DE2259512B2 - gamma-Glutamyl-4-nitranilid-3carbonsäure, deren Salze, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und deren Verwendung - Google Patents

Description

Die Geschwindigkeit der Freisetzung des gelbge- sungsmittel.

färbten p-Nitroanilins kann optisch verfolgt werden Zur isolierung des Rohproduktes bedient man sich

Und ist ein Maß für die vorhandene Aktivität an 40 zweckmäßig Chromatographischer Methoden, bei-

y-GT. spielsweise der Anionenaustauscherchromatographie

Für eine routinemäßige Anwendung dieses Ver- oder/und der Adsorptionschromatographie unter Verfahrens ist die Instabilität und schlechte Löslichkeit wendung von Adsorptionsmitteln wie Kiesefgel oder des Substrates y-Glutamyl-4-nitranilid ein schwerer Aluminiumhydroxyd, wie sie sich insbesondere für die Nachteil. Die Verbindung läßt sich nur schwer in 45 Dünnschichtchromatographie eignen.
Lösung bringen und die Lösungen sind nur kurzzei- Die Löslichkeit (in Wasser bzw. 0,2 M Tris-Puffer tig (etwa 2 Stunden) haltbar. Es war daher erforderlich, pH 8,25 bei 20 bis 25°C) der erfindungsgemäßen VerAbfüllungen jeweils nur für relativ wenige innerhalb bindung ohne Lösungsvermittler liegt über 120 mM, kurzer Zt it durchzuführende Bestimmungen herzustel- d. h., daß sie mindestens 20mal größer als die Löslichlen. Eine Aufbewahrung der Reagenslösungen war so keit des y-Glutamyl-4-nitranilids ist.
nicht möglich. Ein weiterer Nachteil bestand darin, Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der daß die SuI: stanz bei 50 bis 6O⁰C in Lösung gebracht erfindungsgemäßen Verbindung, ihre Eigenschaften Werden mußte, bei einem Überschreiten dieser Tempe- und ihre Verwendung als Substrat für die Bestimmung fatur aber spontan hydrolysierte. Eine derartige der y-Glutamyltranspeptidase (y-GT).
Hydrolyse teeinflußt die optische Extinktion der 55 Bei der enzymatischen Spaltung der erfindungsge-Lösungen, die für die Messung entscheidend ist, in mäßen Verbindung wird 2-Nitro-5-amino-benzoettarkem Maße. Dies ist insbesondere von großem Nach- säure freigesetzt. Deren UV-Spektrum weist folgende teil bei der Durchführung der y-GT-Bestimmung mit Charakteristika auf:
Analysenautomaten, da infolge der dabei gebildeten χ _ 3go_nm
hohen Absorption höhere Aktivitäten nicht exakt 60 _£ ^max _ 9 4 (_Cm²/uMol) bei 405 nm
genug gemessen werden können. Infolge dessen wurde ₌ ^₇₅ (_cm2/„_Mol) bei 380 nm;
bisher bei suboptimalen Substratkonzentrationen von _c _ 9 93 . jq-b ^j
nur 3 bis 4 mM gemessen im Gegensatz zur optimalen '

Konzentration bei etwa 6 mM (CHn. Chim. Acta, 31 Die erfindungsgemäße Verbindung weist nicht nur

[1971], 175 bis 179). 65 eine bessere Löslichkeit als das y-Glutamyl-4-nitrani-

Die aufgeführten Nachteile konnten teilweise be- lid auf, es erfordert auch beim Lösen kein Erwärmen,

seitigt werden durch das in der DT-AS 20 42 829 be- so daß höhere Blindextinktionen vermieden werden,

schriebene Reagens, bei welchem in Gegenwart eines Die Stabilität in Lösung ist gut, bei der Optimalisierung

3 ⁷ 4

der Testbedingungen zur Bestimmung der y-GT treten /?/-Werte im System Butanol/Eisessig/Wasser (Ver-

keine Probleme auf, was für die Erfordernisse der klini- hältnis 50:15:15):

sehen Chemie von großer Bedeutung ist Die Herstel- y-G!utamyl-4-nitranilid-3-c2rbonsäure: 0,25;

lung der Verbindung ist einfach uri billig, die Emp- 4-Nitranilin: 0,6;

findlichkeit der Meßanordnung entspricht der bei S Glutaminsäure: 0,18;

Verwendung von y-Glutamyl-4-nitranilid. -,„„,- _T~ /·κ;

" ' ^J Der optische Drehwert λ m 10%iger Losung (bi-

».;..:,! ι destilliertes Wasser bei 25° C) in einem 50 mm langen

^BeiSpieil Rohr beträgt 37,6°.

