DE3415636A1

DE3415636A1 - Verfahren zur selektiven bestimmung der aktivitaet von kathepsin-b und peptidsubstrate

Info

Publication number: DE3415636A1
Application number: DE3415636A
Authority: DE
Inventors: David N. Hortonville Wis. Haney
Original assignee: Kimberly Clark Corp
Current assignee: Kimberly Clark Corp
Priority date: 1983-04-28
Filing date: 1984-04-26
Publication date: 1984-10-31
Also published as: DK201084D0; IT8448107A0; IT1182706B; AU2743284A; FI841686A; NL8401375A; GB2140423A; GB8410841D0; SE8402305L; ES8604691A1; DK201084A; ES531962A0; KR850002289A; BR8401996A; SE8402305D0; FR2545503A1; FI841686A0

Description

^{p 18792}

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Kathepsin-B-Aktivität in Anwesenheit anderer proteolytischer Enzyme, wie Trypsin. Darüber hinaus betrifft die Erfindung neue Substrate, die hochspezifisch für Kathepsin-B sind. Die erfindungsgemäße Methode ist besonders geeignet zur Feststellung abnormaler Kathepsin-B-Aktivitätsspiegcl in Körperfluiden, wie menschlichem Blut und in Körpcvr- jQ geweben.

Proteinasen sind Enzyme, die Proteine und Polypeptidketten verdauen. Diese Enzyme sind hochselektiv für die Spaltungsstellen der Polypeptidsubstrate. Diese Enzymaktivität wird in einem normalen biologischen System genau gesteuert. Ein Zusammenbruch dieser Steuerung kann zu ernstlichen biologischen Folgen führen. Derartigen Zusammenbrüchen oder Störungen der Aktivität von Proteinasen wurden zahlreiche Erkrankungszustände zugeschrieben (wie in A. J. Barrett, Ed« 1979,

2Q Proteinases in Mammalian Cells and Tussues, North-Holland, New York; A. J. Barrett und J. K. McDonald (1980), Mammalian Proteases: A Glossary and Bibliography, Bd. 1, Academic Press, New York, diskutiert).

Kathepsin-B ist eine normale lysosoirtale Cystein(thiol)-proteinase. In der letzten Zeit wurde gezeigt (A. J. Barrett und J. K. McDonald, loc. cit.; M. Sandler, Ed. 1980, Enzyme Inhibitors as Drugs, University Park Press, Baltimore), daß ein offenbarer Zusammenbruch in der Steuerung der Kathepsin-B-Aktivität zu zahlreichen Erkrankungszuständen führen kann. Mehrere Erkrankungen, die mit dem Kollagen- und Strukturglykoprotein-Zusammenbruch einhergehen, wurden in Verbindung mit einer erhöhten Kathepsin-B-Aktivität gebracht. Insbesondere wurde eine Beziehung zwischen der Aktivität von Kathepsin-B und metastatischer Erkrankungen durch verschiedene Untersuchungen vorgeschlagen, einschließlich der Erhöhung der Kathepsin-B-Aktivität oder der kathepsin-B-artigen Aktivität in dem Blut von Patienten mit metastatischen

EPO COPY

Erkrankungen (wie in R. J. Pietras, et al., (1978) Obstet. Gynecol. 52; 321-327; R. J. Pietras, et al. (1979) Gynecol. Oncol. 7; 1-17, diskutiert).

Dementsprechend wäre eine Methode für die genaue und selektive Bestimmung der Aktivität von Kathepsin-B in Körperflüssigkeiten von Säugern eine brauchbare Diagnosehilfe, wie die Feststellung oder die überwachung.

YQ Die Bestimmungen zahlreicher Enzymaktivitäten sind im klini schen Labor Routineverfahren. Typischerweise umfassen derartige Assays den Kontakt der Enzym enthaltenden Probe mit einem synthetischen Substrat (als die Substanz oder Verbindung definiert, auf die das Enzym einwirkt) das durch die-

jc ses Enzym selektiv zu Produkten gespalten wird, die die Farbe ändern.

Enzym

Substrat > Produkte

(farblos) (gefärbt)

oder
(gefärbt) (farblos)

So wären Substrate für Kathepsin-B, Peptidverbindungen oder peptidartige Verbindungen, die bei Spaltung eine Analyse der Produkte ermöglichen. Assays, die für Kathepsin-B verwendet wurden, wie in A. J. Barrett, loc. cit.; R. J. rictras, loc. cit.; A. J. Barrett (1980) Biochem. J. 187: 909-912 diskutiert, umfaßten Peptidsubstrate, die eine oder mehrere Arginyl- oder Lysyl-aminosäuren gebunden an eine enzymspaltbare Indikatorgruppe enthalten (z. B. Bz-Arg-NA, CBZ-Lys-PNP, CBZ-Arg-Arg-MNA, CBZ-Ala-Arg-AFC, CBZ-Phe-Arg-AMC, vergleiche die nachstehenden Abkürzungen). Zwar ist die selektive Spaltung synthetischer Substrate durch Kathep sin-B noch nicht voll verständlich, jedoch sind diese bisher verwendeten Substrate durch die Natur ihrer positiv geladenen Gruppen auch durch die trypsinartigen (Serin)

Proteasen spaltbar. Somit sind die Assays für Kathepsin-B unter Verwendung eines dieser Lysyl- oder Arginylsubstrate in Körperflüssigkeiten von Säugern kompliziert durch die Anwesenheit von überschüssigen trypsinartigen Proteasen.

Insbesondere war es nicht bekannt, wie eine spezifische Wirkung zur Feststellung der Aktivität von Kathepsin-B in der Anwesenheit von Trypsin und trypsinartigen Enzymen erreicht werden könnte.

IQ Dementsprechend ist ein Ziel der Erfindung die Bereitstellung von für Kathepsin-B hochspezifischen Substraten. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die selektive Bestimmung der Aktivität von Kathepsin-B in Anwesenheit anderer proteolytischer Enzyme, beispielsweise von Trypsin. Ein weiteres

j5 Ziel der Erfindung ist die Bestimmung der Aktivität von Kathepsin-B in Körperfluiden bzw. -flüssigkeiten und Geweben von Säugern. Weitere Ziele und Gegenstände der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zum Test der Aktivität von Kathepsin-5 in Materialien. ξ.Ε. in Körpern ui den bzw. -fiüssigkeite:·; oder Geweben von Säugern,bereitgestellt durch Messung der Rate bzw. des Ausmaßes in der bzw. dem eine Indikatorgruppe X bei Spaltung eines für Kathepsin-B hochselektiven synthetischen Peptidsubstrats freigesetzt wird. Substrate, die geeignete Indikatorgruppen zur Feststellung von Kathepsin-B enthalten, weisen folgende allgemeine Formel auf:

sowie Salze davon, worin:

X ein Rest ist, der durch Kathepsin-B an der R₁-X-Bindung spaltbar und durch die Spaltung feststellbar bzw. bestimmbar ist;

R₁ eine Aminosäuregruppe mit der L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe (C_a) ist und die innerhalb des pH-Bereichs der Testbedingungen nicht positiv geladen ist, vorzugsweise mit einer polaren Seitenkette,

wobei die Seitenkette vorzugsweise 2 bis 8 Atome aufweist;

R ist eine hydrophobe Aminosäuregruppe, vorzugsweise Phenylalanyl, mit der L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe (C₀J ; und weist vorzugsweise eine Seitenkette der Formel -CH₂-Y auf, worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe von Niedrigalkyl, Phenyl, substituiertem Phenyl und Indolgruppen.

Z ist eine aminoblockierende Gruppe bzw. eine Aminoschutz-,Q gruppe, die nicht in die selektive Bindung von Kathepsin-B an die Gruppen R₁ und R₂ eingreift.

Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert. Es werden folgende Abkürzungen verwendet: ,C Aminosäuren (falls nicht anders angegeben werden alle als

L angenommen)	- L-Phenylalanylgruppe
Ph e	- L-Citrullylgruppe
Cit	- L-Alanylgruppe
AIa	- Arginylgruppe
Arg	- Lysylgruppe
Ly s

Ly s - I

(NO₉)Arg - N -Nitroarginylgruppe (Ts)Arg - N°-Tosylarginyl (oder N^-p-Toluolsulfonyl-

arginyl )-gruppe Trp - Triyptophylgruppe Met - Methionylgruppe Asp - Aspartylgruppe (TFA)Lys - N^-Trifluoracetyllysinylgruppe U'lV.')liys - N -Carbobenzyloxylysylgruppe VaI - Valylgruppe Leu - Leucylgruppe He - Isoleucylgruppe NaIa - Naphthylalanylgruppe

Amin blockierende Gruppen bzw. Aminoschutzgruppen CBZ - Carbobenzyloxygruppe Bz - Benzoylgruppe t-BOC - t-Butyloxycarbony!gruppe ' Ef⁵O COPY

Chromophore und Fluorophore

AMC - 7-Amino-4-methylcumaringruppe

HMC - 7-Hydroxy-4-methylcumaringruppe

AFC - 7-Amino-4-trifluormethylcumaringruppe (PCT-Patent W080/02295)

AQ - 6-Aminochiniingruppe

NA - 2-Naphthylamingruppe

MNA - 4-Methoxy-2-naphthylamingruppe

PNP - para-Nitrophenolgruppe

2Q PNA - para-Nitroanilingruppe

Synthetische Reagentien und Lösungsmittel

TEA - Triethylamin DCC - NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid DMF - N,N-Dimethylformamid THF - Tetrahydrofuran DMSO - Dimethylsulfoxid HOAc - Essigsäure HBr/HOAc - Essigsäure gesättigt mit HBr Pd-PEI - Palladium-Polyethylenimin-Katalysator

Verschiedene

EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz mMol - Millimol mm - Millimeter nm - Nanometer

/«7^ (DMF) - optische Drehung bei 589 nm, 25 ⁰C, in DMF-Lösungsmittel

Bis-Tris - 2,2-Bis(hydroxymethyl)-2,2',2"-nitrilotr!ethanol HPLC - hochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie (High-Performance-Flüssigkeitschromatographie) unter Anwendung von einer Alltech (Deerfield, 111.) Säule: 4,6 χ 250 mm, C18; Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektor: UV 340, 313, 280 und 254 nm. Das Lösungsmittel der mobilen Phase, die

Retentionszeit und die geschätzte Reinheit sind für jede Probe aufgeführt.

