DE69123411T2

DE69123411T2 - 2-Benzothiazolyl-tetrazolium-Salze als Indikatoren

Info

Publication number: DE69123411T2
Application number: DE69123411T
Authority: DE
Inventors: Robert P Hatch; Nan-Horng Lin; Scott Ruetten
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1990-09-19
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2011-09-07
Also published as: AU626498B2; GR3022399T3; JPH04288076A; EP0476457A2; CA2049230A1; JP3157560B2; AU8341891A; ATE145905T1; DE69123411D1; EP0476457B1; CA2049230C; DK0476457T3; ES2095892T3; EP0476457A3

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Tetrazoliumsalz- Indikatorverbindungen zur Verwendung bei der Bestimmung reduzierender Substanzen, insbesondere von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) Tetrazoliumsalze sind als chromogene Indikatoren, die gegenüber reduzierenden Substanzen eine Reaktion zeigen, wohlbekannt. Bei Reduktion werden Tetrazoliumsalze in Formazan-Farbstoffprodukte überführt. Diese Indikatoren haben auf vielen Gebieten ihre Anwendung gefunden, insbesondere auf dem Gebiet der medizinischen Diagnose, wo sie, u.a., bei der Färbung von Zellen sowie der Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten wie Urin, Milch, Serum und Plasma verwendet worden sind. Im allgemeinen ist bei der Bestimmung von Körperflussigkeitsanalyten eine NAD-abhangige enzymatische Reaktion involviert, wobei NADH als eine Funktion der Menge von in der getesteten Probe vorhandenem Analyt gebildet wird. Die Menge an erzeugtem NADH kann durch reduktive Überführung eines entsprechenden Tetrazoliumsalz-Indikators in sein Formazan-Farbstoffprodukt ermittelt und bestimmt werden.
Auf dem Gebiet medizinischer Diagnose-Testververfahren eignen sich Tetrazoliumsalz-Indikatoren für eine Vielzahl unterschiedlicher Produkttypen. Ein besonderer Typ ist der Reagensstreifen. Dieses Produkt stellt gewissermaßen eine Vorrichtung in festem Zustand dar, die eine Matrix aus Papier oder einem anderen porösen Träger umfaßt die mit chemischen Reagentien imprägniert oder auf sonstige Weise beaufschlagt ist, wobei die Reagentien gegenüber einem besonderen Analyt, z.B. Glucose oder Cholesterol, eine Reaktion zeigen. Das ein- bzw. aufgebrachte Reagenssystem enthält einen chromogenen Indikator, durch welchen eine Farbe als Funktion der Menge eines Analyt in einer auf die Matrix aufgebrachten Probe entwickelt oder verändert wird. Die sich ergebende kolorimetrische Reaktion kann in Augenschein genommen werden, um cualitative oder halb-quantitative Ablesungen zu ermöglichen. Quantitative Ergebnisse sind erhältlich, indem die Reflexion oder entsprechende Werte der Matrix-Oberfläche bei einer oder mehreren definierten Wellenlängen mit einem geeigneten Gerät (Reflexionsmeßgerät) abgelesen werden.
Es besteht ein anerkanntes Interesse an der Entwicklung von Tetrazoliurn-Indikatoren, die eine starke Absorption bei Wellenlängen aufweisen, die in einem längeren Wellenlängenbereich liegen als die Absorption der hauptsächlichen Störagentien, die in der Testprobe vorliegen können. Beispielsweise stellt eine Störung bzw. Interferenz aus bzw. durch Hämoglobin-Färbung ein besonderes einschlägiges Problem dar, wenn die Probe beispielsweise Gesamtblut ist. Indikatoren mit signifikanter Absorption bei ca. 640 nm sind erforderlich, um eine Hämoglobin-Interferenz im wesentlichen zu überwinden. Die allgemein verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren sind 2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (INT), 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumchlorid (MTT) sowie 2,2',5,5-Tetraphenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylen)ditetrazoliumchlorid (NBT). Diese Verbindungen zeigen Maximalabsorption (UVmax) im Bereich von 465 bis 605 nm.
