DE69130443T2

DE69130443T2 - Phenylsubstituierte 2-Thiazolyl-tetrazolium-Salze als Indikatoren

Info

Publication number: DE69130443T2
Application number: DE69130443T
Authority: DE
Inventors: Juergen Dr. W-5000 Koeln 80 Koecher; Klaus Dr. W-5600 Wuppertal 1 Wehling
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1990-09-19
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2011-09-07
Also published as: ATE172972T1; AU626764B2; EP0476455A3; EP0476455B1; JP3631769B2; AU8456891A; CA2049209A1; JPH04270278A; EP0476455A2; CA2049209C; DK0476455T3; DE69130443D1; ES2123503T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Tetrazoliumsalz-Indikatorverbindungen zur Bestimmung reduzierender Substanzen, insbesondere von Nikotinamidadenindinukleotid (NADH).
Tetrazoliumsalze sind als chromogene Indikatoren gut bekannt, welche auf reduzierende Substanzen reagieren. Bei Reduktion werden Tetrazoliumsalze in Formazan-Farbstoffprodukte überführt. Diese Indikatoren haben Anwendung auf einer großen Vielzahl von Gebieten, insbesondere auf dem Gebiet der medizinischen Diagnose, gefunden, wo sie, unter anderen, zur Zellfärbung und zur Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten wie Urin, Milch, Serum und Plasma angewandt worden sind.
Gewöhnlich beinhaltet die Bestimmung von Körperflüssigkeitsanalyten eine NAD-abhängige enzymatische Reaktion, bei der NADH als eine Funktion der Menge an in der getesteten Probe vorhandenem Analyt gebildet wird. Die Menge an erzeugtem NADH kann dann durch die reduktive Überführung eines geeigneten Tetrazoliumsalz-Indikators in sein Formazan-Farbstoffprodukt ermittelt bzw. bestimmt werden.
Auf dem Gebiet medizinischer Diagnosetestverfahren werden Tetrazoliumsalz-Indikatoren in vielen unterschiedlichen Produkttypen verwendet. Ein besonderer Typ ist der Reagensstreifen. Dieses Produkt ist eine Vorrichtung im Feststoffzustand aus Papier oder einer anderen porösen Trägermatrix, welche mit chemischen Reagentien, die auf einen besonderen Analyt, z. B. auf Glucose oder Cholesterin, reagieren, imprägniert oder auf sonstige Weise beaufschlagt werden. Das aufgebrachte Reagenssystem schließt einen chromogenen Indikator ein, der eine Farbe oder Farbänderungen als eine Funktion der Menge eines in einer auf die Matrix aufgebrachten Probe vorhandenen bzw. vorliegenden Analyt entwickelt. Die sich ergebende kolorimetrische Reaktion kann visuell betrachtet und erfasst werden, um qualitative oder halb-quantitative Ablesungen zu ergeben. Quantitative Ergebnisse sind erhältlich, indem man die Reflektion der Matrixoberfläche bei einer oder mehreren definierten Wellenlängen mit einem geeigneten Gerät (Reflektionsmeßgerät) abliest.
Es besteht ein anerkanntes Bedürfnis, Tetrazolium-Indikatoren zu entwickeln, die eine starke Absorption bei Wellenlängen aufweisen, die länger als die Absorptionsbereiche der hauptsächlichen Störmittel sind, die in der Testprobe vorliegen können, Beispielsweise stellt die Störung aus bzw. durch die Hämoglobin-Färbung ein besonderes Problem dar, wenn es sich bei der Probe um Vollblut handelt. Indikatoren mit signifikanter Absorption oberhalb ca. 640 nm sind erforderlich, um die Hämoglobin-Störung im wesentlichen zu überwinden. Die gewöhnlich verwendeten Tetrazoliumsalz- Indikatoren sind 2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- phenyltetrazoliumchlorid (INT), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumchlorid (MTT) und 2,2',5,5'-Tetraphenyl-3,3'-(3,3'- dimethoxy-4,4'-diphenylen)ditetrazoliumchlorid (NBT). Diese Verbindungen weisen eine maximale Absorption (UVmax) im Bereich von 465 bis 605 nm auf.
Ein weiterer Nachteil der herkömmlich verwendeten Tetrazoliumsalz- Indikatoren des Standes der Technik betrifft die Entwicklung der Instrumentation bzw. der entsprechenden Gerätschaften, welche zur Messung von deren kolorimetrischer Reaktion angewandt werden. Es werden rasche Fortschritte bei der Entwicklung kleinerer, kostengünstigerer Reflektionsmeßgeräte gemacht. Eine der teureren Komponenten solcher Meßgeräte ist das optische System, welches eine Lichtquelle, einen Filter oder weitere Spektralelemente zur Auswahl oder Begrenzung der Wellenlänge des einfallenden oder reflektierten Lichts und einen Sensor umfaßt. Deutliche Kosteneinsparungen könnten erreicht werden, und zwar durch Weglassen oder Zusammenfassen von Funktionen der Elemente des optischen Systems oder durch Verwendung von weniger aufwendigen Komponenten, z. B. von LEDs als Beleuchtungslichtquellen. Allerdings emittieren im Handel erhältliche LEDs Licht, das eine Zentralwellenlänge aufweist, die deutlich schwanken kann, und zwar aufgrund von Herstellvarianzen und einer Temperaturabhängigkeit. Die herkömmlich verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren INT, MTT und NBT weisen Reflektionsspektren auf, die im Bereich oberhalb von deren UVmax stark geneigt sind. Daher können, ohne eine individuelle Kalibrierung sowohl eines jeden Geräts, zum Abgleich der Herstellvarianzen in der LED, als auch eines jeden Testlaufs, zum Abgleich der Schwankung aus Temperatureinflüssen, große Fehler auf die Assayergebnisse übertragen werden.