MS - Massenspektroskopie unter Verwendung eines

.EPO-COPV

Micro Mass VG7070H-Instrumentes mit einer Atom-

bombardment-Probe (9KV Xenon) und Probe gelöst in DMSO/Glyzerin.

H-NMR - Protonenkernmagnetische Resonanz an einem Bruker 270 MHζ-Instrument unter Verwendung von d_fi-DMSO

als Lösungsmittel und Tetramethylsilan als innerer Standard bei einer chemischen Verschiebung («Γ) von 0/0. Die chemischen Verschiebungen <f, die maximalen Splittings: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, qn = Quin

tett, se = Sextett, c = komplexes Multiplett, und die Anzahl der Protonen (Ip = 1 Proton) sind für jede Probe angegeben.

Fp - Schmelzpunkt (nicht korrigiert, Fisher-Johns-Vorrichtung)

HPLC(Prep)- Hochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie

(High Performance Flüssigkeitschromatographie) unter Anwendung einer Alltech (Deerfield, 111.)

Säule: 10 χ 250 mm, C18, Strömungsgeschwindigkeit: 2 ml/min; Detektor: UV 340 nm. Lösungsmittel der mobilen Phase und Retentionszeit sind für jede Probe aufgeführt.

Aus Ubersichtlichkeitsgründen sind die Peptidsubstratverbindungen unter Anwendung folgender Beziehung zwischen der Formel und der Struktur angegeben. Die allgemeine Formel lautet wie folgt:

Die Strukturformel dafür kann wie folgt geschrieben werden

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^R2 Γ ^Rl

R₄ j O

ο Il

1 ^ CH^ L* NHv^ ^C I NH ο C § ^CH^

¹O ' . R₃

worin R- die Seitenkette für die R..-Aminosäuregruppe ist, und R₄ die Seitenkette für die R_-Aminosäuregruppe ist.

X ist ein Rest der durch Kathepsin-B an der R₁ - X -Bindung abspaltbar ist, der bei Abspaltung gemessen werden kann. Beispiele für X umfassen AMC, AFC, AQ, HMC, PNP, PNA.

.

Salze dieser Verbindungen umfassen jegliche Salze zur Kristallisation wie dies der Fall wäre, wenn X die Bedeutung von AQ hätte und dieser Rest das Hydrochloridsalz bilden würde.

R₁ ist eine Aminosäuregruppe mit der L-Konfiguration an dem vorstehend als OC₁ bezeichneten Kohlenstoff, die unter den Assay-Bedingungen nicht positiv geladen ist. Beispielsweise sollte die Aminosäuregruppe R₁ nicht im pH-Bereich von etwa 4 bis etwa 8 positiv geladen sein.

Unter Bezugnahme auf die vorstehende Strukturformel ist R₃ eine Seitenkette von R-, die vorzugsweise 2 bis 8 Atome enthält. Beispiele für R., umfassen:

- CH₃ für R₁ das Ala ist.

NH

- (CH₂)₃-NHC-NH-NO₂ für R₁ das (NO₂) Arg ist.

"

- (CH-)-,-NHC-NH₀ für R₁ das Cit ist.

NH

- (CH₂)3-NHC-NH-SO₂-C₆H₅-CH₃ für R₁ das (Ts) Arg ist.

COPY

O ~r~ FQ*

-(CH₂)₄-NH-CCF₃ für R₁ das (TFA) Lys ist.

Die L-Konfiguration ist zur Bindung von Kathepsin-B notwendig. Der Zweck des Ausschlusses positiv geladener Gruppen liegt in der Eliminierung möglicher Reaktionen mit trypsinartigen Enzymen, die den Assay oder die Bestimmung stören wurden.

R2 ist eine hydrophobe Aminosäuregruppe, vorzugsweise Phe, 2Q mit der L-Konfiguration am ou-Kohlenstoff (C*). Die L-Konfiguration wird zur Bindung von Kathepsin-B benötigt. Die hydrophobe Aminosäuregruppe erhöht auch die Bindung des . Substrats an Kathepsin-B.

In der vorstehenden Strukturformel ist R. eine Seitenkette für R₂ , vorzugsweise mit der Formel:

- CH₂ - Y

worin Y eine Niedrigalkyl-, Phenyl-, substituierte Phenyl- oder Indolylgruppe ist. Mit Niedrigalkyl sind 1 bis 8 Kohlenstoff atome gemeint. Beispiele für R, umfassen:

_^,,_|| H J für R₂ das Trp ist CH₂ -*

- CH₀-C, H₅ für R das Phe ist.

- 011,-OH-(CH,)., für R., das Leu ist.

- CH-(CH₃), für R₂ das VaI ist.

Z ist weniger wichtig als R^ und R₂, ist jedoch geeignet zur Bewirkung geringfügiger Veränderungen der Affinität der Verbindung für KathepsinB. Diese Gruppe Z kann eine einfache Aminoschutzgruppe sein wie CBZ, BOC oder Bz. Z kann auch eine andere blockierte Aminosäuregruppe sein, wie CBZ-(D- oder L-Konfiguration)-Ala. Die Gruppe Z sollte in keinem Falle in die selektive Bindung von Kathepsin-B an die Gruppen R. und Rp eingreifen.

1 Die chemischen Strukturen der hier diskutierten und in den Beispielen vorkommenden Peptide sind im folgenden aufgeführt:

Nr. Verbindung oder Substrat 5.1. CBZ - Phe - Cit - AMC

2. CEZ - Leu - Cit - AMC

3. CEZ -

EPO COPY A

1 4. CBZ - VaI - Cit - AMC

NH

15 5. CBZ - Trp - Cit - AMC

6. CBZ - Phe - Ala - AMC

EPO

1 7. CBZ - VaI - Ala - AMC

I!

NH

CH,

8. CBZ - Trp - Ala - AMC

9. CBZ - Phe - (NO₂) Arg - AMC

EPO COPY

* «ßIf·. »

1 10, 11. CBZ - (.D oder L> Ala - Phe - Cit - AMC

12. CBZ - Phe - Met - AMC

13. CBZ - Phe - (Ts) Arg - AMC

H₅

CH,

EPO COPY

1 -14. CBZ - Phe .- (CBZ) Lys - AMC

15. CBZ - Phe - (TFA) Lys - AJMC

16. CBZ - Phe - Trp - AMC

" ΝίΓΥ^ΝΗ

Il

NH

CH₃

COöi

1 17. CBZ - NaIa - Cit - AMC

18. C3Z - Phe - Arg - AFC

19. CBZ - Ala - Arg - Arg - AFC

EPO COPY

20. BZ- VaI - Lys - Lys - Arg - AFC

Die Synthese der Peptidsubstrate kann durch zahlreiche allgemein übliche Peptidsynthesemethöden erfolgen. Im folgenden sind drei Synthesemöglichkeiten veranschaulicht:

Methode A: Die Gruppe Z-R- wird an die Gruppe R₁-X nach der DCC-, gemischten Anhydrid- oder anderen typischen Kupplungsmethode gekuppelt.

Methode B: Das vorausgehend synthetisch hergestellte vollständige Peptid Z-R₂-R₁ wird mit der Indikatorgruppe X gekuppelt unter Anwendung der DCC-, gemischten Anhydridoder einer anderen brauchbaren Kupplungsmethode. Methode C: Anschließend an die Sequenzkupplung der Gruppen Z, R₂ und R₁ folgt die Kupplung der Indikatorgruppe X unter Anwendung der DCC-, gemischten Anhydrid- oder einer anderen brauchbaren Kupplungsmethode.