Ein weiterer Mangel bei den gewöhnlich verwendeten Tetrazoliumsalz- Indikatoren des Standes der Technik betrifft die Entwicklung der Instrumentierung, die zur Messung der entsprechenden kolorimetrischen Reaktion heranzuziehen ist. Rasche Fortschritte werden bei der Entwicklung kleinerer, billigerer Reflexionsmeßgeräte erzielt. Eine der teureren Komponenten derartiger Meßgeräte ist das optische System, das eine Lichtquelle, einen Filter oder weitere Spektralelemente zur Auswahl oder Eingrenzung der Wellenlänge des ein- oder austretenden Lichts sowie einen Sensor umfaßt. Deutliche Kosteneinsparungen könnten realisiert werden, indem man Funktionen der Elemente des optischen Systems wegläßt oder kombiniert oder billigere Komponenten, z.B. LEDs als Lichtquellen mit entsprechender Leuchtkraft, verwendet. Allerdings emittieren handelsübliche LEDs Licht, das eine Zentralwellenlänge aufweist, die wegen Herstellungsabweichungen und Temperaturabhängigkeit deutlich schwanken kann. Die gewöhnlich verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren INT, MTT und NBT weisen Reflexionsspektren auf, die eine starke Neigung im Bereich oberhalb von deren tvmax aufweisen. Demzufolge können, wenn man nicht jeweils einzeln sowohl ein jedes Gerät zum Abgleich der Herstellungsvariabilität in der LED als auch einen jeden Testlauf zum Abgleich der aufgrund der Temperatur eintretenden Varianz kalibriert, große Fehler bei den Ergebnissen des Assay-Verfahrens entstehen.
Die folgenden Angaben sind repräsentativ für die jeweilige technische Lehre des Standes der Technik, betreffend die Verwendung verschiedener Tetrazoliumsalze in kolorimetrischen Analyseverfahren. Tanaka et al., JP 61000084 (Chem. Abst. 104:203469y), beschreiben den Nachweis von Glucose unter Verwendung eines Formazan-Chelat, erhalten durch Reduktion von 2-(2- Benzthiazolyl)-3-(carboxyphenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumhalogenid in der Gegenwart von Nickel(II). Limbach et al., DE 3 247 894 (Chem. Abst. 101:125929v), beziehen sich auf die Verwendung von INT in Glucose-Assayverfahren. Rittersdorf et al., DE 2 147 466, beschreiben die Verwendung von sieben 2-(2-Benzthiazolyl)-3-phenyl-5-(4-[trimethylammoniumiphenyl)tetrazoliumsalzen bei der Bestimmung reduzierender Substanzen wie reduzierender Zucker, von Ascorbinsäure und Ketosteroiden.
Die in der Literatur bekannte Vielzahl von 2-Thiazolyltetrazoliumsalzen und/oder von deren entsprechenden Formazanen wird nun im folgenden kurz erörtert. Serebryakova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 10.1403 - 1405 (1970), beschreiben die Synthese und chromatischen Eigenschaften von Benzthiazolyl-3-phenyl(methyl)-5-p-nitro(dimethylamino)phenylformazanen. Die Autoren stellen fest, daß sowohl eine Elektronen-abziehende Nitro-Gruppe in der para-Position der N-5-Phenyl- Gruppe als auch eine Benzthiazolyl-Gruppe in der N-1-Position eine batochrome Verschiebung ergeben. Bednyagina et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 2:342 - 345 (1967), beschreiben die Synthese von 1-Benzthiazolyl- und 1-Benzoxazolyl-3-methyl-(oder phenyl)-5-arylformazanen. Die Beziehung zwischen der Farbtiefe und Basizität des Heterocyclus wird ebenfalls diskutiert. Gulemina et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 6:774 - 777 (1974), beschreiben den Effekt einer o-Nitro-Gruppe auf die Struktur und Eigenschaften von Benzthiazolylformazanen. Die Ionisierungskonstanten und IR- und UV-Spektren wurden bestimmt bzw. ermittelt und auf die Struktur bezogen. Lipunova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 4:493 - 499 (1974), beschreiben die Herstellung von 3-(Methyl, Isopropyl, Phenyl)-1-benzthiazolyl-5-nitrophenylformazanen sowie deren spektrale Eigenschaften. Gulemina et al., Zh. Prikl. Spektrosk. 22(5) :941 - 943 (1975), beschreiben die Beobachtung eines sowohl positiven als auch negativen UV-Thermochromismus in Abhängikeit von Lösungsmittel und Temperaturänderungsbedingungen für 1-Benzthiazolyl-, 1-Thiazolyl- und 1-(5-Bromthiazolyl)-3- methyl-5-(p-nitrophenyl)formazane. Ponyaev et al., Zh. Obshch. Khim. 55(11) :2615 - 2617 (1985), beschreiben kinetische Studien einer Interkonversion der photoinduzierten Formen von 1-Benzthiazolyl-3-methyl-5- phenylformazan-Analoga. Es wurde aufgezeigt, daß diese Formen tiefer gefärbt als Triphenylformazan sind Lipunova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin (1971) 831 - 835, vergleichen den bathochromen Effekt einer 5- Naphthyl- oder o-Tolyl-Gruppe auf das sichtbare Spektrum von 1-Benzthiazolylformazanen.
Verschiedene 2-Benzthiazolyltetrazoliumsalze und verwandte Verbindungen sind auf photographischem Gebiet ebenfalls angewandt worden, wie dies gemäß der Beschreibungen in US 3 655 382 und 4 221 864 dargestellt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden 2-Benzthiazolyltetrazoliumsalze bereitgestellt, die bei Reduktion Formazane ergeben, welche neue und verbesserte optische Eigenschaften aufweisen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:
2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(8-chinolyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-nitrophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(2-methyl-4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-chlor-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-fluorphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)- 5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4,5- trimethoxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-(6-Carboxybenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxy-4-carboxyphenyl-5-[4-(2- (2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-acetamidophenyl)-5-(methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(8-chinolyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-tnaphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5- phenyltetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)-5-[4-(2,3- dihydroxypropylthio)phenyl]tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-]-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-ylj-3-(4-carboxyphenyl)-5-[4-(2-(2-(2- hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-carboxphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-nitrophenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz und aus
2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-cyanophenyl)-5-(3-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz.
Die vorliegenden Verbindungen sind durch ein Reflexionsspektrum gekennzeichnet, das eine ausgedehntes Plateau oberhalb 600, vorzugsweise oberhalb ca. 650, um aufweist. Ein derartiges Plateau bei den Reflexionswerten gibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Assayverfabren auf Basis von Reflexions-Ablesungs-Streifen, insbesondere wenn das optische Meßsystem schwankende Zentralwellenlängen aufweist bzw. erzeugt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, vorzugsweise von NADH.
Somit betrifft die Erfindung außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, wobei man eines oder mehrere der Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung in ein Medium einbringt, von dem angenommen wird, daß es die reduzierende Substanz enthält, und man das Vorhandensein der reduzierenden Substanz durch eine Farbänderung im Tetrazoliumsalz ermittelt und bestimmt.
Schließlich wird durch die vorliegende Erfindung ein Teststreifen zum Nachweis einer reduzierenden Substanz bereitgestellt, welcher eine oder mehrere der Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthält.
Figuren 1 bis 4 zeigen die Reflexionsspektren der Formazane, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT, NBT sowie 2-(Benzthiazol-2- yl)-3-(1-naphthyl)-5-phenyltetrazoliumsalz (USSR) des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind.
Figuren 5 bis 10 zeigen die entsprechenden Spektren für Formazane aus besonderen Indikatorverbindungen der vorliegenden Erfindung (siehe Liste am Anfang der Tabelle im die Beispiele betreffenden Abschnitt).
Die Auswahl des Gegenanions beruht vorrangig auf Überlegungen bezüglich Stabilität und Löslichkeit des besonderen Tetrazoliumsalzes von Interesse. Im allgemeinen wird aus solchen Gegenanionen eine Auswahl getroffen, wie sie durch die anorganischen Anionen Chlorid, Bromid, Jodid, Nitrat, Fluoroborat, Perchlorat und Sulfat sowie durch organische Anionen wie Acetat, Oxalat, Tartrat und Arylsulfonate (Benzolsulfonat, Tosylat) dargestellt sind.
Tetrazoliumsalze werden durch in der Literatur wohlbekannte Verfahren hergestellt (Hooper, W.D., Rev. Pure and Appl. Chem., 1969, 19, 221; Putter, R., in Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl-Müller ed., Thieme Verlag, Stuttgart, 1965, Bd. 10/3, S. 633; Nineham, A. W. Chem. Rev., 1955, S. 355 - 483). Im allgemeinen werden die Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man zuerst ein 2-Hydrazinothiazol mit einem Aldehyd reagieren läßt und dann das entstandene Hydrazon mit einem diazotierten Anilin behandelt. Das sich ergebende Formazan wird dann zum Tetrazoliumsalz durch wohlbekannte Verfahren oxidiert. Demnach beinhaltet die Synthese drei grundsätzliche Ausgangsmaterialien, und zwar den Aldehyd, das Anilin und das 2-Hydrazinothiazol. Aldehyd 2-Hydrazinothiazol Hydrazon diazotiertes Anilin Formazan Tetrazoliumsalz