Im folgenden werden technische Lehren des Standes der Technik dargestellt und abgehandelt, welche die Verwendung verschiedener Tetrazoliumsalze in der kolorimetrischen Analyse betreffen. Tanaka et al. beschreiben in JP 61000084 (Chem. Abst. 104 : 203469y) den Nachweis von Glucose unter Verwendung eines Formazan-Chelats, das durch die Reduktioon von 2-(2- Benzothiazolyl)-3-(carboxyphenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumhalogenid in der Gegenwart von Nickel(II) erhalten wird. DE 32 47 894 von Limbach et al. (Chem. Abst. 101 : 125929v) betrifft die Verwendung von INT in Glucose- Assayverfahren. Rittersdorf et al. beschreiben in DE 21 47 466 die Verwen dung von sieben 2-(2-Benzothiazolyl)-3-phenyl)-5-(4-(trimethylammonio)- phenyl)tetrazoliumsalzen bei der Bestimmung reduzierender Substanzen wie von reduzierenden Zuckern, Ascorbinsäure und von Ketosteroiden.
Die Vielzahl von aus der Literatur bekannten 2-Thiazolyltetrazoliumsalzen und/oder ihrer entsprechenden Formazane wird nun dargestellt und abgehandelt. Serebryakova et al. beschreiben in Khim. Geterotsikl. Soedin. 10 : 1403-1405 (1970) Synthese und chromatische Eigenschaften von Benzothiazolyl-3-phenyl(methyl)-5-p-nitro(dimethylamino)phenylformazanen. Die Autoren stellen fest, daß sowohl eine Elektronen-abziehende Nitrogruppe in der para-Position der 5-Phenylgruppe als auch eine Benzothiazolylgruppe in der 1-Position eine bathochrome Verschiebung ergeben. Lipunova et al. vergleichen in Khim. Geterotsikl. Soedin. (1971), 831-835, den bathochromen Effekt einer 5-Naphthyl- oder o-Tolylgruppe auf das sichtbare Spektrum von 1-Benzothiazolylformazanen. Johne et al. beschreiben in Pharmazie 34 : 790-794 (1979) bestimmte 2-(4,5-Diphenyl)thiazol-2-yltetrazoliumsalze.
EP 239 931 ist ein Enzym-Assayverfahren unter Verwendung bestimmter Tetrazoliumsalze beschrieben.
In EP 190 740 handelt von der Verwendung substituierter Chinon- Elektrontransferagentien in analytischen Bestimmungsverfahren.
DE 32 47 894 betrifft ein Testsystem zur Bestimmung von NAD(P)H.
Durch die vorliegende Erfindung werden Thiazolyltetrazoliumsalze bereitgestellt, die bei Reduktion Formazane ergeben, die neue und verbesserte optische Eigenschaften aufweisen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind:
1. Phenyl-substituierte 2-Thiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren, die durch die Formel gekennzeichnet sind:
worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl-Gruppe eine 4,5-Bis(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4- Carboxyphenyl- und R³ eine 2-Thienyl-Gruppe und X&supmin; ein Gegenion sind, wobei die Verbindungen des weiteren dadurch gekennzeichnet sind, daß das Reflektionsspektrum, das jede der genannten Verbindungen bei Reduktion in ihren gefärbten Formazan-Zustand ergibt, um weniger als ca. 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm schwankt, wenn der Mittelpunkt des Bereiches von 50 nm 640 nm oder mehr beträgt, sowie
2. Phenyl-substituierte 2-Thiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren, die durch die Formel gekennzeichnet sind:
worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl-Gruppe eine 4- Phenylthiazol-2-yl-Gruppe ist,
und worin R&sup4; eine 4-Carboxyphenyl- und R³ eine 3,4- Methylendioxyphenyl-Gruppe sind, oder worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl-Gruppe eine 4-(p-Fluorphenyl)thiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4-Carboxyphenyl- und R³ eine 3,4-Methylendioxyphenyl- Gruppe sind, oder worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl- Gruppe eine 4-Phenyl-5-methylthiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4- Carboxyphenyl- und R³ eine 2-Thienyl- oder eine 4-Methylphenyl-Gruppe sind, oder worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolylgruppe eine 4- Naphthyl-5-phenylthiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4- Carboxyphenyl- und R³ eine 3,4-Methylendioxyphenyl- oder eine 2-Thienyl- Gruppe sind, worin X&supmin; jeweils ein Gegenion ist, wobei die Verbindungen des weiteren dadurch gekennzeichnet sind, daß das Reflektionsspektrum, das jede der genannten Verbindungen bei Reduktion in ihren gefärbten Formazan- Zustand ergibt, um weniger als ca. 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm schwankt, wenn der Mittelpunkt des Bereiches von 50 nm 640 nm oder mehr beträgt.
Fig. 1 bis 4 zeigen die Reflektionsspektren derjenigen Formazane, die bei Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT und NBT des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt werden.
Fig. 5 zeigt das entsprechende Spektrum für das Formazan, das aus der vorliegenden Verbindung 2-(4,5-Bis(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl)-3-(4- carboxyphenyl)-5-(2-thienyl)tetrazoliumsalz gebildet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere 2-(4,5-Bis(4- methoxyphenyl)thiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5-(2- thienyl)tetrazoliumsalze.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der obigen Verbindungen zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, vorzugsweise von NADH, sowie ein Reagens zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, wobei das Reagens eine oder mehrere dieser Verbindungen umfaßt.

