DE2858099C2 - Verfahren zur Messung der Aktivität von γ-Glutamyl-transpeptidase - Google Patents

Verfahren zur Messung der Aktivität von γ-Glutamyl-transpeptidase

Info

Publication number
DE2858099C2
DE2858099C2 DE2858099A DE2858099A DE2858099C2 DE 2858099 C2 DE2858099 C2 DE 2858099C2 DE 2858099 A DE2858099 A DE 2858099A DE 2858099 A DE2858099 A DE 2858099A DE 2858099 C2 DE2858099 C2 DE 2858099C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
glutamyl
anilide
phthalyl
diethylamino
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2858099A
Other languages
English (en)
Inventor
Masaaki Kawagoe Nakahata
Takanori Tohyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Original Assignee
Wako Pure Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wako Pure Chemical Industries Ltd filed Critical Wako Pure Chemical Industries Ltd
Application granted granted Critical
Publication of DE2858099C2 publication Critical patent/DE2858099C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C07D209/48—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles with oxygen atoms in positions 1 and 3, e.g. phthalimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

verwendet, worin R1 und R2 unabhängig voneinander eine Aikylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten und
is R3 ein Wasserstoffatom, eine Aikylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe bedeutet, und
daß man die Menge des durch y-Glutamyl-transpeptidase freigesetzten p-Phenylendiamin-Derivats unier Verwendung eines Oxidationsmittels in Gegenwart eines Kupplers colorimetrisch bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Oxidationsmittel einsetzt, das aus-20 gewählt ist unter Perjodaten, Chloramin T, Hypochloriten und Persulfaten.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel Kalimnperjodat einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Kuppler einsetzt, der ausgewählt ist unter Phenol, a-Naphthol.jff-Naphthol, Monosulfonsäure-Derivaten von a- oder^S-Napiithol, Disulfon-
25 säure-Derivaten von a- oderjS-Naphthol, Carbonsäure-Derivaten von a- oderjJ-Naphthol und Polyhydroxyphenolen.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kuppler l-Naphthol-2-sulfonsäure einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivat
L-y-GIutamyl-p-(N,N-diethylamino)anilid,
L-y-GIutamyl-p-(N,N-dimethylamino)anilid,
L-y-GIutamyI-m-methyI-p-(N,N-diethylamino)anilid oder
L-y-GIutamyl-p-(N,N-dipropylamino)anilid einsetzt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Aktivität von y-Glutamyl-transpeptidase in einer Probe. 40 y-Glutamyl-transpeptidase (nachstehend »y-GTP« genannt) ist ein Enzym des y-Glutamyl-peptid-Stoffwechsels in einem Lebewesen und überführt die y-Glutamylgruppe von y-Glutamylpeptid in andere Peptide oder Aminosäuren.
Die Messung der y-GTP-Aktivität im Blut istein brauchbares Diagnosehilfsmittel zur Feststellung von Krankheiten wie aktiver chronischer Hepatitis, Hepatitis aufgrund von Gallenstauungen, Obstruktionsikterus, primä-45 rem oder metastatischem Leberkrebs.
Als Substrate zur Messung der y-GTP-Aktivität sind y-Glutamyl-p-nitroanilid, y-GIutamyl-a-naphthylamid, y-Glutamyl-./f-naphthylamid bekannt. Die Verwendung dieser Verbindungen als Substrat hat jedoch viele Nachteile, es müssen Blindversuche von Proben unter sehr strengen Bedingungen durchgeführt werden, es müssen sehr strenge Maßstäbe an die Messungen angelegt werden, es sind komplizierte und umständliche Verfahren 50 nötig, es gibt kein geeignetes Farbentwicklungs-Reagens mit guter Farbstabilität und α-Naprtthylamin und ^-Naphthylamin, welche als Standardsubstanz verwendet werden, sind karzinogene Verbindungen.
Die erfindungsgemäß verwendeten y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate weisen ausgezeichnete Eigenschaften als Substrat bei der Messung der y-GTP-Aktivität von lebendem Material auf.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen 55 Formel I:
DJ
O O , R1
60 HO-C-CH-CHj-CHj-C-N-(CY)-N (I)
I
NH2 R2