Die allgemeinen Verfahrensweisen für die Hauptanzahl der in den Beispiele!! b^s£hr^ebe.n^nJ7ej^ii}jd.ungen_^ind--nachste- --hend aufgeführt und verlaufen nach der allgemeinen Methode A:

Base

.2. CBZ -

- + AMC

gemischtes

Anhydrid

-> CBZ - R-· - AMC

EPO COPY

₀/Pd

H_nN-R₁- AMC

4. CBZ-R₁₊ H₂N

- AMC

gemischtes

CBZ -

- _AMC

worin R, und f:_ unterschiedliche Aminosäuren in der allgemeinen Formel bezeichnen, und CBZ für Z und AMC für X verwendet werden. Gemischtes Anhydrid bezieht sich auf den Typ der Kupplungsverfahrensweise.. Die Einzelheiten der Reaktion 1-4 sind nachstehend aufgeführt.

(1) CBZ-Cl-Reaktion: In einigen Fällen waren die CBZ-R-Derivate handelsüblich,in anderen wurden sie nach folgender Verfahrensweise hergestellt: Die Aminosäure R (25 mMol) und 50 mMol Natriumbicarbonat wurden in 50 ml Wasser in einem 100-ml-KoiDen gelöst. 27,5 iriMol Carbobenzyloxvchlorid wurden unter Rühren bei Raumtemperatur in 5 aliquoten Teilen während 1 Stunde zugesetzt. Nach dem Rühren der Lösung wäh-

2C rend weiterer 2 Stunden vjrde sie mit Ether zweimal extrahiert und anschließend in 10 0 ml 1 m HCi getropft. Das Produkt fiel zuerst als Halbfeststoff aus und verfestigte sich . dann beim Stehen. Das Rohprodukt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet. Die durch-

25 schnittliche Ausbeute betrug 55 %.

(?) AMC-Kupplung; In einen 50-rcl-Kolben wurden 11,4 mMol block.eil-· R.-Amino-'Siir·. , 15 ml wasserfreies THF und 11,54 ■· r.uMol TEA gc;iü?t.. Nach dem Auflösen der .Verbindung wurde, die Lösung auf Eis gekühlt* und 11 ,4 mMol Isobutylchlorformiat V wurden zugesetzt. Die Lösung wurde 10 Minuten auf Eis ^.;^_:,' gerührt und anschließend wurde eine gekühlte Lösung von "_.--.. 11,4 mMol AMC in 21 ml DMF zugesetzt. Es wurde weiter 1 Stunde auf Eis und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das THF wurde aus dem Filtrat auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in einen 125-ml-Scheidetrichter zusammen mit 20 ml CH₃Cl₂ und 30 ml 10 % wäßriger HCl gefügt

BAD ORIGINAL EPOCOPY

und kräftig geschüttelt. Nach dem Extrahieren der organischen Phase mit einem aliquoten Teil einer zweiten wäßrigen Säure fiel das Produkt in der organischen Phase aus. Die wäßrige Phase wurde dekantiert und die Ausfällung durch Filtrieren gesammelt und mit Ether gewaschen. Das Produkt wurde getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet. Die durchschnittliche Ausbeute betrug 41 %.

(3) Deblockieren bzw. Abspalten der Schutzgruppe: Die N-Carbobenzyloxy-Schutzgruppe wurde von Z-R, - AMC entfernt entweder durch Behandeln mit einer Bromwasserstoff/Eisessiglösung (HBr/HOAc) oder durch katalytische Hydrierung. In zwei Beispielen wurden -t-BOC anstelle von CBZ verwendet und die Abspaltung der Schutzgruppe wurde durch Behandeln mit Ameisensäure erzielt.

HBr/HOAc): In einen 500-ml-Kolben wurden 3,8 mMol Z-R"-AMC und 70 ml 33 % HBr/HOAc gefügt. Nach dem Auflösen der Probe wurde die Lösung weitere 15 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 500 ml Ether verdünnt und die resultierende Ausfällung wurde durch Filtrieren unter Stickstoff gesammelt. Das Produkt wurde erneut dreimal in 100 ml Ether suspendiert und erneut filtriert. Das Produkt wurde getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet. Die durchschnittliche Ausbeute betrug 98 %.

Katalytisches Hydrieren: In einen 500-ml-Druckkolben wurden 8,5 mMol Z-R--AMC, 4 g Palladium-Polyethyleniminperlen (Pd-PEI) und 200 ml Methanol gefüllt. Der Kolben wurde mit einem Wasserstoffüberdruck von 1,4 bar (20 psig) unter Druck gesetzt und 6 Stunden geschüttelt, worauf er weitere 18 Stun den stehengelassen wurde. Nach dem Absetzen der Katalysatorperlen wurde der Alkohol dekantiert und die Perlen wurden zweimal mit 50 ml Methanol gewaschen. Um die Reinigung zu unterstützen wurde das Hydrochloridsalz hergestellt durch Zusatz von 12,5 ml 1 η wäßriger HCl. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde erneut aufgelöst und zweimal mit 50 ml denaturiertem Alkohol erneut

verdampft. Der Rückstand wurde mit denaturiertem Alkohol trituriert und über Nacht stehengelassen. Das Produkt R--AMC wurde durch Filtrieren gesammelt, mit denaturiertem Alkohol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet. Die durchschnittliche Ausbeute betrug 78 %.

Ameisensäure: In einen 500-ml-Kolben wurden 1,75 mMol t-BOC-R.-AMC und 30 ml 97 % Ameisensäure gefügt. Nach dem Auflösen der Verbindung wurde die Lösung bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Hierzu wurden 250 ml Ether und 0,2 ml konzentrierter HCl (zur Bildung des HCl-Salzes) gefügt. D.\e weiße Ausfällung wurde filtriert und mit Ether gewaschen. Nach dem Trocknen unter Vakuum wurde das Produkt ohne weitere Reinigung verwendet.

(4) Peptidkupplung: In einen 50-ml-Kolben wurden 3,2 mMol R--AMC . HBr (oder HCl), 25 ml wasserfreies DMF und 3,2 mMol TEA gefügt. In einen zweiten 50-ml-Kolben wurden 3,2 mMol CBZ - R_, 10 ml wasserfreies DMF und 3,2 mMol TEA gefügt. Nach dem Auflösen der Verbindungen wurden beide Lösungen auf Eis gekühlt und 3/2 mMol Isobutylchlorformiat wurden zu der CBZ - R_-Lösung gefügt. Dieses Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten auf Eis gerührt und dann wurde die gekühlte R- - AMC-Lösung zu dem CBZ - R -Reaktionsgemisch gefügt.

Es wurde weiter 1 Stunde auf Eis und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 9 50 ml 5 % wäßriges Natriumbicarbonat unter Rühren getropft. Die Ausfällung wurde durch Filtrieren gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die durchschnittliche Rohausbeute betrug 90 %.

Reinigung: Die Endprodukte wurden durch folgende Kristallisation gereinigt und in einigen Fällen durch zusätzliche Kristallisationen und HPLC. Das CBZ - R₂ - R₁ - AMC-Produkt (2,9 mMol) wurde in 35 ml Eisessig unter Rühren und gelindem Erwärmen gelöst. Hierzu wurden 54 ml Acetonitril gefügt und diese Lösung wurde zum Rückfluß erwärmt. Die heiße

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Lösung wurde filtriert und 80 ml Wasser wurden zu dem FiI-trat in geringen aliquoten Teilen unter Erwärmen und Rühren gefügt. Beim Kühlen bildete sich eine weiße Ausfällung, die filtriert und mit Wasser gewaschen wurde. Das umkristallisierte Produkt wurde unter Vakuum getrocknet und die durchschnittliche Kristallisationsausbeute betrug 80 %. Die Gesamtausbeute und synthetische Änderungen sind für jedes nachstehende Beispiel aufgeführt.

Assay: Die Aktivität von Kathepsin-B wird durch Überwachung des Ausmaßes der Freisetzung der Indikatorgruppe X festgestellt. Die Indikatorgruppe kann ein Rest sein, dessen Fluoreszenz oder Absorptionsfähigkeit sich bei der Abspaltung ändert. Es können jegliche der bekannten Indikatoren wie AMC₇ HMC, AFC₇ AQ oder PNA verwendet werden. Alternativ kann ein radioaktiv markierter Indikator verwendet werden.

Die Assay-Verfahren für dieses Enzym, Kathepsin-B, verfolgen Standardverfahrensweisen und allgemeine Prinzipien, die für Enzyme gelten (wie beschrieben in A. J. Barrett, loc. cit.; W. P. Jencks (1969), Catalysis in Chemistry and Enzymology, McGraw Hill, New York). Kinetische

Bedingungen eines konstanten Zustandes werden eingestellt unter Anwendung geeigneter Enzym/Substrat-Konzentrationsverhältnisse (die Substratkonzentration und ihre Michaelis-Konstante übersteigen stark die Enzymkonzentration) um eine genaue Information über das Ausmaß im kürzesten Laborzeitmaßstab zu erhalten.