Gegenanion

Die Auswahl des Gegenanions beruht in erster Linie auf Überlegungen im Hinblick auf Stabilität und Löslichkeit des besonderen Tetrazoliumsalzes von Interesse. Im allgemeinen kann man aus solchen Gegenanionen als anorganische Anionen Chlorid, Bromid, Jodid, Nitrat, Fluorborat, Perchlorat und Sulfat sowie als organische Anionen Acetat, Oxalat, Tartrat und Arylsulfonate (Benzolsulfonat, Tosylat) auswählen.

Synthetische Verfahren

Tetrazoliumsalze werden gemäß Verfahren hergestellt, die in der Literatur gut bekannt sind (Hooper W.D., Rev. Pure and Appl.Chem., 1969, 19, 221; Putter R., in Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl-Müller ed., Thieme Verlag: Stuttgart, 1965, Bd. 10/3, S. 633; Nineham A.W., Chem.Rev., 1955, S. 355-483). Im allgemeinen werden die Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man zuerst ein 2-Hydrazinothiazol mit einem Aldehyd reagieren läßt und dann das entstandene Hydrazon mit einem diazotierten Anilin behandelt. Das entstandene Formazan wird dann zum Tetrazoliumsalz gemäß bekannter Verfahren oxidiert. Demnach schließt die Synthese drei grundsätzliche Ausgangsmaterialien ein, nämlich den Aldehyd, das Anilin und das 2-Hydrazinothiazol.

Herstellung der 2-Hydrazinothiazole

4,5-Diphenyl-2-hydrazinothiazole werden gemäß zwei Verfahren hergestellt. Das eine beruht darauf, daß man zuerst ein Benzoin- Kondensationsprodukt (I) zwischen zwei Aldehyden bildet (Ide W.S., Buck J.S., Org.React., 1948, Bd. 4, 269). Benzoine, die mit diesem Verfahren nicht erhältlich sein sollten, werden hergestellt aus der Kondensation eines Phenyl-substituierten "Acylanion-Äquivalent" mit einem Aldehyd, worauf die Carbonyl-Schutzgruppe abgespalten wird (Bertz S., J. Chem.Soc., Chem. Comm., 1980, 17, 831). Ein spezifisches Beispiel ist die Kondensation des metallierten O-Trimethylsilylcyanhydrin (3) mit einem Arylaldehyd. Von dem Produkt (4) wird die Schutzgruppe unter Verwendung von wässriger Essigsäure abgespalten, um das Benzoin-Produkt (I) zu ergeben:
Die Benzoin-Produkte werden dann unter Verwendung herkömmlicher Reagentien wie von Thionylchlorid in das Halogenid (2) überführt, um die α- Haloketone (2) herzustellen, die mit Thioharnstoff umgesetzt werden, um 4,5-Diphenyl-2-aminothiazole herzustellen (Traumann V., Liebigs Ann. Chem. 1888, 250, 31, Dodson et al., J. Am. Chem. Soc., 1945, 67, 2442). Diese Verbindungen können in die 2-Hydrazino-Verbindungen mit Hydrazin überführt werden, wie beschrieben für die Benzo-Beispiele.
Dieselben α-Haloketone reagieren mit Thiocyanat, um α- Thiocyanatoketone (5) herzustellen, die rasch einen Ring bilden. Die Behandlung mit Chlorwasserstoffgas werden beispielsweise die 2-Chlorthiazole (6) erhalten, die mit Hydrazin reagieren, um die 2-Hydrazinothiazole zu ergeben:
Alternativ dazu, können die α-Haloketone verwendet werden, um direkt das benötigte Hyrazon (8) zu ergeben, indem man das Haloketon mit einem N- Arylthiosemicarbazon (7) behandelt (Johne S., Schaks A., Hartung S., Scharf K.-D. und Nover L., Pharmazie, 1979, 34, 790):
Thiazole, die in der 4-Position mit einem Arylrest und in der 5- Position mit einem Alkylrest oder Wasserstoff substituiert sind, können in ähnlicher Weise mit einem α-Haloketon und Thiosemicarbazon oder Thioharnstoff hergestellt werden:
R¹ = Alkyl, Wasserstoff
R² = Aryl