worin R' und R2 unabhängig voneinander eine Aikylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten, R3 für 65 Wasserstoff, eine Aikylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Carboxylgruppe oder eine Sulfo-Gruppe steht.
Die y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen Formel I werden hergestellt durch Umsetzung eines N-Phthalyl-y-glutamyl-p-aminoanilid-Derivats der allgemeinen Formel 11:
(Π)
10
worin R1, R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit Hydrazin, vorzugsweise in einem Lösungsmittel und bevorzugt bei einer Temperatur von 00C bis 600C.
In den obigen Formeln steht der Begriff »Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen« beispielsweise für Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl und Amyl.
Beispiele für N-Phthalyl-y-glutamyl-p-aminoanilid-Derivate ier Formel II sind: 15
N-Phthalyl-y-glutamyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilid, N-Phthalyl-y-glutamyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilid, N-Phthalyl-)>-glutamyl-p-(N,N-dipropylarnino)-amlid,
N-Phthalyl-f-&Jutamyl-o-methyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilid, 20
N-Phthälyl-rgiuiarnyl-o-rncthyl-p-iN.N-diäthylarninoJ-aniüd, N-Phthalyl-y-glutamyl-m-methyl-p-CN,N-diäthylamino)-anilid, N-Phthalyl-y-gIutamyl-o-sulfo-p-(N,N-dimethylamino)-anilid, N-Phthalyl-y-glutamyl-m-sulfo-p-(N,N-diäthylamino)-anilid,
N-Phthalyl-^glutamyl-m-carboxy-p-i^N-dimethylaminoVanilid, 25
N-Phthalyl-y-glutamyl-o-carboxy-p-iN^-diäthylaminoVanilid.
Beispiele für y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen Formel I sind:
y-Glutamyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilid, 30
y-Glutamyl-p-^N-diathylaminoVanilid, y-Glutamyl-p-(N,N-dipropylamino)-anilid, j^Glutamyl-o-methyl-(N,N-dimcthylamino)-anilid, y-Glutamyl-o-methyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilid,
y-Glutamyl-m-methyl-p-(N,N-diäihylamino)-anilid, 35
y-Glutamyl-o-sulfo-p-(N,N-dimethylamino)-aniIid, y-Glutamyl-m-sulfo-p-(N,N-diäthylamino)-anilid, y-Glutamyl-m-carboxy-p-CN^-dimethylaminoHnilid, y-Glutamyl-o-carboxy-p-CN^-diäthylaminoHnilid.
Die N-Phthalyl-y-glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen Formel II können beispieisweise hergestellt werden, indem man N-Phthalylglutaminsäureanhydrid mit einem p-Phenylendiamin-Derivat der allgemeinen Formel III:
(ΠΙ)
50
worin R\ R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, wie folgt umsetzt:
55 60
^yx I Il
OT N-CH-(CH2^-C-N C/
15 |( )\ Ν — CH-iCH^C—N^ ( ) >—N (Π)
Die Reaktion kann durchgeführt werden, indem n.'an eine theoretische Menge oder eh'-.u geringen Überschuß N-Phthalylglutaminsäureanhydrid. erforderlichenfalls in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, gegebenenfalls in Gegenwart einer organischen Säure, wie Essigsäure, bei einer Temperatur von 200C bis 1000C umsetzt. Nach beendeter Reaktion kann das sich ergebende N-Phthalyl-y-glutamyl-n-ami-25 noanilid-Derivat der allgemeinen Formel II auf herkömmliche Weise abgetrennt werden.
Beispiele für p-Phenylendiamin-Derivate der allgemeinen Formel III sind:
Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin,
Ν,Ν-Diäthyl-p-phenyleiidiamin,
30 Ν,Ν-Dipropyl-p-phenylendiamin,
o-Methyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilin,
o-Methyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilin,
m-Methyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilin,
o-Sulfo-p-(N,N-dimethylamino)-anilin,
35 m-Sulfo-p-(N,N-diäthylamino)-anilin,
m-Carboxy-p-(N,N-dimethylamino)-anilin,
o-Carboxy-p-(N,N-diäthyiamino)-aniiin.
Die Umsetzung des N-Phthalyl-y-glutamyl-p-aminoanilid-Derivats der allgemeinen Formel II mit Hydrazin 40 kann w^e folgt durchgeführt werden:
N-CH-(CH2^-C-N
HO-C-CH-CH2-NH2
Il
-CH2-C-N H
R3
-<ά^κ
R'
Als Hydrazin kann Hydrazin als solches (NH2NH2), Hydrazinhydrat (NHjNH2 H2O), Hydrazinsalze, wie Mineralsalze, beispielsweise Sulfat oder Hydrochlorid verwendet werden. Üblicherweise verwendet man Hydrazinhydrat (NH2NH2 ■ H2O).