Herstellung von 2-Hydrazinothiazolen

Die entsprechend substituierten 2-Hydrazinobenzthiazole werden aus 1- Halo-2-nitroarenen (1) hergestellt, indem man zuerst das Halogenid durch Thiocyanat ersetzt um das Nitrothiocyanat (2) zu erzeugen. Dieses wird dann mit reduzierenden Mitteln wie Zinn reduziert, und es wird das entstandene Aminothiocyanat (3) zum 2-Aminobenzthiazol (4) cyclisiert.
Das gleiche Aminothiocyanat (3) kann auch synthetisiert werden, indem man das Amin mit Thiocyanogen behandelt (Metzger, J. V., in Comprehensive Heterocyclic Chemistry, A. R. Katritzky, C. W. Rees ed.; Peragamon: New York, 1984; Vol. 6, Teil 4, S. 324).
Das 2-Hydrazinothiazol (5) wird dann hergestellt, indem man Hydrazin mit dem 2-Aminothiazol (4) in Ethylenglykol bei 140ºC zur Reaktion bringt (Liu, K-C., Shih, B-J., Arch. Pharm., 1985, 18, 283).
Weitere Verfahren zur Herstellung von 2-Aminobenzthiazolen (4) beruhen darauf, daß man das aromatische Amin (6) mit Mineralsäure und Thiocyanat reagieren läßt, um den Thioharnstoff (8) zu erzeugen (Org. Synth., Coll. Vol. IV, 180), oder indem man das aromatische Amin N- Benzoylthiocyanat reagieren läßt um den N-Benzoylthioharnstoff (7) zu bilden, und man dann die Benzoyl-Gruppe hydrolysiert, um die entsprechende Thioharnstoff-Verbindung zu erzeugen (Org. Synth., Coll. Vol., III, 635). Weitere Verfahren zur Thioharnstoff-Herstellung können ebenfalls in diesen Literaturstellen aufgefunden werden. Diese Thioharnstoff-Verbindungen werden dann mit Reagentien wie Brom oxidiert, um 2-Aminobenzothiazole zu erzeugen (Bhargave, P. N., Baliga B. T., J. Ind. Chem., 1958, 5, 807).

Herstellung von Aldehyden

Die Aldehyde werden aus handelsüblichen Quellen bezogen oder können durch Verfahren hergestellt werden, mit denen der auf dem einschlägigen Gebiet tätige Durchschnittsfachmann vertraut ist.
Beispielsweise können Aldehyde durch benzylische Oxidation eines Arylmethans (March, J. Advances Organic Chemistry Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 1079) oder durch Reduktion eines Arylsäurechlorids (ibid., S. 396) oder Arylsäurederivats hergestellt werden (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, S. 604 - 605).
Arylhalogenide können ebenfalls zur Synthese von Aldehyden herangezogen werden. Bei diesem Verfahren wird durch eine Transmetallierungsreaktion eine arylmetallische Spezies erzeugt die mit einer Reihe von Reagentien, wie mit Dimethylformamid, zur Erzeugung des Aldehyds behandelt werden kann (ibid., S. 681 - 683).
Die vorgenannten Arylaldehyde, -säuren, -methane und -halogenide können mit einer Reihe funktioneller Gruppen vor deren Überführung in Tetrazoliumsalze derivatisiert sein. Dies kann durch aromatische nukleophile Substitution (March, J., Advances Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 576 - 607), durch aromatische elektrophile Substitution (ibid., S. 447 - 511) oder durch Heteroatom-gesteuerte Metallierungsreaktionen (Gschwend, H. W., Rodriguez, H. R., in Organic Reactions, John Wiley and Sons: New York, 1979, Vol. 26, 1) durchgeführt werden.
In Fällen, in denen der Aldehyd-Teil des Tetrazoliumsalzes ein Phenol oder Amin enthält, müssen diese Gruppen geschützt werden, so daß zwischen diesen und dem diazotierten Anilin oder dem zur Herstellung des Tetrazoliumsalzes verwendeten oxidierenden Mittel keine Reaktion eintritt.
Dies kann durchgeführt werden, indem man einen Hydroxyarylaldehyd als ein Acetat schützt worauf die Reaktionsfolge zur Herstellung der Formazane abläuft, und man das Acetat bei pH 10 hydrolysiert. Ansäuerung auf pH 5 und anschließende Filtration ergeben das gewünschte Formazan.
Reagiert das entstandene Phenol-Formazan mit dem oxidierenden Mittel bei der Tetrazoliumsalz-Herstellung, kann das Phenol durch eine im Sauren labile Gruppe wie Dihydropyran geschützt werden (Greene, T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons: New York, 1981, S. 87 - 113), welche dann durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen wieder abgespalten wird.
In ähnlicher Weise müssen Amine am Aldehyd-Teil geschützt werden, um deren Reaktion zu verhindern. Dies wird am besten dadurch bewerkstelligt daß man ein im Sauren labiles Carbamat verwendet (ibid., S. 218 - 247), welches dann durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen wieder abgespalten wird.

Herstellung von Arylaminen

Arylamine können durch Reduktion der entsprechenden Nitro- oder Azid- Verbindung (Larock, P. C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, S. 412 - 415 oder 409 - 410), durch Reaktion zwischen einer arylmetallischen Verbindung und einem elektrophilen Stickstoff-Reagens (ibid. S. 399 - 400) oder durch Umlagerung von Acylaziden oder oxidierten Amiden (ibid., S. 431 - 432) hergestellt werden.
Wie im Fall der Aldehyde können eine elektrophile und eine nukleophile aromatische Substitution dazu herangezogen werden, um verschiedene funktionelle Gruppen in das Arylamin oder dessen synthetische Vorstufenverbindung einzuführen.
Die grundsätzliche Verwendung der Tetrazoliumsalz-Verbindungen der vorliegenden Erfindung beruht auf deren Einsatz als chromogene Indikatoren zum Nachweis reduzierender Substanzen. Insbesondere eignen sich die vorliegenden Verbindungen zum vorteilhaften Nachweis von NADH. Insowiet eignen sich, da NADH in Enzym-katalysierten Nachweisreaktionen erzeugt wird, die für verschiedene biochemische Substanzen spezifisch sind, die vorliegenden Verbindungen ganz besonders für Testverfahren in der medizinischen Diagnose. Im allgemeinen können aber auch andere reduzierende Substanzen nachgewiesen werden, wie Schwefelwasserstoffgas, Diboran, Arsenhydrid oder Phosphorhydrid.
Bei den vorliegenden Verbindungen ist insbesondere herausgefunden worden, daß sie ein ausgedehntes Plateau in ihren Reflexionsspektren oberhalb ca. 600 nm aufweisen. Die am meisten bevorzugten Indikator- Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen ein Plateau oberhalb ca. 650 nm auf (d.h., der flachste, ca. 50 nm breite Teilbereich beginnt zwischen 640 und 660 nm). Ein derartiges Plateau bei den einschlägigen Reflexionswerten ergibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Testverfahren, die auf der Messung der Reflexion aus einem Reagensstreifen beruhen.
Reagensstreifen sind im Stand der Technik als analytische Vorrichtungen bekannt, die eine feste Trägermatrix umfassen, welche mit einer Test-Zusammensetzung beaufschlagt ist, die eine Farbänderung in Reaktion auf Kontakt mit einer flüssigen Testprobe erzeugt die den Analyt von Interesse enthält. Eine derartige Test-Zusammensetzung enthält im Fall der vorliegenden Erfindung (a) ein Reagens oder Reagentien, die mit dem Analyt reagieren, um eine reduzierende Substanz zu erzeugen, sowie (b) ein hier beschriebenes 2-Thiazolyltetrazoliumsalz, das sich durch eine derartige reduzierende Substanz reduzieren läßt, um ein chromogenes Formazan- Farbstoffprodukt zu erzeugen. Die Farb-Reaktionsweise derartiger Reagensstreifen kann visuell betrachtet werden, um halb-quantitative Werte zu ergeben. Es werden jedoch quantitative Ergebnisse erhalten, indem man das Reflexionsverhalten der Trägermatrix bei einer vorbestimmten Wellenlänge mißt. Derartige Messungen beinhalten, daß die zur Reaktion gebrachte Trägermatrix mit einer Lichtquelle bestrahlt und die Reflexion der Trägermatrix mit einem Sensor erfaßt werden, indem man das reflektierte Licht mit einem Detektor-Element mißt.
Das Auffinden von Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die ein Reflexionsplateau aufweisen, erweist sich in den Fällen als besonders vorteilhaft, in denen das Reflexionsverhalten aus einem Reagensstreifen mit einem Instrument abzulesen ist, das einer Variabilität bei der Zentralwellenlänge seines optischen Systems (die Kombination von Lichtquelle, Detektor-Element, spektraler Steuerelemente, z.B. Filter, sowie weitere Komponente) unterliegt. Die Schwankung der Zentralwellenlänge des optischen Systems kann durch eine Reihe von Faktoren hervorgerufen werden, z.B. Variabilität bei der Zentralwellenlänge des hauptsächlichen spektralen Steuerelements wie der bestrahlenden Lichtquelle oder der Filter. Bei Verwendung von z.B. Licht-emittierenden Dioden (LEDs) als die Lichtquelle schwankt die Wellenlänge des emittierten Lichts in typischer Weise um ± 4 nm innerhalb eines Instruments und bis zu ± 8 nm zwischen LEDs bei verschiedenen Geräten, und zwar aufgrund der Herstellungsvarianzen. Darüber hinaus unterliegen LEDs einer variablen/schwankenden Zentralwellenlänge auch aufgrund von Temperatureffekten. Bei Verwendung von Breitband-Lichtquellen mit Filtern zur spektralen Steuerung der Zentralwellenlänge liegt die Schwankung innerhalb eines Geräts in typischer Weise unter 1 nm, kann jedoch bei den verschiedenen Geräten bis zu ± 6 nm ausmachen. Somit laßt sich die vorliegende Erfindung auch in jenen Situationen erfolgreich zur Anwendung bringen, in denen die Zentralwellenlänge des das in das entsprechende Gerät eingebaute Detektor-Element erreichenden Lichts Schwankungen im Bereich von ca. ± 5 nm unterliegt.
Bei der Herstellung eines Reagensstreifens zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist die Auswahl der Trägermatrix, der Testreagentien, die mit Analyt zur Erzeugung der reduzierenden Substanzen reagieren, sowie des Verfahrens, mit dem solche Reagentien und der Tetrazolium-Indikator in die Trägermatrix eingebracht werden, eine Angelegenheit, die im entsprechenden Stand der Technik wohlbekannt ist. Um nur einige Beispiele zu nennen, sind typische Trägermatrices poröse und absorbierende Materialien wie Papier, Tuch, Glasfaserfilter, polymere Membranen und Filme und dgl. Die entsprechenden Aufbringungsverfahren schließen Imprägnation einer gebildeten Trägermatrix mit einer Lösung, Suspension oder weiteren flüssigen Form der Test-Zusammensetzung, in einer oder mehreren Stufen, und anschließende Trocknung der Matrix, oder Bildung einer Matrix in Gegenwart einer oder mehrerer Komponenten der Test- Zusammensetzung ein, z.B. durch Gießen oder Beschichten von bzw. mit Lösungen film- oder membranbildender Formulierungen.
Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, anhand der folgenden Beispiele noch weiter erläutert.

Beispiele

A. Synthese der Verbindungen

Hydrazon-Herstellung

Eine Aufschlämmung von 25 mmol des geeigneten Aldehyds und 25 mmol des geeigneten Hydrazins in 125 ml absolutem Ethanol wird 3 h lang am Rückfluß gehalten. Wasser wird mit 3A Molekularsieben in einem Soxhlet- Extraktor entfernt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und dann filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.

Formazan-Herstellung

Es wird zuerst das Diazoniumsalz hergestellt, indem man eine Aufschlämmung oder Lösung von 8,5 mmol des Amins in 60 ml 3 N HCl auf 5ºC abkühlt. Natriumnitrit (0,70 g, 10,15 mmol) in 5 ml Wasser wird dann zugetropft. Nach 30 min Rühren wird die Mischung zu einer kalten (-25ºC) Mischung von 8,5 mmol des Hydrazons in 120 ml von 1:1 (V/V) DMF-Pyridin getropft. Während der Zugabe läßt man die Temperatur der Reaktion nicht über -15ºC ansteigen. Unter 2 h Rühren läßt man die Temperatur der Mischung auf Raumtemperatur ansteigen. Nach Abf iltrieren erhält man das Formazan als schwarzen Feststoff. Verunreinigungen können durch wiederholtes Waschen mit Methanol oder durch Halten des Feststoffs in am Rückfluß siedendem Methanol und Heißfiltration beseitigt werden.

Tetrazoliumsalz-Herstellung

Eine Aufschlämmung von 1,5 mmol des Formazans wird mit 20 ml Essigsäure und 4 ml Isoamylnitrit 16 bis 48 h lang gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, um das Tetrazoliumsalz zu ergeben. In Fällen, in denen das Salz nicht niedergeschlagen werden konnte, verursachte eine Verdünnung mit Ether dessen Ausfällung.

B. Herstellung von Reagensstreifen

Jeder Indikator wurde in einen Reagensstreifen eingebracht und mit einer Lösung getestet, die eine bekannte Menge an Glucose, Cholesterol oder NADH enthielt. Der Reagensstreifen besteht aus einem Griff aus Polystyrol, worauf eine einzelne Reagens-Unterlage fest angeordnet ist. Die Reagens- Unterlage war ein Quadrat von 0,5 cm x 0,5 cm (0,2 x 0,2") und enthält Reagentien, die eine Farbänderung ermöglichen, die instrumentell abgelesen wurde, als eine entsprechende Teilmenge einer Probe mit dem entsprechenden Analyt aufgebracht wurde. Die Trockenphasen-Reagens-Unterlage ist ein fester Träger aus beispielsweise Cellulosefasern oder einer Nylon-Membran. Die Reagens-Unterlage wurde zuerst mit einer Lösung des Tetrazoliumsalzes von Interesse (0,8 M/l) und Detergens (0,3 %) in einem Lösungsmittel wie Methanol imprägniert. Die zweite Lösung zur Imprägnierung der Reagens- Unterlage enthält die folgenden Komponenten:

Glucose-Streifen

Glucose-Dehydrogenase (GDH) 0,8 E/l
Diaphorase (DPH) 0,8 E/l
NAD 0,03 Mol/l
PIPES-Puffer 0,15 Mol/l
Detergens 0,5 %

Cholesterol-Streifen

Cholesterol-Dehydrogenase (CDH) 0,3 E/l
Cholesterol-Ester-Hydrolase (CEH) 0,6 E/l
Diaphorase 0,3 E/l
NAD 0,4 Mol/l
PIPES-Puffer 0,2 Mol/l
Detergens 1 % V/V
Ca. 0,01 ml verschiedener Test-Lösungen (Serum, Plasma, wäßrig), enthaltend mindestens fünf verschiedene Analyt-Konzentrationen zwischen und 33 mM, wurden auf das Zentrum der getrockneten Reagens-Unterlage aufgebracht. Nach einem Zeitablauf von ca. 60 s wurden die Reflexionsspektren eines jeden Indikators bei Inkrementen von 5 nm über den Wellenlängenhereich von 400 bis 1100 nm gemessen:

C. Gebrauchsdaten

Es folgt eine Tabelle mit spektralen und weiteren analytischen Daten, betreffend verschiedene synthetisierte Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung sowie verschiedene synthetisierte Vergleichsbeispiele. Die Verbindungen sind durch die allgemeine Formel (A) dargestellt:
Die Verbindungen sind der Reihe nach aufgeführt, und zwar gemäß der Form des. jeweiligen Benzthiazolyl-Rests, dann gemäß ihrem R&sup6;-Substituent und schließlich gemäß ihrem R&sup5;-Substituent.
Beispielsweise ist die erste Verbindung unter A.1.a) angegeben, und weist die Formel A auf, worin alle Substituenten R¹ bis R&sup4; Wasserstoff (unter Bildung eines unsubstituierten Benzthiazolyl-Rings), R&sup6; 4-Nitrophenyl und R&sup5; 4-Acetamidophenyl sind; die zweite Verbindung A.1.b) weist denselben Benzthiazolyl-Rest und denselben R&sup6;-Substituent wie Verbindung A.1.a) auf, wobei aber R&sup5; Phenyl ist; usw.
Beim Reflexionsspektrum der Tetrazoliumsalze wird davon ausgegangen. daß es von der Umgebung abhängig ist, in der es beobachtet, aufgenommen oder gemessen wird. Für Vergleichszwecke zwischen einzelnen Tetrazoliumsalzen schließen die unten angegebenen Daten eine Messung der relativen Flachheit des flachsten Teilbereichs des Reflexionsspektrums bei Wellenlängen von oberhalb 600 nm ein, wobei das Spektrum mit einem Glucose- oder Cholesterol-Reagensstreifen aufgenommen ist, die gemäß obigem Teilabschnitt B hergestellt sind. Die relative Flachheit des Spektrum ist in den Daten bzw. Meßergebnissen K/S-Einheiten ausgedrückt bzw. angegeben, die bezüglich der Gehaltsmenge an nachgewiesenem Analyt normalisiert sind, wie im folgenden definiert.
K/S ist durch die Gleichung definiert:
(1-R)²/2R
worin R instrumentell abgelesene Einheiten der Reflexionswerte sind. Eine Prozentänderung bei K/S ist die Anderung, ausgedrückt als ein Prozentsatz über einen Bereich von 50 nm, dividiert durch den Durchschnittswert der hohen und niedrigen K/S-Werte über diesen Bereich.
Die Plateau-Eigenschaft der vorliegenden Erfindungen sollte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als eine Prozentänderung im Reflexionsspektrum (auf Basis von im vorstehenden Abschnitt definierten KS- Werten) von weniger als ca. 17 % über eine Wellenlängenspanne von 30 bis 50 nm, beginnend bei einer Wellenlänge oberhalb ca. 600 nm, verstanden sein. Die bevorzugteren Verbindungen weisen ein Plateau mit einer Prozentänderung in K/S von weniger als ca. 10 % über eine Wellenlängespanne von 50 nm auf. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Tetrazoliumsalz- Indikatoren, die eine Prozentänderung in K/S von ca. 5 % oder weniger über eine Wellenlängenspanne von 50 nm aufweisen. Verbindungen, die ein mehr geneigtes Reflexionsspektrum ergeben, sind dennoch bevorzugt solange der flachste Teilbereich bei Wellenlängen oberhalb 650 nm, vorzugsweise oberhalb 675 nm, liegt.
Bezüglich der Zeichnungen, zeigen Figur 1 bis 4 die Reflexionsspektren der Formazane, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT und NBT des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind. Zum Vergleich zeigen Figuren 5 bis 10 die entsprechenden Spektren für ausgewählte Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Das Vorliegen eines Plateaus in den Spektren der Formazane aus den vorliegenden Verbindungen und das entsprechende Fehlen bei denjenigen der Formazane aus den Verbindungen des Standes der Technik sind unmittelbar ersichtlich.
Die vier oben genannten Verbindungen des Standes der Technik ergeben Prozentänderungen in K/S über den Wellenlängenbereich von 650 bis 700 nm wie folgt:
INT 71 %
MTT 178 %
NBT 73 %
USSR 28 %
Je niedriger der entsprechende Prozentwert beim K/S-Wert für das Formazan, desto toleranter ist das Tetrazoliumsalz bezüglich Abweichungen bei der Zentralwellenlänge des zur Messung der Reflexion und somit zur Messung der Analyt-Konzentration verwendeten optischen Systems.
Die folgenden nicht-standardisierten Abkürzungen werden im nachfolgenden Text verwendet:
"UV" - Die Wellenlänge in Nanometern des Maximum-Reflexionspeak im UV- Reflexionsspektrum des Formazans. Der Extinktionskoeffizient und das bei der Messung verwendete Lösungsmittel sind in Klammer angegeben.
"nm" - Die Position des flachsten Teilbereichs des Reflexionsspektrums des Formazans über eine Wellenlängenspanne von 50 nm (angegeben als die beginnenden und endenden Wellenlängen in Nanometern)
"K/S" - Die Prozentänderung bei K/S-Einheiten über den oben genannten flachsten Teilbereich von 50 nm des Reflexionsspektrums. Die Konzentration an zur Erzeugung des Reflexionsspektrums verwendeten Analyt ist in Klammern angegeben. mmol betrifft die Konzentration in mmol/l.

Tabelle

Im folgenden ist eine Aufstellung der Verbindungen angegeben, deren Reflexionsspektren in Figuren 5 bis 10 der Zeichnungen gezeigt sind. Deren abgekürzte Bezugsnummer und Anordnung in der folgenden Tabelle, sind in Klammern vor den Verbindungsnamen angegeben.

Claims

1. 2-Benzthiazoltetrazoliumsalze,die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:

2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(8-chinolyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-nitrophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(2-methyl-4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-chlor-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-fluorphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)- 5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4,5- trimethoxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-(6-Carboxybenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxy-4-carboxyphenyl-5-[4-(2- (2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-acetamidophenyl)-5-(methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(8-chinolyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5- phenyltetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)-5-[4-(2',3'- dihydroxypropylthio)phenyl]tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-carboxyphenyl)-5-[4-(2-(2-(2- hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-carboxphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-nitrophenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz und aus

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-cyanophenyl)-5-(3-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz.

2. Verfahren zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, wobei man eines oder mehrere der Tetrazoliumsalze gemäß Anspruch 1 in ein Medium einbringt, von dem anzunehmen ist, daß es die reduzierende Substanz enthält, und man das Vorhandenseit der reduzierenden Substanz durch eine Farbänderung im Tetrazoliumsalz bestimmt.

3. Verwendung der Verbindungen geinäß Anspruch 1 zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, vorzugsweise von NADH.

4. Reagens zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, welches eine oder mehrere der Verbindungen gemäß Anspruch 1 enthält.

5. Teststreifen zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, welcher eine oder mehrere der Verbindungen geinäß Anspruch 1 aufweist.