Herstellung der Aldehyde

Die Aldehyde werden aus handelsüblichen Quellen erhalten oder können mit Verfahren hergestellt werden, mit denen der einschlägige Durchschnittsfachmann vertraut ist. Beispielsweise können Aldehyde durch benzylische Oxidation eines Arylmethans (March J., Advances Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 1079) durch Reduktion eines Arylsäurechlorids (ibid., S. 396) oder eines Arylsäurederivats (Larock R.C., Comprehensive Organic Transformations, VCH: New York, 1989, S. 604- 605) hergestellt werden.
Arylhalogenide können ebenfalls zur Synthese von Aldehyden verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird durch eine Transmetallierungsreaktion eine arylmetallische Species erzeugt, die mit einer Vielzahl von Reagentien, wie mit Dimethylformamid, behandelt werden kann, um den Aldehyd herzustellen (ibid., S. 681-683).
Die vorgenannten Arylaldehyde, Säuren, Methane und Halogenide können mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen derivatisiert sein, bevor sie in die entsprechenden Tetrazoliumsalze überführt werden. Dies kann durch aromatische nukleophile Substitution (March J., Advanced Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 576-607), durch aromatische elektrophile Substitution (ibid., S. 447-511) oder durch Heteroatom-gesteuerte Metallierungsreaktionen bewerkstelligt werden (Gschwend H.W., Rodriguez H.R., in Organic Reactions, John Wiley and Sons: New York, 1979, Vol. 26, 1).
Enthält der Aldehyd-Teil des Tetrazoliumsalzes ein Phenol oder Amin, müssen die Gruppen geschützt werden, so daß keine Reaktion von diesen mit dem diazotierten Anilin oder mit einem oxidierenden Reagens erfolgt, welche zur Herstellung des Tetrazoliumsalzes eingesetzt und angewandt werden.
Dies kann durchgeführt werden, indem man einen Hydroxyarylaldehyd als ein Acetat schützt, wobei man die Reaktionsabfolge durchführt, um das Formazan herzustellen, worauf man das Acetat bei pH 10 hydrolysiert. Ansäuerung auf pH 5 und anschließende Filtration ergeben das gewünschte Formazan.
Sollte das sich ergebende Phenol-Formazan mit einem oxidierenden Mittel bei der Tetrazoliumsalz-Herstellung reagieren, muß das Phenol mit einer Säure-labilen Gruppe wie mit Dihydropyran geschützt werden (Greene T.W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and sons: New York; 1981, S. 87-113), worauf die Gruppe durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen abgespalten wird.
Ebenso müssen Amine am Aldehyd-Teil geschützt werden, um deren Reaktion zu verhindern. Dies wird am besten mit einem Säure-labilen Carbamat bewerkstelligt (ibid. S. 218-247), welches später durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen abgespalten wird.

Herstellung der Arylamine

Die Arylamine können durch Reduktion der entsprechenden Nitro- oder Azid-Verbindungen (Larock P.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, S. 412-415 oder 409-410), durch Reaktion einer arylmetallsichen Verbindung mit einem elektrophilen Stickstoff-Reagens (ibid, S. 399-400) oder durch Umlagerung von Acylaziden oder oxidierten Amiden (ibid., S. 431-432) hergestellt werden.
Wie im Fall der Aldehyde, können elektrophile und nukleophile aromatische Substitutionen angewandt werden, um verschiedene funktionelle Gruppen in die Arylamine oder die synthetischen Vorstufenverbindungen einzuführen.

