JPH02500463A - 単一の血液試料から身体の状態の歴を確認する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 単−の血液試料から身体の状態の歴を 確認する方法 技術分野 本発明は、−人の患者からの年齢の異なる血球を比較することにより確認するこ とのできる身体状態の確認および評価方法に関するものである。

背景技術 従来、身体の状態の歴記録（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ　ｒｅｃｏｒｄ）は、該状態 または疾病の経過と共に該状態または疾病の指標が測定されなければ得ることは できなかった。

赤血球は、血液中の酸素と二酸化炭素の輸送に関係する錯体分子のヘモグロビン を含有する。赤血球は、これが作られる骨髄から循環系に連続的に入り込む。最 初に血流に入り込んだ赤血球は網赤血球と称し、核酸材料の「細網（ｒｅｔｉｃ ｕｌｕｍ）　Ｊが循環の最初の２日目に網赤血球から取り除かれた後は、赤血球 は成熟細胞として普通のヒトで１２０日間循環し続ける。この期間経過後、赤血 球は循環系から、また体から除かれる。

かかる寿命の間、赤血球は化学組成を連続的に変化させながら液性の血漿中に浸 漬されることは良く知られていることである。血漿の若干の成分もまた自由に細 胞膜を介して赤血球の中に入ったり出たりしている。同時に赤血球において、こ れら成分の若干のものが赤血球の成分分子、特にヘモグロビン分子に影響を及ぼ す。

ヘモグロビン（Ｈｂ）分子は≦（色素）とグロビン（蛋白質）とから成る。二ム は第一鉄状態の鉄を含む。蛋白質部分は２種のα−鎖（１４１個のアミノ酸）お よび２種のβ−１ｍ（１４６個のアミノ酸）によって形成されている。通常のヘ モグロビンはヘモグロビンＡ　（ＨｂＡ）と称する。１００を超えるアミノ酸シ ーケンスの変種が知られている。

化学的に変質形態の種々のヘモグロビンが知られている。

０□は迅速にかつ可逆的にヘモグロビンと結合してオキシヘモグロビンを形成す る。ヘモグロビンの鉄が酸化されて第二鉄形態になると、メトヘモグロビンが形 成される。この変化はＤＰＮＨおよびメトヘモグロビン還元酸素によって逆に起 こる。Ｗｂはある薬剤により不可逆的にスルフヘモグロビンに変化する。−酸化 炭素がヘモグロビンに結合すると、カルボキシヘモグロビンが形成する。シアノ ヘモグロビンはＨｂとシアニドイオンとの反応生成物である。

グリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ヘモグロビンは既知である。

アッシュベイら、ディアベティック　メディシン（Ａｓｈｂｙ。

ｅｔａｌ、、　Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　２　：８３　８７　（ １９８５）　ｉモーテンセン、ダニッシュ　メディカル　ビュレティン（Ｍｏｒ ｔｅｎｓｅｎ。

Ｄａｎｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）　３６　：３６９　３２Ｂ 　（１９８５）　；ホワードら、アクタ　バアエディエイトル、スカンド、　（ Ｈｏｗａｒｄ。

ｅｔａｌ、、Ａｃｔａ　Ｐａｅｄｉａｔｒ、　５ｃａｎｄ、）　７０　：　６９ ５−６９８　（１９８１）　；モーテンセン、ジュー。クロマトグラ、　（Ｍｏ ｒｔｅｎｓｅｎ、　Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、）　１８２　：　３２５　３３　（１９８０）　、グリ コヘモグロビンは、酸素の輸送というヘモグロビンの初期の機能を維持している 。生成したグリコヘモグロビンの量は、赤血球を取り囲む循環する血漿中のグル コースの濃度と、曝露時間とに直接比例する。

血液試料中のグルコヘモグロビン対ヘモグロビンの割合は測定することができ、 この測定は化学試験として行い、その一般的概念は米国特許第４３９９２２７号 、第４４４８８８８号、第４４３８２０４号、第４３７２７４７号及び第４４６ ５７７４号の主題である。これらの試験においては、種々の年齢の細胞からのヘ モグロビンとグリコヘモグロビンとが無差別に混合されている。

５つの最も突出したグリコジル化ヘモグロビンをまとめてＨｂＡｌと称する。こ れらはＨｂＡｌ、＋　（０，２χ）、１ｌｂＡ１．！（０，２χ）、ｏｂＡｒ　 ｂ　（０，５り、’ｂＡ＋ｃ（４−６χ）およびｔｕｂＡＩ４（０，２−０，６ χ）である。

ＨｂＡと）ｌｂＡ　、とを−緒にすると全ヘモグロビン含量は約９７％となる。

グリコヘモグロビンの測定は、糖尿病患者が従う食事療法（ｄｉｅｔａｒｙ　ｃ ｏｍｐｌｉａｎｃｅ）の可能な指標として注目を集めている。ホワードら、アク タ　ベデイアトル、スカンド、、７０：　６９５−９８　（１９８１）参照。

ホバーマン（Ｈｏｂｅｒ＋ａａｎ）による米国特許第４４６３０９８号には、１ ［，５−デオキシ−Ｄ−キシルロース−１−フォスフニー）　（ＤＸＰ）　と反 応させてｒ　ＤＸＰ−ヘモグロビン」を生ぜしめることによって変化するヘモグ ロビン分子の濃度を記録することにより、患者におけるアルコール消費の平均歴 記録を測定することについて示されている。かかる糖分子は、赤血球における糖 の通常の分解機構に対するアルコールの間接的作用により、ヘモグロビン分子上 に捕捉されることになる。ホバーマンの特許における測定は、細胞ごとに基づき （ｃｅｌｌ−ｂｙ−ｃｅｌｌ　ｂａｓｉｓ）なされるものでなく、アルコールレ ベルの日々の変化の平均をとる傾向にある。

赤血球を相対的密度に基づき年齢により分離することができるということは一般 に受け入れられていることである。

パン　ガスチル（Ｖａｎ　Ｇａ５ｔｅｌ）、　１９６８−ＲＶＩ、メソッズ　フ ォー　スタディング　ザ　イン　ビボ　エージング　オブレッド　セルズ（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｔａｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｉｎ　ＶｉｖｏＡｇｉｎｇｏ ｆ　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ）、　１−３２　（ブラッド　インフォメーションサー ビス（Ｂｌｏｏｄ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）　）　；シャＪ Ｌ＋？ン。

バイオチム、パイオフィス、アクタ（Ｓｃｈｕｌｍａｎ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ａｃｔａ）、　１４８　：２５１　５５　（１９６７）　； レイフおよびピノグレード、バイオケミストリー（Ｌｅｉｆ　ａｎｄＶｉｎｏｇ ｒａｄ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　５１　：５２９−２８　（１９６４）　、しか し、これはモルテンソン、ダニッシュメド、プル、（Ｍｏｒｔｅｎｓｏｎ、　Ｄ ａｎｉｓｈＭｅｄ、　Ｂｕｌｌ、）、　３２　：３０９．３２０　（１９８５年 １２月）では問題とされていない。

種々の生化学変化は赤血球の老化に関係していると考えられている。フィトラク ル、エム、ニス、テラス。エージーリレーテッド　チェンジズ　イン　レッド　 セル　アクティビティーズ　オブ　グリコリティック　エンザイムス。