Herstellung von y-GIutamyl-^nitraniJid-S-carbon- _Tri7

säure (GLUPA-3-carbonsäure) ¹⁰ UV-Spektrum:

/_max = 317 mn;

9,1 g 2-Nitro-5aniino-benzoesäure (5OmMoI) und ε = 11,7 (αη*/μΜο1) bei 317 nm. 14,2 g Phthaloylglutaminsäureanhydrid (55 mMol)

werden in 50 ml absolutem Dioxan nach Zusatz von Das UV-Spektrum ist in der Zeichnung wiedergege-

13 ml Tributylaiflin gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 15 ben, zusammen mit dem Spektrum der bei der enzyma-

2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach dem Ab- tischen Spaltung freigesetzten 2-Nitro-5-aminobenzoe-

kühlen werden dem Reaktionsgemisch 100 ml 2 N- säure in 0,2 M 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-pro-

Ammoniak zugesetzt und das sich abscheidende Tri- pandiol (Tris-Puffer) und 45 mM GlycyJglycin pH

butylamin mit Äther ausgeschüttelt. Die wäßrige Lö- 8,25.
sung wird zur Trockne eingeengt, in Methanol gelöst ao

und mit 80%igem Hydrazinhydrat auf pH 10 gestellt. Beispiel 2

Die Reaktionslösung bleibt etwa 20 Stunden bei Verwendung der GLUPA-3-carbonsäure zur

Raumtemperatur stehen. Teilweise scheidet sich dabei Bestimmung der y-GT ein Produkt ab, das nach dem Abfiltrieren und nach

dem Waschen mit Methanol verworfen wird. Das 35 A. Durchführung der Messung

methanolische Filtrat wird bis zur Trockene konzen- _{Jn eme KüveUe p}j_pettieren·

triert, und das zurückbleibende Öl in etwa 300 ml destil- _Q. _{M ΤΚΙ5}._Ρ^_{εΓ 40 mM Glycyl}.

liertes Wasser gelöst. , ; _{H = g 25 2 g ml}

Diese wäßrige Losung wird über eine Säule mit _{m mM GLU}p_A._{3<arbonsälire in}

100 ml eines stark basischen Anionenaustauschers auf 30 _Q p_ujf_er 0 2 ml

Styrolbasis mit einer Korngröße zwischen 0,15 und Temperieren auf 25°C, Bestimmung'

0,30 mm m Formiat-Form Chromatographie« mit _{starten durch z be von}

300 ml destilliertes Wasser gewaschen und graduie- Hnmansenim 0 2 ml

- » — . — — _t A 1 Λ *" » ■■ A * 1 '-^ Uli JCWlDWi Ulli ■■«·»«*···«··■>■>· XJmSm IAJLI

rend mit 2 1 Wasser gegen 2 1 0,5 N-Ammoniumcarbo-

natlösungeluiert. Das Eluat wird in 100-ml-Fraktionen 35 mischen, Extinktion bei 405 nm ablesen, gleichzeitig

aufgefangen und dünnschichtchromatographisch (Kie- Stoppuhr starten. Nach genau 1,2 und 3 min Ab-

selgelplatten) im System Butanol/Eisessig/Wasser im lesung wiederholen.

Verhältnis 50:15:15 untersucht (Entwicklung der Aus den Extinktionsdifferenzen pro min (Δ i/min)

Chromatogramme: im UV-Licht blaue Flecke oder Mittelwert bilden und diesen in die Berechnung ein-

nach Besprühen mit Ninhydrin und anschließendem 40 setzen.

Erhitzen, braune Flecke der aminosäurehaltigen

Z' ien). Die Fraktionen, die das Produkt y-Glutamyl- B. Berechnung

4-i..tranilid-3-carbonsäure enthalten (R. Wert 0,25) _{Eine intemationale Einheit {u) ist die} Enzymaktivi-

werden gesammelt und im Vakuum bis zur Trockene _{tät dje bd 25}o_c j _M(J, _{Substrat in 1 min umsetzt Be}.

konzentriert. Das zurückbleibende Pulver wird mit 45 _ZOgen wird auf 1 ml Körperflüssigkeit, z. B. Serum. Für

absolutem Alkohol verrührt, abfiltnert und im Va- _{die Berechnung der} Enzymaktivitäten pro ml (A)

kuum über Calciumchlorid getrocknet. ^ _{allgemein die Formel}

Ausbeute: 7 g y-Glutamyl^-nitranilid-S-carbon-

säure, Di-Ammoniumsalz (58% der Theorie). ^ _ V' IQQQ . ^ £ (mU/ml)

Elektrophoretische Mobilität: 50 min · ε · d ■ ν

V = konstant; 1 120 Volt, etwa 35 mA, _ _ . . . , ,. . .. . . _T.. ...

0,05 M Triäthylammonium-carbonat-Puffer pH 7,5 , ^D<? Extinkt.onskocffizient (ε) von 4-Nitramlin-

Laufzeit: 45 min bei Raumtemperatur, ^^Cf^b°ⁿ _Q ^Sa,^UrC ^w⁸ "AcI" Z*ft ^T^

Laufstrecke· 405 nm 9,4 αη²/μΜο1. Die Schichtdicke (d) der Ku-

bei Bezug auf die Laufstrecke der Glutamnnsäure 55 ^^{ette ist},_n\^cmA L^ht _A ^dal ^V"^lumei\,^des eingesetzten

(= 1,0) ergibt sich ein Verhältnis der Laufstrecken Se'urns (0,2 ml), K ist dieSumme der Voluminaι (3,2ml).

für y-Glutamyl^-nitranilid-S-carbonsäure: 0,82, ^Die ^«»«"8 ^der Extinktion £ erfolgt in Abstanden

für 4-Nitranilin-3«arbonsäure: 0,88, jeweils ano- ^{von X min}· ^{Daraus er}8^{lbt slch}

disch. A = Δ (405 nm)/min · 1702 (mU/ml)

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

oberflächenaktiven Mittels und von Polyvinylpyrroli- Patentansprüche: don gearbeitet wird. Durch dieses Reagens können die Löslichkeitseigenschaften des y-GIutamyl-p-nitranilid

1. y-Glutamyl-^nitranilid-a-carbonsäure und sehr verbessert werden, und auch die Haltbarkeit der deren Salze. S Lösungen wird wesentlich verbessert. Auch m diesem

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen Fall ist jedoch immer noch ein Erwärmen auf 50 bis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 60⁰C erforderlich mit der Gefahr der spontanen Hyman jeweils in an sich bekannter Weise zunächst drolyse und der dadurch hervorgerufenen Ungenauig-2-Nitro-5-amino-benzoesäure mit Phthaloylglut- keit der Messung.

aminsäureanhydrid und anschließend das Reak- io Die erfindungsgemäße Verbindung beseitigt diese

tionsprudukt mit Hydrazin umsetzt und y-Glut- Nachteile und weist einerseits ausgezeichnete Löslich-

amyl-4-nitranilid-3-carbonsäure, gegebenenfalls in keitseigenschaften auf und bildet gleichzeitig ein gutes

Salzform, in üblicher Weise isoliert Substrat für das Enzym y-GT. Besonders letzteres ist

3. Verwendung der Verbindungen gemäß An- überraschend, da andere Derivate des y-Glutamylipruch 1 eis Substrat für die Aktivitätsbesthnmung 15 4-nitranilid mit löslichkeitsverbessernden Substituvou y-Glutamyltranspeptidase. enten der y-GT nicht als Substrat dienen können.

Sie ist bei Raumtemperatur gut löslich und erreicht etwa 80% der Umsatzrate von y-GIutamyi-4-nitranihd

bei gleichen Bedingungen. Die erfindungsgemäße Ver-

ao bindung ist daher ein überlegenes Substrat für die Bestimmung der j'-Glutamyltranspeptidase.

Gegenstand der Erfindung ist die neue Verbindung Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbin-

y-Glutamyl-4-nitranilid-3-carbonsäure und deren Salze. dung erfolgt durch Umsetzung von 2-Nitro-5-amino-Gegenstand der Erfindung sind ferner ein Verfahren benzoesäure mit einem aktivierten Glutaminsäure- «ur Herstellung von y-GlutamyM-nitranilid-S-carbon- as derhat, aämlich Phthaloylglutaminsäureanhydrid. Die Säure und deren Salzen sowie deren Verwendung als Umsetzung wird einem polaren organischen Lösungs-Substrat zur Aktivitätsbestimmung der y-Glutamyl- mittel in Gegenwart eines Amins durchgeführt und transpeptidase gemäß den vorstehenden Patentan- das erhaltene Reaktionsprodukt mit Hydrazin unter Sprüchen. alkalischen Bedingungen zur Reaktion gebracht, wobei

Die Bestimmung der y-GIutamyltranspeptidase 30 die erfindungsgemäße Verbindung erhalten wird. Als (y-GT) wird im klinisch-chemischen Labor in zuneh- polares organisches Lösungsmittel wird Dioxan beinendem Maße zur Diagnostik von Lebererkrankungen vorzugt. Es können aber auch andere Lösungsmittel durchgeführt. Nach einem bekannten Verfahren er- verwendet werden, wie Tetrahydrofuran oder Formfolgt die Bestimmung entsprechend der Reaktion: amid. Als Amin wird ein tertiäres aliphatisches Amin ... .... _, , , . 35 eingesetzt, insbesondere mit 1 bis 6 Kohlenstoffato-

y-Glutamyl-4-nitranilid + Glycylglycm _men j_e Alkylgruppe. Die Umsetzung mit Hydrazin er-

«*= 4-Nitranihn + GlutamylglycyCglycin _{folgt in einem n}j_edrj_gen Alkohol oder Keton als Lö-