Vorzugsweise verwendet man bei der Reaktion ein Lösungsmittel. Üblicherweise können Wasser oder organische Lösungsmittel, welche die Umsetzung nicht ungünstig beeinflussen verwendet werden. Beispiele organischer Lösungsmittel sind wasserlösliche, polare organische Lösungsmittel, wie Alkohole, beispielsweise Methanol, Äthano1 Propanol, Isopropanol oder Äthylenglycol; Hydroxyäther, beispielsweise Methyl-Cellosolve: Äther, beispielsweise Tetrahydrofuran oder Dioxan.
umgesetzte Menge Verhältnis
(nilU)
220') 100,0
2302) 104,5
i 0 ΐ Α
2122) 96,4
194-) 88,2
Die Umsetzung erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur von 00C bis 60°C, vorzugsweise von 100C bis 300C. Man verwendet eine theoretische Menge oder einen geringen Überschuß des Hydrazins.
Nach beendeter Umsetzung wird das Endprodukt der allgemeinen Formel I abgetrennt, und nötigenfalls auf herkömmliche Weise gereinigt.
Die y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen Formel I haben die g'.eiche oder eine noch größere Substrat-Affinität (Substrat-Reaktivität) gegenüber y-GTP wie y-Glutamyl-p-nitroanilid, das vielfach als Substrat zur Messung der y-GTP-Aktivität verwendet wurde, wie sich aus der nachstehenden Tabelle ergibt.
Tabelle
Substrat-Reaktivität
Substrat
L-y-GIutamyl-nitroanilid (Vergleichssubstanz)
L-}'-Glutamyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilid
L-y-ülutamyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilid
L-y-Glutamyl-p-(N,N-dipropylamino)-anilid
L-y-Glutamyi-m-methyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilid
Anmerkung:
!> Der Wert wurde auf herkömmliche Weise gemessen.
:) Die Werte wurden nach dem in Beispiel i der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren erhalten.
Demgemäß können die y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen Formel I zufriedenstellend als Substrat zur Messung der y-GTP-Aktivität verwendet werden.
Bei einem herkömmlichen Verfahren zur Messung der y-GTP-Aktivität in Lebewesen unter Verwendung von y-Glutamyl-p-nitroanilid als Substrat, kann man die Menge an durch y-GTP freigesetztem p-Nitroanilin durch Messung der optischen Absorptionen bei 4i0 nm bestimmen oder kann alternativ die y-GTP-Aktivität aus der optischen Absorption bei einer maximalen Wellenlänge nach Farbentwicklung von p-Nitroanilin unter Verwendung eines Aldehyds, wie p-Dimethylaminozimtaldehyd oder p-Dimethylaminobenzaldehyd, als Farbentwickler berechnen. Bei dem Verfahren zur Messung der Absorption von p-Nitroanilin bei 410 nm müssen Blindversuche unter höchst exakten Bedingungen durchgeführt werden, da die Wellenlängen anderer Bestandteile der lebenden Probe sehr nahe am Wert der zu messenden Wellenlänge liegen, und außerordentlich exakte Arbeitsweisen müssen angewandt werden, um genaue Daten zu erhalten, was das Verfahren sehr kompliziert und aufwendig macht. Bei dem Verfahren der Farbentwicklung von p-Nitroanilin mit einem Aldehyd, wie p-Dimethyiaminozimtaldehyd müssen ebenfalls sehr exakte und aufwendige Verfahren angewandt werden, um genaue Messungen zu erzielen; man verwendet eine Zelle mit konstanter Temperatur, da die optische Absorption der Farbsubstanz mit der Temperatur abnimmt; beispielsweise nimmt ein Absorptionswert gemessen bei 37°C bei 200C um die Hälfte ab. Somit ergibt sich, daß die Verwendung von y-Glutamyl-p-nitroanilin als Substrat nicht praktisch und für alltägliche Testverfahren, bei denen Genauigkeit und Schnelligkeit erforderlich sind, ungeeignet ist.
Es wurde dagegen festgestellt, daß man bei Verwendung der y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate der allgemeinen Formel I als Substrat zur Messung der y-GTP-Aktivität bei Proben exakte und rasche Messungen durchführen kann, da eine große Sensitivität für die Farbreaktion und eine rasche Farbentwicklungsreaktion vorliegen.
