Alters mit dem Verhältnis, das in roten Blutkörperchen bekannten Alters, welche unter den ausgewählten Teil fallen, erhalten wird, um dadurch das Alter der Zellen auf einer Einzelzellgrundlage zu bestimmen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin vor der Stufe (b) wenigstens einer der Bestandteile mit einer fluoreszierenden Markierung markiert ist, wobei jede dieser Markierungen eine charakteristische Fluoreszenzwellenlänge besitzt, und der Gehalt des markierten Bestandteils gemessen wird durch Messen der Fluoreszenzintensität der Zelle bei dieser Wellenlänge.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin (i) vor der Stufe (b) wenigstens einer der Bestandteile mit einer Markierung markiert ist, die mit einer Substanz, wie einem Lectin mit einer Affinität für Kohlenhydrat, verknüpft ist, (ii) der Bestandteil einen Kohlenhydratanteil umfaßt, und (iii) die Menge des markierten Bestandteils gemessen wird durch Nachweisen und Quantifizieren der Markierung in der Zelle.

19. Verfahren rum Bestimmen des Verhältnisses des Gehalts eines Indikatorbestandteils in einem roten Blutkörperchen zum Alter des roten Blutkörperchens, welches umfaßt, Vergleichen des Gehalts des Indikatorbestandteils und des Alters des roten Blutkörperchens auf Einzelzellgrundlage, wobei das Alter durch das Verfahren nach Anspruch 16 bestimmt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin Reticulozyten von nicht-Reticulozyten unterschieden werden.

21. Verwendung eines nicht-diätetischen Zuckers für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 6.

22. Verwendung nach Anspruch 21, worin der Zucker Rhamnose oder Xylose ist.