DE69122824T2

DE69122824T2 - Analytisches Verfahren unter Verwendung von Tetrazoliumsalzindikatoren mit Reflektionsplateau

Info

Publication number: DE69122824T2
Application number: DE69122824T
Authority: DE
Inventors: Robert P Hatch; Juergen Koecher; Nan-Horng Lin; Scott Ruetten; Klaus Wehling
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1990-09-19
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2011-09-07
Also published as: AU635151B2; JP3069170B2; EP0476454A1; US5126275A; CA2049231C; CA2049231A1; ATE144622T1; ES2093664T3; DE69122824D1; AU8341991A; GR3021993T3; EP0476454B1; DK0476454T3; JPH04340466A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Tetrazoliumsalz- Indikator-Verbindungen, die zur Bestimmung reduzierender Substanzen, insbesondere von Nikotinamidadenindinukleotid (NADH), verwendet werden können.
Tetrazoliumsalze sind als chromogene Indikatoren wohlbekannt, die gegenüber reduzierenden Substanzen eine Reaktion zeigen. Bei ihrer Reduktion werden Tetrazoliumsalze in Formazan-Farbstoffprodukte überführt Diese Indikatoren haben auf vielen Gebieten Verwendung gefunden, insbesondere auf dem Gebiet der medizinischen Diagnose, wo sie u.a. bei der Zellfärbung sowie der Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten wie Urin, Milch, Serum und Plasma angewandt worden sind. Gewöhnlich beinhaltet die Bestimmung von Analyten einer Körperflüssigkeit eine NAD-abhängige enzymatische Reaktion, bei der NADH als eine Funktion der Menge des in der getesteten Probe vorhandenen Analyt gebildet wird. Die Menge an erzeugtem NADH läßt sich dann durch die reduktive Umwandlung eines geeigneten Tetrazoliumsalz-Indikators in sein Formazan-Farbstoffprodukt ermitteln und bestimmen.
Aus dem Gebiet von Testverfahren zur medizinischen Diagnose sind Tetrazoliumsalz-Indikatoren in einer Vielzahl unterschiedlicher Produkttypen verwendbar. Ein besonderer Typ ist der Reagensstreifen. Dieses Produkt stellt eine Vorrichtung in festem Zustand dar, die ein Papier oder eine andere poröse Trägermatrix aufweist, die mit chemischen Reagentien imprägniert oder auf sonstige Weise beaufschlagt sind, welche gegenüber einem besonderen Analyt, z.B. Glucose oder Cholesterol, eine Reaktion zeigen. Das auf- bzw. eingebrachte Reagens-System schließt einen chromogenen Indikator ein, der eine Farbe oder Farbänderungen als eine Funktion der Menge des in einer Probe vorhandenen Analyt entwickelt, die auf die Matrix aufgebracht wurde. Die sich ergebende kolorimetrische Reaktion kann in Augenschein genommen werden, um qualitative oder halb-quantitative Ablesungen zu ermöglichen. Quantitative Ergebnisse sind erhältlich, indem man die Reflexion bzw. entsprechende Werte der Matrixoberfläche bei einer oder mehreren definierten Wellenlängen mit einem geeigneten Gerät (Reflexionsmeßgerät} abliest.
Es besteht ein anerkanntes Bedürfnis, Tetrazolium-Indikatoren zu entwickeln, die ein starkes Absorptionsvermögen bei Wellenlängen aufweisen, die in einem längeren Wellenlängenbereich als die entsprechenden Absorptionswerte häufiger vorkommender störender Substanzen liegen, die in der Testprobe vorhanden sein können. Beispielsweise stellt eine Störung aus bzw. durch eine Hämoglobin-Färbung ein besonderes Problem dar, wenn die Probe Gesamtblut ist. Es sind dann Indikatoren, die eine signifikante Absorption oberhalb ca. 640 nm aufweisen, erforderlich, um eine Störung durch Hämoglobin im wesentlichen zu überwinden. Die gewöhnlich verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren sind 2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- phenyltetrazoliumchlorid (INT), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumchlorid (MTT) und 2,2', 5,5'-Tetraphenyl-3,3'- (3,3'- dimethoxy-4,4'-diphenylen)ditetrazoliumchlorid (NBT) . Diese Verbindungen zeigen maximale Absorption (UVmax) im Bereich von 465 bis 605 nm.
Ein weiterer Nachteil herkömmlich verwendeter Tetrazoliumsalz- Indikatoren des Standes der Technik betrifft die Entwicklung der zur Messung von deren kolorimetrischer Reaktion eingesetzten Gerätschaften. Es werden rasche Fortschritte bei der Entwicklung kleinerer, billigerer Reflexionsmeßgeräte gemacht. Eine der teureren Komponenten derartiger Meßgeräte stellt das optische System dar, das eine Lichtquelle, einen Filter oder weitere Spektralelemente zur Auswahl oder Eingrenzung der Wellenlänge des ein- oder austretenden Lichts sowie einen Sensor umfaßt. Beachtliche Kosteneinsparungen konnten realisiert werden, indem Funktionen der Elemente des optischen Systems weggelassen oder zusammengefaßt oder weniger teure Komponenten, z.B. LEDs als lichtaussendende Quellen, verwendet wurden. Allerdings emittieren handelsübliche LEDs ein Licht, das eine Zentralwellenlänge aufweist, die wegen Fertigungs- bzw. Herstellvarianzen und aufgrund von Temperaturabhängigkeit signifikant schwanken kann. Die herkömmlich verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren INT, MTT und NBT weisen Reflexionsspektren auf, die im Bereich oberhalb ihres UVmax stark geneigt bzw. abgeschrägt sind. Demzufolge können, wenn man nicht sowohl jedes Gerät bezüglich der Herstellvariabilität des der LED als auch jeden Testlauf bezüglich der Temperaturschwankung jeweils einzeln kalibriert, große Fehler beim Ergebnis eines Assayverfahrens auftreten.
Es wird nun eine repräsentative Darstellung der Lehren des einschlägigen Standes der Technik abgehandelt, betreffend die Verwendung verschiedener Tetrazoliumsalze bei der kolorimetrischen Analyse. Tanaka et al, JP 61000084 (Chem. Abst. 104:203469y), beschreiben den Nachweis von Glucose unter Verwendung eines Formazan-Chelat, das durch die Reduktion von 2-(2- Benzothiazolyl)-3-(carboxyphenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumhalogenid in der Gegenwart von Nickel(II) erhalten wird. Limbach et al, DE 32 47 894 (Chem. Abst. 101:125929v), beschreiben die Verwendung von INT Glucose- Assayverfahren. Rittersdorf et al, DE 21 47 466, beschreiben die Verwendung von sieben 2-(2-Benzothiazolyl)-3-phenyl-5-(4-(trimethylammonium)phenyl)tetrazoliumsalzen bei der Bestimmung reduzierender Substanzen wie reduzierender Zucker, von Ascorbinsäure und Ketosteroiden.
Die Vielzahl von 2-Thiazolyltetrazoliumsalzen und/oder deren entsprechenden Formazanen, welche in der Literatur bekannt sind, werden nun im folgenden abgehandelt. Serebryakova et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. 10:1403-1405 (1970), beschreiben Synthese und chromatische Eigenschaften von Benzothiazolyl-3-phenyl(methyl)-5-p-nitro(dimethylamino)phenylformazanen. Die Autoren stellen fest, daß sowohl eine Elektronen-abziehende Nitrogruppe in der para-Position der N-5-Phenylgruppe als auch eine Benzothiazolylgruppe in der N-1-Position eine bathochrome Verschiebung ergeben. Bednyagina et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. 2:342-345 (1967), beschreiben die Synthese von 1-Benzothiazolyl- und 1-Benzoxazolyl-3- methyl(oder phenyl)-5-arylformazanen. Die Beziehung zwischen der Farbtiefe und der Basizität des Heterozyklus werden ebenfalls diskutiert. Gulemina et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. 6:774-777 (1974), beschreiben den Effekt einer o-Nitroguppe auf Struktur und Eigenschaften von Benzothiazolylformazanen. Die Ionisierungskonstanten sowie IR- und UV-Spektren wurden bestimmt und auf die Struktur bezogen. Lipunova et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. 4:493 - 499 (1974), beschreiben die Herstellung von 3-(Methyl, Isoprpoyl, Phenyl)-1-benzothiazolyl-5-nitrophenylformazanen sowie deren spektrale Eigenschaften. Gulemina et al, zh. Prikl. Spektrosk. 22(5): 941-943 (1975), beschreiben die Beobachtung eines sowohl positiven als auch negativen UV- Thermochromismus, abhängig von Lösungsmittel und Temperaturänderungsbedingungen, für 1-Benzothiazolyl-, 1-Thiazolyl- und 1-(5-(Bromthiazolyl)-3- methyl-5-(p-nitrophenyl)formazanen. Ponyaev et al, Zh. Obshch. Khim. 55(11):2615-2617 (1985), beschreiben kinetische Untersuchungen einer Interkonversion der photoinduzierten Formen von 1-Benzothiazolyl-3-methyl-5- phenylformazan-Analoga. Es wurde aufgezeigt, daß diese Formen tiefer gefärbt als Triphenylformazan sind. Lipunova et al, Khim. Geterotsikl. Soedin. (1971) 831-835, vergleichen den bathochromen Effekt einer N-5- Naphthyl- oder -o-Tolylgruppe auf das sichtbare Spektrum von N-1- Benzothiazolylformazanen. Johne et al, Pharmazie 34:790-794 (1979), beschreiben die Verbindungen 1-(4-Methyl-5-carbethoxythiazol-2-yl)-3-(3- pyridyl)-5-(2-carboxyphenyl) formazan und 1-(4-Methyl-5-carbethoxythiazol-2- yl)-3-(2-pyridyl)-5-(2-carboxyphenyl)formazan sowie bestimmte 2-(4,5- Diphenylthiazol-2-yl) tetrazoliumsalze.
Verschiedene 2-Benzothiazolyltetrazoliumsalze und entsprechende Verbindungen sind auch auf photographischem Gebiet angewandt worden, wie dies gemäß der Beschreibungen in US 3.655.382 und 4.221.864 dargestellt ist.
WO 90/12318, eine Entgegenhaltung unter Art. 158 (2) und Art. 54 (3) und (4) EPÜ, beschreibt ein Assayverfahren, wobei eine Albumin-Tetrazolium- Wechselwirkung genutzt wird. WO 88/8882 betrifft ein Verfahren zur Abschätzung reduzierter Pyrimidin-Nukleotide. In JP 177 059 ist ein analytisches Element zur Bestimmung eines Coenzym vom reduzierten Typ offenbart.