Verwendet man das y-Glutamyl-p-amino-anilid-Derivat der Formel I als Substrat bei der Messung der y-GTP-Aktivität, so wird die Menge an p-Phenylendiamin-Derivat gemessen, die durch die enzymatisch^ y-GTP-Aktivität entwickelt wird. Bei der Bestimmung der Menge an p-Phenylendiaminderivat kann man verschiedene herkömmliche Verfahren zur Bestimmung aromatischer Amine mittels Farbentwicklung anwenden, beispielsweise das Diazo-Kupplungsverfahren, ein Verfahren durch das eine Schiffsche Base bestimmt wird, welche durch Umsetzung einer Aldehyd-Verbindung erhalten wurde. Man bestimmt die gefärbte Verbindung, welche durch Oxydation erhalten wird. Das p-Phenyiendiamin-Derivat wird in Gegenwart eines Kupplers, der eine gefärbte Substanz erzeugen kann oxidiert, indem man den Kuppler oxydativ mit dem p-Phenylendiamin kondensiert. Hierbei ergibt sich eine gefärbte Substanz, welche colorimetrisch bestimmt wird, um die y-GTP-Aktivität zu messen.
Bei der Messung der y-GTP-AJctivität unter Verwendung des y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivats der allgemeinen Formel I als Substrat, verwendet man vorzugsweise einen pH im Bereich von 7,5 bis 9,0. Um den pH im geeigneten Bereich zu halten, kann man Puffer, wie Phosphate, Borate, Carbonate, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Barbital, Triethanolamin oder Glycin verwenden. Von diesen Puffern verwendet man wiederum vorzugsweise anorganische Salze, wie Borate, Phosphate und Carbonate.
Das hergestellte p-Phenylendiamin-Derivat kann leicht durch Einwirkung eines Oxydationsmittels in eine gefärbte Verbindung überführt werden. In diesem Fall wendet man oxydative Kondensation in Gegenwart eines Kupplers an. Wird beispielsweise die Oxydation bei einem pH von etwa 4 bis 9 durchgeführt, so erhält man eine Verbindung mit einer maximalen Absorption bei etwa 510 nm. Wird die ci/dative Kondensation in Gegenwart
eines Kupplers, wie Phenol oder eines Naphthols durchgeführt, so kann man eine gefärbte Verbindung mit einer maximalen Absorption bei —670 nm erhalten. Es können alle Kuppler verwendet werden, welche bei oxydativer Kondensation mit dem p-Phenylendiamin-Derivat gefärbte Substanzen ergeben. Beispio' für solche Kuppler sind Phenol, σ-Naphthol, ,^-Naphthol und deren Derivate, wie Monosulfonsäuredcrivate, beispielsweise l-Naphthol-2-suIfonsäure, l-Naphthol-8-sulfonsäure, 2-Naphthoi-7-sulfonsäure oder2-Naphlhol-8-sulfonsäure sowie deren Salze, Disullonsäurederivate, wie z. B. 2-Naphthol-3,6-disulfonsäure, 2-Naphthol-6,8-disulfonsäure, sowie deren Salze, Carbonsäure-Derivate, beispielsweise l-Naphthol-2-carbonsäure, Salicylsäure sowie de^n Salze, Polyhydroxyphenole, z. B. Katechin und Brenzkatechin.
Die Farbentwicklungsreaktion bei der Herstellung einer gefärbten Verbindung durch Oxydation oder durch
ίο oxydative Kondensation in Gegenwart eines Kupplers kann quantitativ sofort bei einem pH von etwa 4 bis 12 erfolgen. Um den pH-Wert im oben erwähnten Bereich zu halten, können Puffer oder Alkalien, wie Alkalihydroxyde, -carbonate, -phosphate oder -borate wirksam verwendet werden.
Es können alle Oxydationsmittel verwendet werden welche durch Oxydation oder oxydative Kondensation eine Farbentwicklung des p-Phenylendiamin-Derivats bewirken. Beispiele für solche Oxydationsmittel sind Oxydationsmittel der Halogenreihe, wie Perjodate, Chloramin T, Hypochlorite, und Oxydationsmittel der Peroxydreihe, wie Persulfate.
Die durch oxydative Kondensation des p-Phenylendiamin-Derivats mit dem Kuppler hergestellte Verbindung ist blau mit einer maximalen Absorption bei —670 nm, welche kaum durch Verunreinigungen mit Absorptionen bei etwa 400 und 570 um, wie sie in Proben vorhanden sind, beeinflußt n'ird; die Farbempfindlichkeit ist sehr hoch, die Farbstabilität ist gut und die Absorption verändert sich kaum aufgrund von Temperaturveränderungen, so daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung der ^GTP-Aktivität bei Proben sehr exakt und in der Praxis brauchbar ist.
Die erfindungsgemäße Messung der Aktivität wird nachstehend noch detaillierter erläutert.