Die Bestimmung der Aktivität von Kathepsin-B erfolgt durch Zusatz einer geringen Menge einer Probe eines Körperfluids bzw. einer Körperflüssigkeit (1-50 Mikroliter, μΐ) zu einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Bereich in dem das Kathepsin-B aktiv ist, üblicherweise pH 5-6,5, vorzugsweise pH 5,5, die EDTA und einen Thiolaktivator (biologisches Antioxidans oder anderes geeignetes Reduktionsmittel) wie Cystein oder Di- · thiothreitol enthält. Nach einer kurzen Aktivierungsperiode wie 1-2 Minuten, wird das Substrat, gelöst in einem

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-JA- ^O«

verträglichen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Acetonitril oder DMF, in einem geringen Volumen (20 μΐ) derart zugesetzt, daß die Konzentration des Substrats wesentlich größer als die Enzymkonzentration (vorzugsweise mindestens 100-fach) ist. Die Temperatur wird auf einen eingestellten Punkt gesteuert, vorzugsweise im Bereich von Umgebungstemperatur bis etwa 37 ⁰C. Nach dem Vermischen von Substrat und Probe kann die Konzentration des gespaltenen Indikators bezogen auf die Zeit in einem Spektrophotometer, Spektro- IQ fluorometer , Scintillationszähler oder mit anderen bekannten Mitteln gemessen werden, die üblich bzw. bekannt sind.

Eine Standardkurve der Konzentrationen des freien Indikators wird aufgestellt, so daß man einen Maßstab für unbekannte Proben erhält. Die Berechnungen für einen fluoreszierenden Indikator sehen wie folgt aus:

Gleichung 1; A · B = C
spezifisch

(A Fluoreszenzeinheiten/min) (B ₎ ₌

Fluoreszenzexnheiten (C μΜ Indikator/min)

worin A aus der Messung mit der Probe erhalten wird, B aus der Standardkurve erhalten wird, und C das Ergebnis ist. Der Ausdruck "μΜ" bedeutet mikromolar (μΜοΙ/Liter), "ml" bedeutet Milliliter und "min" bedeutet Minuten. Die Berechnungen erfolgen in gleicher Weise, wenn andere Indikatoren verwendet werden. Die Information aus dieser Berechnung ergibt das Ausmaß als Konzentration der freien Indikatorgruppe X und ihre Veränderung im Verlauf der Zeit. Dieses Ausmaß steht in direkter Beziehung zu dem Ausmaß der Substratspaltung durch das Enzym, und somit kann die Menge der Enzymaktivität abgeleitet werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

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Beispiele für die Substratsynthese

Beispiel 1: CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC wurde synthetisch wie in den vorhergehenden Stufen 1-4 genauer angegeben hergestellt unter Anwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in Stufe 3 und Umkristallisieren aus 17 ml HOAc, 74 ml CH^CN, 140 ml H₂O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 14 % Fp = 227-230 ⁰C; fkj ^⁵ (DMF) =

-22.77°. HPLC (70% CH₃OH/30%H₂0) 9.6 min, 97.3%.

¹ H-NMR: δ 1.30-1.55, c, 2p; 6 1.55-1.81, c, 2p; δ 2.40, s, 3p; δ 2.75, t, Ip; δ 2.90-310, C, 3p; δ 4.28-4.40, c, Ip; δ 4.40-4.51, c, Ip; δ 4.94, s, 2p; δ 5.43, s, 2p; δ 6.00, t, Ip; 6 6.28, s, Ip; δ 7.10-7.39, c, 10p; δ 7.48, d, Ip; δ 7.51, d, Ip; δ 7.73, d, Ip; δ 7.80, d, Ip; δ 8.35, d, Ip; δ 10.51, s, Ip. MS: stammmolekülion = 614.

Elementaranalyse: berechnet auf C₃3^H3 5^N5°7'

C 64,59 % H 5,75 % N 11,41 %; gefunden C 64,81 %, H 5,77 %, N 11 ,61 %.

Beispiel 2: CBZ-L-Leu-L-Cit-AMC wurde wie genauer in den vorstehenden Stufen 1-4 angegeben synthetisch hergestellt unter Verwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in Stufe 3 und Umkristallisieren aus 17 ml HOAc, 36 ml CH...CN, 136 ml H₀O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 19 %; Fp = 196 - 198 ⁰C. L*\ZT (DMF) =

-25.79°. HPLC, (45% CH₃CN/55% H₂O) 9.8 min, 99.9%. ¹ H-NMR: δ 0.87, 2d, 6p; δ 1.44, t, 3p; δ 1.54-1.77, c,

4p; δ 2.39, s, 3p; δ2.86-3.10, c, 2p; δ4.10, g, Ip; δ 30

4.43, q, Ip; 6 5.04, s, 2p; δ 5.42, s, 2p,- δ 5.98, t, Ip; δ 6.27, S, Ip; δ 7.24-7.53, c, 7p; δ 7.72, d, Ip; δ 7.78, d, Ip; δ 8.16, d, Ip; δ 10.46, s, Ip. MS: Stamm-molekülion = 580.

Elementaranalyse: berechnet auf ^C3q^H37^N5^O7'

C 62,16 %, H 6,43 %, N 12,08 %; gefunden C 62,59 %, H 6,50 %, H 12,06 %.

EPOCOPY ff"'

Beispiel 3: CBZ-L-Ile-L-Cit-AMC wurde wie genauer vorstehend in den Stufen 1-4 beschrieben synthetisch hergestellt unter Anwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in Stufe 3, und Umkristallisieren aus 20 ml HOAc, 34 ml CH₃CN, 54 ml H-O pro Gramm. Die Gesamtausbeute trug 19 %. Fp = 240 - 242 ⁰C. £*J ^⁵ (DMF) = -28.16°. HPLC (50%CH₃CN/50%H₂0) 7.1 min, 91.8%. ¹ H-NMR: δ 0.73-0.93, C, 6p; δ 1.00-1.80, C, 7p; δ 2.40, S, 3p; δ 2.86-3.12, c, 2p; δ 3.96, t, Ip; δ 4.43, q, Ip; δ 5.05, s, 2p; δ 5.43, s, 2p; δ 5.99, t, Ip; δ 6.27, s, Ip; δ 7.25-7.42, c, 6p; δ 7.49, d, Ip; δ 7.72, d, Ip; δ 7.78, s, Ip; δ 8.20, d, Ip; δ 10.46, s, Ip. MS; Stamm-Molekülion = 580.
Elementaranalyse: berechnet auf C-._QH-_N O₇,

!5 C 62,16 %, H 6,43 %, N 12,08 %; gefunden C 62,24 %, H 6,36 %, N 12,14 %. -

Beispiel 4: CBZ-L-Val-L-Cit-AMC wurde synthetisch hergestellt wie genauer vorstehend in den Stufen 1-4 beschrie- hen unter Verwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in Stufe 3, und Umkristallisieren aus 24 ml HOAc, 75 ml CH₃CN, 128 ml H₃O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 16 %. Fp = 244-247 ⁰C. /K 7 J⁵ (DMF) = -27.36°. HPLC (35%CH₃CN/65%H₂0) 17.1 min, 93.8%.

¹ H-NMR: δ 0.73-1.0, c, 6p; δ 1.30-1.54, c, 2p; δ 1.54-1.83, c, 2p; δ 1.83-2.10, c, Ip; δ 2.40, s, 3p; δ 2.83-3.12, c, 2p; δ 3.94, t, Ip; δ 4.43, q, Ip; δ 5.05, s, 2p; Ö 5.42, s, 2p; δ 5.98, t, lp; δ 6.28, S, Ip; δ 7.20-7.43, c, 5p; δ 7.44-7.49, c, 2p; δ 7.72, d, Ip; δ 7.77, d, Ip; δ 8.19, d, lp; δ 10.46, s, Ip. MS: Stamm-Molekülion = 566

Elementaranalyse: berechnet auf ^C29^H35^N5°7' C 61,58 %, H 6,24 %, N 12,38 %; gefunden C 61,86 %, H 6,27 %, N 12,44 %.

EPO COPY

Beispiel 5: CBZ-L-Trp-L-Cit-AMC wurde synthetisch hergestellt wie vorstehend genauer in den Stufen 1-4 beschrieben unter Anwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in Stufe 3, und Umkristallisieren aus 16 ml HOAc, 37 ml CH₃CN, 96 ml H₃O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 17 %. Fp. = 235-238 ⁰C, /ÖC_7 ^⁵ (DMF) = -23,75°. HPLC, (45%CH₃CN/55%H₂0) 5.2 min, 95.6%.

¹ H-NMR: 6 1.30-1.54, C, 2p; δ 1.54-183, c, 2p; δ 2.40,' S, 3p; δ 2.82-3.40, C, 4p; δ 4.33-4.54, c, 2p; δ 4.96, s, 2p; δ 5.43, s, 2p; δ 5.99, t, Ip; δ 6.27, s, Ip; δ 6.95, t, Ip; δ 7.05, t, Ip; δ 7.10-7.45, C, 8p; δ 7.50, d, Ip; δ 7.65, d, Ip; δ 7.73, d, Ip; δ 7.80, d, Ip; δ 8.33, d, Ip; δ 10.49, s, Ip; δ 10.79, s, Ip. MS: Stamm-Molekülion = 653.

Elementaranalyse: berechnet auf ^C3 5^H3g^N6°7' C 64,41 %, H 5,56 %, N 12,88 %; gefunden: C 64,46 %, H 5,48 %, N 12,94 %.

Beispiel 6: CBZ-L-Phe-L-Ala-AMC wurde synthetisch wie vorstehend in den Stufen 1-4 genauer beschrieben hergestellt unter Verwendung der Deblockierung durch katalytisches Hydrieren in der Stufe 3, und Umkristallisieren aus 18 ml HOAc, 27 ml CH₃CN, 29 ml H₃O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 31 %. Fp. = 232-234 °C. ßtj ^⁵ (DMF) =

-23.41°. HPLC (55%CH₃CN/45%H₂0) 6.8 min, 98.2%.

¹ H-NMR: δ 1.36, d, 3p; δ 2.40, s, 3p; δ 2.74, t, Ip; δ 2.98-3.13, c, Ip; δ 4.33, c, Ip; δ 4.46, c, lp; δ 4.94, s, 2p; δ 6.28, S, Ip; δ 7.12-7.40, c, 10p; δ 7.44-7.56, c, 2p; δ 7.74, d, lp; δ 7.78, d, Ip; δ 8.40, d, Ip; δ 10.43, s, Ip.

MS: Stamm-Molekülion = 528.

Elementaranalyse: berechnet auf ^c-3q^H29^N3°6' C 68,30 %, H 5,54 %, N 7,96 %; gefunden C 68,57 %, H 5,68 %', N 7,96 %.

Beispiel 7: CBZ-L-Val-L-Ala-AMC wurde synthetisch wie vorstehend genauer in den Stufen 1-4 beschrieben hergestellt unter Anwendung der Deblockierung durch katalytisches

Hydrieren in der Stufe 3, und Umkristallisieren aus 100 ml HOAc, 104 ml CH₃CN, 67 ml H₂O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 31 %. Fp. = 260-265 ⁰C. ßfj ^⁵ (DMF) = -34.51°. HPLC (45%CH₃CN/55%H₂0) 6.8 min, 1/0·

¹ H-NMR: δ 0.82-0.96, C, 6ρ; δ 1.33, d, 3p; δ 1.88-2.07, C, Ip; δ 2.40, s, 3ρ; δ 3.92, t, Ip; δ 4.44, C, Ip; δ 5.05, S, 2ρ; δ 6.28, s, Ip; δ 7.26-7.42, C, 5ρ; δ 7.45-7.52, c, 2ρ; δ 7.73, d, Ip; δ 7.76, d, Ip; δ 8.25, d, Ip; δ 10.39, s, Ip.
MS: Stamm-Molekülion = 480.

Elementaranalyse: berechnet auf ^C26^H29^N3°6' C 65,12 %, H 6,10 %, N 8,76 %; gefunden C 6 5,59 %, H 6,02 %, N 8,79 %.

Beispiel 8: CBZ-L-Trp-L-Ala-AMC wurde synthetisch wie vorstehend in den Stufen 1-4 genauer erläutert hergestellt unter Anwendung der Deblockierung durch katalytisches Hydrieren in der Stufe 3, und Umkristallisieren aus 33 ml HOAc,

47 ml CH₃CN, 44 ml H„0 pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 17 %. Fp. = 248 - 253 ⁰C. /jOj ^⁵(DMF) = -16.55°. HPLC (45%CH₃CN/55%H₂0) 13.8 min, 93.4%. ¹ H-NMR: δ 1.34, d, 3p; δ 2.40, s, 3p; δ 2.94, c, Ip; δ 3.08-3.22, c, Ip; δ 4.36, se, lp; δ 4.45, t, Ip; δ 4.95, s, 2p; δ 6.26, s, Ip; δ 6.95, t, lp; δ 7.05, t, Ip; δ 7.10-7.40, c, 8p; δ 7.50, d, Ip; δ 7.66, d, Ip; δ 7.72, d, Ip; δ 7.78, d, Ip; δ 8.36; d, lp; δ 10.38, s,

'"'_: Ip: δ 10.79, s, Ip.

,MS: t^;t amiu-Molekülion -- LUw.

'Elomontaranalyse: berechnet auf C₃₂H₃₀N₄O₆, C 67,83 %, H 5,34 %, N 9,89 %; gefunden C 68,00 %, H 5,42 %, N 9,96 %.

Beispiel 9: CBZ-L-Phe-L-(NO₂)Arg-AMC wurde synthetisch wie vorstehend in den Stufen 1-4 genauer beschrieben hergestellt unter Anwendung der HBr/HOAc-Deblockierung in der Stufe 3, und Umkristallisieren aus 8 ml HOAc, 16 ml CH₃CN, 15 ml H₂O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 20 %.

EPO COPY

Fp. = 150 - 160 °C (Zers.). /_vj £³ (DMF) = -3.80°. HPLC (55%CH₃CN/45%H₂O) 8.8 min 95.9%.

¹ H-NMR: δ 1.4-1.9, C, 4p; δ 2.4, s, 3p; δ 2.7-3.1, c, 2p; δ 3.19, C, 2p; δ 4.34, C, lp; 6 4.45, C, lp; δ 4.95, s, 2p; 6 6.28, s, Ip; 6 7.10-7.42, C, 13p_; δ 7.49, d, 2p; δ 7.74, d, Ip; δ 7.78, d, lp; δ 8.34, d, Ip; δ 10.49, s, Ip.

MS: Stamm-Molekülion = 658.

Elementaranalyse: berechnet auf C .,H^j-N.Og, C 60,27 %, H 5,36 %, N 14,91 %; gefunden: C 60,03 %, H 5,41 %, N 15,09 %.

Beispiel 10: CBZ-L-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC wurde synthetisch hergestellt aus CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC (Beispiel 1) durch Deblockieren mit HBr/HOAc wie vorstehend in der Stufe 3, gefolgt von der Peptidkupplung dieses Reaktionsprodukts mit CBZ-L-Ala wie in der vorstehenden Stufe 4. Das Endprodukt wurde aus 34 ml HOAc, 44 ml CH.,CN, 273 ml H₉O pro Gramm umkristallisiert, und weiter durch enzymatische Analyse durch HPLC gereinigt (Präp. 45 % CH₃CN/55 % H₃O, 20 Min.). Die Gesamtrohausbeute betrug 40 %. Fp. = 236 - 240 °C. /"«7 J⁵ (DMF) = -39,91°. HPLC (60%CH₃CN/40%H₂0) 6.5 min, 92.1%. ¹ H-NMR: δ 1.14, d, 3p; 6 1.28-1.54, c, 2p; δ 1.54-1.83, c, 2p, 6 2.42, S, 3p; 6 2.73-3.14, C, 4p; δ 4.02, t, Ip; δ 4.44, q, Ip; 6 4.56, C, Ip; δ 5.00, q, 2p; 5 5.43, S, 2p; 6 5.99, t, Ip; 6 6,28, s, Ip; 6 7.08-7.40, c, lOp; δ 7.45, d, Ip; δ 7.53, d, Ip; δ 7.74, d, Ip; δ 7.79, d, Ip; δ 7.90, d, Ip; 6 8.28, d, Ip, δ 10.44, s, Ip.

MS: Stamm-Molekülion = 685.

Elementaranalyse: berechnet auf ^c-5c^H4o^N6°8' C 63,15 %, H 5,89 %, N 12,27 %; gefunden: C 63,10 %, H 5,91 %, N 12,15 %.

_EPO

-26-

Beispiel 11: CBZ-D-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC wurde synthetisch in gleicher Weise wie in Beispiel 10 hergestellt unter Verwendung von CBZ-D-AIa und L-Phe-L-Cit-AMC bei der endgültigen Peptidkupplung. Das Endprodukt wurde aus 13 ml HOAc, 36 ml CH₃CN, 173 ml H₃O pro Gramm umkristallisiert und weiter gereinigt zur enzymatischen Analyse durch HPLC (Präp. 45 % CH..CN/55 % H₉O, 20 Min.). Die Gesamtausbeute betrug 34 %. Fp. = 194-196 ⁰C. /«*_/ ^ (DMF) = -17,89° HPLC, (60%CH₃CN/40%H₂0) 6.5 min, 88.4%.

¹ H-NMR: δ 0.98, d, 3p; δ 1.28-1.56, c, 2p; δ 1.56-1.88, C, 2p; δ 2.41, s, 3p; δ 2.78-3.20, c, 4p; δ 4.03, t, Ip; δ 4.44, c, Ip; δ 4.58, c, Ip; δ 4.95, g, 2p; δ 5.42, s, 2p; δ 6.00, t, Ip; δ 6.28, s, Ip; δ 7.10-7.38, C, 10p; δ 7.44, d, Ip; δ 7.54, d, Ip; δ 7.73, d, Ip; δ 7.80, d, Ip; δ 8.19, d, Ip; δ 8.24, d, Ip; δ 10.32, S, Ip.

MS: Stamm-Molekül =685.

Elementaranalyse: berechnet auf C ,H₄₀N 0_R, C 63,15 %, H 5,89 %, N 12,27 %; gefunden C 62,97 %, H 5,91 %, N 12,20 %.

Beispiel 12: CBZ-L-Phe-L-Met-AMC wurde synthetisch wie genauer in den Stufen 1-4 vorstehend angegeben hergestellt unter Verwendung der Deblockierung mit HBr/HOAc in der Stufe 3 und Umkristallisieren aus 3 ml HOAc, 10 ml CH₃CN, 4 ml H₃O pro Gramm, und weiteres Reinigen durch HPLC (Präp. 60 % CH₃CN/40 % H₂O, 15 Min.) zur enzymatischen Unter-, suchung. Die Gesamtausbeute betrug 16 %. Fp. = 2.02-209 ⁰C. /«7 J (DMF) = -3,79°. HPLC, (45 % CH₃CN/55 % H₃O) 17,3 min, 85,2 %.

¹ H-NMR: δ 1.85-2.20, c, 2p; δ 2.07, s, 3p; δ 2.35-2.62, c, 2p; δ 2.42, s, 3p; δ 2.76, t, 2p; δ 4.34, c, Ip; δ 4.53, c, Ip; δ 4.96, s, 2p; δ 6.28, s, Ip; δ 7.14-7.39, C, 10p; δ 7.50, d, 2p; δ 7.74, d,·Ip; δ 7.78, d, Ip; δ 8.36, d, Ip; δ 10.48, s, Ip.
MS: Stamm-Molekülion = 588.

Elementaranalyse: berechnet auf C^H₃₃N₃OgS C 65,40 %, H 5,66 %, N 7,15 %, S 5,46; gefunden C 65,76 %, H 5,77 %, N 7,09, S 5,45 %. ^""

£PO COPY

Beispiel 13: CBZ-L-Phe-L-(Ts)Arg-AMC wurde synthetisch wie genauer in den Stufen 2-4 beschrieben hergestellt ausgehend von d-t-BOC(Ts)Arg anstelle des ot-CBZ-Derivats in der Stufe 2. Die oc-t-BOC-Gruppe wurde durch Ameisensäure wie vorstehend beschrieben in 17 % Ausbeute entfernt. Die Gesamtrohausbeute betrug 9,2 % und dieses Material wurde weiter gereinigt durch HPLC (Präp. 75 % CH₃OH/25 % H₉O, 20 Min.) Fp. = 118-125 ⁰C.

falp⁵ + 7.0°. HPLC, (65%CH₃CN/35%H₂0) 11.3 min, 90.9%. ¹ H-NMR: δ 1.29-1.58, c, 2p; δ 1.58-1.86, C, 2p; δ 2.28, S, 3p; 5 2.40, s, 3p; δ 2.74, t, Ip; δ 2.92-3.20, c, 3p; δ 4.24-4.52, c, 2p; δ 4.95, s, 2p; δ 6.28, s, Ip; δ 6.43-7.11, c, 3p; δ 7.11-7.44, C, 14p; δ 7.62, d, 2p; δ 7.75, d, Ip; δ 7.78, s, Ip; δ 8.34, c, Ip; δ 10.52, s,

Ip- .

MS: Stamm-Molekülion =767.

Elementaranalyse: berechnet auf C₄o^H42^N6°8^S' C 62,65 %, H 5,52 %, N TO,96 %, S 4,18; gefunden C 62,04 %, H 5,66 %, N 10,90, S 4,47 %.

Beispiel 14: CBZ-L-Phe-L-(CBZ)Lys-AMC wurde synthetisch wie genauer in den Stufen 2-4 beschrieben hergestellt ausgehend von dem cx-t-BOC (CBZ)Lys anstelle des A-CBZ-Derivats der Stufe 2. Die *-t-BOC-Gruppe wurde durch Ameisensäure wie vorstehend beschrieben entfernt mit einer Ausbeute von 83 %. Es wurde umkristallisiert aus 20 ml Essigsäure, 56 ml CH₃CN, 127 ml H₂O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 39 %. Fp. = 170-173 ⁰C. /"5c7 J⁵ (DMF) = -4.28°. HPLC, (45%CH₃CN/55%H₂0) 15.3 min, 97.5%.

¹ H-NMR: δ 1.20-1.54, c, 4p; δ 1.54-1.82, c, 2p; δ 2.40, s, 3p; δ 2.76, t, 2p; δ 2.88-3.09, c, 2p; δ 4.28-4.48, c, 2p; δ 4.96, d, 4p_; δ 6.27, s, Ip; δ 7.10-7.43, c, 17p; δ 7.49, t, Ip; δ 7.73, d, ..Ip, δ 7.77, s, Ip; δ 8.29, d, Ip; δ 10.47, s, Ip.

MS: Stamm-Molekülion =719.

Elementaranalyse: berechnet auf C₄₁H₄₂N₄Oo, C 68,51 %, H 5,89 %, N 7,79 %; gefunden: C 68,23 %, H 5,91 %, N 7,69 %.

Beispiel 15: CBZ-L-PhIe-L-(TFA)LyS-AMC wurde synthetisch hergestellt wie genau in den Stufen 1-4 beschrieben unter Anwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in Stufe 3 und Umkristallisieren aus 28 ml CH₃CN pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 9 %.

1^208-210⁰C. ial£⁵ (DMF)= -8.15°. HPLC, (45%CH₃CN/55%H₂0) 15.8 min, 80.4%. ¹ H-NMR= δ 1.20-1.45, c, 2p; δ 1.45-1.61; c, 2p_; δ 1.61-1.85, c, 2p; δ 2.42, s, 3p; δ 2.75-3.06, c, 2p; δ 3.18, c, 2p; δ 4.28, se, Ip; δ 4.48, q, lp_; δ 4.95, s, 2p; δ 6.28, s, Ip; δ 7.14-7.39, c, 10p; δ 7.44-7.54, c, 2p; δ 7.74, d, Ip; δ 7.78, d, Ip, δ 8.31, d, Ip; δ 9.40, c, Ip; δ 10.48, s, Ip.

MS: Stamm-Molekülion = 681.
Elementaranalyse: berechnet auf C^rH^. 1-N₄O₇F-. , C 61,76 %, H 5,18 %, N 8,23 %, F 8,37 %; gefunden C 62,28 %, H 5,38 %, N 8,30, F 8,06 %.

Beispiel 16: CBZ-L-Phe-L-Trp-AMC wurde hergestellt wie genauer in den Stufen 1-4 vorstehend beschrieben unter Anwendung der Deblockierung durch katalytische Hydrierung in der Stufe und Umkristallisieren aus 11 ml HOAc, 11 ml CH.,CN und 4 ml H₂O pro Gramm. Die Gesamtausbeute betrug 31 %. Fp. = 165-167 ⁰C. /1t"J J⁵ (DMF) =■

+51.89°. HPLC, (45%CH₃CN/55%H₂0) 16.2 min, 99.4%. ¹ H-NMR: δ 2.40, s, 3p; δ 2.74, t, 2p; δ 2.83-3.30, c, 2p; δ 4.33, qn, Ip, δ 4.76, q, Ip; δ 4.97, s, 2p; δ 6.28, s, Ip; δ 6.97, t, Ip; δ 7.07, t, Ip; δ 7.12-7.38, c, 13p; δ 7.48, d, Ip; δ 7.63, d, Ip; δ 7.72, d, Ip; δ 7.76, s, Ip; δ 8.38, d, Ip; δ 10.52, s, lp; δ 10.86, S,

MS: Stamm-Molekülion = 643.

Elementaranalyse: berechnet auf C-pH,.N.0,, C 71,01 %, H 5,33 %, N 8,72 %; gefunden C 71,21 %, H 5,40 %, N 8,72 %.

ΓΌΟ\/

Beispiel 17: CBZ-L-Nala-L-Cit-AMC wurde synthetisch hergestellt wie genauer vorstehend in den Stufen 1-4 beschrieben unter Anwendung der Deblockierung durch katalytisches Hydrieren in der Stufe 3 und Umkristallisieren aus 4 0 ml HOAc, 86 ml CH₃CN und 92 ml H₃O pro Gramm.

Die Gesamtausbeute betrug 13 %. Fp. = 225-227 ⁰C. /«_7^⁵(DMF) -20.3°. HPLC, (60%CH₃CN/40%H₂0) 8.0 min, 99.9%. ¹ H-NMR: 6 1.30-1.56, C, 2p; δ 1.56-1.85) C, 2p; δ 2.40, s, 3p; δ 2.84-3.22, c, 4p_; δ 4.38-4.57, c, 2p; δ 4.91, S₇ 2p; δ 5.43, s, 2p; δ 6.00, t, Ip; δ 6.28, s, Ip; δ 7.07-7.65, c, 12p; δ 7.74, d, Ip; δ 7.78, d, Ip; δ 7.92, d, Ip; δ 8.22, d, lp_; δ 8.34, d, Ip; δ 10.50, s, Ip.
MS: Stamm-Molekülion = 664.

Elementaranalyse: berechnet auf C ^₇H ^₇N ,-O₇, C 64,59 %, H 5,75 %, N 11,41 %; gefunden C 64,68 %, H 5,87 %, N 11,40 %.

Assay-Beispiele

Gereinigtes Kathepsin-B wurde aus Schweineleber und neoplastischer menschlicher Leber unter Anwendung von üblichen Aussalζverfahren bereitet. Der Assay wurde durchgeführt unter Anwendung eines 0,1 M Bis-Tris, Acetat-oder Phosphat- >. Puffers vom pH 5,5, der 1 inM EDTA enthielt. 10 mM Cystein '" 25 wurden als Thiolaktivator verwendet und der Puffer, der den Aktivator enthielt, wurde jeden Tag frisch bereitet. Ein geringes Volumen (5 μΐ) der Probe, die Kathepsin-B enthielt, wurde mit 585 um 37 ⁰C frischem Puffer vermischt, der Thiolaktivator enthielt, in einer 5 χ 5 mm Fluorimeterküvette und 2 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Anschließend wurden 20 μΐη Substrat in DMF in einem Konzentrationsbereich von 0,05 mM bis 2 mM unter Vermischen zugesetzt. Die Zunahme der Fluoreszenz wurde im Verlauf der Zeit bei 37 ⁰C während mehrerer Minuten unter Anwendung eines Perkin-Elmer-LS-5 Spektrofluorimeters überwacht. Für AMC betrug die Erregerwellenlänge 350 nm, die Emissionswellenlänge 460 nm, und für AFC betrug die Erregerwellenlänge 385 nm und die Emissionswellenlänge 490 nm. Es wurden folgende /&*"*''"

-yf-

Fluorimetereinstellungen verwendet: Schlitzbreiten 5 und 5 mm, Filterreaktion 1, und der Skalenfaktor wurde auf 0-1,0 eingestellt. Die Ergebnisse der enzymatischen Wechselwirkung mit den Substratproben 1-17 und der handelsüblichen Standards CBZ-Phe-Arg-AFC (Beispiel 18), CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC (Beispiel 19) und Bz-Val-Lys-Lys-Arg-AFC (Beispiel 20) sind in der Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Bsp.

Nr.

Verbindung

Katheps in-B

/K

Trypsin

relative Größenordnung des Wertes ³)

1 CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC¹ 0.296 NR² 2

2 CBZ-L-Leu-L-Cit-AMC 0.116 NR 6

3 CBZ-L-Ile-L-Cit-AMC 0.126 NR 5

4 CBZ-L-Val-L-Cit-AMC 0.169 NR 3

5 CBZ-L-Trp-L-Cit-AMC 0.148 NR 4

6 CBZ-L-Phe-L-Ala-AMC 0.034 NR 13

7 CBZ-L-Val-L-Ala-AMC 0.018 NR 14

8 CBZ-L-Trp-L-Ala-AMC 0.069 NR 8

9 CBZ-L-Phe-L-(NO₂)Arg-AMC 1.025 NR 1

10 CBZ-L-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC 0.105 NR 7

11 CBZ-D-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC 0.062 · NR 15

12 CBZ-L-Phe-L-Met-AMC* 0.614 NR 12

13 CBZ-L-Phe-L-iTsJArg-AMC¹· 1.575 NR 9

14 CBZ-L-Phe-L-(Z)LyS-AMC* 0.182 NR 11

15 CBZ-L-Phe-L-(TFA)Lys-AMC* 0.457 NR 10

16 CBZ-L-Phe-L-Trp-AMC 0.01 NR 17

17 CBZ-L-Nala-L-Cit-AMC 0.01 NR 16

18 CBZ-Phe-Arg-AFC* 0.007 0.003 12

19 CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC* 0.003 0.058 14

20 BZ-Val-Lys-Lys-Arg-AFC* 0.017 0.077 13

EPO COPY

1 AMC weist eine Empfindlichkeit von 0,049 μΜ/Fluoreszenzeinheit auf und wurde als B in der Gleichung 1 für diese Berechnungen verwendet.
2 NR- keine Reaktion

3 Die Ordnung basiert auf dem Reaktionsausmaß mit Kathepsin-B (je größer das Ausmaß umso kleiner die Ordnung) und dem Ausmaß der Reaktion mit Trypsin (je grosser das Ausmaß desto höher die Ordnung).

4 Der relative Wert für diese Verbindung ist aufgrund doV ^O geringen Löslichkeit und der niedrigen maximalen Rate verringert.

5 AFC weist eine Empfindlichkeit von 0,0 09 μΜ/Fluoreszenzeinheit auf und wurde als B in der Gleichung 1 für diese Berechnungen verwendet.

Aus diesen Daten geht klar hervor, daß Substrate 1-17 (Tabelle I) gemäß der Erfindung einen wesentlich größeren Selektivitätsgrad und Empfindlichkeitsgrad für die Feststellung von Kathepsin-B in Anwesenheit von Trypsin aufweisen als die bisher verwendeten Peptide, wie die Substrate 18-20 in der Tabelle I, oder ähnliche Peptide mit einer positiv geladenen Gruppe an der R--Stellung (gebunden an X). Da die tryptischen Enzyme normalerweise in menschlichem Blut gefunden werden, greifen diese Enzyme in die Messung mit Kathepsin-B ein. Die erfindungsgemäßen Peptidsubstrate vermeiden oder verringern die Wechselwirkungsprobleme, die durch trypsinartige Enzyme bedingt werden und erhöhen die Empfindlichkeit für Kathepsin-B um das 60-350-fache von der der Peptide der Beispiel 18-20.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Aktivität von Kathepsin-B auf qualitativer oder halbguantitativer Basis gemessen werden durch Kontakt einer bereiteten Probe des Säugerfluids mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Substrat. Typische klinische Laborverfahrensweisen zur Erzielung derartiger Analysen können beispielsweise umfassen die cytologische Analyse in der Zeil-, Gewebs- oder Organprobe mit dem Substrat oder anderen Reagentien zur

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selektiven Fleckenbildung in Kontakt gebracht wird. Weitere ty_tj. klinische Analysen umfassen einen Teststreifen, bei dem das Substrat in einem geeigneten relativ inerten Träger eingearbeitet wird, der ein Cellulosematerial, Vliesmaterial oder eine Kombination hiervon sein kann. Wenn die Probe mit einem Teststreifen in Kontakt gebracht wird, so wird die Probe in den Teststreifen absorbiert, so daß als Ergebnis eine Farbänderung für eine relativ rasche Analyse erhalten wird.

Claims

GRÜNECKER. KINKELDEY. STÖCWAIR &

PATENTANWÄLTE

EUROPEAN PATENT ATTORNEVS

A GRUNECKER. cupu-inü

DR H KINKELDEY opv -"*g ■

DR W STOCKWAIR. OPi imo »ε t i

DR K SCHUMANN, opi ws

P. H JAKOB ο« ,Mt;

DR G BEZOLD. opv. ocm

W MEISTER DIPV.1NG

H HILGERS c-=l ing

DR H MEYER-PLATH. op«. iNG

KIMBEELY-CLÄEK CORPORATION 401 North Lake Street Keenah, Wisconsin 5^-956 USA

8000 MÜNCHEN 1*2

MAXIMILIANSIHAfiSt M*

P 18- 792-60 /So 26. April 1984

15

Verfahren zur selektiven Bestimmung der Aktivität von Kathepsin-B und Peptidsubstrate

Patentansprüche

f1 Λ Verfahren zur selektiven Bestimmung der Aktivität von 25 Kathepsin-B in Materialien, . " '

. die Trypsin und trypsinartige Enzyme enthalten können, gekennzeichnet durch folgende Stufen: (a) Vermischen einer Probe der Materialien mit einem Substrat

der Formel
30 .· Z-R-R₁-X

und der Säuresalze davon, worin

X ein Indikatorrest ist, der durch Spaltung der

R^-X-Bindung durch Kathepsin-B freigesetzt wird 35 und der durch die Spaltung bestimmbar wird;

ist eine Aminosäuregruppe, die die L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zu der Carboxylgruppe aufweist und die innerhalb des pH-Bereichs für

EPO GOPY

den Assay nicht positiv geladen ist; R₂ ist eine hydrophobe Aminosäuregruppe, die die L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe aufweist; und
c Z ist eine aminoblockierende Gruppe bzw. Amino-

schutzgruppe, die nicht in die selektive Bindung von Kathepsin-B an die Gruppen R.. und R₂ eingreift;

wobei das Vermischen in einem wäßrigen Medium mit jQ einem pH-Wert in dem Bereich erfolgt, in dem Kathepsin-B aktiv ist; und das Gemisch eine Konzentration des Substrats aufweist, die wesentlich größer ist als die Konzentration von Kathepsin-B und in ausreichender Konzentration, so daß die abgespaltene jg Gruppe X feststellbar ist; und

(b) Messen des Ausmaßes der Abspaltung der Gruppe X von dem Substrat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X ein abspaltbarer Rest ist, dessen Fluoreszenzemission sich bei der Abspaltung ändert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X ein abspaltbarer Rest ist, dessen sichtbares Spektrum oder Ultraviolettspektrum sich bei der Abspaltung ändert.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R " eine Citrullylgruppe ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R- eine Nitroarginylgruppe ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, oder einem der Ansprüche 2

bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Phenylanalylgruppe ist.

Copy

-3-
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₉ eine Leucylgruppe ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Tryptophylgruppe ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₉ eine Isoleucylgruppe ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß R₉ eine Valylgruppe ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Phenylanalylgruppe und R. eine Citrullylgruppe ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Phenylalanylgruppe und R. eine Nitroarginvlgruppe ist.
2g 13. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R- eine Citrullylgruppe und R₉ eine Valylgruppe ist. ·
14. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn-

3Q zeichnet, daß R- eine Citrullylgruppe und R₉ eine Tryp-. tophylgruppe ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R^ eine Citrullylgruppe und R_ eine Isoleucylgruppe ist.

EPO COPY
16. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Kathepsin-B in Materialien. . ■ das

zum selektiven Assay von Kathepsin-B geeignet ist, das Trypsin und trypsinartige Enzyme enthalten kann, gegebenenfalls gemäß einem der Ansprüche 1 bis' 15, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

(a) Kontakt einer Probe der Materialien mit einem Substrat der Formel

und Säuresalzen davor., worin

X ein Indikatorrest ist, der durch Spaltung der R.-X-Bindung durch Kathepsin-B freigesetzt wird und der durch die Abspaltung bestimmbar wird;

R₁ eine Aminosäuregruppe ist, die die L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe aufweist und die in dem pH-Bereich für den Assay nicht positiv geladen ist;

R- eine hydrophone Arcinogruppe ist, die die L-Kon-

figuration air; alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe aufweist; und
Z eine aminobiocki&rende Gruppe bzw. Aminoschutzgruppe ist, die nicht in die selektive Bindung von Kathepsin-E an die Gruppen R. und R₀ ein-

greift,

wobei dieser Kontakr mit dem vorstehenden Substrat unter derartigen Bedingungen durchgeführt wird, bei denen das Kathepsin-B aktiv ist und bei Konzentrationen bei denen das Substrat in Mengen vorhanden ist, die wesentlich größer sind als die Konzentration, von Kathepsin-B; und

(b) Bestimmung der Bildung des von dem Substrat abgespaltenen χ.
35

PAD ORIGINAL'" _Epo
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß X einen abspaltbaren Rest darstellt, dessen Fluoreszenzemission sich bei der Abspaltung ändert.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß X einen abspaltbaren Rest darstellt, dessen sichtbares Spektrum oder Ultraviolettspektrum sich bei der Abspaltung ändert.
ίο 19. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Citrullylgruppe ist.
20. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Nitroarginylgruppe ist.

■ -
21. Verfahren nach Anspruch 16, oder einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Phenylalanylgruppe ist.
22. Verfahren nach Anspruch 16, oder einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Leucylgruppe ist. ■
23. Verfahren nach Anspruch 16, oder einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß R„ eine Tryptophylgruppe ist.
24. Verfahren nach Anspruch 16 oder einem der Ansprüche

17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Isoleucylgruppe ist.
25. Verfahren nach Anspruch 16, oder einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Valylgruppe ist.
26. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ eine Phenylalanylgruppe ist und R₁ eine Citrullylgruppe ist. ^--
27. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß-Rp eine Phenylalanylgruppe und R₁ eine Nitroarginylgruppe ist.
28. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Citrullylgruppe und R„ eine Valylgruppe ist.
29. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennjQ zeichnet, daß R.. eine Citrullylgruppe und R eine Tryptophylgruppe ist.
30. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß R.. eine Citrullylgruppe und R₂ eine Iso-5 leucylgruppe ist.
31. Verbindungen der folgenden Formel:

Z-R₂-R₁-X

und die Säuresalze davon, worin

X ein Indikatorrest ist, der von R₁ abgespalten werden kann ;

R₁ eine Aminosäuregruppe ist, die die L-Konfiguration ' am alpha-Kohlenstoff zu der Carbonylgruppe aufweist und nicht positiv geladen ist;

R„ eine hydrophobe Aminosäuregruppe ist, die die L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe aufweist, und

Z eine aminoblockierende Gruppe bzw. eine Aminoschutzgruppe ist.
32. Verbindungen nach Anspruch 31, worin X einen abspaltbaren Rest darstellt, dessen Fluoreszenz sich bei der

3b Abspaltung ändert.
33. Verbindungen nach Anspruch 31, worin X einen abspaltbaren Rest darstellt, dessen sichtbares Spektrum oder Ultraviolettspektrum sich bei der Abspaltung ändert.

EPO COPY
34. Verbindungen nach Anspruch 31, 32 oder 33, worin R. eine Citrully!gruppe ist.
35. Verbindungen nach Anspruch 31, 3 2 oder 33, worin R. eine Nitroarginylgruppe ist.
36. Verbindungen nach Anspruch 31, oder.32 bis 35, worin R_ eine PhenylalanyIgruppe ist.
IQ 37. Verbindungen nach Anspruch 31, oder 32 bis 35, worin R_ eine Leucylgruppe ist.
38. Verbindungen nach Anspruch 31, oder 32 bis 35, worin R~ eine Tryptophylgruppe ist.
39. Verbindungen nach Anspruch 31, oder 32 bis 35, worin

R~ eine Isoleucylgruppe ist.
40. Verbindungen nach Anspruch 31, oder 32 bis 35, worin R₂ ^e^^ne Valylgruppe ist.
41. Verbindungen nach Anspruch 31, 32 oder 33, worin R₂ eine Phenylalanylgruppe und R₁ eine Citrullylgruppe ist.
42. Verbindungen nach Anspruch 31, 32 oder 33, worin

R₂ eine Phenylalanylgruppe und R₁ eine Nitroarginylgruppe ist.
43. Verbindungen nach Anspruch 31, 32 oder 33, worin R₁ eine Citrullylgruppe und R~ eine Valylgruppe ist.
44. Verbindungen nach Anspruch 31, 32 oder 33, worin R. eine Citrullylgruppe und R_ eine Tryptophylgruppe ist.
45. Verbindungen nach Anspruch 31 ,. 32 oder 33, worin R₁ eine Citrullylgruppe und R₀ eine Isoleucylgruppe ist.

EPO COPY A

-δι
46. Verbindungen der folgenden Formel, gegebenenfalls nach einem der Ansprüche 31 bis 45:

und die Säureadditionssalze davon, worin . · R₃ die Seitenkette einer Aminosäuregruppe ist, die die L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff zur Carbonylgruppe aufweist und nicht positiv geladen ist, und R-. 2 bis 8 Atome enthält;

R. die Seitenkette einer hydrophoben Aminosäuregruppe ist, die die L-Konfiguration am alpha-Kohlenstoffatom zur Carbonylgruppe aufweist und R₄ folgende Formel hat:

- CH₂ - Y

worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe von Niedrigalkyl-, Phenyl-, substituierten Phenyl- und Indolgruppen; X ein Indikatorrest ist, der von der Verbindung abgespalten werden kann; und

Z eine aminoblockierende Gruppe bzw. Aminoschutzgruppe ist.
47. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R_ folgende Bedeutung hat: 0 -.

- CH₂ - CH₂ - CH₂ -NH-C- NH₃.
48. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R₃ folgende Bedeutung hat: NH

- CH₀ - CH₀ - CH₀ - NH - C - NH - NO₀.
49. Verbindungen nach Anspruch 46 bis 48, worin R₄.folgende

Bedeutung hat: . '· ■

-CH₂-C₆H₅.

EPO

— Q —
50. Verbindungen nach Anspruch 46 bis 48, worin R₄ folgende Bedeutung hat:

- CH₂ - CH - (CH₃)₂.
51. Verbindungen nach Anspruch 46 bis 48/ worin R₄ folgende Bedeutung hat:

-CH

10
52. Verbindungen nach Anspruch 46 bis 48, worin R, folgende Bedeutung hat:

- CH

CH.
53. Verbindungen nach Anspruch 46 bis 48, worin R. folgende Bedeutungen hat:

- CH - CH₉ - CH-

CH-,
54. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R₄ -CH₂ - C_g ist und R^ - CH₉ - CH₉ - CH₉ -NH -C- NH₉ ist.

25
55. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R₄ "CH₂ - C,- H₁- ist und R₃ - CH₂ - CH₂ - CH₂ - NH -C-NH- NO₃ ist.

NH

30
56. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R₃ - CH₃ C

Il

-CH₉ - NH - C - NH₉ ist und R„ CH - CH,, ist.

CH.
57. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R₃ - CH₃ - CH₂ -

-CH₀ - NH - C - NH₉ ist und R.
2 „ 2 4

Il

EPO COPY ö.

-CHj

ist.

CH- -
58. Verbindungen nach Anspruch 46, worin R, - CH-

-CH₀ - NH - C - NH₀ und R. CH - CH₀ - CH- ist.

2 „2 4 , 2

O CH₃

10
59. Verbindungen nach Anspruch 46, oder einem der Ansprüche

47 bis 58, worin X ein abspaltbarer Rest ist, dessen

Fluoreszenz sich bei der Abspaltung ändert.
60. Verbindungen nach Anspruch 46, oder 47 bis 58, worin 15 χ ein abspaltbarer Rest ist, dessen sichtbares Spektrum oder Ultraviolettspektrum sich bei der Abspaltung ändert.

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