レデュースト　グルタチオン、アンド　ヘモグロビン　デナチュレーション（Ｐ ｈｙｔｒａｋｕｉ、　Ｍ、Ｓ、　Ｔｈｅｓｉｓ＋　Ａｑｅ−ＲｅｌａｔｅｄＣｈ ａｎｇｅｓ　ｉｎ　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｌｙｃ ｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ＋Ｒｅｄｕｃｅｄ　ＧｌｕＬａｔｈｉｏｎｅ、　 ｓｎｄ　Ｈｅ＋＋＋ｏｇｌｏｂｉｎ　Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）＋　１−８５ （ユニバーシティ　オブ　オレゴン　ヘルス　サイエンス　センター、ボートラ ンド、オレ、（［１ｎｉｖｅｒｓｔｔｙ　ｏｆＯｒｅｇｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　５ ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｐｏｒｔｌａｎｄ＋　Ｏｒｅ、）　；　１９ ７６　；ケイチルら、ブラッド（Ｋｅｉｔｅｌ、　ｅｔａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ） 　１０　：　３７０−７６　（１９５５）　；ベルンスタイン、ジェー、タリン 、インベスト、（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）＋　３ ８　＝　１５７２−８６（１９５９）　ｉエドワーズおよびリガス５　ジエー、 クリン、インベスト、（Ｅｄｗａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｒｉｇａｓ、　Ｊ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）、　４６　：１５９９−８８　（１９６７）　。

ポリクロナコスらは、成熟ＲＢＣと生まれたてのＲＢＣとの間に見られるインシ ュリン結合の違いは全てではないが大部分は後者の若いＲＢＣのより一層の優位 性によることを見い出した（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｎａｋｏｓ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ 、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ。

Ｍｅｔａｂ、、　５５　：　２９０　（１９８２）　）　、初期の研究では、網 赤血球は古い細胞よりも約２倍多くインシュリンと結合することが立証されてい る。

フィツギボンズらは正常および糖尿病の赤血球の双方が古い細胞においてより多 くの量のヘモグロビンＨｂＡ、、。５およびｌ１ｂＡｌｅを含んでいることを見 い出した（Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎｓ。

ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｂ、　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、、　５８　：　８２０　 ８２４）。同様にエルセワイディらはグリコＨｂ（ｇｌｙｃｏ　Ｈｂ）において 赤血球の年齢に関係する増加があると考えた（Ｅｌｓｅｗｅｉｄｙ、　ｅｔａｌ 、＋　Ｊ。

Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、１０２　：６２８　（１９８１））　、一方 、モーテンセンは、「若い」　（遅い沈降（ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｎｇ）　）細胞 と「老いた」　（速い沈降）細胞との間の）ｌｂＡ＋ｃ含量の違いは統計学上は 重要ではないと報告した（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ＋　Ｄａｎｉｓｂ　Ｍｅｄ。

Ｂｕｌｌ、、　３２　：　３０９，３２０　（１２月　１９８５）　）。

ＲＢＣの寿命の間、ＨｂＡは緩徐にかつ不可逆的にグリコジル化されるという事 実の証拠がある。マネーら、ブラッド（Ｍａｎｅｙ、　ｅｔａｌ、＋　Ｂｌｏｏ ｄ）、　４６　：　１０５１　（１９７５）　（概要）；ア上述のモーテンセン （Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ）　（１９８５）も参照。これが数学的に予測可能な方法 で起こる場合には、グリコＨｂＡ対）１ｂＡの比はＲＢＣの年齢の指標となり、 また他の代謝産物における年齢に関係する変化を検知するために使用することが できる。

ステイルマン（Ｓｔｉｌｌｍａｎ）による米国特許第３８６４５７１号には、リ ンパ球、多形核の好中球、エオシン好性白血球、単核白血球、好塩基球、血小板 および網赤血球をこれらの核および細胞質の異なる染色に基づき別々にカウント するケイ光活性細胞カウンタが記載されている。ホイーレス、ジュニア（Ｗｈｅ ｅｌｅｓｓ、　Ｊｒ、）による米国特許第３４９７６９０号では、ケイ光色素染 料による決定として、核酸含量により正常細胞を発癌性細胞から区別している。

カメントスキイ−（Ｋａｍｅｎ　ｔｓｋｙ）による米国特許第３４１３４６４号 はこの識別性を高める方法に関するものである。また、染色法はグロナー（Ｇｒ ｏｎｅｒ）による米国特許第３７４０１４３号によ採用されている。

バーカー（Ｐａｒｋｅｒ）による米国特許第２８７５６６６号１フルワイラ−（ Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）による米国特許第３８９３７６７号；アダムス（Ａｄａｍｓ ）による米国特許第３８８３２４７号；カメントスキー（Ｋａｏ＋ｅｎｔｓｋい による米国特許第３６６２１７６号；エルキン（Ｅｌｋｉｎ）による米国特許第 ３６６１４６０号；エールリッチ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）による米国特許第３６９９ ３３６号；タイラー（Ｔｙｒｅｒ）による米国特許第４１７２２２７号；ポウト ン（Ｂｏｕ　ｔｏｎ）による米国特許第３８７３９７４号；ミラー（Ｍｉｌｌｅ ｒ）による米国特許第３８２７８０４号；およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）による 米国特許第３８３２６８７号も参照。

フルワイラ−（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）による米国特許第４４９９０５２号では、２ 種の異なる標識試剤に対し相対的に異なる感受性を有する細胞を、該細胞に結合 する２種の標識試剤（例えば、フルオレセインおよびローダミン粒子）の比によ り区別している。

ロガース（Ｒｇｅｒｓ）による米国特許第４４１６７７８号では、輸血に使用す るための幼若白血球富化血液の調製方法が記載されている。幼若白血球（若いＲ ＢＣ）は上白血球（ｇｅｒｏｃｙ　ｔｅｓ）（古いＷＢＣ）からこれらの密度の 差に基づき遠心分離法により分離された。

発明の開示 血液の単一試料から時系列（ｔｉｍｅ　５ｅｒｉｅｓ）分析によりヒトまたは動 物の患者における状態を確認しかつ評価する方法を開示する。血液の試料を患者 より得、この血液試料の細胞を測定すべき各成分について染色し、染色された細 胞を細胞ごとに基づき定量的に測定し、測定結果および／または計算した比を番 号順に配列させる。番号順に配列された細胞を、測定した細胞の寿命の長さに従 い時系列に分割し、このようにして状態の歴記録を得る。

本発明の目的は、血液の単一試料から状態の時系列の解析を提供することにある 。

本発明の他の目的は、細胞ごとに基づき血液のグリコヘモグロビンおよびヘモグ ロビン含量を比較することにある。

本発明の更に他の目的は、身体状態のこれまでの経緯（ｐａｓｔ　ｃｏｕｒｓｅ ）の歴記録を得るための方法を提供することにある。

表１８および１ｂは正常な患者における患者の化学現象（ｐａｔｉｅｎｔ　ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ）を示す。

表２ａおよび２ｂは管理されていない糖尿病についての患者の化学現象を示す。

表３，４および５は処置の種々の段階での表２の患者についての化学現象を示す 。

発明を実施するための最良の形態 赤血球は血流中へ連続的に放出され、血漿中における数々の正常に存する化学物 質や異常時に存する化学物質の影響下で１２０日間循環し続ける。これら化学物 質の若干は、赤血球中のヘモグロビン分子におけるこれら物質の存在および濃度 の記録を残す。この記録は累積され、かつ不可逆的であるので、かかる濃度を細 胞ごとに基づき適当に測定することにより、身体状態の経緯の歴記録となる時経 列に細胞を分類することが可能となる。この方法の多くの用途うちには、糖尿病 における糖の採り方のコントロール、アルコールの消費または濫用の記録および 治療薬または食養生（ｄｔｅｔａｒｙ　ｒｅｇｉｍｅｎｓ）によるコンプライア ンス（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）の記録がある。また、本方法を用いて赤血球の異 常な破壊の記録を提供することもできる。他の目的としては、患者の疾患の診断 方法をつくり、もしくは確認し、患者の疾患の進行または処置を監視し、一般の 疾病から保護し、また将来の基準のために患者のベースラインを確立することで ある。多くの重要な試験を一般に間隔をあけて繰り返し、これにより、使用して 診断および治療の判断に影響を及ぼすことのできる患者に対する時系列を確立す る。