Verwendung der Verbindungen

Die hauptsächliche Verwendung der Tetrazoliumsalz-Verbindungen der vorliegenden Erfindung betrifft chromogene Indikatoren zum Nachweis reduzierender Substanzen. Insbesondere werden die vorliegenden Verbindungen in vorteilhafter Weise zum Nachweis von NADH eingesetzt und angewandt. Da NADH in Enzym-katalysierten Nachweisreaktionen erzeugt wird, die spezifisch für verschiedene biochemische Substanzen sind, werden somit die vorliegenden Verbindungen insbesondere in medizinischen Diagnosetestverfahren verwendet. Ganz allgemein können jedoch auch weitere reduzierende Substanzen nachgewiesen werden, wie Schwefelwasserstoffgas, Diboran, Arsenhydrid oder Phosphorhydrid.
Die vorliegenden Verbindungen zeigen bzw. ergeben insbesondere ein ausgedehntes Plateu in ihrem Reflektionsspektrum oberhalb ca. 600 nm. Die am meisten bevorzugten Indikator-Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen ein Plateu oberhalb 650 nm auf (d. h., der flachste ca. 50 nm breite Teilbereich beginnt zwischen 640 und 660 nm). Ein solches Reflektionsplateau ergibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Testvefahren auf Basis der Reflektionsmessung aus einem Reagensstreifen. Reagensstreifen sind im Stand der Technik als analytische Vorrichtungen bekannt, die eine feste Trägermatrix umfassen, die mit einer Testzusammensetzung beaufschlagt ist, die eine Farbänderung in Reaktion auf den Kontakt mit einer flüssigen Testprobe erzeugt, die den Analyt von Interesse enthält. Eine solche Testzusammensetzung enthält, im Falle der vorliegenden Erfindung, (a) ein Reagens oder Reagentien, die mit dem Analyt reagieren, um eine reduzierende Substanz zu erzeugen, und (b) ein hier beschriebenes 2-Thiazolyltetrazoliumsalz, das durch eine solche reduzierende Substanz reduzierbar ist, um ein chromogenes Formazan-Farbstoffprodukt zu erzeugen. Die Farbreaktion solcher Reagensstreifen kann visuell betrachtet und erfaßt werden, um halbquantitative Werte zu ergeben, wobei jedoch auch quantitative Ergebnisse erhältlich sind, und zwar durch Messung der Reflektion der Trägermatrix bei einer vorbestimmten Wellenlänge. Solche Messungen beinhalten, daß man die zur Reaktion gebrachte Trägermatrix mit einer Lichtquelle bestrahlt und die Reflektion der Trägermatrix sensorisch erfaßt, indem man das reflektierte Licht mit einem Detektorelement mißt.
Das Auffinden von Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die ein Reflektionsplateau aufweisen, ist dann von besonderem Vorteil und nötig, wenn die Reflektion aus einem Reagensstreifen mit einem Gerät abgelesen wird, das Schwankungen im Zentralwellenbereich seines optischen Systems (der Kombination von Lichtquelle, Detektorelement, Spektralsteuerelementen, z. B. Filtern, und von weiteren Komponenten) unterliegt. Schwankungen im Zentralwellenlängenbereich des optischen Systems können durch eine Vielzahl von Faktoren verursacht werden, z. B. Schwankungen im Zentralwellenbereich des hauptsächlichen Spektralsteuerelements, die der Beleuchtungslichtquelle oder Filter. Werden beispielsweise Licht-emittierende Dioden (LEDs) als die Lichtquelle verwendet, schwankt die Wellenlänge des emittierten Lichts in typischer Weise um ±4 nm innerhalb eines Geräts und um bis zu ±8 nm unter LEDs in verschiedenen Geräten, und zwar aufgrund von Herstellvarianzen. Ausserdem sind LEDs auch empfindlich bezüglich schwankenden Zentralwellenlängen, die durch Temperatureinflüsse verursacht werden. Werden Breitband-Lichtquellen mit Filtern angewandt, um eine Spektralsteuerung der Zentralwellenlänge zu ergeben, liegt der Schwankungsbereich innerhalb eines Geräts in typischer Weise unter 1 nm, kann aber von Gerät zu Gerät um bis zu ± 6 nm schwanken. Somit wird die vorliegende Erfindung für diejenigen Fälle angewandt, in denen die Zentralwellenlänge des das Detektorelement erreichenden Lichts im Gerät gegenüber Schwankungen im Bereich von ca. ±5 nm emfpindlich ist.
Bei der Herstellung eines Reagensstreifen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Auswahl der Trägermatrix, die Testreagentien, die mit Analyt zur Erzeugung der reduzierenden Substanz reagieren, und das Verfahren, wodurch solche Reagentien und Tetrazolium-Indikator auf die Trägermatrix aufgebracht werden, im Stand der Technik von Reagensstreifen gut bekannt. Um nur einige Beispiele aufzuführen, sind typische Trägermatrices poröses und absorbierendes Papier, Tuch, Glasfaserfilter, polymere Membra nen und Filme und dgl.. Beaufschlagungsverfahren schließen die Imprägnierung einer gebildeten Trägermatrix mit einer Lösung, Suspension oder einer sonstigen flüssigen Form der Testzusammensetzung, in einer oder mehreren Stufen, und anschließende Trocknung der Matrix, die Bildung einer Matrix in der Gegenwart einer oder mehreren der Komponenten der Testzusammensetzung, z. B. durch Gießen oder Beschichten mit Lösungen eines Films, oder Membran bildende Zubereitungen ein.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die vorliegenden Beispiele noch weiter erläutert, soll aber nicht auf diese eingeschränkt sein.

Beispiele

A. Verbindungssynthese

Hydrazon-Herstellungen

Herstellung von Arylaldehyd-4,5-diarylthiazol-2-ylhydrazonen und von Arylaldehyd-4-aryl-5-alkyl- oder -wasserstoffthiazol-2-ylhydrazonen

Eine Mischung aus 50 mMol des Thiosemicarbazon, 50 mMol des α- Chlorketon und aus 100 mMol Pyridin in 200 ml Ethanol wurde 1 h lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.

Herstellung von Arylaldehyd-4-styryl-5-arylthiazol-2-ylhydrazonen

Verbindungen des Typs 1,4-Diaryl-2-oxo-3-buten wurden durch das Verfahren von S.A. Fine und P.D. Pulaski in J. Org.Chem.38, 1747 (1973) hergestellt. Gemäß dem Verfahren von P.L. Southwick und D.I. Sapper in J. Org.Chem. 1926 (1954) wurde eine Mischung aus 130 mMol 1,4-Diaryl-2-oxo- 3-buten, 130 mMol Jod und aus 260 mMol eines Thiosemicarbazon in 1,2 l Ethanol 5 h lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.