Beispielsweise gibt man zu 1,0 ml einer Pufferlösung mit 0,05 Mol/l Borsäure mit pH 8,0, welche 10mMol/ly-Glutamy!-p-(N,N-diäthylamino)-ani!id und 20 mMol/1 Giycylglycin enthält, eine lebende Probe, beispielsweise 0,02 ml Serum und erhitzt in einem konstanten Temperaturbad 15 Minuten auf 37°C. Man mischt die Reaktionslösung mit 1,0 ml einer 0,2 Gew-%igen Phenollösung zusammen mit 1,0 ml Borsäurepufferlösung (0,3 Mol/l) von pH 8,0, welche 0,2 Gew.-% Kaliumperjodat enthält. Die Reaktionslösung zeigt sofort eine Blaufärbung mit einer maximalen Absorption bei 670 nm. Die optische Absorption der Reaktionslösung bei 670 nm wird gemessen und mit einer Probe aus einem Blindversuch verglichen, bei dem Wasser anstelle der Serumprobe verwendet u urde. Die y-GTP-Aktivität in der Probe kann berechnet werden unter Verwendung einer Kalibrierungskurve, die auf herkömmliche Weise erhalten wurde unter Verwendung bekannter Mengen an Standard-Serum oder Ν,Ν-Diäthyl-p-phenylendiamin.
Läßt man das erfindungsgemäße Substrat in Form einer wäßrigen Lösung stehen, so kann durch Hydrolyse ein p-Phenylendiamin-Derivat freigesetzt werden. Man kann dies jedoch verhindern, indem man der Lösung einen Puffer zusetzt oder die molare Konzentration des Puffers regelt. Im Fall einer Phosphorsäure-Pufferlösung mit einem pH 8,0 oder einer Tris-Pufferlösung mit pH 8,0 wird beispielsweise die Freisetzung an p-Phenylendiaminderivat um so geringer je niedriger die molare Konzentration des Puffers wird. Im Falle von Boraten dagegen findet unabhängig von der molaren Konzentration nahezu keine Freisetzung von p-Phenylendiamin-Derivat statt.
Gibt man einen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Äthylenglycol, Propylenglycol, Diäthylenglycol oder Glycerin in einer Menge von etwa 0,01 bis 3,0 Gew.-%, bezogen auf das Endgewicht der gefärbten Lösung zu der zu messenden Lösung, so hat dies einen günstigen Einfluß auf die Farbstabilität.
Wie bereits erwähnt, gestattet die. Verwendung des y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivats der Formel I bei der Messung der y-GTP-Aktivität an einer lebenden Probe exakte und rasche Messungen, ohne daß Sicherheits- oder Gesundheitsprobleme bei der Handhabung auftreten. Da darüberhinaus die Färbeempfindlichkeit sehr hoch ist und die Farbentwicklungsreaktion sofort vollständig durchgeführt werden kann, kann das erfindungsgemäße Meßverfahren auch bei automatischen Analysevorrichtungen angewandt werden.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Die angegebenen Prozentsätze stellen Gewichtsprozent dar, falls nichts anderes angegeben ist.
Vergleichsbeispiel 1
Eine Mischung von 110 g N-Phthalyl-L-glutaminsäure-anhydrid, 69,3 g Ν,Ν-Diäthyl-p-phenylendiamin,
440 ml Chloroform und 82,5 ml Essigsäure erhitzt man 1 Stunde zum Rückfluß. Nachdem man das Chloroform
abdestilliert hat, gibt man Äthanol zu, damit sich Kristalle bilden. Diese Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet, wobei man 160 g N-PhthalyI-L-y-glutamyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilid mit einem Fp. 189°C bis 190,50C erhält.
Verwendet man anstelle des Ν,Ν-Diäthyl-p-phenylendiamins Ν,Ν-Dimethyl-p-phenylendiamin, N,N-Dipropyl-p-phenylendiamin oder m-Methyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilin, so erhält man entsprechend N-Phthalyl-L-y-glutamyl-p-{N,N-dimethylamino)anilid, N-Phthalyl-L·)»-glutamyl-Γ>-(NίN-dipΓopylaInino)-an^lid oder N-Phthalyl-L-)vglutamyl-m-methyl-p-{N,N-diäthylamino)anilid.
Herstellungsbeispiel 1
Zu 10 g N-Phthalyl-L-y-glutamyl-p-(N^l-diäthylamino)-anilid, das gemäß Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde, gibt man 70 ml Methanol und 13,2 ml einer 80%igen wäßrigen Hydrazinhydratiösung und mischt. Die erhaltene Mischung rührt man dann 2 Tage bei Raumtemperatur, um die Reaktion durchzurühren. Dann wird die Reaktionsmischung abfiltriert, gewaschen und getrocknet, wobei man 14,7 g L-)>-Glutainyl-p-(N,N-diäthyI-
amino)-anilid in Form von weißen Kristallen mit einem Fp. von 217-220°C (Zers.) erhält.
Analyse Ci5H23O3N3 ■ 2HCI ■ H2O:
Berechnet: C 46,88 H 7,08 N 10,94%;
Gefunden: C47,27 H 7,27 N 10,78%.
Ia]Jl' = +17,3° (c = 3,0 in Methanol).
Herstellungsbeispiel 2