本発明は、細胞ごとに基づ（歴のデータについて解析される、単一試料に基づく 時系列結果を提供する。時経列結果は、分析すべき血液成分について表および／ またはグラフの型で示される。これにより赤血球の老化をふりかえって研究する 。

ヘモグロビン、グルコースと赤血球の寿命との間の関係についての知識は、反応 してグルコヘモグロビンを形成するヘモグロビン対全ヘモグロビンの割合を解析 することにより赤血球の寿命の間のグルコース濃度の平均記録を測定する本発明 の方法の進展に影響を及ぼす。これは、−試料中における赤血球を分解し、反応 ヘモグロビンを未反応ヘモグロビンから分離し、ヘモグロビン分子の色素部分に より吸収される光によりこれら成分の双方を測定する化学試験として行う。細胞 溶解物におけるヘモグロビンとグルコヘモグロビンの測定は当業界では既知であ る。

グルコースまたは他の糖とヘモグロビンとの反応によりグルコヘモグロビンを生 成する反応の他に、かかる数種の反応は既知である。従って、種々の薬剤が直接 に、あるいは間接的にかかる反応を有するであろうことは予測することができる ことである。しかし、かかる反応はほんの僅かな量で起こり得、このため現在用 いられている分離技術により測定することは困難である。かかる反応を以下に考 察する。

本発明においては、ヘモグロビンや変種ヘモグロビン、例えばグルコヘモグロビ ンの分析を細胞ごとに基づき行う。

これは細胞の懸濁液またはスライドガラス上に塗布された細胞に対する各成分に ついての定量的染色反応を行うことにより、あるいは他の適当な方法により行う 。次いで、細胞を染色物について光学的に測定するが、かかる測定に関しては数 種類の器械が存在する。かかる器械の例は、フルワイラー（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ） による米国特許第３８９３７６７号、ステイルマン（Ｓｔｉｌｌｍａｎ）による 米国特許第３８６４５７１号、エルキンド（Ｅｌｋｉｎｄ）による米国特許第３ ６６１４６０号、グローナー（Ｇｒｏｎｅｒ）による米国特許第３７４０１４３ 号およびカメントスキ（ｋａｍｅｎ　ｔｓｋｙ）による米国特許第３４１３４６ ４号に見い出せる。

スライド測定（ｓｌｉｄｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）器械に関する特許には、 ミラーによる米国特許第３８３２６８７号や第３８２７８０４号のものが含まれ る。バカス（Ｂａｃｏｓ）による米国特許第４２０９５４８号にはパターン認識 （ｐａｔｔｅｒｎ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）器械が記載されている。

細胞を染色するだけで細胞の年齢を明らかにすることの他に、細胞を密度に基づ き年齢のグループに分けることもできる。しかし、染色法を用いる方が好ましい 。

細胞ごとの測定の結果より、血球の未変種成分、例えばヘモグロビンおよび変種 成分、例えばグルコヘモグロビン（グルコシル化ヘモグロビンとしても既知）の 定量的測定が得られる。変種成分対未変種成分（例えばグルコヘモグの比を番号 順に配列させる。ヘモグロビンは血漿内において循環するグルコースと連続的に かつ不可逆的に反応するので、古い赤血球におけるこの比は若い赤血球のそれよ りも大きい。従って、順番に配列された一連の比は、当該比を得た細胞の相対的 年齢を示す。これらの比を等しい割合かまたは変性成分の等しい濃度に配列する ことにより、赤血球の寿命は１２０日であることが既知であることから真の時系 列を誘導することができる。

変化が一定でかつ若干の大きさがある場合、例えばヘモグロビンのグルコヘモグ ロビンへの変化の場合は、２〜７日の等しい分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を有 するように時系列を選択することができる。変化が小さくかつほとんど一定でな い場合は、時系列を上述の基本技術により直接かつ確実性をもって得ることはで きない０分析しようとするヘモグロビン、グルコヘモグロビンおよび他の成分に ついて、同じ細胞につき細胞ごとに組み合わせて分析を行うことにより、グルコ ヘモグロビンについて得られる時系列を、測定しようとする他の成分についての 時系列を確立するために使用することもできる。これにより、かかる他の成分の 歴の記録も得ることができる。比較的信頼性のある種類の任意他の改良方法を用 いて、より可変的な方法との比較に関し規準タイムライン（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ 　ｔｉａ＋ｅｌｉｅ）を確立することができる。更に細胞の年齢を決定する他の 方法、例えば細胞の沈降比や、赤血球の不安定な内生成分の定常的な劣化をめる 方法を較正の目的のために用いることができる。

グルコＨｂ対）１ｂの比の他に、細胞年齢の他の決定要因が本発明では考えられ る。インシュリン結合や糖分解酵素の定常的かつ漸次の劣化は染色および測定に 従う。

疾患の診断および治療のための監視における本発明の利点は明白である０例えば 、糖尿病においては、患者は糖分子（グルコース）の代謝の間通室のコントロー ルを失い、このためインシュリン、他の薬物の投与により、あるいは食事のしっ かりした管理によりかかるコントロールの外部からの修正を必要とするが、単一 の血液試料の分析により前１２０日間ふりかえって糖の一日こ゛とのコントロー ルを調べることができる。これを３または４ケ月間隔で行った場合、連続的な記 録を維持することができ、かかる記録を用いてコントロールの一日ごとのレベル を確立することができる。既知の方法により行われたバッチ試験は本発明の方法 とは対照的に、単一のデータポイントにて１２０日の時間分離′（ｔｉｍｅ　ｒ ｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を有するのみであるが、本発明の方法においては赤血球の １２０日の寿命を、細胞ごとに基づき分析される単一試料の時系列解析により、 例えば周間隔に分けることができ、この単一試料を１２０日間の最後に採取する 。１２０日の間、患者の血漿中の糖の濃度は高い期間もあれば低い期間もある。

既知の方法を用いると、かかる別々の事項を−の値として平均化し、これにより 誤差相互を相補ねしめ、バッチ試験に対し正常な結果を得られるようにする。誤 差を補うことは本発明の方法により大いに回避される。この理由は、短期間の間 隔に分けられた歴の時系列はかかる誤差を殆どなくしてしまう可能性があるから である。

細胞の年齢を決定するために監視する反応は不可逆的であることが好ましいが、 該反応は極緩徐に可逆的であっても十分である。緩徐に可逆的である場合は、最 も古い血球によって示される「歴」は失われることになる。

また、反応が一定であることも好ましい。しかし、反応の速度°変化が一定かつ 予測可能である場合には、他の手段により細胞の年齢を決定して、この年齢に関 する基体：生成物の比の関係を較正することができる。

更に、反応は細胞の寿命の間を通して起こるのが好ましい。しかし、細胞の寿命 の限られた期間に反応が起こる場合、この期間がより一層制限されるものであっ ても、尚該反応を用いて時系列データを得ることができる。

糖分子の無毒性類似体を独立標識として使用することもできる。かかる独立標識 を薬物と薬学的に混合することができ、この混合物は標識対薬物を一定の割合と する。この標識は細胞成分、例えばヘモグロビンと不可逆的かつ一定速度で反応 する物質であるのが好ましい。かかる手段により、任意薬剤の消費の歴記録を得 ることができる。

この種の記録は薬剤治療養生法（ｄｒｕｇ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｒｅｇｉｍｅｎ） へのコンプライアンス（ｃｏ＋＊ｐｌ　１ａｎａｃｅ）を決定するのに使用する ことができ、また、薬物の不測のまたは任意の摂取の記録として有用である。

使用する標識は通常の食事の中には見い出せない希少な糖、例えばラムノースお よびキシロースであるのが好ましい、コックおよびメンシーズ、ダイジエスショ ン（Ｃｏｏｋ　ａｎｄＭｅｎｚｉｅｓ、　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、　３３　：１ ０９　１１６　（１９８６）では、“無代謝（ｎｏｎ−ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ）″マーカーを用いて腸の吸収を評価している。フォードら、ジュー。ベト、ガ ストロエンド。

アンド　ヌトロ、　（Ｆｏｒｄ、　ｅｔａｌ、、Ｊ、　Ｐｅｄ、　Ｇａ５ｔｒｏ ｅｎｔ、　＆Ｎｕｔｒ、）、４　：　５６８　７４　（１９８５）。

非糖尿病患者においては、細胞ごとに基づき行った同様のグリコヘモグロビン分 析により、試料を採取した時点における循環系の赤血球の寿命の歴の記録も得る ことができる。例えば、単一細胞における最大濃度が正常な試料中で見い出され るそれのほんの１／１０の場合には、この患者における赤血球の寿命は１２０日 ではなく僅か１２日である。本発明の方法は、出血により血液を失う疾病に比し 、赤血球の破壊の疾病に対し診断学上の正確さを向上する手段を提供する。糖尿 病患者におけるＲＢＣ破壊の評価も可能である。

本発明の方法を用いるために、流体試料をヒト（または動物）から採取し、下記 の２種の一般的方法の一つで処理をする。

（１）血液の流体試料を平坦な表面、例えばスライドガラスの上に塗布する。

これは、従来の手動技術によるか、もくしは米国特許第４２０９５４８号に記載 されているような血液スピナー（ｂｌｏｏｄｓｐｉｎｅｒ）技術により行うこと ができる。塗布された試料を米国特許第４２０９５４８号および第４４８３８８ ２号に記載されているようにまだ湿潤状態の間に固定するか、あるいは塗布され た試料をスライドガラス上で乾燥させ、次いで従来のメタノール浸漬法により固 定するか、または他の従来技術により固定することができる。

（２）試料を処理するもう一つの方法は、試料を流体形態に維持し、赤血球を血 漿から沈降させる。遠心分離法を用いてこの沈降処理を速めることができる。上 層の血漿層を取り除き、赤血球の形態を保護するように選択された性質を有する 緩衝溶液と置き換える。沈降（および遠心分離）を繰り返し、緩衝液の第２番目 の容積を通用し、これにより赤血球を洗浄する。洗浄後、赤血球を２種の方法の 一つで再度処理してもよく、上記（１）に一般的に記載したように平坦な表面上 に塗布するか、あるいは染色工程中懸濁液に維持してもよい。

細胞を染色工程の間懸濁液に維持する場合には、細胞を固定してその形状を保護 し、かつ染料および他の試剤を浸透させなければならない。かかる固定は希薄溶 液、例えば緩衝液中のエタノールまたは緩衝液中のホルムアルデヒドの使用によ り達成することができる。固定後、細胞を再度洗浄して固定試剤の影響を取り除 く。しかし、アルデヒド固定剤の場合、ジメドン（ｄｉ＋１ｅｄｏｎ）のような 試剤を更に添加して、固定剤を中和することにより洗浄と同様の結果を得ること ができる。

平坦な表面に塗布した試料を同様に洗浄することができるが、この洗浄を該平坦 な表面を清澄な溶液に浸漬することにより行うことは除かれる。洗浄の一つの目 的は、赤血球から未だ未結合であるような無関係の糖分子または他の標識を除去 することにある。

洗浄および固定後に、懸濁液中または平坦な表面上いずれにしても、次に赤血球 を染色して１または２以上の特性を測定することができるようにする。ヘモグロ ビン分子は色素でありまた固定された場合には特徴的な光吸収特性を有するため 、この分子の同定を別途行う必要はない。しかし、ヘモグロビンを従来の蛋白質 染料、例えばフルオレセイン、イソチシオアネートまたは５−ジメチルアミノ− １−ナフタレンスルホニルクロリドにより染色することもできる。異なるケイ光 色でかつ異なる励起波長の多くの試剤はこの目的に対し直ちに役立つ。ヘモグロ ビンは赤血球中に存する唯一の蛋白質ではないが、これは他の蛋白質の量の計数 （ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ）が結果に影響を及ぼすことがないような大きな割合で 他の蛋白質よりも過剰に存在する。

ヘモグロビンの染色の他に、試料は他の成分、例えばグルコヘモグロビン（ヘモ グロビン分子に結合したグルコース）についても染色する。上述したように、ま た以下の特別な実施例で示すように他の標識も適用することができる。

各染色工程後洗浄して、操作の次工程に対する試剤の影響を取り除くことが必要 である。

染色終了後、試料を細胞ごとの方法により測定する。かかる測定装置は、例えば 米国特許第３４１３４６４号および第３８９３７６７号に記載されている。測定 に使用する色フィルターの厳密な特性は試料の染色の正確なる実行に依存する。

グルコヘモグロビンは数種の方法で検出することができる。炭水化物部分に対し 作用する酵素を用いて、信号発生系（ｓｉｇｎａｌ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｓ ｙｓｔｅｍ）に関係する活性種を放出させることができる。標識レクチンまたは 炭水化物特異性抗体をグルコヘモグロビンに結合させることができ、次いで、得 られた複合体を検出する。

各細胞を少なくとも２種の成分について測定し、かかる測定により得られたデー タを最終結果を報告するまで、更なる解析のために計器メモリーに保持する。こ の処理はコンピュータ法による解析に直ちに役立つ。計算には、測定した少なく とも２種の成分の比を尚細胞ごとに基づき得ることも含まれる。この比の結果は 高い順に配列させ、グラフ的に示すためにヒストグラムまたは他の型にプロット する。細胞ごとに基づく少なくとも２種の成分の定量的測定は同じ細胞に対し同 時にまたは連続的に行う。

配列した比の同データは次の評価にも使用する。配列の一端から開始し、数えた 細胞の総数の一定部分（ｃｏｎｓｔａｎｔｆｒａｃｔｉｏｎ）を数等分に分け、 これらの比を平均化し、この平均を手作業かもしくはコンピューターメモリにお いて記録する。同様の一定部分を操り返し等分に分け、これらの比を配列のもう 一端に達するまで平均化しかつ記憶させる。かかる−足部分の数は個々の赤血球 の全寿命の時間の部分的増加を示している。この時間の増加の厳密な特性は、試 料を採取する固体の他の情報に左右される。−例として、配列した試料を６０個 の一定部分に分けた、１２０日の赤血球の寿命を有する正常なヒトからの試料は ２日を示す各部分を有することになる。かかる表示にも若干の不正確さがあり、 これは、例えば前１２０日の各日日に生成した赤血球の数の生物学上の変動に左 右される。このため、更に長い時間間隔を示すより大きな部分は分離（ｒｅｓｏ ｌｕｔｉｏｎ）を犠牲とする代わりに一般に優れた精度を有する。

一定時間間隔を示す一定部分の確実性についての第２の試験として、器械により 標準偏差をとり、かつまたは−足部分内における各組の比において簡単な統計学 上の計算をすることができる。中間に近い部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）で開始し、 この部分は対称的に大きくまた減少し、再度標準偏差を計算する。従って、この 技術の迅速なるインターレーション（ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎｓ）により、各間隔 に関する最高の適合（ｆｉｔ）が規定され、新しい間隔に関する平均が計算され 、これを用いて間隔に関する初期の記憶値と置き換える。各平均値と順番で次の 先の平均値との間該差を計算する。この計算は、平均によって示される時間間隔 の間において赤血球へ集まる標識の増加を示している。

このように、各に測定した赤血球の相対的年齢と各時間間隔において集まった標 識の量は双方とも規定される。異なるタイプの試料について、計算に対し別途調 整を行う必要がある。細胞生存の歴がより良（知られている場合は、かかる調整 は時間間隔の規定法を改善することができる。

例えば、赤血球が一般に１２０日間生存するが、赤血球の減損が女性の月経周期 のように既知の間隔で起こる場合、適当なる補正項を適用する。

同様に、患者が輸血を受けたことが分かっている場合には注意する必要がある。

この理由は、輸血した細胞におけるグルコヘモグロビンレベルが患者よりはむし ろ提供者におけるグルコースレベルに少なくとも一部影響を及ぼし得るからであ る。

上述した２種の測定法に加え、更に他の測定を行うこともできる。各細胞に対し 更なる測定を行うことについて一つの目的は、試料を採取した固体において同じ 時間で集まる更に別の標識を検出することである。

各細胞に対し更なる測定を行うことについての別の目的は、検討すべき時間間隔 についてより良好なる明確さを得ることにある。例えば、米国特許第３８６４５ ７１号に記載されているように各細胞におけるリポ核酸（ＲＮＡ）の量を測定す ることにより、赤血球寿命の最も最近の２日間を調べることができる。これは、 ＲＮＡが赤血球の寿命の最初の２日間だけ該赤血球中に存在するからである。標 識および標識の比等の測定を唯一これらの一日に古い細胞および２日古い細胞（ 網赤血球として機知）に限定することにより、固体における標識処理の直後の歴 が確認される。従って、細胞を染色し、ヘモグロビンおよびグルコヘモグロビン について測定する場合、またＲＮＡも測定する場合は、試料を採取した日の２日 前までの各々の日についてグルコースのコントロールを調べることができる。尚 、これら測定はすべて細胞ごとに基づき行う。これら細胞に対し他の標識、例え ば標識付けおよび測定をすることのできるアルコールまたは特定の薬剤を同時に 測定する場合には、前２日の各々の日の間のアルコールまたは薬剤の摂取を知べ ることかできる。これは、これらの日についての関係する細胞をこれら細胞中の ＲＮＡの更なる存在により確認したからである。

本発明の使用を示す簡単なモデルを以下に示す。表１８はこのモデルの数とルー ルを示す増加量（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ　ｔａｂｌｅ）の混成（ｃｏｍｐｏｓ ｅ　ｔｅ）を示す。第１欄は時間、例えば週の増加を示す；第２欄は各時間間隔 に関するベースラインの付加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）を示しており、このベースラ インは正常な固体における循環において赤血球を変質させる速度の表示である； 第３＆］は患者の疾病の過程に関係する一定の異常増加を示す（第１表では正常 な患者であるためゼロである）；第４欄は−の時間間隔のみの範囲内での患者の 化学的状態（ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｔａｔｕｓ）における一時的変化に関係する 一定ではない増加を示す（正常な患者においてはゼロ）；第５欄は第２．３およ び４欄の一つの時間間隔内における合計を示す；第６欄は最初の間隔すなわち列 から現行の間隔すなわち列まで全ての時間間隔に基づく累積数を示す。第６欄の 下部に平均の増加量、すなわち平均値を示す。この平均値は時間の増加数により 第６欄の累積総数を割り算することによりめられる。表１８のモデルにおける数 はベースラインの値だけを累積的に加える場合に平均増加分が正常な総グリコヘ モグロビンの値をシミュレートするように考え出されている。

表１ｂは表１８の第６欄に基づく累積分布曲線を示す。表１８は変種ヘモグロビ ン分子が第１欄において示されるような異なる年齢の赤血球において時間でいか に累積されるかを示しており、また表１の第６欄も表示している。

表１の第３成分は各単一時間間隔におけるヘモグロビンの増加的変質（ｉｎｃｒ ｅｍｅｎｔａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をグラフ的に示している。これは 、例えば糖尿病の患者の処置において医師が最も興味のあるであろうグラフであ る。また、これは単一の時間間隔について示される時間間隔で、血漿中を循環す る変質物質の量を示している。

表２〜５は上述の表１と類似するものである。表２においては、値は、ベースラ インの増加分に等しい一定増加分によりコントロールから糖の濃度が常に逸脱し ている重大な糖尿病をシミュレートしており、すなわち循環する糖の値は正常値 の常に２倍である。表２８における値は表２ｂにおいてグラフ的に示しており、 これでは糖の濃度のコントロールの喪失の程度を示している。

同様に、薬剤の使用量を監視することができる。すなわち、モルフイネ常用癖は 増加したグルコヘモグロビンレベルと関係する。ギイウグリアン、ディアベトロ ジア（Ｇｉｕｇｌｉａｎｅ、　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）＋　２２　：　３７ ９　（９８２）。

表３は（表３．４および５に示す）最初の３回の時間間隔の間表２の仮想患者に 対する治療処置の結果を示す。これは、薬物、例えばインシュリンの作用により 負の増加を示す。この治療の効果を表３ｂにグラフ的に示す。表４および５にお いては、同じ患者のインシュリン治療の他の期間をモデル化し、表４ｂおよび５ ｂにグラフ的に示している。治療の成功は、表１に示す正常方向へ戻る増加グラ フとして示される。この患者の正常値への完全な戻りのないことは表５における 増加曲線の逸脱によって示される。

次に本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に制限され るものではない。

災施斑上 血液試料を前１２０日の間重大な血液減損のなかったことが分かっている糖尿病 の男性から採取した。試料の一部をｐＨ７，４でリン酸塩酸緩衝液（ＰＢＳ）に て洗浄し、スピナー法により顕微鏡用スライドガラスに塗布した。この試料を風 乾し、乾燥メタノールに３０秒間浸漬することにより固定し、再度風乾した。

風乾した試料を蒸留水に２分間浸漬し、次いで０．５％の過ヨウ素酸溶液に２０ 分間浸漬した。次いで、同試料を１０分間流水に浸漬し、更に２０分間シッフ（ Ｓｃｈｉｆｆ）溶液中に置いた。シッフ溶液は０．５ｇの黄色ケイ光（５４０ｎ ｍ）発生アクリフラビン塩酸塩と、２０１１１２のＩＮ塩酸と、２００ｍ　ｅの 蒸留水に溶解した１ｇメタ重亜硫酸ナトリウムとから成る。この溶液を１日間エ ーシングし、しかる後、これを活性炭と一緒にろ過し、清澄なコハク色のろ液を ４°Ｃで貯蔵した。水道水における最終洗浄により過剰な試剤を取り除いた。

得られた試料をメタノール中における赤色ケイ光（６２０ｎｍ）発生ブロモフェ ノールブルーＯ〜２ｇ％で染色し、メタノールで３回洗浄し、風乾した。十分に 乾燥した後、ケイ光物質の存在しない固定媒体を用いて試料をカバーガラスで被 覆した。

個々の細胞ごとの測定をフルワイラーによる米国特許第３８９３７６７号に記載 されているものと類似するゲイ光顕微鏡で行った。１千個の赤血球を測定し、分 析のためのデーターベースに取り入れた。黄色対赤色のケイ光物質の比を測定し 、結果を最少の比から最大の比の大きさのもに順次配列させた。配列した赤血球 を最小の比から開始して約６００のグループに分け、その結果を平均化した。各 平均値を次の更に高い平均値から引き算し、残りを血糖の患者のコントロールの 一週間の歴を示すヒストグラムにグラフ的プロットした。結果を通常の変化につ いての知識を有する医師によるものと比較した。

裏庭±１ 血液の液体試料を意識不明でかつぎこまれた急患の既知の女性糖尿病患者から採 取した。血液試料をＰＢＳで２回洗浄し、次いで約２００万個の細胞を含有する １００／ＩＤ試料をＰＢＳにおける０、５％のホルムアルデヒド溶液と混合した 。

５分経過後、細胞を再度きれいなＰＢＳで２回洗浄した。洗浄した細胞をＴＲＩ ＴＣ標識付は標識力ナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の溶液と混合した。　ＣｏｎＡは、 グルコース分子に結合し得る特性を有し、グルコース自身はヘモグロビン分子に 結合する。

この溶液にＰＢＳと０．１％の非アニオン性洗浄溶液（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） 　２０）とを加えた。この溶液を２０分間細胞に作用させた後、細胞を再度洗浄 し、懸濁液を調合して最終濃度をＩＣｌ１１’当たり５０万個の細胞とした。細 胞のこの最終懸濁液を波長を５４５±２０ｎｍに限定した励起フィルタを用いて 、ベクトン　ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｔｎｓｏｎ）　ＦＡＣＳア ナライザーのようなフローサイトメーター（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を 通して流した。ケイ光フィルターを用いて、一方が６２Ｏｒ＋ｎ＋以上またもう 一方が５８Ｏｎ＋ｍ以下の２色のケイ光を測定した。

２種のケイ光色の間の交差点（ｃｒｏｓｓ　１ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を実験 的にめ、修正を行った。２万４千個の細胞を測定し、器械のコンピューターメモ リーにおける「リストモード（ｌｉｓｔｍｏｄｅ）　Ｊに蓄積した。

実施例１におけるようにして比を計算し、結果を２日間間隔に分けた。コンピュ ーターにおいて標準偏差を用いて、各間隔でデータのベストフィツトが達成され るまでイテレート法で平均値を判断した。集合（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の１ 日の増加分を実施例１におけるようにして計算し、この患者のグルコースコント ロールの歴に対し結果報告した。

ｎ１ユ 洗浄した細胞懸濁液をホルムアルデヒド溶液で処理する前に、これを０．４％の ニューメチレンブルー（ＮＭＢ）および１％のシュウ酸カリウムと混合した以外 は実施例２の手順に従った。４分経過後、等量のホルムアルデヒド溶液を添加し 、更に２分経過後、懸濁液を実施例２におけろうにして洗浄した。染色工程はま さに実施例２におけるようにするが、すべての工程は最初に洗浄工程を含み、０ ．２％のセチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）を含む。

測定もまた実施例２におけるように行うが、更に各細胞の広角光散乱を測定しか つ記録し、その他にリストモードにおける２種の測定を一緒に行った。ＮＭＢは 網赤血球の凝集または沈澱を生ぜしめた。細胞内の沈澱を、すべての溶液にＣＰ Ｃを添加することにより高屈折率を有する固体軟塊として維持した。ＣＰＣは非 ケイ光物質なので、これが他の測定を妨害することはない。しかし、これは網赤 血球における光散乱の有意な増加をもたらす。

データ解析は実施例２におけるように進めた。別々のデータ解析を大きな光散乱 の結果を存する細胞について行った。これら細胞を２つの等しい数のグループに 分けた。最大量の光散乱を有するものは試料採取の前日を示した。光散乱が少な い細胞はその日前の日を示した。このように、急変前の２日間のグルコースコン トロールの歴を明確に決定することができる。

災立拠土 した試料をスライドガラス上に置き、３色の分析により顕微鏡下で測定した。

ｎ−例」− 赤血球を実施例１におけるようなリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）内で洗浄することに より調製した。この赤血球を実施例１におけるようにスライドガラス上に塗布し た。２枚のスライドガラスを準備し、別りの染色手順に供した。

スライドガラスＡを実施例１におけるようにして染色した。

スライドガラスＢにおいては、実施例１の過ヨウ素酸を用いる代わりに、シグマ ケミカル　カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）より入 手できる微生物ポリボラスサーシネイタス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　ｃｉｒｃｉｎ ａｔｕｓ）またはダクチリウムデンドロイデス（ＤａｃｔｉｌｌｉｕＩｌｌｄｅ ｎｄｒｏｉｄｅｓ）から単離した酵素ガラクトースオキシダーゼを１　ｍｌ当た り３ユニツト（ｕｎｉｔｓ）含有する溶液に酸スライドガラスを浸漬した。この 溶液は非イオン性洗浄剤、０．１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０、および１ ０ユニツト／　ｌｌ１１．のカタラーゼ並びにｐ）ｔ６．ｏに調整する希薄緩衝 剤も含有する。ガラクトースオキシダーゼは糖ガラクトースまたは重合槽におけ る末端基ガラクトースを、過ヨウ素酸により生成する化合物と同様のジアルデヒ ドを存する化合物に酸化する性質を有するが、この酵素はガラクトースおよび関 係する数種の糖、例えばガラクトサミン、ラフィノースおよびスクチョース（ｓ ｔａｃｈｙｏｓｅ）に対し特異的である。すなわち、これはグルコースとは反応 しない。

カタラーゼを含有せしめて、反応において生じかつ細胞から拡散する過剰の過酸 化水素を消費した。

ガラクトースオキシダーゼ溶液で処理しかつ蒸留水で洗浄した後、スライドガラ スＢをアクリフラビンシッフ溶液で実施例１におけるように処理し、また実施例 １におけるようにブロムフェノールブルーでも処理した。

実施例１におけるような２種のケイ光色による細胞ごとの定量的決定法により、 比の計算およびスライドガラスＡによるカレンダーの展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｌｅｎｄａｒ）が可能となる。

正常な患者においては、スライドガラスＢではカレンダーをコンピューター処理 し得る増加は示されない。しかし、ガラクトース血症をわずらっている患者にお いては、結果は、患者により摂取されたガラクトースの量に依存する増加量によ るカレンダーリゼーション（ｃａｌｅｎｄａｒｉｓａｔｉｏｎ）である。

このため、過ヨウ素酸をガラクトースオキシダーゼにより置き換えた試験では、 ガラクトースにより変化したヘモグロビンに対し特異的な反応が起こる。かかる 試験をガラクトース血症をわずらっている患者の食事を監視するのに用いること ができ、またグルコースの増加におけるガラクトースの影響を評価するのに用い ることができる。

プラトレイ　ニー、シュルトおよびサムエルニス、スバイサー（Ｂｒａ＋Ｎｅｙ 　Ａ、　５ｃｈｕｌｔｅ　ａｎｄ　Ｓａｍｕｅｌ　Ｓ、　５ｐｉｃｅｒ）、　’ ライト　マイクロスコピック　ヒストケミカル　ディテクション　オプ　ターミ ナルガラクトース　オア　Ｎ−アセチルガラクトサミン　イン　ロデントコンプ レックス　カルボハイトレー・ン、ニージン′グ　ア　ガラクトースオキシダー ゼ−シッフ　シーケンス」ジュー。ヒストケミストリーアンド　サイトケミスト リー（Ｊ、　Ｈ４ｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ）、　３１．１９　２４．１９８３　；エヌ、ジェー、ホワード、エッチ、モ ナガンおよびジュー。エム、マーチン（Ｎ、　Ｊ、　Ｈｏｗａｒｄ、　Ｈ，Ｍｏ ｎａｇｈａｎ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍ、　Ｍａｒｔｉｎ）　「ヘモグロビンＡ！イン ガラクトセミア、ア　ポジプル　ロールイン　モニターリング　ダイエタリー　 コンプライアンス」アクタ　バエディエイトル、スカド（Ａｃｔａ　Ｐａｅｄｉ ａｔｒ、　５ｃａｄ）。

互６９５−６９８．１９８１参照。

１隻１− 全血の試料を実施例１におけるように洗浄し、スライドガラス上に塗布し、固定 した。

次いでスライドガラスを、０．１％のツイーン２０．３ユニツト／佃Ｐのガラク トースオキシダーゼ、５ユニツト／　ｍ　ｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ および２ｍｇ／ｍｆの試剤４−クロロ−１−ナフトールの溶液で１０分間処理し た。

得られた赤血球は、この中に有するガラクトース−変質ヘモグロビンの量に定量 的に依存する暗青黒色を呈した。

この場合の測定は、ヘモグロビン成分については４１０ｎｍで、またガラクトー スの存在に依存する反応生成物については６００ｒ＋ｍで光吸収させることによ り行った。しかし、得られた結果の定量およびカレンダリゼーションを先の実施 例におけるようにして行い、この実施例のインターブリチージョン（ｉｎｔｅｒ ｐｒｅｔａｔｉｏｎ）は実施例５と同様とした。過ヨウ素酸はヘモグロビンの色 素特性を破壊するので、先の実施例におけるような過ヨウ素酸の反応終了後、ヘ モグロビンの色素検出のための光吸収の実施を一般に不可能とする。

しかし、この実施例においては、過ヨウ素酸の代わりに、ヘモグロビン色素を破 壊することのない酵素反応を用いた。

このため、ヘモグロビン色素は直接測定するのに役立った。

実施±１ 全血の試料を実施例１におけるように洗浄し、スライドガラス上に塗布し、固定 した。

スライドガラスを０．１％のツイーン２０と、α−Ｄ−ガラクトシル誘導体に特 異的に結合するレクチン、マクルラボミニフェラ（Ｍａｃｌｕｒａ　ｐｏｍｉｎ ｉｆｅｒａ）凝集素（ＭＰＡ）のペルオキシダーゼ誘導体０．１ｍｇ／ｍｊ！と を含有する溶液で処理した。

簡単な蒸留水による洗浄に引き続いて、スライドガラスを０．０３％の過酸化水 素および２　ｍｇ／ｍ　ｊ２の４−クロロ−１−ナフトールの溶液で処理した。

簡単な蒸留水による洗浄後、更にスライドガラスを０．５％の過酸化水素の溶液 で処理して、一連の手順のこの部分において使用するペルオキシダーゼを不活性 にした。

蒸留水による別途簡単な洗浄に続き、スライドガラスを更に、グルコースおよび マンノースの誘導体に特異的に結集素（ＰＥＡ）のペルオキシダーゼ誘導体で処 理した。更に蒸留水による簡単な洗浄後、スライドガラスを０．０３％の過酸化 水素および２　ｍｇ／ｍ　Ｅの３−アミノ−９−エチルカルバゾール、過酸化水 素および酵素ペルオキシダーゼの存在下で赤色反応生成物を生ずるクロモゲンで 処理した。最後の蒸留水による洗浄を行い、かつスライドガラスを測定用カバー ガラス下に設置した。

上述のようにレクチンで処理したスライドガラスを３種類の波長の光；全ヘモグ ロビンの測定については４１０ｎｍ。

ガラクトース変質ヘモグロビンの量を示す４−クロロ−１＝ナフトールの反応生 成物の測定については６００ｎｍおよびグルコース−変質ヘモグロビンの量を示 す３−アミノ−９−エチルカルバゾールの反応生成物の測定については５５０ｎ Ｉ１１による細胞ごとの測定に供した。

細胞測定の結果をグルコース変質ヘモグロビン対全ヘモグロビンの比およびガラ クトース変質ヘモグロビン対全ヘモグロビンの比に表わした。各細胞に関するこ れら２種の比を一緒のリストに保持して、グルコース変質ヘモグロビンについて 一旦配列し、かつカレンダー化した（ｃａｌｅｎｄａｒｉｚｅｄ）細胞の比によ り、ガラクトース変質に関する細胞の比もカレンダー化した。この比の組み合わ せはヘモグロビンの第２変質の場合に有用であり、この場合にはガラクトースは 、これらが独立してカレンダーを形成することが困難となるような程少量で存在 する。

本実施例で使用したレクチンおよび他の試剤は種々の所、例えばビーニー１８９ ７６、ウォリントン、バレイロード４００所在のポリサイエンス社より入手する ことができる。

実施±１ 幼若白血球と上白血球（ｇｅｒｏｃｙｔｅｓ）　との間のインシュリン結合にお ける違いを用で、細胞ごとに基づき血球の年齢培養し、洗浄し、フルオレセイン によるようなある方法により標識付けしたインシュリン結合蛋白質（例えば抗体 ）と共に培養した。この試料を洗浄し、希薄ホルマリンまたはバラホルムアルデ ヒドで固定し、再度洗浄した。次いでｌを、０．２％のツイーン２ｏにおけるス トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　２７５５からのレクチンのロ ーダミン抱合体と共に培養した。このレクチンはＬ−ラムノースに対し異常な程 大きな親和性を有する。Ｌ−ラムノースを一定割合でカプセルまたは錠剤におけ る薬剤に提供した場合には、これはレクチンと結合することになる。この高レベ ルの薬剤に晒された細胞は、対応する多量のラムノースを取り込み、これにより 一層多くの標識レクチンと結合する。細胞の年齢を、インシュリン拮抗剤抗体に 対する標識の強さを測定しかつこれをインシュリンのケイ光の強さと比較するこ とにより決定した。

本発明をその好適例について説明してきたが、本発明の意図および範囲を逸脱す ることなく種々変更および改良することができることは明白である。

繭晶−ＣＪ　ｃ−）　、ＩＪ’）。、い。８＝＝：暗ロー号；Ｊ品８芒＝旨巴８ 刈＝ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２６２６ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／工ＳＡ／２１０．　Ｐａｒセ 　ＩＩ。

ＩＩ、　ＦＩＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＨＥＤ　５ＥＡＲＣＨＴＥＲＭＳ＝

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異なる年齢の赤血球の相対的優位性の変化により示される身体の状態の認識 方法において、（ａ）患者から赤血球を得、（ｂ）上記細胞の基体成分のレベル および生成物成分のレベルを細胞ごとに基づき測定し、（ｃ）上記成分の測定し たレベルの比を細胞ごとに基づき決定し、この際上記基体成分と上記生成物成分 とを、基体成分が赤血球の寿命の選定された期間に亘り生成物成分に本質的に不 可逆的に変換される関係とし、（ｄ）上記比を既知の年齢の赤血球について決定 された基準の比と比較して当該赤血球の実際の年齢分布を得、（ｅ）この分布を 基準分布と比較することを特徴とする身体の状態の認識方法。 ２．状態が赤血球の異常減損に起因するものである請求の範囲第１項記載の方法 。 ３．患者の状態の確認方法において、（ａ）赤血球を得、（ｂ）細胞の年齢を細 胞ごとに基づき決定し、（ｃ）上記細胞の各々について指示成分のレベルを測定 し、（ｄ）上記細胞についての赤血球の年齢に対する指示成分の測定したレベル の依存性を決定し、この際上記指示成分が赤血球内のそのレベルが赤血球の年齢 に依存する成分としての特徴を有し、かつ上記依存性が上記状態が現在（ｐｒｅ ｓｅｎｔ）の場合には変化することを特徴とする患者の状態の確認方法。 ４．単一の赤血球試料から特別の期間に亘り血流中における物質の歴のレベルを 決定する方法において、（ａ）赤血球の試料を得、（ｂ）細胞ごとに基づき赤血 球の年齢を決定し、（ｃ）各細胞における指示成分のレベルを測定し、（ｄ）赤 血球の上記指示成分のレベルを細胞ごとに基づき赤血球の年齢と比較し、上記期 間が赤血球の寿命を超えることがなく、上記指示成分が赤血球内のそのレベルが 定量的に血流中の上記物質のレベルに影響される赤血球成分としての特徴を有す ることを特徴とする血流中における物質の歴のレベルの決定方法。 ５．月間隔より長い間隔で採取した赤血球の試料から患者の状態の連続的記録を 得る方法において、（ａ）少なくとも４ケ月ごとの頻繁さで赤血球の試料を得、 （ｂ）各赤血球の年齢を決定し、（ｃ）各赤血球中の指示成分のレベルを測定し 、（ｄ）細胞ごとに基づき赤血球の年齢を、細胞の過去の寿命における特別の状 態での患者の状態の指標となる細胞の指示成分と比較し、上記指示成分が細胞中 におけるそのレベルが上記患者の状態に応答する赤血球成分としての特徴を有す ることを特徴とする患者の状態の連続的記録の取得方法。 ６．患者が食養生法または治療的養生法に従うか否かを確認する方法において、 （ａ）赤血球の試料を得、（ｂ）各赤血球の年齢を決定し、（ｃ）各細胞におけ る指示成分のレベルを測定し、（ｄ）細胞ごとに基づき指示成分のレベルを細胞 の年齢と比較し、上記指示成分が赤血球中のそのレベルが上記養生法に応答する 赤血球成分としての特徴を有する食養生法または治療的養生法に従うか否かの確 認方法。 ７．細胞の年齢を、（ｉ）細胞ごとに基づき基体成分のレベルと生成物成分のレ ベルとを測定し、（ｉｉ）細胞ごとに基づき上記測定したレベルの比を計算し、 この際、基体成分が細胞の寿命の選定された期間において該細胞により生成物成 分に本質的に不可逆的に変換され、（ｉｉｉ）上記比を既知の牢齢の細胞で得た 比と比較することにより決定する請求の範囲第３，４，５または６項記載の方法 。 ８．細胞ごとに基づき試料中の赤血球の年齢を決定する方法において、（ａ）赤 血球の試料を得、（ｂ）細胞ごとに基づき上記細胞の基体成分のレベルと生成物 成分のレベルとを測定し、細胞ごとに基づき上記レベルの比を計算し、この際、 基体成分が赤血球の寿命の選定された期間において該細胞により生成物成分に木 質的に不可逆的に変換され、（ｃ）未知の年齢の上記細胞における上記比を、細 胞ごとに基づき細胞の年齢を決定するために上記選定された期間内に納まる既知 の年齢の赤血球において得た比と比較することを特徴とする赤血球の年齢の決定 方法。 ９．工程（ｂ）の前において、上記成分の少なくとも１種をケイ光発生標識で標 識付けし、かかる各標識が区別可能な波長のケイ光を有し、上記標識付け成分の レベルを上記波長での細胞のケイ光の強度を測定することにより測定する請求の 範囲第７項記載の方法。 １０．一標識がテトラメチルローダミンイソチオシアネートである請求の範囲第 ９項記載の方法。 １１．少なくとも一の成分が炭水化物部分を含み、該成分を工程（ｂ）前に炭水 化物に対し親和性を有する物質と結合する標識で標識付けし、上記標識付けした 成分のレベルを上記細胞中の上記標識を検串しかつ定量することにより測定する 請求の範囲第７項記載の方法。 １２．炭水化物結合物質がコンカナバリンＡである請求の範囲第７項記載の方法 。 １３．赤血球中における指示成分のレベルと赤血球の年齢との関係を決定する方 法において、指示成分のレベルと、請求の範囲第８項記載の方法により決定され る赤血球の年齢とを細胞ごとに基づき比較することを特徴とする赤血球中におけ る指示成分のレベルと赤血球の年齢との関係の決定方法。 １４．網赤血球を非綱赤血球から区別する請求の範囲第１０項記載の方法。 １５．患者の状態が血液中の治療剤のレベルにより、また指示成分が上記治療剤 または網赤血球中に見い出される該治療剤の代謝産物である請求の範囲第３また は４項記載の方法。 １６．患者の状態が血糖レベルにより、また指示成分が血糖である請求の範囲第 ３または４項記載の方法。 １７．患者の状態が血液中のアルコールレベルにより、また指示成分がアルコー ルまたは網赤血球中に見い出されるアルコールの細胞代謝物である請求の範囲第 ３または４項記載の方法。 １８．更に、上記治療的養生法において要求される薬剤を非毒性指示薬に対し一 定の割合で含む医薬組成物を患者に投与し、上記指示薬が赤血球成分となるかも しくは該成分を変質させて指示成分となる請求の範囲第６項記載の方法。 １９．一日古い網赤血球を２日古い網赤血球から区別する請求の範囲第４項記載 の方法。 ２０．生成物成分がグルコヘモグロビンであり、またケイ光色素／レクチン結合 体で標識付けされている請求の範囲第１２項記載の方法。 ２１．レクチンがコンカナバリンＡである請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．網赤血球をこれらのＲＮＡ含量によって同定する請求の範囲第１４項記載 の方法。 ２３．細胞をＲＮＡ沈澱手段で処理する請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．沈澱手段がニューメチレンブルーである請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５．ＲＮＡ沈澱物をこれらの屈折率に基づき区別する請求の範囲第２３項記載 の方法。 ２６．細胞もセチルピリジウムクロリドで処理する請求の範囲第２５項記載の方 法。 ２７．唯一の規定された赤血球の部分母集団を年齢解析のために提供する請求の 範囲第３項記載の方法。 ２８．更に、細胞ごとに基づき２種の成分を測定しかつ各細胞についての２種の 成分の比を求め、当該比を番号順に配列して配列リストを得、この配列リストを 特定の年齢グループに対応する小区分に再分する請求の範囲第１３項記載の方法 。２９．小区分を調整して赤血球の減損の予期した事項に対し補正を行う請求の 範囲第２８項記載の方法。 ３０．細胞が赤血球である請求の範囲第１，３または４項記載の方法。 ３１．基体成分がヘモグロビンである請求の範囲第７項記載の方法。 ３２．生成物成分がグルコヘモグロビンである請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３．生成物がグルコヘモグロビンであり、これをグルコースに対し親和性を有 する標識により検出する請求の範囲第３２項記載の方法。 ３４．生成物がガラクトヘモグロビンであり、これをガラクトースに対し親和性 を有する標識により検出する請求の範囲第３２項記載の方法。 ３５．指示薬が糖である請求の範囲第１８項記載の方法。 ３６．糖が本質的に通常の食事の部分にはない請求の範囲第３５項記載の方法。 ３７．炭水化物部分がＬ−ラムノースであり、物質がストレプトマイセス２７５ ５のラムノース結合レクチンである請求の範囲第１１項記載の方法。 ３８．各細胞の年齢を細胞のインシュリン結合能力から決定する請求の範囲第３ ，４，５または６項記載の方法。 ３９．変換が本質的に一定速度で起こる請求の範囲第７項記載の方法。 ４０．生成物成分を、該成分をガラクトースオキシダーゼで処理し、アルデヒド 生成物のレベルをガラクトースオキシダーゼのガラクトヘモグロビンに対する作 用により測定することによって測定する請求の範囲第３４項記載の方法。 ４１．生成物成分を、該生成物のガラクトース部分を標識ピサムスクチビュム凝 集素と結合させて生成物成分と標識凝集素との標識結合体を得、このようにして 得た標識結合体を定量する請求の範囲第３３項記載の方法。 ４２．生成物を、該生成物を過ヨウ素酸と反応させてアルデヒドを得、得られた アルデヒドを定量する請求の範囲第３２項記載の方法。 ４３．各細胞の年齢を各細胞の糖分解酵素の活性から決定する請求の範囲第３， ４，５または６項記載の方法。