Formazan-Herstellung

Das Diazoniumsalz wird hergestellt, indem man zuerst eine Aufschlämmung oder Lösung von 8,5 mMol des Amin in 60 ml 3 N HCl auf 5ºC abkühlt. Natriumnitrit (0,70 g, 10,15 mMol) in 5 ml Wasser wird dann zugetropft. Nach 30minütigem Rühren wird die Mischung zu einer kalten (-25ºC) Mischung aus 8,5 mMol des Hydrazon in 120 ml 1 : 1 (V/V) DMF-Pyridin getropft. Man läßt die Temperatur der Reaktion während der Zugabe nicht auf oberhalb - 15ºC ansteigen. Die Mischung wird auf Raumtemperatur erwärmt, wobei man 2 h lang rührt. Filtration ergibt das Formazan als schwarzen Feststoff. Verunreinigungen können durch wiederholtes Waschen mit Methanol oder Rückflußsieden des Feststoffs in Methanol und Heißfiltrieren beseitigt werden.

Tetrazoliumsalz-Herstellung

Eine Aufschlämmung von 1,5 mMol des Formazan wird mit 20 ml Essigsäure und 4 ml Isoamylnitrit über eine Dauer von 16 bis 48 h gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, um das Tetrazoliumsalz zu ergeben. Fällt das Salz nicht aus, ergab eine Verdünnung mit Ether die Fällung.

B. Herstellung von Reagensstreifen

Reagensstreifen wurden mit Indikatoren imprägniert und mit einer Lösung getestet, die eine bekannte Menge Glucose oder NADH enthält. Der Reagensstreifen besteht aus einem Griff aus Polystyrol auf dem eine Einzelreagensunterlage befestigt ist. Die Reagensunterlage war ca. 0,5 · 0,5 cm² groß und enthält Reagentien, die eine Farbänderung ermöglichen, die instrumentell abgelesen wurde, als eine Anteilsmenge einer Glucose enthaltenden Probe aufgebracht wurde. Die Trockenphasen-Reagensunterlage ist beispielsweise eine feste Trägerunterlage aus Cellulosefasern oder aus einer Nylon- Membran. Die Reagensunterlage wurde erst mit einer Lösung des Tetrazoliumsalzes von Interesse (0,8 m/l) und Detergens (0,3%) in einem Lösungsmittel wie Methanol imprägniert. Die zweite Lösung, mit der die Reagensunterlage imprägniert wird, enthält die folgenden Komponenten:
Glucose-Dehydrogenase (GDH) 0,8 E/l
Diaphorase (DPH) 0,8 E/l
NAD 0,03 Mol/l
PIPES-Puffer 0,15 Mol/l
Detergens 0,5
Ca. 0,01 ml verschiedener Testlösungen (Serum, Plasma wässrig), enthaltend mindestens 5 verschiedene Glucose- oder NADH-Konzentrationen von 0 bis 33 mM/l, wurden auf das Zentrum der getrockneten Reagensunterlage aufgebracht. Nach einem Zeitablauf von ca. 60 Sekunden wurden die Reflektionsspektren eines jeden Indikators bei Inkrementen von 5 nm über den Wellenlängenbereich von 400 bis 1100 Nanometer aufgenommen und gemessen.

C. Gebrauchsdaten

Im folgenden ist eine Tabelle spektraler und weiterer analytischer Daten angegeben, welche verschiedene synthetisierte Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung betreffen. Die Verbindungen sind jeweils durch die Art ihres Thiazolyl-Rests, dann durch deren R&sup4;-Substituent und schließlich durch deren R³-Substituent der Reihe nach angegeben.
Beispielsweise ist die erste aufgeführte Verbindung A.1.a) und weist die Formel A auf, worin R¹ und R² beide 4-Methoxyphenyl, R4 4- Carboxyphenyl und R³ 2-Thienyl sind; die zweite Verbindung B.1.a) weist ei nen anderen Thiazolyl-Rest (R¹ und R² sind beide unsubstituiertes Diphenyl) auf, R&sup4; ist Carboxyphenyl, und R³ ist 3,4-Methylendioxyphenyl; usw..
Das Reflektionsspektrum des Tetrazoliumsalzes ist, wie zu verstehen ist, abhängig von der Umgebung, worin es aufgenommen oder gemessen wird. Für Vergleichszwecke unter den jeweiligen Tetrazoliumsalzen schließen die unten angegebenen Daten eine Messung der relativen Flachheit des flachsten Teilbereichs des Reflektionsspektrum bei Wellenlängen oberhalb 600 nm ein, wobei das Spektrum unter Verwendung eines Glucose- oder Cholesterin- Reagensstreifen erzeugt ist, welche gemäß obigem Teil B hergestellt sind. Die realtive Flachheit des Spektrum ist in den Daten in K/S-Einheiten ausgedrückt, die bezüglich der Gehaltsmenge von nachgewiesenem Analyt normalisiert sind, wie unten definiert.
K/S ist durch die Gleichung definiert:
worin R instrumentell abgelesene Reflektionseinheiten sind. Die Prozentänderung beim Wert für K/S ist die Änderung, ausgedrückt als Prozentsatz, über einen Bereich von 50 nm, dividiert durch den Durchschnittswert der hohen und niedrigen K/S-werte über den Bereich.
Plateau-Eigenschaft der vorliegenden Verbindungen soll für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als eine Prozentänderung im Reflektionsspektrum (ausgedrückt, bezogen auf K/S. wie im obigen Abschnitt definiert) von weniger als ca. 17%7 über einen Wellenlängenbereich von 30 bis 50 nm, beginnend bei einer Wellenlänge von oberhalb 600 nm, verstanden sein. Die bevorzugteren Verbindungen ergeben bzw. zeigen ein Plateau, das eine Prozentänderung in K/S von weniger als ca. 10% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm aufweist. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die eine Prozentänderung in K/S von ca. 5% oder weniger über einen Wellenlängenbereich von 50 nm ergeben bzw. zeigen. Verbindungen, die ein abgeflachteres Reflektionsspektrum aufweisen, sind dennoch bevorzugt, wenn der flachste Teilbereich bei einer Wellenlänge oberhalb 650 nm, vorzugsweise oberhalb 675 nm, liegt.
Bezüglich der Darstellungen zeigen Fig. 1 bis 4 die Reflektionsspektren der Formazane, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT und NBT des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind. Für Vergleichszwecke zeigt Fig. 5 das entsprechende Spektrum für die vorliegende Verbindung (siehe Verbindung A-1-a in der unten angegebenen Tabelle), getestet mit verschiedenen Gehaltsmengen von NADH. Das Vorliegen eines Plateau in den Spektren der aus den vorliegenden Verbindungen gebildeten Formazane und dessen Abwesenheit in denjenigen der aus den Verbindungen des Standes der Technik gebildeten Formazane ist sofort erkennbar.
Die vier oben genannten Verbindungen des Standes der Technik ergeben Prozentänderungen bei den K/S-Werten über den Wellenlängenbereich von 650 bis 700 nm wie folgt:
INT 71%
MTT 178%
NBT 73%
USSR 28%
Je niedriger der Prozentwert beim K/S-Wert für das Formazan ist, desto toleranter ist das Tetrazoliumsalz bezüglich Schwankungen bei der Zentralwellenlänge des zur Reflektionsmessung angewandten optischen Systems, was somit auch für die Messung der Analyt-Konzentraiton gilt.
Die folgenden Nicht-Standard-Abkürzungen werden im unten angegebenen Text verwendet:
"UV" - Die Wellenlänge in Nanometern des maximalen Reflektionspeak im UV-Reflektionsspektrum des Formazans. Extinktionskoeffizient und zur Messung verwendetes Lösungsmittel sind in Klammern angegeben.
"nm" - Die Position des flachsten Teilbereichs des Reflektionsspektrum des Formazans über einen Wellenlängenbereich von 50 nm (ausgedrückt als der Beginn und das Ende der Wellenlängen in nm).
"K/S" - Die Prozentänderung in K/S-Einheiten über den oben genannten flachsten 50 nm breiten Teilbereich des Reflektionsspektrum. Die Konzentration an Analyt, die zur Erzeugung des Reflektionsspektrum angewandt ist, ist in Klammern angegeben. mMol betrifft die Konzentration in mMol/Liter.

Tabelle

A. 4,5-Bis(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl
1. R&sup4; = 4-Carboxyphenyl
a) R³ = 2-Thienyl
UV: 623 (11,6 · 10³, Wasser)
nm: 660-710 nm; K/S: 9% (14 mMol)
B. 4,5-Diphenylthiazol-2-yl(Vergleichsbeispiele)
1. R&sup4; = Carboxyphenyl
a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
UV: 495 (12,6 · 10³, Wasser)
nm: 630-680 nm; K/S: 16% (15 mMol)
b) R³-4-Methoxyphenyl
UV: 613 (8,66 · 10³, Wasser)
nm: 630-680 nm; K/S: 17% (8 mMol)
c) R³ = 2-Thienyl
UV: 602 (8,22 · 10³, Wasser)
nm: 635-685 nm; K/S: 18% (9 mMol)
d) R³ = 3-Thienyl
UV: 599 (11,8 · 10³, Wasser)
e) R³ = 4-Fluorphenyl
UV: 592 (13,6 · 10³, Wasser)
nm: 625-675 nm; K/S: 11% (33 mMol)
f) R³ = 4-Hydroxyphenyl
UV: 620 (11,2 · 10³, Wasser)
2. R&sup4; = Phenyl
a) R³ = 2-Thienyl
UV: 571 (9 · 10³, Wasser)
nm: 640-690; K/S: 4% (14 mMol)
3. R&sup4; = 3-Pyridyl
a) R³ = 4-Methoxyphenyl
UV: 589 (11,8 · 10³, Wasser)
nm: 620-670 nm; K/S: 15% (15 mMol)
4. R&sup4; = 8-Chinolyl
a) R³ = Phenyl
UV: 607 (14,4 · 10³, Wasser)
nm: 620-680 nm; K/S: 21% (15 mMol)
5. R&sup4; = 4-Nitronaphthyl
a) R³ = 3-Thienyl
UV: 695 (10,4 · 10³, Wasser)
nm: 620-670 nm; K/S: 12% (14 mMol)
6. R&sup4; = 4-Sulfophenyl
a) R³ = 2-Thienyl
UV: 610 (6,0 · 10³, Wasser)
7. R&sup4; = 3,5-Dicarboxyphenyl
a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
UV: 597 (5,2 · 10³, Wasser)
nm: 620-670 nm, K/S: 7% (14 mMol)
C. 4-Phenylthiazol2-yl
1. R&sup4; = 3,4,5-Trimethoxyphenyl (Vergleichsbeispiel)
a) 3,4-Methylendioxyphenyl
nm: 645-695 (K/S: 28% (8,3 mMol)
2. R&sup4; = 4-Carboxyphenyl
a) R³ = 3,4-Mehylendioxyphenyl
nm: 620-670; K/S: 11% (8,3 mMol)
D. 4-(p-Fluorphenyl)thiazol-2-yl
R&sup4; = 3,4,5-Trimethoxyphenyl(Vergleichsbeispiel)
a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
nm: 645-695; K/S: 19% (8,3 mMol)
2. R&sup4; = 4-Carboxyphenyl
a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
nm: 625-675; K/S: 12% (8,3 mMol)
E. 4-Phenyl-S-methylthiazol-2-yl
1. 3,4,5-Trimethoxyphenyl (Vergleichsbeispiel)
a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
nm: 625-675; K/S: 22% (8,3 mMol)
2. 4-Carboxyphenyl
a) R³ = 2-Thienyl
nm: 600-650; K/S: 10% (10,3 mMol)
b) 4-Methylphenyl
nm: 580-630; K/S: 5% (10,3 mMol)
F. 4-Naphthyl-5-phenylthiazol-2-yl
1. R&sup4; = 4-Carboxyphenyl
a) R³ = 3,4-Methylendioxyphenyl
nm: 620-670; K/S: 10% (8,3 mMol)
b) R³ = 2-Thienyl
nm: 600-650; K/S: 4 (10,3 mMo)
G. 4-Styryl-5-phenylthiazol-2-yl (Vergleichsbeispiel)
1. 3,4,5-Trimethoxyphenyl
a) 3,4-Methylendioxyphenyl
nm: 670-720; K/S: 21% (10,3 mMol)

Claims

1. Phenyl-substituierte 2-Thiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren, gekennzeichnet durch die Formel:

worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolylgruppe eine 4,5-Bis(4-methoxyphenylthiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4- Carboxyphenyl- und R³ eine 2-Thienyl-Gruppe sind, worin X&supmin; jeweils ein Gegenion ist, wobei die Verbindungen des weiteren dadurch gekennzeichnet sind, daß das Reflektionsspektrum, das jede der genannten Verbindungen bei Reduktion in ihren gefärbten Formazan-Zustand ergibt, um weniger als ca. 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm schwankt, wenn der Mittelpunkt des Bereiches von 50 nm bei 640 nm oder mehr liegt.

2. Phenyl-substiutierte 2-Thiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren, gekennzeichnet durch die Formel:

worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl-Gruppe eine 4- Phenylthiazol-2-yl-Gruppe ist,

und worin R&sup4; eine 4-Carboxyphenyl- und R³ eine 3,4- Methylendioxyphenyl-Gruppe sind, oder worin R1 und R2 so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl-Gruppe eine 4-(p-Fluorphenyl)thiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4-Carboxyphenyl- und R³ eine 3,4-Methylendioxyphenyl- Gruppe sind, oder worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolyl- Gruppe eine 4-Phenyl-5-methylthiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4- Carboxyphenyl- und R³ eine 2-Thienyl- oder eine 4-Methylphenyl-Gruppe sind, oder worin R¹ und R² so beschaffen sind, daß die 2-Thiazolylgruppe eine 4- Naphthyl-5-phenylthiazol-2-yl-Gruppe ist, und worin R&sup4; eine 4- Carboxyphenyl- und R³ eine 3,4-Methylendioxyphenyl- oder eine 2-Thienyl- Gruppe sind, worin X&supmin; jeweils ein Gegenion ist, wobei die Verbindungen des weiteren dadurch gekennzeichnet sind, daß das Reflektionsspektrum, das jede der genannten Verbindungen bei Reduktion in ihren gefärbten Formazan- Zustand ergibt, um weniger als ca. 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 nm schwankt, wenn der Mittelpunkt des Bereiches von 50 nm bei 640 nm oder mehr liegt.

3. 2-(4,5-Bis(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5- (2-thienyl)tetrazoliumsalz.

4. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Nachweis einer reduzierenden Substanz.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die reduzierende Substanz NADH ist.

6. Reagens zur Bestimmung einer reduzierenden Substanz, wobei das Reagens eine oder mehrere der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.