Verwendet man das in Vergleicnabeispiel 1 erhaltene N-Phthalyl-L-y-glutamyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilid anstelle des in Beispiel 1 verwendeten N-Phthalyl-L-y-glutamyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilids, so erhält man entsprechend auf die gleiche Weise wie in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben L-y-Glutamyl-p-(N,N-dimethylamino)anilid. Auf die gleiche Weise erhält man L-)>-Glutamyl-p-(N,N-dipropylamino)-anilid oder L-y-Glutamylm-methyl-p-(N,N-diäthylenamino)-anilid wenn man entsprechend die in Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Verbindungen N-Phthalyl-L-y-glutamyl-p-(N,N-dipropylamino)-anilid oder N-Phthalyl-L-y-glutamyl-m-methyl-p-(N,N-diäthyIamino)-anilid verwendet.
Beispiel 1
Reagenzlösungen
1) Substratpufferlösung:
Man stellt eine Pufferlösung aus 0,05 Mol/l Borsäure mit pH 8,0 her, die 10 mMol L-^Glutamyl-p-(N,N-diäthylamino)-anilid gemäß Herstellungsbeispiel 1,20 mMol/lGlycylglycin, 0,2 mMol/1 l-Naphthol-2-sulfonsäure und 2% Äthylenglycol enthält.
2) Oxydationsreagenzlösung:
Man stellt eine Pufferlösung aus 0,3 Mol/l Borsäure mit pH 8,0 her, die 0,2% Kaliumperjodat enthält.
Meßverfahren
Zu 1,0 ml Substratpufferlösung gibt man 0,02 ml Serumprobe und mischt gut. Anschließend erwärmt man die Mischung 15 Minuten lang in einem Bad, das bei einer konstanten Temperatur von 37°C gehalten wird. Zu der Mischung gibt man dann 2,0 ml Oxydationsreagenslösung, um die Farbentwicklung durchzuführen.
Es wird eine Absorption der Probe bei 670 nm gemessen. Als Kontrolle wird in einem Blindversuch auf die gleiche Weise wie oben beschrieben eine Lösung hergestellt, welche jedoch 0,02 ml Wasser anstelle der Serumprobe enthält, und man mißt ebenfalls die Absorption. Die y-GTP-Aktivität wird dann durch Vergleich niii der Kaiibrierungskurve berechnet, welche auf herkömmliche Weise unter Verwendung von Ν,Ν-Diäthyl-p-phenylendiamin erhalten wurde.
Beispiel 2
Reagenzlösungen
1) Substratpufferlösung:
Man stellt eine Pufferlösung aus 0,05 Mol/l Borsäure mit pH 8,0 her, die 10 mMol/1 L-y-Glutamyl-p-(N,N-dimethylamino)-anilid gemäß Herstellungsbeispiel 2 und 20 mMol/1 Glycylglycin enthält.
2) Oxydationsreagenzlösung: Man stellt eine Pufferlösung von 0,3 Mol/l Borsäure mit pH 8,0 her, welche 0,2% Kaliumperjodat enthält.
Meßverfahren
Zu 2,0 ml Substratpufferlösung gibt man 0,02 ml Serumprobe und mischt gut. Anschließend erhitzt man die Mischung in einem Bad das bei einer konstanten Temperatur von 37°C gehalten wird. Dann gibt man 2,0 ml Oxydationsreagenzlösung zu der Mischung, um die Farbentwicklung durchzuführen. Man mißt eine Absorption der Probe bei 510 nm. Als Kontrolle verwendet man eine Reagenzvergleichslösung, welche auf die gleiche Weise wie oben beschrieben hergestellt wurde, jedoch 0,02 ml Wasser anstelle der Senunprobe enthält und mißt ebenfalls die Absorption. Die y-GTP-Aktivität wird berechnet, indem man mit der Kalibrierungskurve vergleicht, welche auf herkömmliche Weise unter Verwendung von p-(N,N-Dimethylamino)-anilin erhalten wurde.
Beispiel 3
Unter Verwendung von L-y-Glutamyl-p-(N,N-dipropylamino>anilid als Substrat, das gemäß Herstellungsbei- 6 spiei 2 erhalten wurde, bestimmt man die y-GTP-Aktivität aui die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 6
Unter Verwendung des gernäß Herstellungsbeispiel 2 erhaltenen L-y-Glutamyl-o-methyl-p-(N,N-diathylamino)anilids als Substrat bestimmt man die y-GTP-Aktivität aufdie gleiche Weise wie in Beispiel 3 beschrieben.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Messung der Aktivität von y-Glutamyl-transpeptidase in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat ein y-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivat der allgemeinen Formel
O O
Il 11
HO-C-CH-CH2-CH2-C—N
I ι
NH2 H
DE2858099A 1977-05-30 1978-05-29 Verfahren zur Messung der Aktivität von &gamma;-Glutamyl-transpeptidase Expired DE2858099C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6306177A JPS53147034A (en) 1977-05-30 1977-05-30 Gamma-glutamyl-p-aminoanilide derivatives and process for their preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2858099C2 true DE2858099C2 (de) 1985-09-05