Es ist nun herausgefunden worden, daß 2-Thiazolyltetrazoliumsalze der unten angegebenen Formel (A) durch ein Reflexionsspektrum gekennzeichnet sind, das ein ausgedehntes Plateau oberhalb ca. 600, vorzugsweise oberhalb ca. 650, nm aufweist. Ein derartiges Reflexionsplateau ergibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Assayverfahren, bei denen eine Testprobe mit einer Reagensstreifen-Testvorrichtung in Kontakt gebracht wird, die eine feste Trägermatrix aufweist, welche wiederum mit einer für den Test vorgesehenen Zusammensetzung beaufschlagt ist, die (a) Reagentien, die mit dem genannten Analyt zur Erzeugung einer reduzierenden Substanz, z.B. von NADH, reagieren, sowie (b) eine Indikator-Verbindung enthält, die ihrerseits durch dieses reduzierende Mittel reduziert wird, um ein chromogenes Farbstoffprodukt zu erzeugen, wobei dann das chromogene Farbstoffprodukt gemessen wird, indem man die Trägermatrix mit einer Lichtquelle bestrahlt, die eine Zentralwellenlänge oberhalb ca. 600 nm aufweist, und man die Reflexion der Trägermatix mit einem Sensor erfaßt, indem das reflektierte Licht mit einem Detektor-Element gemessen wird. Die Eigenschaft des Reflexionsplateau der vorliegenden Verbindungen ist von besonderer Wichtigkeit bei denjenigen Situationen bzw. Bedingungen, bei denen das Licht, das das Detektor-Element erreicht, aus einem engen Wellenlängenband besteht, dessen Zentralwellenlänge Abweichungen von mehr als ca. ±5 nm unterliegt, z.B. wenn LED- Lichtquellen eingesetzt sind.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen offenbart.
Die Thiazolyltetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung weisen die Formel auf:
In Formel A sind R³ eine Aryl- oder Styrylgruppe, R&sup4; eine Arylgruppe und X ein geeignetes Gegenanion.
Bezüglich der Substituenten R¹ und R² können die vorliegenden Verbindungen, aus Gründen der Übersichtlichkeit, in vier Hauptgruppen eingeteilt werden:
Verbindungen der Gruppe 1 - die unsubstituierten Benzothiazolyl- Verbindungen, in denen R¹ und R², zusammengenommen, einen Benzoring bilden, der unsubstituiert ist,
Verbindungen der Gruppe 2 - die substituierten Benzothiazolylverbindungen, in denen R¹ und R², zusammengnommen, einen Benzoring bilden, der substituiert ist, wie dies nachfolgend im einzelenen beschrieben wird,
Verbindungen der Gruppe 3 - besondere Alkyl-substituierte Thiazolyl- Verbindungen, in denen
(i) R¹ ein Carboxyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carbamoyl- oder Cyano-Rest und R² ein Alkyl-Rest oder ein Chloratom oder
(ii) R¹ ein Alkyl- oder Arylrest und R² ein Carboxyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carbamoyl- oder Cyano-Rest, oder
(iii) R¹ ein Di- oder Trifluoralkyl-Rest, worin die Fluorsubstituenten an dem in der Formel zum Thiazolyl-Rest benachbarten Kohlenstoffatom vorliegen, und R² ein Chloratom sind, sowie
Verbindungen der Gruppe 4 - die Mono- und Diphenyl-substituierten Thiazolyl-Verbindungen, in denen einer oder beide der Reste R¹ und R² substituierte oder unsubstituierte Phenyl-Reste sind, und wenn lediglich einer ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl-Rest ist, der andere Wasserstoff oder ein Alkyl-Rest ist.
Fig. 1 bis 4 zeigen die Reflexionsspektren der Formazane, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT, NBT und von 2-(Benzothiazol-2-yl)- 3-(1-naphthyl)-5-phenyltetrazoliumsalz (USSR) des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind.
Fig. 5 bis 16 zeigen die entsprechenden Spektren für die Formazane aus besonderen Indikator-Verbindungen der vorliegenden Erfindung (siehe Liste am Anfang der Tabelle in dem für die Beispiele vorgesehenen Abschnitt).
Die folgenden Definitionen sollen in der vorliegenden Beschreibung gelten:
"C&sub1;&submin;&sub4;" verwendet zur Eingrenzung eines Restes, d.h. von C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, auf diejenigen Formen, die 1 bis einschließlich 4 relevante Atome, d.h. Kohlenstoffatome, enthalten.
"Alkyl" - lineare und verzweigte Kohlenwasserstoffreste der allgemeinen Formel CnH2n+1, vorzugsweise "Niedrigalkyl" wie die C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylreste von Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl und von t-Butyl, sowie höhere Alkylreste wie n-Pentyl und n-Hexyl.
"Alkoxy" - der Rest -OR, worin R Alkyl ist.
"Alkylamido" - der Rest -NRC(=O)R', worin R und R', gleich oder verschieden, Alkyl sind.
"Alkylthio" - der Rest -SR, worin R Alkyl ist.
"Amido" - der Rest -NHC(=O)H.
"Amino" - der Rest -NRR', worin R und R', gleich oder verschieden, Wasserstoff oder Alkyl sind.
"Aryl" - organische Reste, die aus einem aromatischen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring oder Ringsystem durch Entfernung eines Wasserstoffatoms abgeleitet sind, das an solche Ringe oder Ringsysteme gebunden ist, z.B. Phenyl, Naphthyl, Pyridyl, Oxazolyl, Chinolyl, Thiazolyl, Thienyl und Furanyl.
"Arylamido" - der Rest -NRC(=O)R', worin R und R', gleich oder verschieden, Aryl sind.
"Aryloxy" - der Rest -OR, worin R Aryl ist.
"Arylthio" - der Rest -SR, worin R Aryl ist.
"Carbalkoxy" - der Rest -C(=O)OR, worin R Alkyl ist.
"Carbaryloxy" - der Rest -C(=O)OR, worin R Aryl ist.
"Carbamoyl" - der Rest -C(=O)NRR', worin R und R', gleich oder verschieden, Wasserstoff oder Alkyl sind.
"Carboxyl" - der Rest -C(=O)OH.
"Halo" - Fluor, Chlor und Brom.
"Imidazo" - der zweiwertige Rest -N=CH-NH-.
"Methylendioxy" - der zweiwertige Rest der Formel -O-CH&sub2;-O-..
"Phenylazo" - der Rest -N=N-Phenyl.
"Styryl" - der Rest -CH=CH-R, worin R Aryl ist.
"Sulfo" - der Rest -SO&sub3;.
"Sulfamido" - der Rest -NRSO&sub2;R', worin R und R', gleich oder verschieden, Alkyl, Aryl oder Wasserstoff sind.
"Sulfamoyl" - der Rest -SO&sub2;NRR', worin R und R', gleich oder verschieden, Alkyl, Aryl oder Wasserstoff sind.
"Trialkylammonio" - der Rest , worin R Alkyl ist.
"Ureido" - der Rest -NRC(=O)NR', worin R und R', gleich oder verschieden, Alkyl, Aryl oder Wasserstoff sind.
Es ist selbstverständlich, daß, wenn nichts anderes spezifisch ausgesagt ist, die Verwendung der obigen Begriffe für den Fall von Resten, die substituiert oder unsubstituiert sein können, z.B. Alkyl, Aryl, Phenylazo und Styryl, die üblich substituierten Formen derartiger Reste sowie deren unsubstituierte Formen einschließen soll. Übliche Substitutionen, die geeignete Verbindungen der vorliegenden Erfindung erzeugen, liegen für den Durchschnittsfachmann auf der Hand und schließen solche Substituenten, ohne Einschränkung, wie Alkoxy-,Amino-, Alkylthio-, Carbalkoxy-, Carboxy-, Hydroxy-, Sulfo- und Sulfamoyl-Reste ein, um nur einige zu nennen.
Plateau-Verbindungen:
2-Thiazolyltetrazoliumsalze, die die Eigenschaft eines definierten Reflexionsplateau aufweisen, umfassen sowohl Verbindungen, die in der Literatur bekannt sind, als auch neue Verbindungen. Solche Verbindungen gelangen im Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Anwendung. Im allgemeinen weisen diese Verbindungen die Formeln A auf, und zwar mit den für die vier Hauptgruppen oben definierten Substituenten R¹ und R². Für die Verbindungen der Gruppe 2 (substituiertes Benzothiazolyl) ist es bevorzugt, daß R¹ und R² zusammen einen Benzoring bilden, um einen Benzothiazolylrest der Formel A1 zu ergeben:
worin (i) R&sup5; und R&sup6;, oder R&sup6; und R&sup7;, oder R&sup7; und R&sup8;, zusammen einen Benzo- oder Cyclohexylring bilden, die unsubstituiert oder mit Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio- Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder mit Ureido-Resten substituiert sind, und worin die anderen, gleich oder verschieden, Wasserstoff, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder Ureido- Reste sind, oder
(ii) einer oder mehrere der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfoamoyl-, Trialkylammonio- oder Ureido-Reste und die anderen, falls überhaupt, Wasserstoff sind.
Für die Verbindungen der Gruppe 4 (Phenyl-substituiertes Thiazolyl) ist es bevorzugt, daß einer oder beide Reste R¹ und R² ein unsubstituierter Phenyl-Rest oder ein Phenyl-Rest sind, der, unabhängig voneinander mit Alkoxy-, Aryloxy-, (vorzugsweise Phenoxy-) , Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido- (vorzugsweise Phenylamido-), Alkylthio-, Arylthio- (vorzugsweise Benzthio-), Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy- (vorzugsweise Carbphenoxy-), Carboxy-, Cyano-, Halo-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-,
Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder mit Ureido-Resten substituiert ist, und falls lediglich einer ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl- Rest ist, der andere Wasserstoff, ein Alkyl-Rest oder ein Chloratom ist.
Für jede der Gruppen 1 bis 4 können R³ und R&sup4; in breitem Umfang variiert sein. Im wesentlichen jedes Tetrazoliumsalz der Formel A, worin R³ eine Aryl- oder Styrylgruppe und R&sup4; eine Arylgruppe sind, weist die angestrebte Eigenschaft des Reflexionsplateau der vorliegenden Erfindung auf. Die Auswahl besonderer Arylreste für die Substituenten R³ und R&sup4; wrd jedoch die Intensität (den Extinktionskoeffizient) des gebildeten Formazans sowie die Position (Bathochromizität) und Flachheit des Plateau beeinflussen.
Bevorzugte Reste R³ und R&sup4;:
Vom Standpunkt der Synthese sowie der Eigenschaften des Reflexionsspektrums des zu bildenden Formazans ist R³ für jede der hier definierten Gruppen 1 bis 4 vorzugsweise ausgewählt aus :
worin Q eine Bindung oder -CH=CH- ist, und worin
(i) Y¹ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Halo- oder ein Wasserstoff-Rest, Y² ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Alkylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest, Y³ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido- Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest und Y&sup4; ein Alkoxy- , Halo- oder Wasserstoff-Rest sind, oder
(ii) Y² und Y³ zusammen eine Methylendioxy- oder Imidazo-Gruppierung bilden und Y¹ und Y&sup4; Wasserstoff sind,
(b&sub1;) 2-, 3- oder 4-Pyridyl,
(c&sub1;) 2- oder 3-Thienyl und aus
(d&sub1;) 2- oder 3-Furanyl;
und R&sup4; ist vorzugsweise ausgewählt aus:
(a&sub2;) Resten der Formel C:
worin Y&sup5; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro- oder ein Ureido- Rest, Y&sup6; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxy-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest, Y&sup7; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- oder ein Ureido-Rest und Y&sup8; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Halo-, Wasserstoff- oder ein Nitro-Rest sind,
(b&sub2;) Resten der Formel D:
worin y&sup9; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest ist,
(c&sub2;) 2-, 4-, 6- oder 8-Chinolyl oder -2-Methylchinolyl sowie aus
(d&sub2;) Anthranyl.
Am meisten bevorzugte Reste R³ und R&sup4;:
Die am meisten bevorzugten Verbindungen in den Gruppen 1 bis 4, und zwar diejenigen mit den besten Reflexionsplateau-Verläufen, sind diejenigen, in denen R³ ausgewählt ist aus:
(a&sub1;) Resten der Formel E:
worin gilt:
(i) Y², Y³ und Y&sup4; sind jeweils ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest,
(ii) Y&sup4; ist Wasserstoff, und Y² und Y³ sind beide C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Reste oder bilden zusammen eine Methylendioxy-Gruppierung, oder
(iii) Y² und Y&sup4; sind beide Wasserstoff, und Y³ ist ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, Alkylthio-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Tri(C&sub1;&submin;&sub4;)alkylammonio- oder ein Ureido-Rest, und aus
(b&sub1;) 2- oder 3-Thienyl.
Auf der Grundlage der Eigenschaften sowie der Synthese der Verbindungen, die hergestellt worden sind, ist es sogar noch bevorzugter, daß R³ ausgewählt ist aus:
3,4,5-Trimethoxyphenyl,
3,4-Dimethoxyphenyl,
3,4-Methylendioxyphenyl,
4-Methoxypehnyl,
4-Acetamidophenyl,
4-Methylthiophenyl,
4-Phenyl,
4-Halophenyl,
4-Cyanophenyl,
4-Nitrophenyl,
2-Thienyl und
3-Thienyl.
Die am meisten bevorzugten Reste R&sup4; sind:
(a&sub2;) Reste der obigen Formel C, worin
(i) Y&sup5; Wasserstoff und jeder der Reste Y&sup6;, Y&sup7; und Y&sup8; ein C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxy-Rest sind,
(ii) Y&sup5; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup6; und Y&sup7; beide ein C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxy-Rest sind oder zusammen eine Methylendioxy-Gruppierung bilden.
(iii) Y&sup5;, Y&sup6; und Y&sup8; jeweils Wasserstoff und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- oder ein Ureido-Rest sind,
(iv) Y&sup5; ein Alkoxy- oder Alkyl-Rest, Y&sup6; und Y&sup8; beide Wasserstoff und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C^&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio, Benzamido-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxy-, Cyano-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylazo- oder ein Ureido-Rest sind,
(v) Y&sup5; und Y&sup8; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest sind, oder
(vi) Y&sup5; und Y&sup8; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest und Y&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido- oder ein Benzamido-Rest sind;
(b2) aus Resten der obigen Formel D, worin Y&sup9; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Benzamido-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido- oder ein Ureido-Rest ist;
(c&sub2;) 8-Chinolyl.
Auf der Grundlage der Eigenschaften und Synthese der Verbindungen, die hergestellt worden sind, ist es sogar noch bevorzugter, daß R&sup4; ausgewählt ist aus:
3,4,5-Trimethoxyphenyl,
3,4-Dimethoxyphenyl,
2,4-Dimethoxyphenyl,
3,4-Methylendioxyphenyl,
4-Methoxyphenyl,
4-Acetamidophenyl,
4-Methylthiophenyl,
4-Carboxyphenyl,
4-Nitrophenyl,
2-Methoxyphenyl,
2-Methoxy-4-carboxyphenyl,
2,5-Dimethoxyphenyl,
2,5-Dimethoxyphenyl-4-benzamidophenyl,
1-Naphthyl,
4-Nitro-1-naphthyl,
4-Methoxy-1-naphthyl,
8-Chinolyl,
2-Methyl-4-carboxyphenyl,
4-Carbmethoxyphenyl,
4-Cyanophenyl und
4-Cyano-1-naphthyl.
Neue Tetrazoliumsalze:
Durch die vorliegende Erfindung werden auch neue Tetrazoliumsalze innerhalb der Gruppen 1 bis 4 bereitgestellt, und zwar wie folgt:
Gruppe 1:
Verbindungen der Formel F:
worin R³ und R&sup4; aus ihren oben beschriebenen bevorzugten Resten ausgewhält sind.
Gruppe 2:
Verbindungen der Formel G:
worin gilt:
(1) R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; sind alle Wasserstoff, und R&sup5; ist ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Carbamoyl-, Carbalkoxy- oder ein Carboxy-Rest, oder
(2) R&sup5;, R&sup6; und R&sup8; sind alle Wasserstoff, und R&sup7; ist eine Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest, oder
(3) R&sup5; ist Wasserstoff, und R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; sind, unabhängig voneinander, ein Alkoxy-, Aryloxy- oder ein Alkyl-Rest, oder
(4) R&sup6; und R&sup8; sind beide Wasserstoff, R&sup5; ist ein Alkoxy-, Aryloxy- Alkyl-, Carbamoyl-, Carbalkoxy- oder ein Carboxy-Rest, und R&sup7; ist ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest, oder
(5) R&sup5; und R&sup6; bilden einen Benzoring, R&sup7; ist ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxy-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff- oder ein Ureido-Rest und R&sup8; ist Wasserstoff, oder
(6) R&sup7; und R&sup8; bilden zusammen einen Benzoring, und R&sup5; und R&sup6; sind beide Wasserstoff, oder
(7) R&sup6; und R&sup7; bilden zusammen einen Cyclohexylring, R&sup5; ist ein Alkyl-, Alkoxy-, Halo- oder Wasserstoff-Rest, und R&sup8; ist Wasserstoff, und
worin R³ und R&sup4; aus ihren oben beschriebenen bevorzugten Resten ausgewählt sind.
Die am meisten bevorzugten Verbindungen sind diejenigen, in denen (i) alle Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; Wasserstoff, (ii) R&sup5;, R&sup6; und R&sup8; Wasserstoff und R&sup7; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy- (besonders bevorzugt), ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, Carboxy- oder ein Halo-Rest sind oder (iii) R&sup5; und R&sup6; zusammen einen Benzoring bilden, R&sup7; Wasserstoff oder ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest und R&sup8; Wasserstoff sind.
Gruppe 3:
Verbindungen der obigen Formel A, worin (a) R¹ ein Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy und R² ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl- oder Chlor-Rest oder (b) R¹ ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl- oder Phenyl-Rest und R² ein Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)Aalkoxy-Rest oder (c) R¹ ein Di- oder Trifluormethyl-Rest und R² ein Chloratom sind, und worin R³ und R&sup4; aus ihren oben beschriebenen bevorzugten Resten ausgewählt sind. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Verbindungen, in denen R¹ ein Di- oder Trifluormethyl-Rest und R² ein Chloratom sind.
Gruppe 4:
Verbindungen der obigen Formel A, worin
(i) beide Reste R¹ und R² unsubstituierte Phenyl-Reste oder Phenyl- Reste sind, die mit einer Gruppe para-substituiert sind, ausgewählt aus Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Caramoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxy-, Cyano-, Halo-, Trialkylammonio- und aus Ureido-Resten, oder
(ii) einer der Reste R¹ und R² ist ein unsubstituierter Phenyl-Rest oder ein mit einem Alkoxy- oder Aryloxy-Rest para-substituierter Phenylrest, und der andere ist Wasserstoff.
Die am meisten bevorzugten Verbindungen dieser Gruppe sind diejenigen, in denen beide Reste R¹ und R² unsubstituierte Phenyl-Reste oder einer ein unsubstituierter Phenyl-Rest und der andere ein mit einem C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest para-substituierter Phenyl-Rest sind, oder worin R¹ ein unsubstituierter Phenyl-Rest oder ein mit einem C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl- oder Halo-Rest para-substituierter Phenyl-Rest und R² Wassserstoff sind.
Weitere Beschreibungen bevorzugter neuer 2-Thiazolyltetrazoliumsalz- Indikatoren finden sich in den allgemein zugeordneten US-Patentanmeldungen, eingereicht am selben Tag zusammen mit der vorliegenden, welche die Bezeichnungen 2-Benzothiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren, substituierte 2- Thiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren und Phenyl-substituierte 2- Thiazolyltetrazoliumsalz-Indikatoren führen und durch die EP- Veröffentlichungs Nummern EP 476 457, 476 456 bzw. 476 455 identifiziert sind.
Gegenanion:
Die Auswahl des Gegenanions erfolgt hauptsächlich auf der Grundlage von Überlegungen bezüglich Stabilität und Löslichkeit des besonderen Tetrazoliumsalzes von Interesse. Im allgemeinen sind sie aus solchen Gegenanionen wie den anorganischen Anionen von Chlorid, Bromid, Jodid, Nitrat, Fluorborat, Perchlorat und Sulfat sowie aus organischen Anionen wie von Acetat, Oxalat, Tartrat und Arylsulfonaten (Benzolsulfonat, Tosylat) ausgewählt.
Synthetische Verfahren:
Tetrazoliumsalze werden gemäß in der Literatur wohlbekannter Verfahren hergestellt (Hooper, W.D., Rev. Pure and Appl. Chem., 1969, 19, 221; Putter, R., in Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl-Müller ed., Thieme Verlag: Stuttgart, 1965, Bd. 10/3, S. 633; Nineham, A.W., Chem. Rev., 1955, S. 355-483).
Im allgemeinen werden die Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man zuerst ein 2-Hydrazinothiazol mit einem Aldehyd zur Reaktion bringt und dann das entstandene Hydrazon mit einem diazotierten Anilin behandelt. Das sich ergebende Formazan wird dann gemäß wohlbekannter Verfahren zum Tetrazoliumsalz oxidiert. Demnach beinhaltet die Synthese die drei grundsätzlichen Ausgangsmaterialien, den Aldehyd, das Anilin und das 2-Hydrazinothiazol. Aldehyd 2-Hydrazinothiazol Hydrazon diazotiertes Anilin Formazan Tetrazoliumsalz
Herstellung der 2-Hydrazinothiazole
Die Verbindungen der Gruppe 1 der vorliegenden Erfindung werden aus unsubstituiertem 2-Hydrazinobenzothiazol (R¹ und R² bilden zusammen einen unsubstituierten Benzoring) hergestellt.
Für die Verbindungen der Gruppe 2 werden substituierte 2- Hydrazinobenzothiazole aus 1-Halo-2-nitroarenen (1) hergestellt, indem man zuerst das Halogenid mit Thiocyanat substituiert, um das Nitrothiocyanat (2) zu erzeugen. Dieses wird dann mit reduzierenden Mitteln wie Zinn reduziert, und das entstandene Aminothiocyanat (3) wird zum 2-Aminobenzothiazol (4) cyclisiert
Dasselbe Aminothiocyanat (3) kann auch synthetisiert werden, indem man das Amin mit Thiocyanogen behandelt (Metzger, J.V., in Comprehensive Heterocyclic Chemistry, A.R. Katritzky, C.W. Rees ed.; Pergamon: New York, 1984; Vol 6, Part 4b, S. 324).
Das 2-Hydroazinothiazol (5) wird dann hergestellt, indem man Hydrazin mit dem 2-Aminothiazol (4) in Ethylenglycol bei 140ºC umsetzt (Liu, K-C., Shih, B-J., Arch. Pharm., 1985, 18, 283).
Weitere Verfahren zur Herstellung von 2-Aminobenzothiazolen (4) beruhen darauf, daß man das aromatische Amin (6) mit Mineralsäure und Thiocyanat umsetzt, um den Thioharnstoff (8) zu erzeugen (Org. Synth., Coll. Vol. IV, 180) oder das aromatische Amin mit N-Benzoylthiocyanat zur Bildung des N-Benzoylthioharnstoffs (7) umsetzt und dann die Benzoylgruppe zum Thioharnstoff hydrolysiert (Org. Synth., Coll. Vol III, 635). Weitere Verfahren zur Thioharnstoff-Herstellung sind ebenfalls in diesen Literaturstellen zu finden. Diese Thioharnstoff-Verbindungen werden dann mit Reagentien wie Brom zu 2-Aminobenzothiazolen oxidiert (Bhargave, P.N., Baliga B.T., J. Ind. Chern., 1958, 5, 807).
Die 2-Hydrazinobenzothiazolyl-Verbindungen, die für die verschiedenen Typen der Verbindungen der Gruppe 3 der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, werden wie folgt hergestellt.
Chlorierung des bekannten 2-Chlor-4-methylthiazols (J. Chem. Soc. 1919, S. 1071 - 1090) bei 100ºC führt hauptsächlich zum 2,5-Dichlor-4- dichlormethylthiazol (14) und bei 160ºC zum 2,5-Dichlor-4- trichlormethylthiazol (9).
Die 4-Carbalkoxy-5-chlorthiazole werden durch Hydrolyse von 4- Trichlormethyl-2,5-dichlorthiazol (9) hergestellt, um die Carboxylsäure (10) zu ergeben (EP 348 735). Behandlungen mit Reagentien wie Thionylchlorid ergibt das Säurechlorid, das mit Alkoholen oder Aminen reagiert, um 4- Carbalkoxy-(11) oder N-Alkylcarbamoylthiazole (12) zu ergeben. Abspaltung von Wasser aus 4-Carbamoyl-2,5-dichlorthiazol erfolgt gemäß in der Literatur bekannter Verfahren, um 4-Cyano-2,5-dichlorthiazol (13) zu ergeben. (March, J. Advanced Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 932-933).
Bei der Herstellung von 4-Di- und -Trifluormethyl-5-chlor-2- hydrazinothiazolen werden die Zwischenproduktverbindungen 4-Dichlormethyl- 2,5-dichlorthiazol (14) bzw. die Trichlormethyl-Verbindung (9) herangezogen. Die Behandlung einer jeden Verbindung mit Fluorwasserstoff ergibt die Fluormethyl-Verbindungen (15) und (16), die bei Umsetzung mit Hydrazin die 2-Hydrazin-Derivate ergeben.
Die Thiazole 4-Alkyl- oder -Aryl-5-carbalkoxy-, -amido-, oder -cyano- 2-substituierten Thiazole werden durch Halogenierung der entsprechenden β- Ketoester, Amide oder Nitrile und durch weitere Reaktion mit Thioharnstoff oder Thiosemicarbazon hergestellt (Metzger, J.V., in Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Katritzky, A.R.,Rees, C.W., ed.; Pergamon: New York, 1985; Vol 6, Part 4, S. 297; Beyer, H., Bulka, E., Z. Chem., 1982, 2, 321- 328).
R¹ =
CONR³R&sup4;
CN, Aryl, Alkyl
R² = Alkyl, Aryl
Thiazole im obigen Schema, worin R¹ Wasserstoff und R² Aryl sind, können aus dem entsprechenden α-Haloacetophenon (R¹ = H und R² = Aryl) hergestellt werden.
Im Falle der Verbindungen der Gruppe 4 werden die erforderlichen Ausgangsmaterialien wie folgt hergestellt:
Die 4,5-Diphenyl-2-hydrazinothiazole werden durch zwei Verfahren hergestellt. Das eine beruht darauf, daß man zuerst ein Benzoin- Kondensationsprodukt (17) zwischen zwei Aldehyden bildet (Ide, W.S., Buck, J.S., Org. React., 1948, Vol. 4, 269). Benzoine, die durch dieses Verfahren nicht erhältlich sind, werden aus der Kondensation eines Phenylsubstituierten "Acylanion-Äquivalent" mit einem weiteren Aldehyd unter anschließender Entfernung der Carbonyl-Schutzgruppe hergestellt (Bertz, S., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1980, 17, 831). Ein spezifisches Beispiel ist die Kondensation des metallierten O-Trimethylsilylcyanhydrins (19) mit einem Arylaldehyd. Aus dem Produkt (20) wird die Schutzgruppe unter Verwendung wässriger Essigsäure abgespalten, um das Benzoin-Produkt (17) zu ergeben.
Die Benzoin-Produkte werden dann in das Halogenid (18) unter Einsatz herkömmlicher Reagentien wie Thionylchlorid in die α-Haloketone (18) überführt, die mit Thioharnstoff zu 4,5-Diphenyl-2-aminothiazolen reagieren (Traumann, V., Liebigs Ann. Chem., 1888, 250, 31, Dodson et al., J.Am. Chem. Soc., 1945, 67, 2442). Diese können in die 2-Hydrazino-Verbindungen mit Hydrazin überführt werden, wie beschrieben für die Benzo-Beispiele.
Dieselben α-Haloketone reagieren mit Thiocyanat zu α-Thiocyanoketonen (21), die rasch und glatt cyclisieren. Beispielsweise werden, bei Behandlung mit Chlorwasserstoffgas, die 2-Chlorthiazole (22) erhalten, die mit Hydrazin zu den 2-Hydrazinothiazolen reagieren.
Alternativ dazu, können die α-Haloketone dazu verwendet werden, das benötigte Hydrazon (24) durch Behandlung des Haloketons mit einem N- Arylthiosemicarbazon (23) direkt zu ergeben (Johne, S., Schaks, A., Hartung, S., Scharf, K. D. und Nover, L., Pharmazie, 1979, 34, 790).
Herstellung der Aldehyde
Die Aldehyde werden aus handelsüblichen Quellen erhalten oder können durch Verfahren hergestellt werden, mit denen der Durchschnittsfachmann vertraut ist.
Beispielsweise können Aldehyde durch benzylische Oxidation eines Arylmethans (March, J., Advances Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985; S. 1079), durch Reduktion eines Arylsäurechlorids (ibid., S. 396) oder eines Arylsäurederivats (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, S. 604-605) hergestellt werden.
Arylhalogenide können ebenfalls zur Synthese von Aldehyden herangezogen werden. Bei diesem Verfahren ergibt eine Transmetallierungsreaktion eine arylmetallische Spezies, die mit einer Reihe von Reagentien, wie mit Dimethylformamid, zur Erzeugung des Aldehyds behandelt werden kann (ibid, S. 681-683).
Die vorgenannten Arylaldehyde, Säuren, Methanverbindungen und Halogenide können mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen vor deren Überführung in Tetrazoliumsalze derivatisiert werden. Dies kann durch aromatische nukleophile Substitution (March, J., Advanced Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985; S. 576 - 607), aromatische elektrophile Substitution (ibid., S. 447-511) oder durch Heteroatom-gesteuerte Metallierungsreaktionen (Gschwend, H.W., Rodriguez, H.R., in Organic Reactions, John Wiley and Sons; New York, 1979; Vol 26, 1) erfolgen.
In Fällen, in denen das Aldehyd-Teilstück des Tetrazoliumsalzes ein Phenol oder Amin enthält, müssen die Gruppen geschützt werden, so daß keine Reaktion zwischen diesen und dem diazotierten Anilin oder dem oxidierenden Reagens erfolgt, welche zur Herstellung des Tetrazoliumsalzes verwendet werden.
Dies kann durchgeführt werden, indem man einen Hydroxyarylaldehyd als ein Acetat schützt, die Reaktionsabfolge durchführt, um das Formazan herzustellen, und dann das Acetat bei pH 10 hydrolysiert. Ansäuerung auf pH 5 und anschließende Filtration ergeben das gewünschte Formazan.
Reagiert das sich ergebende Phenol-Formazan mit einem oxidierenden Mittel bei der Tetrazoliumsalz-Herstellung, kann das Phenol mit einer Säure-labilen Gruppe wie Dihydropyran geschützt werden (Greene, T.W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons: New York; 1981, S. 87-113), welche dann durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen entfernt wird.
In ähnicher Weise müssen Amine am Aldehyd-Teilstück zur Verhinderung von deren Reaktion geschützt werden. Dies erfolgt am besten durch Bildung eines Säure-labilen Carbamats (ibid, S. 218-247) , das später durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen entfernt wird.

Herstellung der Arylamine

Arylamine lassen sich durch Reduktion der entsprechenden Nitro- oder Azid-Verbindung (Larock, P.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989; S. 412-415 oder 409-410), durch Reaktion zwischen einer arylmetallischen Verbindung und einem elektrophilen Stickstoff-Reagens (ibid., S. 399-400) oder durch Umlagerung von Säureaziden oder oxidierten Amiden (ibid., S. 431-432) herstellen.
Wie im Fall der Aldehyde können elektrophile und nukleophile aromatische Substitutionen angewandt werden, um verschiedene funktionelle Gruppen in das Arylamin oder seine synthetische Vorstufenverbindung einzuführen.

Analytische Verfahren

Durch die vorliegende Erfindung ist in vorteilhafter Weise herausgefunden worden, daß die hier beschriebenen 2-Thiazolyltetrazoliumsalz- Indikatoren ein ausgedehntes Plateau in ihren Reflexionsspektren oberhalb ca. 600 nm aufweisen. Die am meisten bevorzugten Indikator-Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen ein Plateau oberhalb 650 nm auf (d.h. der flachste, ca. 50 nm breite Teilbereich beginnt zwischen 640 und 660 nm). Ein derartiges Reflexionsplateu ergibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Testverfahren, die auf der Messung der Reflexion aus einem Reagensstreifen beruhen.
Reagensstreifen sind im Stand der Technik als analytische Vorrichtungen bekannt, die eine feste Trägermatrix aufweisen, die mit einer Test- Zusammensetzung beaufschlagt ist, die wiederum eine Farbänderung in Reaktion auf Kontakt mit einer flüssigen Testprobe erzeugt, die den Analyt von Interesse enthält. Eine derartige Test-Zusammensetzung umfaßt, im Falle der vorliegenden Erfindung, (a) ein Reagens oder Reagentien, die mit dem Analyt zur Erzeugung einer reduzierenden Substanz reagieren, sowie (b) ein hier beschriebenes 2-Thiazolyl-Tetrazoliumsalz, das sich mit einer derartigen reduzierenden Substanz reduzieren läßt, um ein chromogenes Formazan- Farbstoffprodukt zu erzeugen. Die Farbreaktion derartiger Reagensstreifen kann in Augenschein genommen werden, um halb-quantitative Werte zu ergeben, es werden allerdings quantitative Ergebnisse erhalten, indem man die Reflexion aus der Trägermatrix bei einer vorbestimmten Wellenlänge mißt. Derartige Messungen beinhalten, daß man die einer entsprechenden Reaktion unterzogene Trägermatrix mit einer Lichtquelle bestrahlt und die Reflexion der Trägermatrix mit einem Sensor erfaßt, indem das reflektierte Licht mit einem Detektor-Element gemessen wird.
Das Auffinden von Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die ein Reflexionsplateau aufweisen, läßt sich auf besonders vorteilhafte Weise nutzen, wenn die Reflexion aus einem Reagensstreifen mit einem Gerät abgelesen wird, das eine Abweichung bei der Zentralwellenlänge seines optischen Systems (der Kombination aus Lichtquelle, Detektor-Element, spektralen Steuerelementen, z.B. Filtern, und weiteren Komponenten) unterliegt. Eine Abweichung bei der zentralen Wellenlänge des optischen Systems kann durch eine Vielzahl von Faktoren hervorgerufen werden, beispielsweise eine Abweichung bei der Zentralwellenlänge des hauptsächlichen spektralen Steuerelements wie der Bestrahlungslichtquelle oder den Filtern. Werden beispielsweise lichtemittierende Dioden (LEDs) als die Lichtquelle verwendet, schwankt die Wellenlänge des emittierten Lichts in typischer Weise um ± 4 nm innerhalb eines Geräts und bis zu ± 8 nm zwischen LEDs bei verschiedenen Geräten, und zwar auf Grund von Herstell- bzw. Fertigungsvarianzen. Darüber hinaus unterliegen LEDs einer schwankenden Zentralwellenlänge auch aufgrund von Temperatureffekten. Bei Verwendung von Breitband-Lichtquellen mit Filtern zur spektralen Steuerung der Zentralwellenlänge liegt die Abweichung innerhalb eines Geräts in typischer Weise unter 1 nm, kann aber von Gerät zu Gerät bis zu ± 6 nm ausmachen. Somit wird die vorliegende Erfindung insbesondere in denjenigen Fällen mit Vorteil angewandt, bei denen die Zentralwellenlänge des das Detektor-Element erreichenden Lichts im jeweiligen Gerät Schwankungen im Bereich von ca. ± 5 nm unterliegt.
Bei der Herstellung eines Reagensstreifens zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Auswahl der Trägermatrix, der Test-Reagentien, die mit dem Analyt zur Erzeugung der reduzierenden Substanz reagieren, sowie das Verfahren, mit dem diese Reagentien und der Tetrazoliumsalz- Indikator auf die Trägermatrix aufgebracht werden, wohlbekannte Maßnahmen und Merkmale auf dem Gebiet der Reagensstreifen. Um nur einige Beispiele aufzuführen, sind typische Trägermatrixmaterialien poröses und absorbierendes Papier, Tuch, Glasfaserfilter, polymere Membranen und Filter und dgl. Aufbringungsverfahren schließen Imprägnierung einer gebildeten Trägermatrix mit einer Lösung, Suspension oder sonstigen flüssigen Form der Test- Zusammensetzung, in einer oder mehreren Stufen, ein, worauf die Matrix getrocknet wird. Ferner kommt die Bildung einer Matrix in der Gegenwart einer oder mehrerer Komponenten der Test-Zusammensetzung in Betracht, z.B. durch Gießen oder Aufbringen von Lösungen von film- oder membranbildenden Zubereitungen.
Bezüglich der auf den Reagensstreifen aufgebrachten Test-Reagentien eignen sich die Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung in besonders vorteilhafter Weise zum Nachweis von NADH. Da NADH in Enzym-katalysierten Nachweisreaktionen erzeugt wird, die spezifisch für verschiedene biochemische Substanzen sind, eignen sich die vorliegenden Erfindungen besonders in Testverfahren zur medizinischen Diagnose, wie zur Bestimmung von Glucose und Cholesterol. Allerdings lassen sich auch ganz allgemein weitere reduzierende Substanzen außer NADH nachweisen, wie Schwefelwasserstoffgas, Diboran, Arsenhydrid oder Phosphorhydrid.
Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne darauf eingeschränkt sein zu sollen, durch die folgenden Beispiele noch weiter erläutert.

Beispiele

A. Synthese von Verbindungen

Hydrazon-Herstellung

Eine Aufschlämmung von 25 mmol des entsprechenden Aldehyds und von 25 mmol des entsprechenden Hydrazins in 125 ml absolutem Ethanol wird 3 h lang am Rückfluß gehalten. Wasser wird mit 3 A Molekularsieben in einem Soxhlet- Extraktor entfernt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und dann filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.

Formazan-Herstellung

Das Diazoniumsalz wird hergestellt, indem man zuerst eine Aufschlämmung oder Lösung von 8,5 mmol des Amins in 60 ml 3 N HCl auf 5ºC abkühlt. Natriumnitrit (0,70 g, 10,15 mmol) in 5 ml Wasser wird dann zugetropft. Nach 30minütigem Rühren wird die Mischung zu einer kalten (-25ºC) Mischung von 8,5 mmol des Hydrazons in 120 ml von 1:1 (V/V) DMF-Pyridin getropft. Während des Zutropfens darf die Reaktion nicht auf eine Temperatur von oberhalb -15ºC erwärmt werden. Man läßt die Temperatur dann unter 2stündigem Rühren auf Raumtemperatur ansteigen. Es wird filtriert, und man erhält das Formazan als schwarzen Feststoff. Verunreinigungen können beseitigt werden, indem man mit Methanol wiederholt wäscht oder den Feststoff in Methanol am Rückfluß hält und im Heißen filtriert.

Tetrazoliumsalz-Herstellung

Eine Aufschlämmung von 1,5 mmol des Formazans wird mit 20 ml Essigsäure und 4 ml Isoamylnitrit über eine Zeitdauer von 16 bis 48 Stunden gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, um das Tetrazoliumsalz zu ergeben. Fällt das Salz nicht aus, läßt sich die Ausfällung durch Verdünnen mit Ether herbeiführen.

2,5-Dichlor-4-dichlormethylthiazol

Ein starker Strom von Chlor wurde in 5888 g (42,9 mol) 97,3%-iges 2- Chlor-4-methylthiazol (J.Chem.Soc. 1919, S.1071-1090), anfänglich bei 80ºC, nach der langsamen Beendigung der exothermen Reaktion bei 100ºC ca. 100 h lang eingeleitet. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur und Stehenlassen über Nacht bildete sich ein kristalliner Niederschlag aus 2,5-Dichlor-4- dichlormethylthiazol, der abfiltriert und auf einem keramischen Tonteller getrocknet wurde. Ausbeute: 3907 g (38,4% der Theorie).
Die flüssige Fraktion der Chlorierungsmischung wurde in einer 2 m hohen, gefüllten Säule fraktioniert destilliert. Das bei 101 bis 103ºC / 6 mbar erhaltene Destillat kristallisierte größtenteils und wurde dann auf einem keramischen Tonteller getrocknet. Ausbeute an 2,5-Dichlor-4- dichlormethylthiazol durch fraktionierte Destillation: 2733 g (26,9% der Theorie).
Gesamtausbeute: 6640 g (65,3% der Theorie) . F.: 42-44ºC (umkristallisiert aus Petrolether)
¹H-NMR (in CDCl&sub3;) : δ = 6,78 ppm

2,5-Dichlor-4-trichlormethylthiazol

Chlorgas wurde in eine Mischung von 1093 g (8,19 mol) 2-Chlor-4- methylthiazol und 4 l Methylenchlorid in einem Dreihalskolben mit Rührer, Thermometer, Rückflußkühler und Gaseinleitungsrohr, beginnend bei Raumtemperatur, eingeleitet. Nach Abbrechen der exothermen Reaktion wurde das Methylenchlorid unter langsamem Temperaturanstieg unter fortgesetzter Einleitung von Chlor abdestilliert. Die Schmelze wurde langsam auf 160ºC erhitzt. Meistenteils bei ca. 160ºC wurde überschüssiges Chlorgas (erkennbar an der leicht grünlichen Farbe des austretenden Gases) eingeleitet, bis ein Gas- Chromatogramm fast alleiniglich die gewünschte Verbindung 2,5-Dichlor-4- trichlormethylthiazol zeigte. Die Gesamtdauer der Chlorierung betrug 40 bis 50 Stunden.
Eine Rohdestillation bis zu einer Kopftemperatur von 150ºC bei 14 mbar ergab 2057 g ca. 95% reines 2,5-Dichlor-4-trichlormethylthiazol, entsprechend einer Ausbeute von 88% der Theorie im reinen Produkt. 2,5-Dichlor-4- trichlormethylthiazol wurde durch Feindestillation über eine mit Silber überzogene, 220 cm hohe, gefüllte Säule in reinem Zustand erhalten. Siedepunkt: 123-125ºC bei 16 mbar

2,5-Dichlor-4-difluormethylthiazol

1010 g (4,26 mol) 2,5-Dichlor-4-dichlormethylthiazol wurden mit 1500 ml wasserfreier Fluorwasserstoffsäure in einem VA-Autoklav bei 145ºC/25 bar fluoriert. Das sich bildende Chlorwasserstoffgas wurde kontinuierlich entfernt. Überschüssige Fluorwasserstoffsäure wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur am Ende der Reaktion abgezogen. Der Rückstand wurde auf Eiswasser gegeben, in Dichlormethan aufgenommen, über Natriumsulfat getrocknet und destilliert. Die Ausbeute betrug 753 g (86,6% der Theorie) 2,5-Dichlor-4- difluormethylthiazol, Sdp.: 74-75ºC/18 mbar, = 1,5171.

2,5-Dichlor-4-trifluormethylthiazol

750 g (2,76 mol) 2,5-Dichlor-4-trichlormethylthiazol wurden mit 100 ml wasserfreier Flußsäure in einem VA-Autoklav bei 130ºC / 19-20 bar fluoriert. Gebildetes HCl wurde kontinuierlich entfernt. Überschüssige Flußsäure wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur am Ende der Reaktion abgezogen. Der Rückstand wurde auf Eiswasser gegossen, in Dichlormethan aufgenommen, über Natriumsulfat getrocknet und destilliert.
Die Ausbetue betrug 570 g (93% der Theorie) 2,5-Dichlor-4- trifluormethylthiazol, Sdp.: 164ºC, = 1,4774.

5-Chlor-2-hydrazino-4-trifluormethylthiazol

75 g (1,5 mol) Hydrazin-Hydrat wurden zu einer Mischung von 111 g (0,5 mol) 2,5-Dichlor-4-trifluormethylthiazol und 600 ml Dioxan mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß die Reaktionstemperatur 25ºC nicht überstieg. Nach weiterem Rühren über 20 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in 2,5 l Eiswasser gerührt; dann wurde abfiltriert, der Rückstand mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 87,3 g (80,3% der Theorie) 5-Chlor-2-hydrazino-4-trifluormethylthiazol, F.: 136- 137ºC.

5-Chlor-2-hydrazino-4 -difluormethylthiazol

Ähnlich wie 5-Chlor-2-hydrazino-4-trifluormethylthiazol erhielt man aus 2,5-Dichlor-4-difluormethylthiazol 5-Chlor-2-hydrazino-4- difluormethylthiazol in 51,3% Ausbeute. F.: 132ºC (Zersetzung) (nach Umkristallisation aus Cyclohexan)
Kleinere Mengen der Verbindung können bei 70ºC / 0,1 mbar sublimiert werden.

B. Herstellung von Reagensstreifen

Jeder Indikator wurde auf einen Reagensstreifen durch Imprägnierung aufgebracht und mit einer Lösung getestet, die eine bekannte Menge an Glucose, Cholesterol oder NADH enthielt. Der Reagensstreifen besteht aus einem Polystyrol-Griff, auf dem eine einzelne Reagens-Unterlage angeordnet ist. Die Reagens-Unterlage war 0,5 cm x 0,5 cm (0,2 x 0,2") im Quadrat groß und enthält Reagentien, die eine Farbänderung ergeben, die instrumentell abgelesen wurde, als eine Teilmenge der den entsprechenden Analyt enthaltenden Probe aufgebracht wurde. Die Trockenphasen-Reagens-Unterlage ist ein festes Trägermaterial aus Cellulosefasern oder einer Nylonmembran als Beispiele. Die Reagens-Unterlage wurde zuerst mit einer Lösung des Tetrazoliumsalzes von Interesse (0,8 ml) und Detergens (0,3%) in einem Lösungsmittel wie Methanol imprägniert. Die zweite Lösung, mit der die Reagens-Unterlage imprägniert wird, enthält die folgenden Komponenten:

Glucose-Streifen:

Glucose-Dehydrogenase (GDH) 0,8 E/l
Diaphorase (DPH) 0,8 E/l
NAD 0,03 Mol/l
PIPES-Puffer 0,15 Mol/l
Detergens 0,5%

Cholesterol-Streifen:

Cholesterol-Dehydrogenase (CDH) 0,3 E/l
Cholesterolester-Hydrolase (CEH) 0,6 E/l
Diaphorase 0,3 E/l
NAD 0,04 Mol/l
PIPES-Puffer 0,2 Mol/l
Detergens 1 %
Ca. 0,01 ml verschiedener Test-Lösungen (Ser V/Vum, Plasma, wässrig), enthaltend mindestens fünf verschiedene Analyt-Konzentrationen von 0 bis 33 mM/l, wurden auf die Mitte der getrockneten Reagens-Unterlage gegeben. Nach einem Zeitablauf von ca. 60 Sekunden wurden die Reflexionsspektren eines jeden Indikators bei 5 nm Inkrementen über den Wellenlängenbereich von 400 bis 1100 nm gemessen.

C. Gebrauchsdaten

Es folgt eine Tabelle von spektralen und weiteren analytischen Daten, die verschiedene synthetisierte Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung betreffen. Die Verbindungen sind der Reihe nach angeordnet, und zwar gemäß der Form ihrer Benzothiazolyl-Reste, dann gemäß ihren R&sup4;-Substituent und schließlich gemäß ihren R³-Substituent. Beispielsweise ist als erste die Verbindung A.1.a) angegeben und weist die Formel A auf, worin R¹ und R² zusammen einen unsubstituierten Benzothiazolyl-Ring bilden, R&sup4; 4-Nitrophenyl und R³ 4-Acetamidophenyl sind; die zweite Verbindung A.1.b) weist dieselben Substituenten R¹, R² und R&sup4; wie Verbindung A.1.a) auf, wobei aber R³ Phenyl ist; usw.
Vom Reflexionsspektrum der Tetrazoliumsalze wird angenommen, daß es von der Umgebung abhängig ist, in welcher die jeweiligen Spektren beobachtet oder gemessen werden. Für Vergleichszwecke zwischen einzelnen Tetrazoliumsalzen schließen die unten angegebenen Daten eine Messung der relativen Flachheit des flachsten Teilbereichs des Reflexionsspektrums bei Wellelängen von oberhalb 600 nm ein, wobei das Spektrum erzeugt ist, als ein Glucose- oder Cholesterol-Reagensstreifen verwendet wurden, die hergestellt waren, wie im obigen Teilabschnitt B beschrieben. Die relative Flachheit des Spektrums ist in den Daten in K/S-Einheiten angegeben, die bezüglich der Gehaltsmenge des nachgewiesenen Analyt normalisiert sind, wie dies nachfolgend definiert wird.
K/S ist durch die Gleichung definiert:
(1 - R)²/2R
worin R der Wert der instrumentell abgelesenen Reflexionseinheiten ist. Die Prozentänderung bei K/S ist die als ein Prozentsatz angegebene Änderung über einen Bereich von 50 nm, dividiert durch den Durchschnittswert der hohen und niedrigen K/S-Werte über diesen Bereich.
Die Plateau-Eigenschaft der vorliegenden Verbindungen sollte, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, als eine Prozentänderung im Reflexionsspektrum (angegeben, bezogen auf K/S, wie im obigen Abschnitt definiert) von weniger als ca. 17% über eine 30 bis 50 nm breite Wellenlängenspanne, beginnend bei einer Wellenlänge von oberhalb 600 nm verstanden sein. Die bevorzugteren Verbindungen zeigen ein Plateau, das eine Prozentänderung in K/S von weniger als ca. 10% über eine Wellenlängenspanne von 50 nm zeigen. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die eine Prozentänderung in K/S von ca. 5% oder weniger über eine Wellenlängenspanne von 50 nm zeigt.Bezüglich der Zeichnungen zeigen Fig. 1 bis 4 die Reflexionsspektren von Formazanen, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT, NBT und USSR des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind. Zu Vergleichszwecken zeigen Fig. 5 bis 16 die entsprechenden Spektren für ausgewählte Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Das Vorliegen eines Plateau in den entsprechenden Spektren der Formazane aus den vorliegenden Verbindungen sowie dessen Abwesenheit in den Spektren aus den Formazanen aus den Verbindungen des Standes der Technik sind unmittelbar erkennbar.
Die vier oben genannten Verbindungen des Standes der Technik zeigen Prozentänderungen in K/S über den Wellenlängenbereich von 650 - 700 nm wie folgt:
INT 71%
MTT 178%
NBT 73%
USSR 28%
Je niedriger der Prozentwert des K/S-Wertes für das Formazan ist, desto toleranter ist das Tetrazoliumsalz gegenüber Abweichungen bei der Zentralwellenlänge des optischen Systems, das zur Messung der Reflexion herangezogen wird, und es ist damit umso geeigneter zur Messung einer Analyt- Konzentration.
Die folgenden Nichtstandard-Abkürzungen werden im nun folgenden Text verwendet:
"UV" - Die Wellenlänge in Nanometern des Maximum-Reflexionspeak im UV- Reflexionsspektrum des Formazans. Der Extinktionskoeffizient und das zur Messung verwendete Lösungsmitel sind in Klammern angegeben.
"nm" Die Position des flachsten Teilbereichs des Reflexionsspektrums des Formazans über eine Wellenlängenspanne von 50 nm (angegeben als die Anfangs- und Endwellenlängen in Nanometern).
"K/S" Die Prozentänderung in K/S-Einheiten über den oben genannten flachsten Teilbereich von 50 nm des Reflexionsspektrums. Die Konzentration an zur Erzeugung des Reflexionsspektrums eingesetztem Analyt ist in Klammern angegeben. Mmol betrifft die Konzentration in mmol/Liter.
Es folt eine Liste der Verbindungen, deren Reflexionsspektren in Fig. 5 bis 16 der Zeichnungen dargestellt sind. Deren abgekürzte Bezugsziffer und Anordnung in der sich daran anschließenden Tabelle sind in Klammern vor den Verbindungsnamen angegeben.
Fig. 5 (A-2-a) 2-(Benzothiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5- phenyltetrazoliumsalz
Fig. 6 (B-6-a) 2-(6-Ethoxybenzothiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 7 (G-1-a) 2-(Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl)-3-(2-methoxy-4- carboxyphenyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 8 (G-17-a) 2-(Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5- (4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 9 (G-23-a) 2-(Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl)-3-(4-methylthiophenyl)- 5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 10 (H-1-a) 2-(8-Methoxynaphtho(1,2-d)thiazol-2-yl)-3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)-5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 11 (I-1-a) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)- 5-(4-(2-(2-(2-ethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl)tetrazoliumsalz
Fi.g 12 (I-1-d) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)- 5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 13 (I-2-a) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 14 (I-9-a) 2-(4-Difluor-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(2-methoxyphenyl)- 5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 15 (J-4-a) 2-(4-Trifluormethyl-5-chlorthiazol-2-yl)-3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)-5(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz
Fig. 16 (Q-1-a) 2-(4,5-Bis(4-methoxyphenyl)thiazol-2-yl)-3-(4- carboxyphenyl)-5-(2-thienyl)tetrazoliumsalz Tabelle
Die vorliegende Erfindung ist im einzelnen beschrieben und anhand der obigen Beispiele dargestellt worden. Selbstverständlich können weitere Variationen und Modifikationen der Erfindung vorgenommen und durchgeführt werden, ohne von ihrem Umfang abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyt in einer Flüssigprobe, wobei die Probe mit einer Test-Vorrichtung in Kontakt gebracht wird, die eine feste Trägermatrix aufweist, die mit einer Test-Zusammensetzung beaufschlagt ist, die (a) Reagentien, die mit genanntem Analyt zur Erzeugung einer reduzierenden Substanz reagieren, und (b) eine Indikator-Verbindung enthält, die ihrerseits durch die genannte reduzierende Substanz zur Erzeugung eines chromogenen Farbstoff-Produkts reduziert wird, und wobei das chromogene Farbstoff-Produkt gemessen wird, indem man die Trägermatrix mit einer Lichtquelle bestrahlt, die eine Zentralwellenlänge von oberhalb ca. 600 nm aufweist, wobei die Wellenlänge aufgrund von Herstellvarianzen sowie einer Temperaturabhängigkeit der Lichtquelle schwankt, und man die Reflexion aus der Trägermatrix durch einen Sensor erfaßt und das reflektierte Licht mit einem Detektor-Element mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man als die genannte Indikator-Verbindung ein Thiazolyltetrazoliumsalz der Formel anwendet:

worin gilt:

(a) R¹ und R² bilden zusammen einen Benzoring, wobei der genannte Benzoring substituiert oder unsubstituiert ist, oder

(b) R¹ ist ein Carboxyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carbamoyl- oder Cyano-Rest, und R² ist ein Alkyl-Rest oder ein Chloratom, oder

(c) R¹ ist ein Alkyl- oder Aryl-Rest, und R² ist ein Carboxyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carbamoyl- oder Cyano-Rest, oder

(d) R¹ ist ein Di- oder Trifluoralkyl-Rest, worin sich die Fluor- Sustituenten an dem Kohlenstoffatom befinden, das zum Thiazolyl-Rest in der Formel benachbart ist, und R² ist ein Chloratom, oder

(e) einer oder beide Reste R¹ und R² sind substituierte oder unsubstituierte Phenyl-Reste, und falls lediglich einer ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl-Rest ist, ist der andere Wasserstoff oder ein Alkyl-Rest; und worin R³ ein Aryl- oder Styryl-Rest, R&sup4; ein Aryl-Rest und X&supmin; ein Gegenanion sind, wobei die Tetrazoliumsalze ferner dadurch gekennzeichnet sind, daß, wenn sie durch die reduzierende Substanz in ihr entsprechendes Formazan reduziert sind, die Reflexion des Formazans um weniger als 17% über einen Wellenlängenbereich von 50 Nanometern schwankt, beginnend bei einer Wellenlänge von oberhalb ca. 600 Nanometern.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei R¹ und R² zusammen einen unsubstituierten Benzolring bilden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin R¹ und R² einen Benzoring bilden, um einen Benzothiazolyl-Rest der Formel zu ergeben:

worin (i) R&sup5; und R&sup6;, oder R&sup6; und R&sup7;, oder R&sup7; und R&sup8;, zusammen einen Benzo- oder Cyclohexylring bilden, die unsubstituiert oder mit einem Alkoxy- , Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammoniuo- oder mit einem Ureido-Rest substituiert sind, und worin die weiteren Substituenten, gleich oder verschieden, Wasserstoff, ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido- Rest sind, mit der Maßgabe, daß, wenn R&sup6; und R&sup7; zusammen einen Benzo- oder Cyclohexylring bilden, R&sup5; kein Wasserstoffatom ist, oder

(ii) einer oder mehrere der Reste R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Cyano-, Halo-, Hydroxyl-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest und die weiteren Reste, falls überhaupt, Wasserstoff sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1,

worin

(a) R¹ ein Carboxyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carbamoyl- oder ein Cyano-Rest und R² ein Alkyl-Rest oder ein Chloratom oder

(b) R¹ ein Alkyl- oder Aryl-Rest und R² ein Carboxyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carbamoyl- oder ein Cyano-Rest oder

(c) R¹ ein Di- oder Trifluoralkyl-Rest, worin sich die Fluor- Substituenten an dem Kohlenstoffatom befinden, das zum Thiazolyl-Rest in der Formel benachbart ist, und R² ein Chloratom

sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1,

worin einer oder beide Reste R¹ und R² ein unsubstituierter Phenyl- oder ein Phenyl-Rest sind, der, unabhängig voneinander, mit einem Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxy-, Cyano-, Halo-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder einem Ureido- Rest substituiert ist, und falls nur einer ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl-Rest ist, der andere Wasserstoff, ein Alkyl-Rest oder ein Chloratom ist.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,

worin R³ ausgewählt ist aus:

(a1)

worin Q eine Bindung oder -CH=CH- ist, und worin

(i) Y¹ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Halo-Rest oder Wasserstoff, Y² ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Amino-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido- Rest, Y³ ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carbaryloxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest und Y&sup4; ein Alkoxy-, Halo- oder Wasserstoff-Rest sind, oder

(ii) Y² und Y³ zusammen eine Methylendioxy- oder Imidazo-Gruppierung bilden und Y¹ und Y&sup4; Wasserstoff sind,

(b&sub1;) einem 2-, 3- oder 4-Pyridyl-Rest,

(c&sub1;) einem 2- oder 3-Thienyl-Rest und

(d&sub1;) einem 2- oder 3-Furanyl-Rest;

und worin R&sup4; ausgewählt ist aus:

(a&sub2;)

worin Y&sup5; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro- oder ein Ureido- Rest, Y&sup6; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkryl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxy-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest, Y&sup7; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Wasserstoff-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- oder ein Ureido-Rest und Y&sup8; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Halo-, Wasserstoff- oder ein Nitro-Rest sind,

(b&sub2;)

worin Y&sup9; ein Alkoxy-, Aryloxy-, Alkyl-, Amido-, Alkylamido-, Arylamido-, Alkylthio-, Arylthio-, Carbamoyl-, Carbalkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl-, Trialkylammonio- oder ein Ureido-Rest ist,

(c&sub2;) einem 2-, 4-, 6- oder 8-Chinolyl- oder einem 2-Methylchinolyl- Rest und

(d&sub2;) einem Anthranyl-Rest.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,

worin R³ ausgewählt ist aus:

(a&sub1;)

worin gilt:

(i) Y², Y³ und Y&sup4; sind jeweils ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest,

(ii) Y&sup4; ist Wasserstoff, und Y² und Y³ sind beide ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy- Rest oder bilden zusammen eine Methylendioxy-Gruppierung, oder

(iii) Y² und Y&sup4; sind beide Wasserstoff, und Y³ ist ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, Alkylthio-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-,

Tri(C&sub1;&submin;&sub4;)alkylammonio- oder ein Ureido-Rest, und

(b&sub1;) einem 2- oder 3-Thienyl-Rest;

und worin R&sup4; ausgewählt ist aus:

(a&sub2;)

worin gilt:

(i) Y&sup5; ist Wasserstoff, und jeder der Reste Y&sup6;, Y&sup7; und Y&sup8; ist ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest,

(ii) Y&sup5; und Y&sup8; sind beide Wasserstoff, und Y&sup6; und Y&sup7; sind beide ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest, oder bilden zusammen eine Methylendioxy-Gruppierung,

(iii) Y&sup5;, Y&sup6; und Y&sup8; sind jeweils Wasserstoff, und Y&sup7; ist ein C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Hydroxyl-, Nitro-, Phenylazo-, Sulfo-, Sulfonamido-, Sulfamoyl- oder ein Ureido-Rest,

(iv) Y&sup5; ist ein Alkoxyl-- oder Alkyl-Rest, Y&sup6; und Y&sup8; sind beide Wasserstoff, und Y&sup7; ist ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylthio, Benzamido-, Carbamoyl-, Carb(C&sub1;&submin;&sub4;)alkoxy-, Carboxyl-, Cyano-, Wasserstoff-, Nitro-, Phenylazo- oder ein Ureido-Rest,

(v) Y&sup5; und Y&sup8; sind ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest, oder

(vi) Y&sup5; und Y&sup8; sind ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-Rest, und Y&sup7; ist ein C&sub1;&submin;&sub4;- Alkylamido- oder ein Benzamido-Rest;

(b2)

worin Y&sup9; ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamido-, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkylthio-, Benzamido-, Cyano-, Halo-, Wasserstoff-, Nitro-, Sulfo-, Sulfonamido- oder ein Ureido-Rest ist, und

(c&sub2;) einem 8-Chinolyl-Rest.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,

worin R³ ausgewählt ist aus einem :

3,4,5-Trimethoxyphenyl-,

3,4-Dimethoxyphenyl-,

3,4-Methylendioxyphenyl-,

4-Methoxyphenyl-,

4-Acetamidophenyl- und einem

4-Methylthiophenyl-Rest,

und worin R&sup4; ausgewählt ist aus einem:

3,4,5-Trimethoxyphenyl-,

3,4-Dimethoxyphenyl-,

2,4-Dimethoxyphenyl-,

3,4-Methylendioxyphenyl-,

4-Methoxyphenyl-,

4-Acetamidophenyl-,

4-Methylthiophenyl-,

4-Carboxyphenyl-,

4-Nitrophenyl-,

2-Methoxyphenyl-,

2-Methoxy-4-carboxyphenyl-,

2,5-Dimethoxyphenyl-,

2,5-Dimethoxy-4-benzamidophenyl-,

1-Naphthyl-,

4-Nitro-1-naphthyl-,

4-Methoxy-1-naphthyl- und einem

8-Chinolyl-Rest.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7,

wobei das Licht, das das Detektor-Element erreicht, aus einem engen Wellenlängenband besteht, dessen Zentralwellenlänge Abweichungen von mehr als ca. ±5 nm unterliegt, und wobei die genannte Lichtquelle vorzugsweise eine LED ist.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8,

wobei die genannte reduzierende Substanz NADH ist.