DE69128180T2 - Substituierte 2-Thiazolyl-tetrazolium-Salze als Indikatoren - Google Patents

Substituierte 2-Thiazolyl-tetrazolium-Salze als Indikatoren

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Tetrazoliumsalz- Indikatorverbindungen zur Bestimmung reduzierender Substanzen, insbesondere von Nikotinamidadenindinucleotid (NADH).
  • Tetrazoliumalze sind als chromogene Indikatoren gut bekannt, die auf reduzierende Substanzen reagieren. Bei Reduktion werden Tetrazoliumsalze in Formazan-Farbstoffprodukte überführt. Diese Indikatoren haben breite Anwendung auf verschiedenen Gebieten, insbesondere in der medizinischen Diagnostik, gefunden, wo sie u.a. zur zellfärbung und Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten wie Urin, Milch, Serum und Plasma angewandt wurden. Im allgemeinen beinhaltet die Bestimmung von Körperflüssigkeitsanalysten eine NAD-abhängige enzymatische Reaktion, wobei NADH in Abhängigkeit der in der getesteten Probe vorhandenen Analytmenge gebildet wird. Die erzeugte NADH- Menge kann dann durch die reduktive Überführung eines geeigneten Tetrazoliumsalz-Indikators in sein Formazan-Farbstoffprodukt ermittelt bzw. bestimmt werden.
  • Auf dem Gebiet medizinischer Diagnosetestverfahren sind Tetrazoiumsalz-Indikatoren in vielen verschiedenen Produkttypen verwendbar. Ein besonderer Typ ist der Reagensstreifen. Dieses Produkt ist eine im Festzustand vorliegende Vorrichtung aus einer Papier- oder sonstigen porösen Trägermatrix, die mit chemischen Reagentien, die auf einen besonderen Analyt, z.B. Glucose oder Cholesterol, reagieren, imprägniert oder auf sonstige Weise beaufschlagt ist. Das eingebrachte Reagenssystem schließt einen chromogenen Indikator ein, der eine Farbe oder Farbänderung in Abhängigkeit der Analytmenge entwickelt, die in einer Probe vorliegt, die auf die Matrix aufgebracht wird. Die sich ergebende kolorimetrische Reaktion kann visuell betrachtet werden, um qualitative oder halb-quantitative Ablesungen zu ermöglichen. Quantitative Ergebnisse sind erhältlich, indem man die Reflektion der Matrixoberfläche bei einer oder mehreren definierten Wellenlängen mit einem geeigneten Gerät (Reflektionsmeßgerät) abliest.
  • Es besteht ein anerkanntes Bedürfnis zur Entwicklung von Tetrazolium- Indikatoren, die ein starkes Absorptionsvermögen bei längeren Wellenlängen als die Absorptionswerte der hauptsächlichen Störquellen aufweisen, die in der Testprobe vorhanden sein bzw. vorliegen können. Beispielsweise betrifft dies insbesondere die Störung aus einer Hämoglobin-Färbung, wenn die Probe Vollblut ist. Indikatoren, die eine signifikante Absorption oberhalb ca. 640 nm aufweisen, sind erforderlich, um eine Hämoglobin-Störung im wesentlichen zu überwinden. Die gewöhnlich eingesetzten Tetrazoliumsalz- Indikatoren sind 2-(4-Jodphenyl)-3-(3-nitrophenyl)-5- phenyltetrazoliumchlorid (INT), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumchlorid (MTT) und 2,2',5,5'-Tetraphenyl-3,3'-(3,3'- dimethoxy-4,4'-diphenylen)ditetrazoliumchlorid (NBT). Diese Verbindungen zeigen maximale Absorption (UVmax) im Bereich von 465 bis 605 nm.
  • Ein weiterer Mangel der herkömmlich verwendeten Tetrazoliumsalz- Indikatoren des Standes der Technik betrifft die Entwicklung der Instrumentierung, die gebraucht wird&sub1; um deren kolorimetrische Reaktion zu messen. Es werden rasche Fortschritte bei der Entwicklung kleinerer, weniger aufwendiger Reflektionsmessgeräte erzielt. Eine der teureren Komponenten derartiger Meßgeräte ist das optische System, das eine Lichtquelle, einen Filter oder ein sonstiges Spektralelement zur Auswahl oder Begrenzung der Wellenlänge von einfallendem oder reflektierten Licht sowie einen Sensor umfaßt. Deutliche Kosteneinsparungen könnten bewerkstelligt werden, indem man Funktionen der optischen Systemelemente wegläßt oder zusammenfaßt, oder indem man weniger teure Komponenten verwendet, z.B. LEDs als Belichtungsquellen. Allerdings emittieren handelsübliche LEDs Licht, das eine Zentralwellenlänge aufweist, die aufgrund von Herstellvarianten und Temperaturabhängigkeit deutlich schwanken kann. Die herkömmlich verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren INT, MTT und NBT weisen Reflektionsspektren auf, die im Bereich oberhalb ihrem UVmax stark geneigt sind bzw. abfallen. Daher können, wenn man nicht jeweils sowohl jedes Gerät zum Abgleich der in der LED von kommenden Herstellvarianz als auch jeden Testlauf zum Abgleich der Temperaturschwankung kalibriert, große Fehler bei den Assayergebnissen eingeschleust werden.
  • Im folgenden werden repräsentative Beispiele der einschlägigen technischen Lehre des Standes der Technik aufgeführt, welche die Verwendung verschiedener Tetrazoliumsalze in der kolorimetrischen Analyse betreffen. Tanaka et al, JP 61000084 (Chem. Abst. 104:203469y), beschreiben den Nachweis von Glucose unter Verwendung eines Formazan-Chelat, erhalten durch die Reduktion von 2-(2-Benzothiazolyl)-3-(carboxyphenyl)-5-phenyl-2H- tetrazoliumhalogenid in Gegenwart von Nickel (II). Limbach et al, DE 3 247 894 (Chem. Abst. 101:125929v), betreffen die Verwendung von INT in Glucose- Assayverfahren. Rittersdorf et al, DE 2 147 466, beschreiben die Verwendung von sieben 2-(2-Benzothiazolyl)-3-phenyl-5-(4- (trimethylammonio)tetrazoliumsalzen bei der Bestimmung reduzierender Substanzen wie reduzierender Zucker, von Ascorbinsäure und Ketosteroiden.
  • Es wird nun die in der Literatur bekannte Vielzahl von 2-Thiazolyl- Tetrazoliumsalzen und/oder ihrer entsprechenden Formazane abgehandelt. Serebryakova et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. 10:1403-1405 (1970), beschreiben die Synthese und chromatischen Eigenschaften von Benzothiazolyl- 3-phenyl(methyl)-5-p-nitro(dimethylamino)phenylformazanen. Die Autoren stellen fest, daß sowohl eine Elektronen-abziehende Nitrogruppe in der p- Position des 5-Phenylrests als auch eine Benzothiazolyl-Gruppe in der 1- Position eine bathochrome Verschiebung ergeben. Lipunova et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. (1971) 831-835, vergleichen den bathochromen Effekt einer 5-Naphthyl-, oder o-Tolyl-Gruppe auf das sichtbare Spektrum von N-1- Benzothiazolylformazanen. Johne et al, Pharmazie 34:790-794 (1979), beschreiben die Verbindungen 1-(4-Methyl-5-carbethoxythiazol-2-yl-3-(3- pyridyl)-5-(2-carboxyphenyl)formazan und 1-(4-Methyl-5-carbethoxythiazol-2- yl-3-(2-pyridyl)-5-(2-carboxyphenyl)formazan.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Thiazolyl-Tetrazoliumsalze bereit, die bei Reduktion Formazane ergeben, die neue und verbesserte optische Eigenschaften aufweisen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen die allgemeine Formel (A) auf:
  • worin R¹ ein Di- oder Trifluoralkylrest, worin die Fluor-Substituenten sich an dem Kohlenstoffatom befinden, das benachbart zum Thiazolyl-Rest der Formel vorliegt, und R² Chlor sind, und worin R³ ausgewählt ist aus:
  • worin Q eine Bindung oder -CH=CH- ist, worin
  • (i) y¹ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthiorest, Halogen oder Wasserstoff,
  • Y² ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sufonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureidorest,
  • Y³ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-,Sulfo-, Sufonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureidorest und
  • Y&sup4; ein Alkoxyrest, Halogen oder Wasserstoff sind, oder
  • (ii) Y² und Y³ zusammen einen Methylendioxy- oder Imidazo-Ring bilden und Y¹ und Y&sup4; Wasserstoff sind, sowie aus einem
  • (b&sub1;) 2-, 3- oder 4-Pyridyl-,
  • (c&sub1;) 2- oder 3-Thienyl- und aus einem
  • (d&sub1;) 2- oder 3-Furanyl-Rest;
  • und worin schließlich R&sup4; ausgewählt ist aus:
  • worin Y&sup5; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro- oder Ureidorest,
  • Y&sup6; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder Ureidorest,
  • Y&sup7; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxl-, Cyano-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, oder Ureidorest und
  • Y&sup8; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Akyl-, Halogen-, Wasserstoff- oder Nitrorest sind, sowie aus:
  • worin Y&sup9; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylsulfo-, Sulfonamido-, Sulfo-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder Ureidorest ist,
  • (c&sub2;) einem 2-, 4-, 6- oder 8-Chinolyl- oder einem 2-Methylchinolyl- Rest und aus einem
  • (d&sub2;) Anthranyl-Rest;
  • und worin X ein Gegenanion ist,
  • mit der Maßgabe, daß
  • jede der Alkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, und daß
  • jede Arylgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Phenyl-, Naphthyl-, Pyridyl-, Oxazolyl-, Chinolyl-, Thiazolyl-, Thienylund einem Furanylring, und daß ferner
  • die Verbindungen dadurch gekennzeichnet sind, daß die Reflektionsspektren, die von jeder der genannten Verbindungen geliefert werden, bei deren Reduktion zu ihrem gefärbten Formazan-Zustand, um weniger als 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm bei Wellenlängen von 600 nm oder oberhalb davon schwanken.
  • Die Figuren 1 bis 4 zeigen die Reflektionsspektren der Formazane, erzeugt bei Reduktion der zum Stand der Technik gehörenden Tetrazolilumsalze INT, MTT, NBT und 2-(Benzothiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-phenyl- Tetrazoliumsalz (USSR) bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose.
  • Fig. 5 bis 9 zeigen die entsprechenden Spektren für die Formazane aus besonderen Indikatorverbindungen der vorliegenden Erfindung (siehe Liste am Anfang der in den Beispielen angegebenen Tabelle).
  • Die folgenden Definitionen geben den jeweiligen Offenbarungsinhalt an:
  • "C&sub1;&submin;&sub4;"- zur Einschränkung eines Restes, z.B. eines C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrestes auf diejenigen Formen, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome einschließlich enthalten.
  • "Alkyl" - lineare und verzweigte Kohlenwasserstoffreste der allgemeinen Formel CnH2n+1, vorzugsweise "Niedrigalkyl" wie die C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylreste des Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- und t- Butylrestes&sub1; sowie höhere Alkylreste wie einen n-Pentyl-, n-Hexyl- und ähnlichen Rest.
  • "Alkoxy" - den Rest -OR, worin R ein Alkylrest ist.
  • "Alkylamido" - den Rest -NRC(=O)R', worin R und R', gleich oder verschieden, Alkylreste sind.
  • "Alkylthio" - den Rest -SR, worin R ein Alkylrest ist.
  • "Amido" - den Rest -NHC(=O)H.
  • "Amino" - den Rest -NRR', worin R und R', gleich oder verschieden, Wasserstoff oder Alkylreste sind.
  • "Aryl" - organische Reste, abgeleitet aus einem aromatischen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring oder Ringsystem durch Entfernung eines an einen solchen Ring oder das Ringsystem gebundenen Wasserstoffatoms, z.B. einen Phenyl-, Naphthyl-, Pyridyl-, Oxazolyl-, Chinolyl-, Thiazolyl-, Thienyl-, Furanyl- und ähnlichen Rest.
  • "Arylamido" - den Rest -NRC(=O)R', worin R und R' gleiche oder verschiedene Arylreste sind
  • "Aryloxy" - den Rest -OR, worin R ein Arylrest ist.
  • "Arylthio" - den Rest -SR, worin R ein Arylrest ist.
  • "Carbalkoxy" - den Rest -C(=O)OR, worin R ein Alkylrest ist.
  • "Carbaryloxy" - den Rest -C(=O)OR, worin R ein Arylrest ist.
  • "Carbamoyl" - den Rest -C(=O)NRR', worin R und R', gleich oder verschieden, Wasserstoff oder Alkylreste sind.
  • "Carboxyl" - den Rest -C(=o)OH.
  • "Halo" - Fluor, Chlor und Brom.
  • "Imidazo" - den zweiwertigen Rest -N=CH-NH-.
  • "Methylendioxy" - den zweiwertigen Rest der Formel -O-CH&sub2;-O-.
  • "Phenylazo" - den Rest -N=N-Phenyl.
  • "Styryl" - den Rest -CH=CH-R, worin R ein Arylrest ist.
  • "Sulfo" - den Rest -SO&sub3;.
  • "Sulfamido" - den Rest -NRSO&sub2;R', worin R und R', gleich oder verschieden, ein Alkyl-, Arylrest oder Wasserstoff sind.
  • "Sulfamoyl" - den Rest -SO&sub2;NRR', worin R und R', gleich oder verschieden, ein Alkyl-, Arylrest oder Wasserstoff sind.
  • "Trialkylammonio" - den Rest -NR&sub3;&spplus;, worin R ein Alkylrest ist.
  • "Ureido" - den Rest -NRC(=O)NR', worin Rund R', gleich oder verschieden, ein Alkyl-, Arylrest oder Wasserstoff sind.
  • Es sollte klar sein, daß, wenn nichts anderes in besonderer Weise angegeben ist, die Verwendung der obigen Begriffe im Fall von Resten, die substituert oder unsubstituert sein können, z.B. von Alkyl-, Aryl-, Phenylazo- und Styrylresten, die in vernünftiger Weise substituierten Formen derartiger Reste und auch deren unsubstituierte Formen einschließen soll. Vernünftige bzw. sachgerechte Substitutionen, die geeignete Verbindungen der vorliegenden Erfindung ergeben, sind für den auf dem einschlägigen Gebiet tätigen Durchschnittsfachmann ohne weiteres und unmittelbar erkennbar und schließen solche Substituenten, ohne Einschränkung, wie Alkoxy-, Amino- , Alkylthio-, Carbalkoxy-, Carboxy-, Hydroxy-, Sulfo- und Sulfamoylreste, um nur einige zu nennen, ein.
  • Bevorzugte R¹- und R²-Reste
  • Vom Standpunkt der Synthese und Reflektionsspektrumeigenschaften des Formazans sind bevorzugte Verbindungen diejenigen, worin (a) R¹ ein Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxyrest und R² ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest oder Chlor oder (b) R¹ ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl- oder Phenylrest und R² ein Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxyrest oder (c) R¹ ein Di- oder Trifluormethylrest und R² Chlor sind. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Verbindungen, in denen R¹ ein Di- oder Trifluormethylrest und R² Chlor sind.
  • Bevorzugte R³- und R&sup4;-Reste
  • Vom Standpunkt der Synthese und Reflektionsspektrumeigenschaften des Formazans ist R³ vorzugsweise ausgewählt aus:
  • (a&sub1;) Resten der Formel E:
  • worin
  • (i) Y², Y³ und Y&sup4; jeweils ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest sind,
  • (ii) Y&sup4; Wasserstoff und Y² und Y³ beide ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest sind oder zusammen einen Methylendioxy-Ring bilden, oder
  • (iii) Y² und Y&sup4; beide Wasserstoff und Y³ ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, Alkylthio-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin; &sub4;)-alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Tri(C&sub1;&submin;&sub4;)- alkylammonio- oder ein Ureidorest sind, und aus einem
  • (b&sub1;) 2- oder 3-Thienylrest.
  • Auf Basis der Eigenschaften und Synthese der hergestellten Verbindungen ist es am meisten bevorzugt, daß R³ ausgewählt ist aus:
  • 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4-Acetamidophenyl, 4-Methylthiophenyl, 4-Phenyl, 4-Halophenyl, 4-Cyanophenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Thienyl und aus 3-Thienyl.
  • Die bevorzugten R&sup4;-Reste sind:
  • (a&sub2;) Reste der obigen Formel (a&sub2;), worin
  • (i) Y&sup5; Wasserstoff und jeder Rest Y&sup6;, Y&sup7; und Y&sup8; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest sind,
  • (ii) Y&sup5; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup6; und Y&sup7; beide ein C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxyrest sind oder zusammen einen Methylendioxy-Ring bilden,
  • (iii) Y&sup5;, Y&sup6; und Y&sup8; jeweils Wasserstoff und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- oder ein Ureidorest sind,
  • (iv) Y&sup5; ein Alkoxy- oder Alkylrest, Y&sup6; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylazo- oder ein Ureidorest sind,
  • (v) Y&sup5; und Y&sup8; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyreste sind, oder
  • (vi) Y&sup5; und Y&sup8; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyreste und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido- oder Benzamidorest sind;
  • (b&sub2;) Reste der obigen Formel (b&sub2;), worin Y&sup9; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido- oder ein Ureidorest ist, und
  • (c&sub2;) der 8-Chinolyl-Rest.
  • Auf Basis der Eigenschaften und Synthese der hergestellten Verbindungen ist es am meisten bevorzugt, daß R&sup4; ausgewählt ist aus:
  • 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 2,4-Dimethoxyphenyl, 3,4- Methylendioxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4-Acetamidophenyl, 4- Methylthiophenyl, 4-Carboxyphenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Methoxyphenyl, 2- Methoxy-4-carboxyphenyl, 2,5-Dimethoxyphenyl, 2,5-Dimethoxyphenyl-4- benzamidophenyl, 1-Naphthyl, 4-Nitro-1-naphthyl, 4-Methoxy-1-naphthyl, 8- Chinolyl, 2-Methyl-4-carboxyphenyl, 4-Carbmethoxyphenyl, 4-Cyanophenyl und aus 4-Cyano-1-naphthyl.
    • Gegenanion
  • Die Auswahl des Gegenanions beruht vorrangig auf Überlegungen hinsichtlich der Stabilität und Löslichkeit des besonderen Tetrazoliumsalzes von Interesse. Im allgemeinen kann man auswählen aus solchen Gegenanionen wie den anorganischen Anionen Chlorid, Bromid, Jodid, Nitrat, Fluorborat, Perchlorat und Sulfat sowie aus organischen Anionen wie einem Acetat, Oxalat, Tartrat und aus Arylsulfonaten (Benzolsulfonat, Tosylat).
    • Synthetische Verfahren
  • Tetrazoliumsalze werden gemäß in der Literatur gut bekannter Verfahren hergestellt (Hooper, W.D., Rev. Pure and Appl. Chem., 1969, 19, 221; Putter, R., in Methoden der organischen Chemie, Houben-Weyl-Müller Ed., Thieme Verlag: Stutgart, 1965, Bd. 10/3, 5. 633; Nineham, A.W., Chem. Rev., 1955, S. 355-483). Im allgemeinen werden die Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man zuerst ein 2-Hydrazinothiazol mit einem Aldehyd reagieren läßt und dann das entstandene Hydrazon mit einem diazotierten Anilin behandelt. Das entstandene Formazan wird dann gemäß gut bekannter Verfahren zum Tetrazoliumsalz oxidiert. Demgemäß schließt die Synthese drei grundsätzliche Ausgangsmaterialien ein, den Aldehyd, das Anilin und das 2-Hydrazinothiazol. Aldehyd 2-Hydrazinothiazol Hydrazon diazotiertes Anillin Formazan Tetrazoliumsalz
    • Herstellung von 2-Hydrazinothiazol
  • Die Chlorierung des bekannten 2-Chlor-4-methylthiazol (J.Chem.Soc.1919, S.1071-1090) führt bei 100ºC hauptsächlich zum 2,5- Dichlor-4-dichlormethylthiazol (6) und bei 160ºC zum 2,5-Dichlor-4trichlormethylthiazol (1).
  • 4-Carbalkoxy-5-chlorthiazol wird durch Hydrolyse von 2,5-Dichlor-4- trichlormethylthiazol (1) hergestellt, um die Carboxylsäure (2) zu ergeben (EP 348 735).
  • Die Behandlung mit Reagentien wie mit Thionylchlorid ergibt das Säurechlorid, das mit Alkoholen oder Ammen reagiert, um 4-Carbalkoxy-(3) oder N-Alkylcarbamoylthiazole (4) zu ergeben. Abspaltung von Wasser aus der Carbamoylgruppe von 4-Carbamoyl-2,5-dichlorthiazol wird gemäß in der Literatur bekannter Verfahren durchgeführt, um 4-Cyano-2,5-dichlorthiazol (5) zu ergeben. (March, J., Advanced Organic Chemistry Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 932-933).
  • Bei der Herstellung von 4-Di- und 4-Trifluormethyl-5-chlor-2- hydrazinothiazolen werden die Zwischenproduktverbindungen 4-Dichlormethyl- 2,5-dichlorthiazol (6) bzw. die Trichlormethyl-Verbindung (1) verwendet. Die Behandlung einer jeden Verbindung mit Fluorwasserstoff ergibt die Fluormethylverbindungen (7 und 8), welche bei Umsetzung mit Hydrazin die 2- Hydrazin-Derivate ergeben.
  • Die Thiazole 4-Alkyl- oder 4-Aryl-5-carbalkoxy- oder -amido- oder die Cyano-2-substituierten Thiazole werden durch Halogenierung der entsprechenden β-Ketoester-, Amid- oder Nitril-Verbindungen und durch Weiterreaktion mit Thioharnstoff oder Thiosemicarbazon hergestellt (Metzger, J:V., in Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Katritzky, A.R., Rees, C.W., ed.; Peragamon: New york, 1985; Vol 6, Teil 4, S. 297; Beyer, H., Bulka, E., Z. Chem., 1962, 2, 321-328).
  • R¹ = CO&sub2;R³
  • CONR³R&sup4;
  • CN, Aryl, Alkyl
  • R² = Alkyl, Aryl
    • Herstellung von Aldehyden
  • Die Aldehyde sind im Handel erhältlich oder können gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden.
  • Beispielsweise können Aldehyde durch benzylische Oxidation eines Arylmethans (March, J., Advances Organic Chemistry Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985; S. 1079) oder durch Reduktion eines Arylsäurechlorids (ibid. S. 396) oder eines Arylsäurederivats hergestellt werden (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH; New York, 1989; S. 604-605).
  • Arylhalogenide können ebenfalls zur Sypthese der Aldehyde verwendet werden. Bei diesem Verfahren ergibt eine Transmetallierungsreaktion eine arylmetallische Species, die mit einer Reihe von Reagentien, wie Dimethylformamid, zur Erzeugung des Aldehyds behandelt werden kann (ibid, S. 681- 683).
  • Die vorgenannten Arylaldehyde-, -säuren, -methane und -halogenide können mit einer Reihe funktioneller Gruppen vor ihrer Überführung in Tetrazoliumsalze derivatisiert werden. Dies kann durch aromatische nukleophile Substitution (March, J., Advanced Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985; S. 576-607), durch aromatische elektrophile Substitution (ibid., S. 447-511) oder durch Heteroatom-gesteuerte Metallierungsreaktionen (Gschwend, H.W., Rodriguez, H.R., in Organic Reactions, John Wiley and Sons: New York, 1979; Vol 26, 1) durchgeführt werden.
  • In Fällen, in denen der Aldehyd-Teil des Tetrazoliumsalzes einen Phenol- oder Aminrest aufweist, müssen die Gruppen so geschützt werden, daß keine Reaktion zwischen diesen und dem diazotierten Anilin oder mit dem oxidierenden Reagens stattfinden, welche zur Herstellung des Tetrazoliumsalzes verwendet werden.
  • Dies kann bewerkstelligt werden, indem man einen Hydroxyarylaldehyd als ein Acetat schützt, die Reaktionsabfolge zur Herstellung des Formazans durchführt und dann das Acetat bei pH 10 hydrolysiert. Ansäuerung auf pH 5 und anschließende Filtration ergeben das gewünschte Formazan.
  • Läßt man das entstandene Phenol-Formazan mit einem oxidierenden Agens bei der Tetrazoliumsalz-Herstellung reagieren, kann der Phenolrest mit einer Säure-labilen Gruppe wie Dihydropyran geschützt werden (Greene, T.W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons: New York; 1981, S. 87-113), wobei die Schutzgruppe dann durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen entfernt wird.
  • In ähnicher Weise müssen Aminreste am Aldehyd-Teil zur Verhinderung ihrer Reaktion geschützt werden. Dies wird am besten durch Verwendung eines säure-labilen Carbamats bewerkstelligt (ibid., S. 218-247), welches später durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen entfernt wird.
    • Herstellung von Arylaminen
  • Arylamine können durch Reduktion der entsprechenden Nitro- oder Azidverbindung (Larock, P.C., Comprehensive Organic Transformation;VCH: New York, 1989; S. 412-415 oder 409-410), durch Reaktion zwischen einer arylmetallischen Verbindung und einem elektrophilen Stickstoffreagens (ibid., S. 399-400) oder durch Umlagerung von Acylaziden oder oxidierten Amiden (ibid., S. 431-432) hergestellt werden.
  • Wie im Fall der Aldehyde, können elektrophile und nukleophile aromatische Substitutionsreaktionen angewandt werden, um verschiedene funktionelle Gruppen in das Arylamin oder eine entsprechende synthetische Vorstufenverbindung einzuführen.
    • Verwendung der Verbindungen
  • Die hauptsächliche Verwendung der Tetrazoliumsalzverbindungen der vorliegenden Erfindung betrifft deren Einsatz als chromogene Indikatoren zum Nachweis reduzierender Substanzen. Insbesondere eignen sich die vorliegenden Verbindungen in vorteilhafter Weise zum Nachweis von NADH. Insofern eignen sich, da NADH in Enzym-katalysierten Nachweisreaktionen, die spezifisch für verschiedene biochemische Substanzen sind, erzeugt wird, die vorliegenden Verbindungen besonders für medizinische Diagnosetestverfahren. Allerdings können ganz allgemein weitere reduzierende Substanzen ebenfalls nachgewiesen werden, wie Schwefelwasserstoffgas, Diboran, Arsenhydrid oder Phosphorhydrid. Bei den vorliegenden Verbindungen ist insbesondere herausgefunden worden, daß sie ein ausgedehntes Plateau in ihrem Reflektionsspektrum oberhalb ca. 600 nm aufweisen. Die am meisten bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen ein Plateau oberhalb ca. 650 nm auf (d.h., der flachste, ca. 50 nm breite Bereich beginnt zwischen 640 und 600 nm). Ein solches Reflektionsplateau überträgt eine bessere Genauigkeit auf analytische Testverfahren auf Basis der Messung des Reflektionsvermögens aus einem Reagensstreifen.
  • Reagensstreifen sind im Stand der Technik als analytische Vorrichtungen bekannt, die eine Feststoff-Trägermatrix aufweisen, die mit einer Testzusammensetzung beaufschlagt ist, die wiederum eine Farbänderung in Reaktion auf Kontakt mit einer Flüssigtestprobe erzeugt, die das Analyt von Interesse enthält. Eine solche Testzusammensetzung umfaßt, im Fall der vorliegenden Erfindung, (a) ein Reagens oder Reagentien, die mit dem Analyt reagieren, um eine reduzierende Substanz zu erzeugen, sowie (b) ein 2-Thiazolyltetrazoliumsalz, wie es hier beschrieben ist, welches mit einer derartigen reduzierenden Substanz reduzierbar ist, um ein chromogenes Formazan-Farbstoffprodukt zu ergeben. Die Farbreaktion solcher Reagensstreifen kann visuell betrachtet werden, um halb-quantitative Werte zu ergeben, allerdings werden auch quantitative Ergebnisse erhalten, indem man das Reflektionsverhalten der Trägermatrix bei einer bestimmten wellenlänge mißt. Solche Messungen beinhalten die Bestrahlung der zur Rekation gebrachten Trägermatrix mit einer Lichtquelle sowie die sensorische Ermittlung der Reflektion der Trägermatrix durch Messung des reflektierten Lichts mit einem Detektorelement.
  • Das Auffinden vn Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die ein Reflektionsplateau aufweisen, wird in besonders vorteilhafter Weise angewandt, wenn die Reflektion aus einem Reagensstreifen mit einem Gerät abgelesen wird, das Schwankungen in der Zentralwellenlänge seines optischen Systems unterworfen ist (der Kombination von Lichtquelle, Detektorelement, Spektralsteuerelementen, z.B. Filtern, sowie weiterer Komponenten). Die Schwankungen in der Zentralwellenlänge des optischen Systems können durch eine Reihe von Faktoren verursacht sein, beispielsweise einer Schwankung im Zentralwellenlängenbereich des hauptsächlichen Spektralsteuerelements wie der Belichtungsquelle oder der Filter. Werden beispielsweise Licht-emittierende Dioden (LEDs) als die Lichtquelle verwendet, schwankt die Wellenlänge des emittierten Lichts in typischer Weise um ± 4 nm innerhalb eines Geräts und um bis zu ± 8 nm zwischen LEDs in anderen Geräten, aufgrund von Herstellvarianzen. Ausserdem unterliegen LEDs auch aufgrund von Temperatureffekten einer Schwankung der Zentralwellenlänge. Werden Breitbandlichtquellen mit Filtern verwendet, um eine Spektralsteuerung der Zentralwellenlänge zu ergeben, liegt die Schwankung innerhalb eines Geräts in typischer Weise unter 1 nm, allerdings kann die Schwankung von Gerät zu Gerät so hoch wie ± 6 nm sein. Daher ist der vorliegende Erfindungsgegenständ für diejenigen Situationen anwendbar, bei denen die Zentralwellenlänge des Lichts, das das Detektorelement im Gerät erreicht, Schwankungen im Bereich von ca. ± 5 nm unterliegt.
  • Bei der Herstellung eines Reagensstreifen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gehören die Auswahl der Trägermatrix, der Testreagentien, die mit Analyt zur Erzeugung der reduzierenden Substanz reagieren, sowie das Verfahren, mit dem solche Reagentien und der Tetrazolium-Indikator in die Trägermatrix eingebracht werden, zum gut bekannten Stand der Technik von Reagensstreifen. Um nur einige Beispiele aufzuzählen, stellen typische Trägermatrices poröses und absorbierendes Papier, Tuch, Glasfaserfilter, polymere Membranen und Filme und dgl. dar. Beaufschlagungsverfahren schließen die Imprägnierung einer gebildeten Trägermatrix mit einer Lösung, Suspension oder sonstigen flüssigen Form der Testzusammensetzung, in einer oder mehreren Stufen, unter anschließender Trocknung der Matrix sowie die Bildung einer Matrix in der Gegenwart einer oder mehrerer Komponenten der Testzusammensetzung ein, z.B. durch Gießen oder schichtweises Aufbringen von Lösungen von Zubereitungen, die einen Film oder eine Membran bilden. Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, durch die folgenden Beispiele noch weiter verdeutlicht.
    • Beispiele A. Synthese von Verbindungen Hydrazon-Herstellungen Herstellung von Arylaldehyd-4-di- oder -trifluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl-hydrazonen
  • Eine Aufschlämmung von 25 mMol des entsprechenden Aldehyds und von 25 mMol des entsprechenden Hydrazins in 125 ml absolutem Ethanol wird 3 h lang am Rückfluß gehalten. Wasser wird mit 3A-Molekularsieben in einem Soxhlet- Extraktor entfernt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und dann filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.
    • Herstellung von Arylaldehyd-4-alkyl- oder -aryl-5-carbalkoxythiazol-2- yl-hydrazonen
  • Hydrazone, abgeleitet aus 4-Alkyl- oder -Aryl-5-carbalkoxythiazolen wurden hergestellt, indem man 1 h lang 0,3 mil 3-Alkyl- oder -Aryl-3-oxo-2- chlorpropionsäureester mit derselben Konzentration des entsprechenden Thiosemicarbazons in Ethanol am Rückfluß hält, wie beschrieben von H. Beyer und E. Bulka in Z.Chem., 2, 321 (1962). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Mischung filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.
    • Herstellung von Arylaldehyd-4-carbalkoxy-5-alkyl- oder -arylthiazol-2- yl-hydrazonen
  • Hydrazone, abgeleitet aus 4-Carbalkoxy-5-alkyl- oder -aryl-5- thiazolen, wurden aus 1-Chlor-1-carbalkoxy-2-alkyl- oder -aryloxiran und dem entsprechenden Thiosemicarbazon hergestellt. Das benötigte Oxiran kann gemäß dem Verfahren von A. Takada, et al., in Bull. Soc. Chem. Jpn., 43, 2997 (1970), hergestellt werden. Eine Lösung von 30 mMol Oxiran und 30 mMol Thiosemicarbazon in 100 ml Ethanol wurde zubereitet und 1 h lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde abgekühlt und dann futriert, um das Hydrazon zu ergeben.
    • Formazan-Herstellung
  • Es wird zuerst das Diazoniumsalz hergestellt, wobei man eine Aufschlämmung oder Lösung von 8,5 mMol des Amins in 60 ml N HCl auf 5ºC abkühlt. Natriumnitrit (0,70 g, 10,15 mMol) in 5 ml Wasser wird sodann zugetropft. Nach 30minütigem Rühren wird die Mischung zu einer kalten (-25ºC) Mischung von 8,5 mMol des Hydrazons in 120 ml 1:1 (V/V) DMF-Pyridin getropft. Man läßt es zu, daß sich die Reaktion beim Zutropfen auf oberhalb
  • -15ºC erwärmt. Die Mischung erwärmt sich unter Rühren über eine Dauer von 2 h auf Raumtemperatur. Nach Filtration erhält man das Formazan als einen schwarzen Feststoff. Verunreinigungen können durch wiederholtes Waschen mit Methanol oder durch Halten des Feststoffs am Rückfluß von Methanol und Filtrieren in der Wärme entfernt werden.
    • Tetrazoliumsalz-Herstellung
  • Eine Aufschlämmung von 1,5 mMol des Formazans wird mit 20 ml Essigsäure und 4 ml Isoamylnitrit 16 bis 48 h lang gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, um das Tetrazoliumsalz zu ergeben. In Fällen, in denen das Salz nicht ausfällt, verursachte eine Verdünnung mit Ether die Ausfällung.
    • 2,5-Dichlor-4-dichlormethylthiazol
  • Ein kräftiger Chlor-Strom wurde in 5888 g (42,9 Mol) 97,3%iges 2- Chlor-4-methylthiazol (J. Chem. Soc. 1919, S. 1071 - 1090) anfänglich bei 80ºC und nach der langsamen Beendigung der exothermen Reaktion bei 100ºC ca. 100 h lang eingeleitet. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Stehenlassen über Nacht bildete sich ein kristalliner Niederschlag aus 2,5-Dichlor- 4-dichlormethylthiazol, der abfiltriert und über keramischem Ton getrocknet wurde. Ausbeute: 3907 g (38,4% der Theorie).
  • Die flüssige Fraktion der Chlorierungsmischung wurde in einer 2m langen gefüllten Kolonne fraktioniert destilliert. Das bei 101 bis 103ºC/6mBar erhaltene Destillat kristallisierte größtenteils und wurde dann auf keramischem Ton getrocknet. Ausbeute an 2,5-Dichlor-4-dichlormethylthiazol durch fraktionierte Destillation: 2733 g (26,9% der Theorie).
  • Gesamtausbeute: 6640 g (75,3% der Theorie), Schmelzpunkt: 42-44ºC (umkristallisiert aus Petrolether), ¹H-NMR (in CDCl&sub3;): δ = 6,78 ppm
    • 2,5-Dichlor-4-trichlormethylthiazol
  • Chlor-Gas wurde in eine Mischung aus 1093 g (8,19 Mol) 2-Chlor-4- methylthiazol und 4 l Methylenchlorid in einen Dreihalskolben mit Rührer, Thermometer, Rückflußkühler und Gaseinleitrohr, ausgehend von Raumtemperatur, eingeleitet. Nach Absterben der exothermen Reaktion wurde das Methylenchlorid unter langsamem Temperaturanstieg unter kontinuierlicher Einleitung von Chlor abdestilliert; die Schmelze wurde langsam auf ca. 160ºC erhitzt. Bei ca. 160ºC wurde meist überschüssiges Chlor-Gas (erkennbar an der leicht grünlichen Farbe des entweichenden Gases) eingeleitet, bis ein Gas- Chromatogramm fast ausschließlich die gewünschte Verbindung 2,5-Dichlor-4- trichlormethylthiazol zeigte. Die Gesamtdauer der Chlorierung betrug 40 bis 50 h.
  • Eine Rohdestillation bis zu einer Kopftemperatur von 150ºC bei 14 mBar ergab 2057 g ca 95% reines 2,5-Dichlor-4-trichlormethylthiazol, entsprechend einer Ausbeute von 88% der Theorie an Reinprodukt. 2,5-Dichlor-4- trichlormethylthiazol wurde durch Feindestillation durch eine Silberüberzogene&sub1; 220 cm lange gefüllte Kolonne rein erhalten. Siedepunkt: 123- 125ºC bei 16 mBar.
    • 2,5-Dichlor-4-difluormethylthiazol
  • 1010 g (4,26 Mol) 2,5-Dichlor-4-dichlormethylthiazol wurden mit 1500 ml wasserfreier Flußsäure in einem VA-Autoklav bei 145ºC/25 Bar fluoriert. Die sich bildende Salzsäure wurde kontinuierlich entfernt. Überschüssige Flußsäure wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur am Ende der Reaktion abgezogen. Der Rückstand wurde in Eiswasser gegeben, in Dichlormethan aufgenommen, über Natriumsulfat getrocknet und destilliert.
  • Die Ausbeute betrug 753 g (86,6% der Theorie) 2,5-Dichlor-4- difluormethylthiazol. Siedepunkt: 74 - 75ºC/18 mBar; nD²&sup0; 40 1,5171
    • 2,5-Dichlor-4-trifluormethylthiazol
  • 750 g (2,76 Mol) 2,5-Dichlor-4-trichlormethylthiazol wurden mit 1000 ml wasserfreier Flußsäure in einem VA-Autoklav bei 130ºC/19-20 Bar fluoriert. Gebildete HCl wurde kontinuierlich entfernt. Überschüssige Flußsäure wurde unter Vakuum bei Raumtemepratur am Ende der Reaktion abgezogen. Der Rückstand wurde auf Eiswasser gegossen, in Dichlormethan aufgenommen, über Natriumsulfat getrocknet und destilliert.
  • Die Ausbeute betrug 570 g (93% der Theorie) 2,5-Dichlor-4- trifluormethylthiazol, Siedepunkt: 164ºC; nD²&sup0; = 1,4774
    • 5-Chlor-2-hydrazino-4-trifluormethylthiazol
  • 75 g (1,5 Mol) Hydrazin-Hydrat wurden zu einer Mischung aus 111 g (0,5 Mol) 2,5-Dichlor-4-trifluormethylthiazol und 500 ml Dioxan mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß die Reaktionstemperatur 25ºC nicht überstieg. Nach weiterem Rühren über 20 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in 2,5 l Eiswasser eingerührt, dann wurde abfiltriert, und es wurde der Rückstand mit Wasser gewaschen und getrocknet.
  • Die Ausbeute betrug 87,3 g (80,3% der Theorie) 5-Chlor-2-hydrazino-4- trifluormethylthiazol, Schmelzpunkt: 136-137ºC.
    • 5-Chlor-2-hydrazino-4-difluormethylthiazol
  • Ähnlich zum 5-Chlor-2-hydrazino-4-trifluormethylthiazol erhält man aus 2,5-Dichlor-4-difluormethylthiazol 5-Chlor-2-hydrazino-4- difluormethylthiazol in 51,3% Ausbeute. Schmelzpunkt: 132ºC (Zersetzung) (nach Umkristallisation aus viel Cyclohexan).
  • Kleine Mengen der Verbindung können bei 70ºC/0,1 mbar sublimiert werden.
    • B. Herstellung von Reagensstreifen
  • Jeder Indikator wurde durch Imprägnierung in einen Reagensstreifen eingebracht und mit einer Lösung getestet, die eine bekannte Menge an Glucose oder Cholesterol enthielt. Der Reagensstreifen besteht aus einem Polystyrolgriff, auf dem eine Einzelreagens-Unterlage aufgebracht ist. Die Reagens-Unterlage war ca. 0,5 x 0,5 cm² groß und enthält Reagentien, die eine Farbänderung ermöglichen, die instrumentell abgelesen wurde, als eine Anteusmenge einer Probe aufgebracht wurde, die das entsprechende Analyt enthält. Die Trockenphasen-Reagens-Unterlage ist eine feste Trägerunterlage aus beispielsweise Cellulosefasern oder einer Nylon-Membran. Die Reagens- Unterlage wurde zuerst mit einer Lösung des Tetrazoliumsalzes von Interesse (0,08 M/l) und Detergens (9,3%) in einem Lösungsmittel wie Methanol imprägniert. Die zweite Lösung, mit der die Reagens-Unterlage imprägniert wurde, enthält die folgenden Komponenten: GLUCOSE-STREIFEN
  • Ca. 0,01 ml verschiedener Test-Lösungen (Serum, Plasma, wässrig), enthaltend mindestens fünf verschiedene Analyt-Konzentrationen von 0 bis 33 mM/l wurden auf das Zentrum der getrockneten Reagens-Unterlage aufgebracht. Nach einer Vorlaufzeit von ca. 60 Sekunden wurden die Reflektionsspektren eines jeden Indikators in 5 nm Increment-Schritten über den Wellenlängenbereich von 400 bis 1000 nm aufgenommen und gemessen.
    • C. Gebrauchsdaten
  • Es folgt eine Tabelle spektraler und weiterer analytischer Daten, betreffend verschiedene synthetisierte Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung. Die Verbindungen sind der Reihe nach angegeben, und zwar gemäß der Form ihres Thiazolyl-Restes, dann gemäß ihrem R&sup4;-Substituent und schließlich gemäß ihrem R³-Substituent. Beispielsweise ist die als erste angegebene Verbindung A.l.a) und gehört zur Formel A, worin R¹ der 4- Difluormethylrest, R² der 5-Chlor-, R&sup4; der 4-Nitrophenyl- und R³ der 4-(2- (2-(2-Ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenylrest sind, die zweite Verbindung A.1.b) weist dieselben Substitutionen am Thiazolyl-Rest und denselben R&sup4;- Substituent wie Verbindung A.1.a) auf, wobei aber R³ der 4-(2-(2-(2- Methoxy)ethoxy)ethoxy)phenylrest ist; usw..
  • Das Reflektionsspektrum der Tetrazoliumsalze soll abhängig von der Umgebung sein, worin sie aufgenommen oder gemessen werden. Aus Vergleichszwecken zwischen individuellen Tetrazoliumsalzen schließen die unten angegebenen Daten eine Messung der relativen Flachheit des flachsten Teilbereichs des Reflektionsspektrum bei Wellenlängen von oberhalb ca. 600 nm ein, wobei das Spektrum anhand eines Glucose- oder Cholesterol- Reagensstreifens erstellt ist, welche wie in obigem Teil B beschrieben hergestellt wurden. Die relative Flachheit des Spektrum ist in den Daten in K/S-Einheiten ausgedrückt, die bezüglich des Gehalts an Analyt normalisiert sind, der wie unten definiert nachgewiesen ist.
  • K/S ist durch die Gleichung definiert:
  • 1 - R)²/2R
  • worin R Reflektionseinheiten darstellt. Eine Prozentänderung beim K/S- Wet ist die Änderung, die als ein Prozentsatz über einen 50 nm Bereich ausgedrückt ist, dividiert durch den Durchschnittswert der hohen und niedrigen K/S-Werte über diesen Bereich.
  • Die Plateau-Eigenschaft der vorliegenden Verbindungen soll, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, als eine Prozentänderung im Reflektionsspektrum (ausgedrückt als K/S-Werte wie definiert in obigem Abschnitt) von weniger als ca. 17% über eine Wellenlängenspannbreite von 30 bis 50 nm bei einer Wellenlänge von oberhalb ca. 600 nm verstanden sein. Die bevorzugteren Verbindungen zeigen ein Plateau, das eine Prozentänderung in K/S-Werten von weniger als ca. 10% aufweist. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die eine Prozentänderung in K/S-Werten von ca. 5% oder weniger über eine Wellenlängenspannbreite von 50 nm ergeben. Verbindungen mit einem Reflektionsspektrum, das mehr Steigung aufweist, sind dennoch bevorzugt, solange der flachste Teilbereich eine Wellenlänge oberhalb 650, vorzugsweise oberhalb 675, nm betrifft.
  • Bezüglich der zeichnungen zeigen Fig. 1 bis 4 die Absorptionsspektren der Formazane, erzeugt nach Reduktion der zum Stand der Technik gehörenden Tetrazoliumsalze INT, MTT und NBT bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose. Für Vergleichszwecke zeigen Fig. 5 bis 9 die entsprechenden Spektren für ausgewählte Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Das Vorliegen eines Plateau in den Spektren der Formazane aus den vorliegenden Verbindungen sowie die Abwesenheit aus denjenigen der Formazane aus den Verbindungen des Standes der Technik ist unmittelbar ersichtlich.
  • Die vier oben genannten Verbindungen des Standes der Technik ergeben Prozentänderungen in K/S-Werten über den Wellenlängenbereich von 650 - 700 nm wie folgt:
  • INT 71%
  • MTT 178%
  • NBT 73%
  • USSR 28%
  • Je niedriger der Prozentsatz des K/S-Wertes für das Formazan ist, desto toleranter ist das Tetrazoliumsalz gegenüber Schwankungen in der Zentralwellenlänge des optischen Systems, das zur Reflektionsmessung und somit zur Messung der Analyt-Konzentration verwendet wird.
  • Die folgenden Nicht-Standard-Abkürzungen werden in dem folgenden Text verwendet:
  • "UV" - Die Wellenlänge in nm des maximalen Reflektionspeak in UV- Reflektionsspektrum des Formazan. Der Extrinktionskoeffizient und das bei der Messung verwendete Lösungsmittel sind in Klammern angegeben.
  • "nm" - Die Position des flachsten Teilbereichs des Reflektionsspektrum des Formazan über eine Wellenlängenspannbreite von 50 nm (ausgedrückt als die beginnenden und endenden Wellenlängen in nm).
  • "K/S" - Die Prozentänderung in K/S-Einheiten über den oben genannten flachsten nm-Teilbereich des Reflektionsspektrum. Die Konzentration an Analyt zur Erzeugung des Reflektionsspektrum ist in Klammern angegeben. mMol betrifft die Konzentration in mMol/l.
    • Aufstellung
  • Es folgt eine Liste der Verbindungen, deren Reflektionsspektren in Fig. 5 bis 9 der Zeichnungen gezeigt sind. Deren abgekürzte Bezugsziffer und Anordnung in der folgenden Aufstellung sind in Klammern vor den Verbindungsbezeichnungen angegeben.
  • Fig. 5 (A-1-a) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)- 5-(4-(2-(2-(2-ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl)-Tetrazoliumsalz
  • Fig. 6 (A-1-d) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)- 5-(3,4-methylendioxyphenyl)-Tetrazoliumsalz
  • Fig. 7 (A-2-a) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)-Tetrazoliumsalz
  • Fig. 8 (A-9-a) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(2-methoxyphenyl)- 5-(3,4-methylendioxyphenyl)-Tetrazoliumsalz
  • Fig. 9 (B-4-a) 2-(4-Trifluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4,5- trimetchoxyphenyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)-Tetrazoliumsalz
  • A. 4-Difluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = 4-Methoxyphenyl
  • a) R³ = 4-(2-(2-(2-Ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 480 nm (12,8 x 10³ Dioxan)nm: 645-695 nm; K/S: 6%(17,7 mMol)
  • Ir(KBr): 2942, 1612, 1504, 1464, 1451, 1261, 1178, 1126, 1061, 837, 658 cm&supmin;¹
  • NMR (300 M Hz, DMSO-d&sub6;): δ 8,24 (e, 2H, J = 8,8 Hz, pH-OMe), 7,92 (d, 2H, J = 9,0 Hz, pH-O-), 7,27 - 7,33 (m, 4H, PRH) , 7,26 (d, 1H, J = 1,04 Hz, -CHF&sub2;), 4,22-4,32 (m, 2H, -CH&sub2;O), 3,90 (s, 3H, -OMe), 3,20 - 3,68 (m, 10H, -OCH&sub2;CH&sub2;O-)
  • Massenspektrum (FAB): 107 (100, 135, (65,4), 568 (4,5; M&spplus;-H) , 570 (1,9, M&spplus;¹)
  • b) R³ = 4-(2-(2-(2-Methoxy)ethoxy)ethoxyphenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 468 nm (10,2 x 10³, Dioxan)
  • c) R³ 40 4-(2-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 466 nm (7,6 x 10³, Dioxan)
  • nm: 645 - 695 nm; K/S : 5% (11,1 mMol)
  • d) R³ - 3,4-Methylendioxiphenyl
  • nm: 650 - 700 nm; K/S : 7% (11,1 mMol)
  • 2. R&sup4; = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (5,66 x 10³, Wasser)
  • nm: 665 - 715 nm; K/S: 5% (17,7 mMol)
  • NMR (300 M Hz, DMSO-d&sub6;): δ 7,91 (dd, 1H) ,7,82 (d, 1H), 7,35 (s, 3H), 7,31 (t, 1H, CHF&sub2;), 7,30 (d, 1H), 6,28 (s, 2H), 3,79 (s, 9H)
  • Massenspektrum (FAB): 167 (71), 330 (34), 524 m&spplus;, 100)
  • b) R³ = 4-(2-(2-(2-Hydroxy)ethoxy)ethoxyphenyl (Vergleichsdaten)
  • UV: 492 nm (3,62 x 10³, Dioxan)
  • nm: 660 - 710 nm; K/S: 14% (11,1 mMol) IR(KBr): 3436, 1611, 1456, 1384, 1309, 1241, 1180, 1126, 1053, 992 cm&supmin;¹
  • NMR (DMSO-d&sub6;&sub1; 300 M Hz): δ 8,26 (d, 2H, J = 8,89, pH), 7,40 (s, 2H, PhH), 7,33 (d, 2H, J 40 8,90 Hz, pH), 7,30 (t, 1H, J = 52,3, (HF&sub2;), 4,29 (dd, 2H, J = 5,66, 4,0 Hz, CH&sub2;-OH), 3,91 (5,64 , -OMe), 3,85 (s, 3H, OME), 3,64- 3,41 (m, 10H, -CH&sub2;O)
  • Massenspektrum (FAB)m/e: 628 (13,5), 630 (6,0)
  • 3. R&sup4; = 1-Naphthyl
  • a) R³ = 4-(2-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 440 nm (6,32 x 10³, Dioxan)
  • 4. R&sup4; = 1-Phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • b) R³ = 4-(2-(2-(2-Ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl
  • UV: 474 nm (13,1 x 10³,Dioxan)
  • nm: 625 - 675 nm; K/S: 25% (11,1 mMol)
  • IR(KBr) 3397 , 3004, 2950, 1612, 1452, 1260, 1180, 1127, 1061, 842 cm&supmin;¹
  • NMR (300 M Hz, DMSO-d&sub6;): δ 8,25 (d, 2H, J = 8,73 Hz, Ph-O-), 8,00 (d, 2H, J = 7,87 Hz, PhH), 7,88 - 7,93 (m, 1H, PhH), 7,80 ( d, 2H, J = 7,90 Hz, PhH), 7,32 (d, 2H, J - 8,81 Hz, PhO-), 7,22 (d, 1H, J = 104,3 Hz, -CHF&sub2;), 4,26 - 4,30 (m, 2H, CHCH&sub2;-), 3,79 - 3,82 (m, 2H, CH&sub2;CH&sub2;OH), 3,31 - 3,62 (m, 8H, -OCH&sub2;CH&sub2;O-)
  • Massenspektrum (FAB): 301 (14,2, 434 (23,9), 538 (35,7, M&spplus;-1) , 539 (11,5, M&spplus;) , 540 (15,8, M&spplus;+1).
  • 5. R&sup4; = 4-(2-(2-(2-Hydroxyethyl)ethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4,5-Trimethoxyphenyl
  • UV: 516 nm (9 x 10³, H&sub2;O)
  • b) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 512 nm (13 x 10³ , H&sub2;O)
  • 6. R&sup4; = 4-(2-Hydroxyethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 492 nm (12 x 10³, H&sub2;O)
  • 7. R&sup4; = 4-(2-(2-Hydroxyethyl)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 514 nm (11,3 x 10³, H&sub2;O)
  • 8. R&sup4; = 3,4-Dimethoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 410 nm (5,34 x 103 , Wasser)
  • nm: 675 - 725 nm; K/S: 15% (11,1 mMol)
  • 9. R&sup4; = 2-Methoxyphenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 610 - 640 (7,5 x 10³)
  • nm: 635 - 685 nm; K/S : 7% (8,2 mMol)
  • B. 4-Trifluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = 4-Carboxyphenyl
  • a) R³ = 4-(2-(2-(2-(Ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 560 nm (5,9 x 10³, Dioxan)
  • nm: 630 - 680 nm; K/S: 18% (11,1 mMol)
  • IR(KBr): 3461, 1612, 1455, 1385, 1263, 1178, 993 cm&supmin;¹
  • NMR (300 MHz,DMSO-d&sub6;): δ 8,20 - 8,32 (m, 5H) , 8,08 - 8,14 (m, 1H, Ph), 7,32 (3, 1H, J = 8,92, -PhH), 7,18 (d, 1H, J 40 8,89, -PhH), 4,16 - 4,32 (m, 2H, CHCH&sub3;), 3,39 - 3,82 (m, 8H, Ethylenglycol), 1,09 (t, 3H, J = 6,99, - CH&sub3;)
  • Massenspektrum (FAB): 320 (15,6), 436 (18,80, 584 (13,9, M&spplus;-H)
  • b) R³ = 4-(2-(2-(2-Hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 492 nm (5,4 x 10³, Dioxan)
  • nm: 640 - 690 nm; K/S : 14% (11,1 mMol)
  • IR (KBr): 3013, 1610, 1518, 1450, 1203, 1050, 928, 717, 664 cm&supmin;¹
  • NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;): δ 8,24 - 8,33 (m, 4H, PhH), 8,12 (d, 2H, J = 8,8 Hz, PhCr2H), 7,32 (d, 2H, J = 8,9 Hz, PhCO&sub2;H), 4,27 - 4,29 (m, 2H, OCHCH&sub2;-), 3,79 - 3,82 (m, 2H, -OCH&sub2;CH&sub2;O), 3,40 - 3,63 (m, 8H, -O-CH&sub2;CH&sub2;-O-)
  • Massenspektrum (FAB)
  • 121 (100), 146 (29,5), 149 (26,5), 600 (9,6 (M&spplus;-H), 602 (4,2, M&spplus;+1)
  • c) R³ - Methoxyphenyl
  • nm: 630 - 680 nm; K/S: 10% (11,1 mMol)#
  • 2. Phenyl
  • a) R³ - 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 520 (Wasser, 4,08 x 10³)
  • nm: 635 - 685 nm; K/S: 21% (11,1 mMol)
  • b) R³ = 4-(2-2-2-(Ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • UV: 580 nm (7,7 x 10³,Dioxan)
  • nm: 625 - 675 nm; K/S : 0,60 (11,1 mMol)
  • IR(KBr): 3582, 3462, 1636, 1614, 1486, 1456, 1384, 1179, 1137, 1051, 993, 986, 848, 765, 745, 691 cm&supmin;¹
  • NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;) : δ 8,26 (3, 1H, J = 8,54 Hz, Ph-O-) , 8,15 (d, 1H, J = 8,48, PhO-), 8,00 - 7,77 (m, 5H, -Ph), 7,32 (d, 1H, J -= 8,73), 7,12 (d, 1H, J = 8,67, Ph-), 3,34 - 4,28 (m, 10H, Ethylenglycol), 1.09 (t, 3H, J 40 6,92, -CH&sub3;)
  • Massenspektrum (FAB) : 540 (M-H)&spplus;
  • c) R³ = 4-Trimethylammonium)phenyl
  • UV: 496 nm (11,4 x 10³ , Dioxan)
  • 3. 4-Nitrophenyl
  • a) R³ = 4-(Trimethylammonium)phenyl
  • UV: 590 nm (4,7 x 10³, Dioxan)
  • nm: 525 - 575 nm; K/S: 14% (11,1 mMol)
  • IR (KBr): 3431, 3065, 1751, 1725, 1486, 1469, 1308, 1209, 1182, 1147, 990 cm&supmin;¹
  • NMR (300 MHz, DMSO-d&sub6;): δ 8,85 - 8,95 (m, 1H, Ph-), 8,59 (d, iH, J = 8,8 Hz, PhNO&sub2;), 8,47 - 8,55 (m, 1H), 8,44 (d, 1H, J = 8,9 Hz, PhNO&sub2;), 8,22 - 8,35 (m, 2H, PhH), 7,96 - 8,05 (m, 1H, PhH) , 7,80 - 7,87 (m, 1H), 3,75 (s, 9H)
  • Massenspektrum (FAB): 161 (100, NCPh&spplus;NMR&sub3;) , 185 (22,6), 511 (12,1, M&spplus;)
  • 4. R&sup4; = 3,4,5-Trimethoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (Wasser, 6,68 x 10³)
  • nm: 675 - 725 nm; K/S: 5% (11,1 mMol)
  • b) R³ = 4-Acetamidophenyl
  • UV: 490 ( Wasser, 7,24 x 10³)
  • R&sup4; = 4-(3-Dimethylammoniopropylamidophenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 400 (Wasser)
  • 6. R&sup4; = 2-Methoxy-5-trimethylammoniophenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 540 (Wasser)
  • 7. R&sup4; = 4-Methoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (Wasser)
  • 8. R&sup4; = 4-Methoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (Wasser)
  • 9. R&sup4; = 3,5-Dicarboxyphenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • nm: 635 -685 nm ; K/S: 16% (12,2 mMol)
  • 10. R&sup4; = Naphthyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • nm: 685 - 735 nm: K/S: 5% (9,4 mMol)
  • C. 4-Carboxyethyl-5-chlorthiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = 4-Methoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 490 (4,9 x 10³, Wasser)
  • D. 4-Carbmethoxy-5-chlorthiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = Phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3-Thienyl
  • UV: 469 (7,66 x 10³, Wasser)
  • b) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • nm: 620 - 670 nm; K/S: 21% (11,1 mMol)
  • E. 4-Carboxyisopropyl-5-chlorthiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = Phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3-Thienyl
  • UV: 468 (7,8 x 10³, Wasser)
  • 2. R&sup4; = Phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 2-Thienyl
  • UV: 490 (7,6 x 10³ , Wasser)
  • 3 R&sup4; = Phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • nm: 625 - 675 nm; K/S: 6% (9,4 mMol)
  • F. 4-Phenyl-5-carbmethoxythiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = 4-Methoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (9,82 x 10³, Wasser)
  • 2. R&sup4; = 3,4-Dimethoxyphenyl
  • a) R³ = 3-Thienyl
  • UV: 510 (9,76 x 10³, Wasser)
  • 3. R&sup4; = Carboxyphenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (5,10 x 10³, Wasser)
  • nm: 660 - 710 nm; K/S: 13% (22 mMol)
  • 4. R&sup4; = 3,4,5-Trimethoxyphenyl
  • a) R³ = 4-Methoxyphenyl
  • UV: 500 (9,44 x 10³, Wasser)
  • nm: 670 - 720 nm; K/S: 20% (22 mMol)
  • G. 4-Methyl-5-carbmethoxythiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = 4-Carboxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 510 (7,82 x 10³, Wasser)
  • nm: 670 - 720 nm; K/S: 14% (22 mMol)
  • 2. R&sup4; = Phenyl (Vergleichsbeispiel)
  • a) R³ = 4-Methoxyphenyl
  • nm: 650 - 700 nm; K/S : 14% (9,4 mMol)
  • b) R³ = 3-Thienyl/UV: 480 (8,76 x 10³ , Wasser)
  • c) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 500 (6,18 x 10³, Wasser)
  • H. 4-Carbmethoxy-5-ethylthiazol-2-yl
  • 1. R&sup4; = 3,4,5-Trimethoxyphenyl
  • a) R³ = 3-Thienyl
  • UV: 500 (7,38 x 10³, Wasser)
  • nm: 640 - 690 nm; K/S: 14% (8,3 mMol)
  • 2. R&sup4; = 3,4,5-Trimethoxyphenyl
  • a) R³ = 4-Methoxyphenyl
  • nm: 625 - 675 nm; K/S: 14% (8,3 mMol)
  • b) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 490 (7,96 x 10³, Wasser)
  • nm: 650 - 700 nm; K/S: 8% (8,3 mMol)
  • 3. R&sup4; = 3,4-Dimethoxyphenyl
  • a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
  • UV: 490 (5,26 x 10³ , Wasser)
  • nm: 665 - 715 ; K/S: 5% (8,3 mMol)
  • b) R³ = 3-Thienyl
  • nm: 635 - 685 nm; K/S: 11% (8,3 mMol)

Claims (10)

1. Verbindung der Formel:
worin R¹ ein Di- oder Trifluoralkylrest, worin die Fluor-Substituenten sich an dem Kohlenstoffatom befinden, das benachbart zum Thiazolyl-Rest der Formel vorliegt, und R² Chlor sind, und worin R³ ausgewählt ist aus:
worin Q eine Bindung oder -CH=CH- ist, worin
(i) Y¹ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthiorest, Halogen oder Wasserstoff,
Y² ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sufonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureidorest,
Y³ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-,Sulfo-, Sufonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureidorest und
Y&sup4; ein Alkoxyrest, Halogen oder Wasserstoff sind, oder
(ii) Y² und Y³ zusammen einen Methylendioxy- oder Imidazo-Ring bilden und Y¹ und Y&sup4; Wasserstoff sind, sowie aus einem
(b&sub1;) 2-, 3- oder 4-Pyridyl-,
(c&sub1;) 2- oder 3-Thienyl- und aus einem
(d&sub1;) 2- oder 3-Furanyl-Rest;
und worin schließlich R&sup4; ausgewählt ist aus:
worin Y&sup5; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro- oder Ureidorest,
Y&sup6; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder Ureidorest,
Y&sup7; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxl-, Cyano-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, oder Ureidorest und
Y&sup8; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Akyl-, Halogen-, Wasserstoff- oder Nitrorest sind, sowie aus:
worin Y&sup9; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylsulfo-, Sulfonamido-, Sulfo-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder Ureidorest ist,
(c&sub2;) einem 2-, 4-, 6- oder 8-Chinolyl- oder einem 2-Methylchinolyl- Rest und aus einem
(d&sub2;) Anthranyl-Rest;
und worin X ein Gegenanion ist,
mit der Maßgabe, daß
jede der Alkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, und daß
jede Arylgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Phenyl-, Naphthyl-, Pyridyl-, Oxazolyl-, Chinolyl-, Thiazolyl-, Thienylund einem Furanylring, und daß ferner
die Verbindungen dadurch gekennzeichnet sind, daß die Reflektionsspektren, die von jeder der genannten Verbindungen geliefert werden, bei deren Reduktion zu ihrem gefärbten Formazan-Zustand, um weniger als 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm bei Wellenlängen von 600 nm oder oberhalb davon schwanken.
2. Verbindung gemäß Aspruch 1, worin R³ ausgewählt ist aus
worin
(i) Y², Y³ und Y&sup4; jeweils ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest sind,
(ii) Y&sup4; Wasserstoff und Y² und Y³ beide ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest sind oder zusammen einen Methylendioxy-Ring bilden, oder
(iii) Y² und Y&sup4; beide Wasserstoff und Y³ ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin; &sub4;)alkylammonio- oder ein Ureidorest sind, und aus einem
(b&sub1;) 2- oder 3-Thienylrest,
und worin R&sup4; ausgewählt ist aus:
worin
(i) Y&sup5; Wasserstoff und jeder Rest Y&sup6;, Y&sup7; und Y&sup8; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest sind,
(ii) Y&sup5; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup6; und Y&sup7; beide ein C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxyrest sind oder zusammen einen Methylendioxy-Ring bilden,
(iii) Y&sup5; und Y&sup6; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin; &sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- oder ein Ureidorest sind,
(iv) Y&sup5; ein Alkoxy- oder Alkylrest, Y&sup6; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylazo- oder ein Ureidorest sind,
(v) Y&sup5; und Y&sup8; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyreste sind, oder
(vi) Y&sup5; und Y&sup8; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyreste und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido- oder Benzamidorest sind;
worin
Y&sup9; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Cyano-, Halogen-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido- oder ein Ureidorest ist, und aus
(c&sub2;) einem 8-Chinolyl-Rest.
3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin R³ ausgewählt ist aus: 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, 4-Acetamidophenyl, 4-Methylthiophenyl, Phenyl, 4-Halophenyl, 4-Cyanophenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Thienyl und aus 3-Thienyl, und worin
R&sup4; ausgewählt ist aus
3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 2,4-Dimethoxyphenyl, 3,4- Methylendioxyphenyl, 4-Methoyphenyl, 4-Acetamidphenyl, 4-Methylthiophenyl, 4-Carboxyphenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Methoxyphenyl, 2-Methoxy-4-carboxyphenyl, 2,5-Dimethoxyphenyl, 2,5-Dimethoxy-4-benzamidophenyl, 1-Naphthyl, 4-Nitro-1-naphthyl, 4-Methoxy-1-naphthyl, 8-Chinolyl, 2-Methyl-4-carboxyphenyl und aus 4-Cyano-1-naphthyl.
4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R¹ ein Di- oder Trifluormethylrest und R² Chlor sind.
5. Verbindung gemäß Anspruch 4, worin R³ ausgewählt ist aus:
3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, 4- Methoxyphenyl, 4-Acetamidophenyl, Phenyl, 4-Halogenphenyl, 4-Cyanophenyl, 4-Nitrophenyl und aus 3-Thienyl, und worin
R&sup4; ausgehält ist aus 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4-Dimethoxyphenyl, 2,4- Dimethoxyphenyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4- Acetamidophenyl, 4-Methylthiophenyl, 4-Carboxyphenyl, 4-Nitrophenyl, 2- Methoxyphenyl, 2-Methoxy-4-carboxyphenyl, 2, 5-Dimethoxyphenyl, 2,5- Dimethoxyp-4-benzamidophenyl, 1-Naphthyl, 4-Nitro-1-naphthyl, 4-Methoxy-1- naphthyl, 8-Chinolyl-, 2-Methyl-4-carboxyphenyl, 4-Carmethoxyphenyl, 4- Cyanophenyl und aus 4-Cyano-1-naphthyl.
6. Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe:
2-(4-Difluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4-(2- (2-(2-ethoxy)ethoxy)phenyl)-Tetrazoliumsalz,
2-(4-Difluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5- (3,4-methylendioxiphenyl)-Tetrazoliumsalz,
2-(4-Difluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxiphenyl)-Tetrazoliumsalz.
2-(4-Difluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(2-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxiphenyl)-Tetrazoliumsalz
2-(4-Trifluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5- (3,4-methylendioxiphenyl)-Tetrazoliumslaz.
7. Verfahren zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, wobei man eine oder mehrere der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einer Flüssigkeit in Kontakt bringt, von der angenommen wird, daß sie eine reduzierende Substanz enthält, und man bestimmt, ob die Verbindung in ihren gefärbten Formazan-Zustand reduziert worden ist oder nicht, indem man eine spektrale Änderung oder ein entsprechendes Fehlen in der Verbindung beobachtet.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die reduzierende Substanz NADH ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die reduzierende Substanz Schefelwasserstoffgas, Diboran, Arsenhydrid oder Phosphorhydrid ist.
10. Reagens zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, welches eine oder mehrere der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
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