Family

ID=13218439

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2823342A Expired DE2823342C2 (de) 1977-05-30 1978-05-29 L-&gamma;-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate und Verfahren zu deren Herstellung
DE2858099A Expired DE2858099C2 (de) 1977-05-30 1978-05-29 Verfahren zur Messung der Aktivität von &gamma;-Glutamyl-transpeptidase

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2823342A Expired DE2823342C2 (de) 1977-05-30 1978-05-29 L-&gamma;-Glutamyl-p-aminoanilid-Derivate und Verfahren zu deren Herstellung

Country Status (4)

Country Link
US (1) US4177109A (de)
JP (1) JPS53147034A (de)
DE (2) DE2823342C2 (de)
FR (1) FR2392960A1 (de)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5569549A (en) * 1978-11-16 1980-05-26 Nitto Boseki Co Ltd Novel substrate for determination of enzyme activity
DE2854987A1 (de) * 1978-12-20 1980-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene
US4327178A (en) * 1979-05-01 1982-04-27 University Of Miami Urinary kallikrein assay: specific substrates and assay method
EP0052296B1 (de) * 1980-11-12 1984-06-27 Mitsubishi Kasei Corporation Als Heilmittel für Immunokrankheiten anwendbare Glutaminderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Zusammensetzungen, die die obengenannten Derivate enthalten
JPS589698A (ja) * 1981-07-10 1983-01-20 Toyo Jozo Co Ltd γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定用基質、およびそれを用いる活性測定法
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
US4588836A (en) * 1982-09-01 1986-05-13 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Novel synthetic substrate and assay method using the same
DE3234478A1 (de) * 1982-09-17 1984-03-22 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Reagenz und verfahren zur bestimmung von (gamma)-glutamyltransferase
JPS5963198A (ja) * 1982-10-01 1984-04-10 Toyo Jozo Co Ltd 酵素を用いる定量法
USRE33635E (en) * 1982-10-01 1991-07-09 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Enzymatic assay method
JPS60164499A (ja) * 1984-02-07 1985-08-27 Kyowa Medetsukusu Kk 酵素活性測定法
US4751178A (en) * 1985-09-26 1988-06-14 Eastman Kodak Company Substrates, compositions, elements and methods for the determination of gamma-glutamyltransferase
US4851572A (en) * 1987-07-03 1989-07-25 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. γ-L-glutamyl-4-nitroanilide derivatives and process for determining γ-GTP activity using the same
WO1990003399A1 (en) * 1988-09-30 1990-04-05 Australian Commercial Research & Development Limited Amino acid transport proteins, amino acid analogues, assay apparatus, uses thereof for treatment and diagnosis of cancer
US5474906A (en) * 1993-03-26 1995-12-12 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Reagent for determining γ-glutamyl transpeptidase activity
JPWO2011126099A1 (ja) * 2010-04-02 2013-07-11 味の素株式会社 糖尿病又は肥満症の予防又は治療剤
WO2016024791A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Samsung Electronics Co., Ltd. Sample test method, microfluidic device, and test device
CN119306640A (zh) * 2024-10-14 2025-01-14 英科新创(厦门)科技股份有限公司 一种γ-谷氨酰转肽酶检测底物及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2259512B2 (de) * 1972-12-05 1975-07-31 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim gamma-Glutamyl-4-nitranilid-3carbonsäure, deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und deren Verwendung
DE2646033A1 (de) * 1975-10-14 1977-04-28 Wako Pure Chem Ind Ltd L-leucyl-p-aminoanilid-derivate, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung
DE2724212A1 (de) * 1976-06-01 1977-12-15 Sankyo Co Verfahren und reagenz zur bestimmung der enzymaktivitaet

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3892631A (en) * 1972-08-21 1975-07-01 Warner Lambert Co Diagnostic reagents used for the determination of gamma-glutamyl transpeptidase in biological fluids
US3986931A (en) * 1972-12-05 1976-10-19 Boehringer Mannheim G.M.B.H. γ-GLUTAMYL-4-NITROANILIDE COMPOUNDS AND THEIR USE IN DETERMINING γ-GLUTAMYL TRANSPEPTIDASE
US4087331A (en) * 1977-01-12 1978-05-02 Coulter Electronics, Inc. Colorimetric method for determining gamma-glutamyl transpeptidase and compositions useful therein
DE2917999A1 (de) * 1979-05-04 1980-11-13 Behringwerke Ag Substrat zur bestimmung der gama -glutamyltranspeptidase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2259512B2 (de) * 1972-12-05 1975-07-31 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim gamma-Glutamyl-4-nitranilid-3carbonsäure, deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und deren Verwendung
DE2646033A1 (de) * 1975-10-14 1977-04-28 Wako Pure Chem Ind Ltd L-leucyl-p-aminoanilid-derivate, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung
DE2724212A1 (de) * 1976-06-01 1977-12-15 Sankyo Co Verfahren und reagenz zur bestimmung der enzymaktivitaet

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Barman, T.E.: Enzyme Handbook, Supplement I, Berlin 1974, S. 199 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPS53147034A (en) 1978-12-21
FR2392960B1 (de) 1981-03-20
DE2823342A1 (de) 1978-12-21
JPS6111219B2 (de) 1986-04-01
FR2392960A1 (fr) 1978-12-29
DE2823342C2 (de) 1985-12-12
US4177109A (en) 1979-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2858099C2 (de) Verfahren zur Messung der Aktivität von &amp;gamma;-Glutamyl-transpeptidase
EP0619374B1 (de) Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator
DE2920292C3 (de) L-γ -Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid und dessen Säureadditions- oder Alkalisalze, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von γ-Glutamyltranspeptidase
DE69213827T2 (de) Merocynanine als Eiweissfehler-Indikatoren
DE2130559C3 (de) Diagnostisches Mittel zum Nach weis von Urobihnogen
JPS59182361A (ja) 過酸化水素の定量方法
EP0098562B1 (de) Verfahren zur Bestimmung von direktem und Gesamt-Bilirubin sowie hierfür geeignetes Reagens
DE2603856A1 (de) Verfahren und reagentien fuer den nachweis, die schaetzung und quantitative bestimmung von nitrationen
DE69332903T2 (de) Biotinylierte, chemolumineszente label, konjugate, assays sowie assay kits
DE3124590A1 (de) Stabilisiertes reagenz zum nachweis von h(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)
DE68912462T2 (de) Xanthenfarbstoffe.
DE2801070A1 (de) Colorimetrisches verfahren zur bestimmung der gamma-glutamyl-transpeptidase-enzymaktivitaet
DE2919545C3 (de) L-Leucin-4-hydroxyanilid-derivate, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Leucinaminopeptidase
US4552849A (en) Method for determination of formaldehyde
DE69801266T2 (de) Diazoniumionen enthaltende Reagentien und ihre Verwendung
DE69124780T2 (de) Oxidierbares, farbproduzierendes Reagenz
DE2521402B2 (de) Diagnostisches mittel zum nachweis von urobilinogen
DE69210434T2 (de) Ein kolorimetrisches Verfahren und Reagenz zum Nachweis von Lithium in einer Testprobe
DE69019810T2 (de) Verfahren zur optischen Bestimmung von Bilirubin und Reagenz dafür.
DE3443415A1 (de) Zusammensetzung zur bestimmung von wasserstoffperoxid
DE69123411T2 (de) 2-Benzothiazolyl-tetrazolium-Salze als Indikatoren
DE3786043T2 (de) Fluoreszenzpolarisationsverfahren zur Überwachung der Reife der Lunge von Föten.
JPS61223651A (ja) ビリルビンの定量方法
DE69128181T2 (de) Enzymtests
DE2646033C3 (de) L-Leucin-p-aminoanilide, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur Messung der Aktivität von Leucylaminopeptidase

Legal Events

Date Code Title Description
Q172 Divided out of (supplement):

Ref country code: DE

Ref document number: 2823342

8110 Request for examination paragraph 44
8181 Inventor (new situation)

Free format text: TOHYAMA, TAKANORI NAKAHATA, MASAAKI, KAWAGOE, JP

AC Divided out of

Ref country code: DE

Ref document number: 2823342

Format of ref document f/p: P

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee