FR2545503A1

FR2545503A1 - Procede permettant de determiner la cathepsine b en presence d'autres enzymes proteolytiques et composes utiles a cet effet

Info

Publication number: FR2545503A1
Application number: FR8406694A
Authority: FR
Inventors: David Neil Haney
Original assignee: Kimberly Clark Corp
Current assignee: Kimberly Clark Corp
Priority date: 1983-04-28
Filing date: 1984-04-27
Publication date: 1984-11-09
Also published as: BR8401996A; KR850002289A; FI841686A; NL8401375A; AU2743284A; ES531962A0; GB2140423A; DK201084A; DE3415636A1; SE8402305D0; IT1182706B; ES8604691A1; GB8410841D0; SE8402305L; DK201084D0; FI841686A0; IT8448107A0

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE PERMETTANT DE DETERMINER LA CATHEPSINE B EN PRESENCE D'AUTRES ENZYMES PROTEOLYTIQUES ET DES COMPOSES UTILES A CET EFFET. LE PROBLEME A RESOUDRE CONSISTE A FOURNIR UN SUBSTRAT HAUTEMENT SPECIFIQUE DE LA CATHEPSINE B, INDEPENDAMMENT DE LA PRESENCE DE TRYPSINE ET D'ENZYMES PROTEOLYTIQUES ANALOGUES. CE PROCEDE CONSISTE D'UNE PART A MELANGER UN ECHANTILLON DESDITS FLUIDES AVEC UN SUBSTRAT ET SES SELS D'ACIDE DE FORMULE Z - R - R - X DANS LAQUELLE X EST UN FRAGMENT DE MOLECULE INDICATEUR LIBERE PAR COUPURE DE LA LIAISON R-X PAR LA CATHEPSINE B ET EST DETECTABLE LORS DE LA COUPURE, R EST UN GROUPE AMINO-ACIDE AYANT LA CONFIGURATION L AU CARBONE EN ALPHA DU GROUPE CARBONYLE ET N'EST PAR CHARGE POSITIVEMENT DANS L'INTERVALLE DE PH AUQUEL S'EFFECTUE LE DOSAGE, R EST UN GROUPE AMINO-ACIDE HYDROPHOBE AYANT LA CONFIGURATION L AU CARBONE EN ALPHA DU GROUPE CARBONYLE, ET Z EST UN GROUPE DE BLOCAGE AMINO N'INTERFERANT PAS AVEC LA LIAISON SELECTIVE DE LA CATHEPSINE B AVEC LES GROUPES R ET R, LEDIT MELANGE ETANT REALISE DANS UN MILIEU AQUEUX AYANT UN PH COMPRIS DANS UN INTERVALLE POUR LEQUEL LA CATHEPSINE B EST ACTIVE, ET LE MELANGE AYANT UNE CONCENTRATION EN SUBSTRAT NOTABLEMENT PLUS GRANDE QUE LA CONCENTRATION EN CATHEPSINE B, ET SUFFISANTE POUR QUE LE GROUPE X COUPE PUISSE ETRE DETECTABLE, ET D'AUTRE PART A MESURER LA VITESSE AVEC LAQUELLE LE GROUPE X EST COUPE DU SUBSTRAT. L'INVENTION TROUVE UNE APPLICATION AVANTAGEUSE POUR LE DIAGNOSTIC DES MALADIES METASTATIQUES.

Description

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PROCEDE PERMETTANT DE DETERMINER LA CATHEPSINE B EN PRESENCE

D'AUTRES ENZYMES PROTEOLYTIQUES ET COMPOSES UTILES A CET

EFFET.

La présente invention concerne un procédé permet-

tant de mesurer l'activité de la cathepsine B en présence d'autres enzymes protéolytiques, telles que la trypsine La présente invention concerne, en outre, de nouveaux substrats

qui sont hautement spécifiques de la cathepsine B Le procé-

dé selon l'invention est d'un intérêt particulier pour la détection de niveaux anormaux de l'activité de la cathepsine B dans les fluides corporels, tels que le sang humain et

dans les tissus corporels.

Les protéinases sont des enzymes qui digèrent des protéines et des chaînes polypeptidiques Ces enzymes sont hautement sélectives pour la coupure de sites des substrats polypeptidiques Cette activité enzymatique est précisément régulée dans un système biologique normal Une défaillance

dans cette régulation peut avoir des conséquences biologi-

ques sérieuses De nombreux cas de maladies ont été attribués à de telles défaillances ou dérèglements dans l'activité des

protéinases (ainsi que décrit par A J Barrett dans Protei-

nases in Mammalian Cells and Tissues, North-Holland, New York,

édit ( 1979); par A J Barrett et J K Mc Donald dans Mamma-

lian Proteases: A Glossary and Bibliography (vol 1 ( 1980),

Academic Press, New-York)).

La cathepsine B est une protéinase (thiol) cysté-

ine lysosomique normale Il a été récemment montré (A J. Barrett et J K Mc Donald dans l'ouvrage précité; M Sandler dans Enzyme Inhibitors as drugs, édit ( 1980), University Park Press, Baltimore)) qu'une défaillance apparente dans la régulation de l'activité de la cathepsine B peut conduire à divers cas de maladies Plusieurs maladies en relation

avec une baisse de collagène et une dégradation de la glyco-

protéine structurelle sont liées à une activité accrue de

la cathepsine B En particulier, l'existence d'une corréla-

tion entre l'activité de la cathepsine B et la maladie métastatique a été suggérée par plusieurs recherches, dont une élévation de l'activité de la cathepsine B, ou de la cathepsine analogue à la cathepsine B, dans le sang des patients atteints d'une maladie métastatique lainsi que décrit par R J Pietras et alo Obstet Gynecol 52, 321-327

( 1978); R J Pietras et al, Gynecol Oncol 7, 14-17 ( 1979)l.

Aussi, un procédé permettant de déterminer de façon précise et sélective l'activité de la cathepsine B dans les fluides corporels de mammifères faciliterait le diagnostic, tel que

par détection ou surveillance.

Les dosages de diverses activités d'enzymes sont des procédés de routine dans un laboratoire clinique De tels dosages comportent, par exemple, la mise en contact de

l'échantillon contenant l'enzyme avec un substrat de syn-

thèse (défini comme la substance ou le composé sur lequel agit l'enzyme) qui est coupé sélectivement par cet enzyme en produits qui changent de couleurs: enzyme substrat produits (sans couleur) (colorés) ou (coloré) (sans couleur) Ainsi, des substrats pour la cathepsine B seraient des peptides ou des composés analogues aux peptides qui, par coupure, permettent l'analyse des produits Des méthodes de dosage qui ont été utilisées pour la cathepsine B lainsi que

décrit par A J Barrett et par R J Pietras dans les ouvra-

ges précités; et par A J Barrett dans Biochem J 187, 909-912 ( 1980)l ont fait appel à des substrats peptidiques contenant un ou plusieurs aminoacides arginyle ou lysyle fixés sur un groupe indicateur pouvant être coupé par une

enzyme (par ex Bz Arg NA, CBZ Lys PNP, CBZ Arg -

Arg MNA, CBZ Ala Arg Arg AFC, CBZ Phe Arg -

AMC, voir la signification des abréviations ci-dessous).

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Bien que la coupure sélective des substrats de synthèse par la cathepsine B n'est pas encore bien comprise, ces substrats couramment utilisés peuvent, par la nature de leurs groupes

chargés positivement, être également coupés par les proté-

ases analogues à la trypsine (sérine) Ainsi, les dosages de la cathepsine B utilisant un des ces substrats de lysyle ou d'arginyle dans les fluides corporels de mammifères sont rendus compliqués par la présence de protéases analogues à la trypsine en quantités importantes Ainsi, on ne sait pas comment obtenir une sélectivité élevée pour la détection de l'activité de la cathepsine B en présence de trypsine ou

d'enzymes analogues à la trypsine.

Aussi, l'un des buts de la présente invention est de proposer des substrats hautement spécifiques pour la cathepsine B Un autre but de l'invention est de doser sélectivement l'activité de la cathepsine B en présence

d'autres enzymes protéolytiques, par exemple de trypsine.

L'invention a encore pour but de déterminer l'activité de la cathepsine B dans les fluides corporels et les tissus de mammifères D'autres buts de l'invention apparaîtront à la

lecture de la description de l'invention.

La présente invention fournit un procédé permet-

tant de tester l'activité de la cathepsine B dans les fluides corporels ou les tissus de mammifères en mesurant

la vitesse avec laquelle est libéré un groupe indicateur (X)-

par coupure d'un substrat peptidique de synthèse hautement sélectif pour la cathepsine B Des substrats contenant des groupes indicateurs appropriés pour la détection de la cathepsine B ont pour formule générale

Z R 2 R 1 -X

et leurs sels, dans laquelle X est un fragment de molécule qui peut être coupé par la cathepsine B au niveau de liaison R 1 X et est détectable lorsqu'il est coupé,

R 1 est un groupe amino-acide qui a la configura-

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tion L au carbone en alpha du groupe carbonyle (CG), qui n'est pas chargé positivement dans l'intervalle de p H dans les conditions du test, et qui a de préférence une chaîne latérale polaire, ladite chaine ayant de préférence de 2 à 8 atomes,

R 2 est un groupe amino-acide hydrophobe, de préfé-

rence phénylalanyle, ayant la configuration L au carbone en alpha du groupe carbonyle (Ca) et ayant de préférence une chaîne latérale de formule -CH 2 Y dans laquelle Y est choisi dans le groupe constitué par des groupes alkyles inférieurs, phényles et phényles substitués et des groupes indoles, et Z est un groupe de blocage amino qui n'interfère pas avec la liaison sélective de la cathepsine B avec les

groupes R 1 et R 2.

Les abréviations suivantes sont utilisées dans la

description qui suit:

Amino-acides (tous supposés avoir une configuration L, sauf indication contraire) Phe: groupe L-phénylalanyle Cit:groupe L-citrullyle Ala:groupe L-alanyle Arg: groupe arginyle Lys:groupe lysyle (N 02)Arg groupe Nw nitroarginyle (Ts)Arg:groupe Nw -tosylarginyle ou groupe Nu -p-toluènesulfonyle arginyle Trp:groupe tryptophyle Met:groupe méthionyle Asp:groupe aspartyle (TFA)Lys:groupe Ne -trifluoroacétyllysinyle (CBZ) Lys:groupe-Ne -carbobenzyloxylysyle Val:groupe valyle Leu: groupe leucyle Ile:groupe isoleucyle Nala:groupe napthylalanyle Groupes de blocage amine CBZ: groupe carbobenzyloxy Bz: groupe benzoyle t-BOC: groupe t- butyloxycarbonyle Chromophores et fluorophores AMC HMC AFC AQ NA MNA PNP PNA Réa TEA DCC DMF THF

DMS

HOA H Br Pd- Div

EDT

: groupe 7-amino-4-méthylcoumarine : groupe 7-hydroxy-4-méthylcoumarine : groupe 7-amino-4-trifluorométhylcoumarine : groupe 6-aminoquinoline : groupe 2-naphtylamine : groupe 4-méthoxy-2-naphtylamine : groupe paranitrophénol : groupe para-nitroaniline ctifs de synthèse et solvants : triéthylamine : N,N'-dicyclohexylcarboliimide : N,N diméthylformamide : tétrahydrofuranne O:diméthylsulfoxyde c: acide acétique /HO Ac: acide acétique saturé avec H Br PEI: catalyseur palladium polyéthylèneimine ers A mmole mm nm 3 o l 25 (DM Bis-Tris HPLC : acide éthylènediaminetétraacétique, sel de disodium : millimole : millimètre : nanomètre IF): pouvoir rotatoire à 589 nm à 25 C dans le solvant DMF : 2, 2-bis (hydroxyméthyl)-2,2 ',2 "-nitrilotriéthanol : chromatographie liquide à haute performance utilisant une colonne Alltech (Deerfield Ill), 4,6 x 250 mm, C 18, débit: 1 ml/mn, détecteur:

UV 340, 313, 280 et 254 nm.

O 2545503

Solvant phase mobile, temps de rétention et

pureté approximative donnés pour chaque exemple.

MS: spectroscopie de masse utilisant un instrument VG 7070 H Micro Mass avec sonde de bombardement d'atomes rapides ( 9 k V xénon) et échantillon

dissous dans DMSO/glycérol.

1 H-RMN: résonance magnétique nucléaire protonique sur

un instrument Bruker 270 M Hz utilisant le d 6-

solvant DMSO et tétraméthylsilane comme un standard interne à un déplacement chimique ( 6) de 0,0 Les déplacements chimiques, 6, le pic se divisant en: S = singulet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, qn = quintet, se = sextet, c = multiplet complexe, et le nombre de protons ( 1 p = 1 proton) sont donnés pour

chaque exemple.

PF: point de fusion (non corrigé, appareil Fisher-

Johns) HPLC: chromatographie liquide à haute performance (Prep) utilisant une colonne Alltech (Deerfield, Ill), x 250 mm, C 18, débit: 2 ml/mn, détecteur: UV 340 nm Solvant phase mobile et durée de

rétention sont donnés pour chaque exemple.

Les composés de substrats peptidiques sont défi-

nis en utilisant la corrélation suivante entre la formule et la structure pour raison de clarté La formule générale est la suivante:

Z R 2 -R 1 X

La formule développée peut être représentée de la manière suivante:

Z R 2 1 -: X

i Z x NH C a C o oc

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dans laquelle R 3 est la chaîne latérale du groupe amino-acide R 1 et R 4 est la chaîne latérale du groupe-amino-acide R 21 X est un fragment de molécule qui peut être coupé par la cathepsine B à la liaison R 1-X et qui peut être mesuré lors de la coupure. Des exemples pour X sont AMC, AFC, AQ, HMC, PNP, PNA. Les sels de ces composés incluraient tout sel de cristallisation, comme cela pourrait être le cas si X était

AQ et si ce fragment de molécule formait le sel de chlorhy-

drate.

R 1 est un groupe amino-acide ayant la configura-

tion L au carbone désigné par i 1 ci-dessus, qui n'est pas chargé positivement dans les conditions du dosage C'est ainsi que le groupe amino-acide R 1 ne' doit pas être chargé positivement dans l'intervalle de p H allant environ de 4 à

environ 8.

Dans la formule développée ci-dessus, R 3 est une

chaîne latérale de R 1 contenant de préférence de 2 à 8 -

atomes Des exemples de R 3 sont: -CH 3 lorsque R 1 est Ala OH -(CH 2)3NHC-NH-N 02 lorsque Rl est (N 02)Arg -(CH 2)3-NHG-NH 2 lorsque R 1 est Cit l I Ei NH -(CH 2)3-NHC-NH-SO 2-C 655-CH 3 lorsque R 1 est (Ts)Arg o I -(CH 2)4-NH-C-CF 3 lorsque R 1 est (TFA)Lys La configuration L est nécessaire pour lier la cathepsine B Le but recherché en excluant les groupes

chargés positivement est d'éliminer des réactions poten-

tielles avec les enzymes analogues à la trypsine qui fausse-

raient le dosage ou la détection.

R 2 est un groupe amino-acide hydrophobe de préfé-

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rence Phe, ayant la configuration L au carbone en alpha (C() La configuration L est nécessaire pour lier la cathepsine B Le groupe aminoacide hydrophobe renforce également la liaison du substrat à la cathepsine B. Dans la formule développée ci-dessus, R 4 est une chaîne latérale de R 2 ayant de préférence la formule

-CH 2-Y

dans laquelle Y est un groupe alkyle inférieur, phényle ou

phényle substitué ou un groupe indolyle Par alkyle infé-

rieur, on entend 1 à 8 atomes de carbone Des exemples de R 4 sont H -CH, lorsque 2 est Trp -CH 2 -C 6 H 5 lorsque R 2 est Phe -CH 2 -CH 2 -(CH 03) 2 lorsque R 2 est Leu' -CH 2 -(CGH 3)2 lorsque R 2 est Val Z a moins d'importance que R 1 et R 2, mais est

utile par les légers changements qu'il apporte dans l'affi-

nité du composé pour la cathepsine B Ce groupe Z peut être

un simple groupe protecteur amino, tel que CBZ, BOC ou Bz.

Mais Z peut être également un autre groupe amino-acide bloqué, tel que CBZ (D ou L)-Ala Le groupe Z ne doit pas, en

tout cas, interférer avec la liaison sélective de la cathep-

sine B avec les groupes R 1 et R 2.

Les structures chimiques des peptides décrits dans ce brevet et dont il est question dans les exemples, sont mentionnés ci-dessous N O Composés ou substrats 1 CBZ Phe Cit AMC CH 3 o o

O

-9- IH 2 2 CBZ -Leu -Ci,,AYIC H.3 3 CBZ Ile C-it A Mc H 3 0 =' IH 2 4 CBZ -Vali-Cit -AMC S CBZ -Trp -Cit AMC 6 CBZ -Phe -Ala AMC m 3 -O 7 BZ Val Ala -AMC :H 3 il e CBZ Trp Ala AMC H 3

9 CBZ Phe (NO 2) Arg AMC-

H 3 , il CBZ ( D ou L)Ala Phe Cit AMC

0, NH 2

r H H

CH 3 O

0 j,N il H il N 1 1 NH il 12 CBZ Phe Met ANC MI 4 CH 3 13 CBZ Phie (Ts> Arg AMC -14 CBZ Plie (CBZ) Lys AMC o 1 C

25455 ( 3 '

CBZ Phe (T Ft) Lys Jti-IC Il O N Il Il NHJ il

H CF

16 CBZ Phe Trp AMC il O NH Il il

0 NH-1

o 17 CBZ Nala Cit AMC 18 CBZ -Phe -Arg -AFC NH-' o 19 CBZ -Ala -Arg -Arg -AFC IH NH =< e BZ -Val -Lys -Lys -Arg -AFC F 3 o ONI N O

V 2 NH 2

"r

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La synthèse des substrats peptidiques peut être réalisée par les divers procédés de synthèse des peptides

généralement connus La description qui suit, illustre

trois méthodes de synthèse: Méthode A: le groupe Z-R 2 est couplé avec le groupe R 1-X par le DCC, un anhydride mixte ou autre méthode

de couplage caractéristique.

Méthode B: le peptide complet Z-R 2-R 1 précédem-

ment préparé est couplé avec le groupe X indicateur en uti-

lisant le DCC, un anhydride mixte ou une autre méthode de

couplage convenable.

Méthode C:le couplage séquentiel des groupes Z, R 2, R 1 est suivi par le couplage du groupe indicateur X en utilisant le DCC, un anhydride mixte ou une autre méthode

de couplage convenable.

Les procédés généraux utilisés pour la prépara-

tion de la majorité des composés décrits dans les exemples sont soulignés ci-dessous et suivent la méthode A générale: 1.R 1 ou 2 + CZ Cl bse CBZ R 1 ou 2 1 ou 2 H È-i 1 OU 2

H 20

2 CBZ R 1 + AMC anhydride CBZ R 1 AMC mixte 3 CBZ R 1 AMC H 2/Pd N R 1 AMC ou H Br/HO Ac 4 CBZ R 2 + H 2 NR 1 AMC anhydrid_ CBZ R 2 R 1 AMC mixte

o R 1 et R 2 désignent différents amino-acides dans la for-

mule générale, CBZ est utilisé pour Z et AMC est utilisé pour X L'anhydride mixte se réfère au type de méthode de

couplage Les réactions 1 à 4 sont décrites en détail ci-

dessous. ( 1) Réaction CBZ C 1: Dans quelques cas, les dérivés CBZ-R étaient disponibles dans le commerce, dans les autres cas, ils ont été préparés par la méthode suivante: l'amino-acide R ( 25 mmoles) et 50 mmoles de bicarbonate de sodium ont été

dissous dans 50 ml d'eau dans un ballon de 100 ml Du carbo-

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benzyloxychlorure ( 25,5 mmoles) a été ajouté sous agitation à la température ambiante en 5 parties aliquotes pendant une heure La solution a été agitée ensuite pendant encore deux heures, elle a été extraite par l'éther deux fois, puis versée goutte à goutte dans 100 ml de 1 M H Cl Le produit

qui précipite tout d'abord est semi-solide, puis il se soli-

difie en le laissant reposer Le produit brut a été lavé

avec de l'eau-, séché et utilisé sans purification ultérieure.

Le rendement moyen était de 55 %.

( 2) Couplage avec AMC: On a additionné dans un ballon de ml, 11,4 mmoles d'amino-acide R bloqué, 15 ml de THF anhydre et 11,54 mmoles de TEA Après dissolution du composé, la solution a été refroidie sur de la glace et 11, 4 mmoles de chloroformate d'isobutyle ont été ajoutés La solution a été agitée pendant 10 minutes sur de la glace et ensuite une solution refroidie de 11,4 mmoles d'AMC dans 21 ml de DMF a été ajoutée On a continué l'agitation sur de la glace pendant une heure, puis à la température ambiante pendant une nuit Le mélange réactionnel a été filtré et le THF a

été éliminé du filtrat dans un évaporateur rotatif Le rési-

du a été placé dans un entonnoir à décantation de 125 ml avec 20 ml de CH 2 Ci 2 et 30 mi d'une solution aqueuse de HCI à 10 %, puis secoué vigoureusement Après extraction de la phase organique avec une seconde partie aliquote d'acide aqueux, le produit a précipité dans la phase organique La phase aqueuse a été décantée et le précipité a été recueilli par filtration et lavé avec de l'éther Le produit a été séché et utilisé sans purification ultérieure Le rendement

moyen était de 41 %.

( 3) Déblocage: Le groupe de blocage N-carbobenzyloxy a été enlevé de Z-R 1-AMC par traitement par le bromure d'hydrogène/

solution d'acide acétique glacial (U Br-HO Ac) ou par hydrogé-

nation catalytique Dans les deux exemples, on a utilisé -t-BOC au lieu de CBZ et le déblocage a été réalisé par

traitement par l'acide formique.

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H Br/HO Ac Dans un ballon de 500 ml, on a ajouté 3,8 mmoles de Z-R 1-AMC et 70 ml de H Br/HO Ac 33 % Après dissolution de l'échantillon, la solution a été agitée pendant encore minutes Le mélange réactionnel a été dilué avec 500 ml d'éther et le précipité résultant a été recueilli par fil- tration sous azote Le produit a été remis en suspension trois fois dans 100 ml d'éther et refiltré Le produit a été séché et utilisé sans purification ultérieure Le rendement

moyen était de 98 %.

Hydrogénation catalytique: Dans un ballon sous pression de 500 ml, on a ajouté 8,5 mmoles de Z-R 1 -AMC, 4 g de perles

de palladium-polyéthylèneimine (Pd-PEI) et 200 ml de métha-

nol Le ballon a été mis sous pression avec 1,4 kg/cm 2 d'hydrogène et secoué pendant six heures, puis a été laissé reposer pendant 18 heures de plus Après que les perles de catalyseur se soient déposées, l'alcool a été décanté et les perles ont été lavées deux fois avec 50 ml de méthanol Afin de faciliter la purification, le sel de chlorhydrate a été préparé en ajoutant 12,5 ml de H Cl aqueux 1 N Le solvant

a été éliminé sous vide et le résidu a été redissous et réé-

vaporé deux fois avec 50 ml d'alcool dénaturé Le résidu a été trituré avec de l'alcool dénaturé et laissé reposer

pendant la nuit Le produit R -AMC a été recueilli par fil-

tration, lavé avec de l'alcool dénaturé, séché sous vide, et utilisé sans purification ultérieure Le rendement moyen

était de 78 %.

Acide formique: Dans un ballon de 500 ml, on a ajouté

1,75 mmole de t-BOC-R 1 -AMC et 30 ml d'acide formique à 97 %.

Après dissolution du composé, la solution a été agitée à la température ambiante pendant 3 heures A celle-ci, on a ajouté 250 ml d'éther et 0,2 ml de H Cl concentré (pour former le sel de H Cl) Le précipité blanc a été filtré et lavé avec de l'éther Après séchage sous vide, le produit

a été utilisé sans autre purification.

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( 4) Couplage des peptides: Dans un ballon de 50 ml ont été additionnés 3, 2 mmoles de R 1-AMC H Br (ou HC 1), 25 ml de DMF anhydre et 3,2 mmoles de TEA Dans un second ballon de 50 ml ont été ajoutés 3,2 mmoles de CBZ-R 2, 10 ml de DMF anhydre et 3,2 mmoles de TEA Après dissolution des composés, les deux solutions ont été refroidies sur de la glace, et 3,2 mmoles de chloroformate d'isobutyle ont été ajoutés à la

solution de CBZ-R 2 Ce mélange réactionnel a été agité pen-

dant 10 minutes sur de la glace puis la solution de R -AMC refroidie a été ajoutée au mélange réactionnel CBZ-R 2 On a poursuivi l'agitation pendant une heure sur de la glace, puis pendant la nuit à la température ambiante Le mélange

réactionnel a alors été ajouté goutte à goutte sous agita-

tion dans 950 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5 % Le précipité a été recueilli par filtration et lavé trois fois avec de l'eau Le rendement brut moyen

était de 90 %.

Purification: Les produits finaux ont été purifiés par-la recristallisation qui suit et dans quelques cas par des recristallisations additionnelles et HPLC Le produit CBZ-R 2-R -AMC ( 2,9 mmoles) a été dissous dans 35 ml d'acide

acétique glacial sous agitation et en chauffant doucement.

On a ajouté 54 ml d'acétonitrile et cette solution a été chauffée sous reflux La solution très chaude a été filtrée

et 80 ml d'eau ont été ajoutés au filtrat par petites ali-

quotes en chauffant et sous agitation Un précipité blanc qui s'est formé lors du refroidissement, a été filtré et lavé à l'eau Le produit recristallisé a été séché sous vide

et le rendement de cristallisation moyen était de 80 %.

Le rendement global et les modifications de syn-

thèse sont donnés pour chaque exemple, ci-dessous.

Dosage: l'activité de la cathepsine B est détectée en contrôlant la vitesse de libération du groupe indicateur X. Le groupe indicateur peut être un fragment de molécule dont

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la fluorescence ou l'absorbance change lorsqu'il est coupé.

Tout indicateur connu, tel que AMC, HMC, AFC, AQ ou PNA peut être utilisé En variante, on peut également utiliser un

indicateur marqué radioactivement.

Les procédés de dosage de l'enzyme, la cathepsine B, suivent les procédés standards et les principes généraux utilisés pour les enzymes (ainsi que décrit par A J Barrett

dans l'ouvrage précité; par W P Jencks ( 1969) dans Cataly-

sis in Chemistry and Enzymology, Mc Graw Hill, New York).

Une condition cinétique à l'état d'équilibre est réalisée en utilisant des rapports de concentration enzyme/substrat appropriés (la concentration du substrat et sa constante Michaelis dépassent largement la concentration de l'enzyme) de manière à obtenir une valeur de vitesse précise dans la

plus petite échelle de temps du laboratoire.

Le dosage de l'activité de la cathepsine B est réalisé en ajoutant une faible quantité d'un échantillon de fluide corporel ( 1 à 50 microlitres, pil) à une solution aqueuse ayant un domaine de p H pour lequella cathepsine B

est active, couramment p H 5-6,5, de préférence p H 5,5 conte-

nant EDTA et un activateur thiol (anti-oxydant biologique ou autre agent réducteur convenable) tel que cystéine ou dithiothréitol Après une courte période d'activation par exemple de 1 à 2 minutes, le subst Mt dissous dans un solvant compatible, tel que méthanol, éthanol, acétonitrile ou DMF, est ajouté à un faible volume ( 20 pl), de telle manière que la concentration du substrat soit notablement plus grande que la concentration de l'enzyme (de préférence au moins 100 fois) La température est régulée par rapport à un point prédéterminé, de préférence dans un intervalle allant de la température ambiante à environ 37 C Après que l'échantillon et le substrat aient été mélangés, la concentration de l'indicateur qui s'est séparé peut être mesurée par rapport au temps à l'aide d'un spectrophotomètre ou d'un compteur à scintillation ou par d'autres moyens connus qui relèvent

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de l'art connu et qui ne font pas partie de l'invention.

On établit une courbe standard de concentrations connues de l'indicateur libre, de façon à disposer d'une

échelle de comparaison pour les échantillons à étudier.

Les calculs sont les suivants pour un indicateur fluores- cent: Equation 1: A B = C spécifiquement (A unités de fluorescence/mn) (B/u M indicateur) _ = unités de fluorescence (C p M indicateur/mn) dans laquelle A est obtenu par la mesure faite avec l'échantillon, B est obtenu par la courbe standard et C est le résultat "FM" signifie micromolaire ( 9 moles/litre), "ml" millilitres et "mn" minutes Les calculs s'effectuent d'une manière similaire lorsque l'on utilise d'autres

indicateurs Les résultats obtenus en effectuant ces cal-

culs donnent une vitesse qui s'exprime par la concentra-

tion du groupe indicateur X libre et par sa variation dans le temps Cette vitesse peut être directement rapportée

à la vitesse avec laquelle s'effectue la coupure du subs-

trat par l'enzyme et ainsi on peut en déduire l'importance

de l'activité de l'enzyme.

L'invention sera décrite plus en détail dans les exemples qui suivent, restant entendu que l'invention

n'est pas limitée à ces exemples.

Synthèse du substrat Exemple 1: CBZ L Phe-L Cit MIC a été préparé ainsi qu'indiqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 17 ml HO Ac, 74 ml CH 3 CN, ml H 20 par gramme Le rendement global était de 14 % PF = 227-230 C li 12 D (DMF) = -22,77 HPLC ( 70 % CH 30 H/

% H 20) 9,6 mn, 97,3 %.

H-NMR 6 1,30-1,55, c, 2 p; S 1,55-1,81, c, 2 p; 6 2,40,

21 2545503

s, 3 p; 6 2,75, t, lp; 6 2,90-3,l O, c, 3 p; 6 4,28-4,40, c, lp; 6 4,40-4, 51, c, lp; 64,94, s, 2 p; 65,43, s, 2 p; 66,00, t, lp; 6 6,28, s, lp; 6 7, 10-7,39, c, 1 Op; 6 7,48, d, lp; 6 7,51, d, lp; 6 7,73, d, lp; 6 7,80, d, lp; 6 8,35, d, lp; 6 10,51, s, lp MS: ion moléculaire père = 614. Analyse élémentaire: calculé pour C 33 H 35 NO 7,

33 35 507

C 64,59 %, H 5,75 %, N 11,41 %; trouvé C 64,81, H 5,77 %,

N 11,61 %.

Exemple 2: CBZ -L-Leu-L-Cit-AMC a été préparé ainsi qu'in-

diqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 17 ml HO Ac, 36 ml CH 3 CN, 136 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 19 % PF = 196-

198 C E< 125 (DMF) = -25,79 HPLC: ( 45 % CH 3 CN/55 % H 20)

9,8 mn, 99,9 %.

H-NIR: 60,87, 2 d, 6 p; 6 1,44, t, 3 p; 6 1,54-1,77, c, 4 p; 6 2,39, s, 3 p; 6 2,86-3,10, c, 2 p; 64,10, q, lp; 64,43, q, lp; 65,04, s, 2 p; 6 5,42, s, 2 p; 65,98, t, lp; 66,27, s, lp; 6 7,24-7,53, c, 7 p; 67,72, d, lp; 67,78, d, lp;

c 8,16, d, lp; 610,46, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 580.

Analyse élémentaire: calculé pour C 30 H 37 N 507, C 62,16 %, H 6,43 %, N 12,08 %; trouvé C 62,59 %, H 6,50 %,

H 12,06 %.

Exemple 3: CBZ-L-Ile-L-Cit-AMC a été préparé ainsi qu' indiqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 20 ml HO Ac, 34 ml CH 3 CN, 54 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 19 %.

PF = 240-242 C 1 l 25 (DMF) = -28,16 HPLC ( 50 % CH 3 CN/50 % D 3

H 20) 7,1 mn, 91,8 %.

H-NMR: 60,73-0,93, c, 6 p; 61,00-1,80, c, 7 p; 62,40, s, 3 p; & 2,86-3,12, c, 2 p; 63,96, t, lp; d 4,43, q, lp; 6 5,05, s, 2 p; 65,43, s, 2 p; 65, 99, t, lp; 66,27, s, lp; d 7,25-7,42, c, 6 p; d 7,49, d, lp; 67,72, d, lp; 67,78, s, lp; 68,20, d, lp; 6 10,46, s, lp; MS: ion moléculaire père = 580 Analyse élémentaire: calculé pour C 30 H 37 N 507, C 62,16 %, H 6,43 %, N 12,08 %, trouvé C 62,24 %, H 6,36 %,

N 12,14 %.

Exemple 4: CBZ-L-Val-L-Cit-AMC a été préparé ainsi qu' indiqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 24 ml HO Ac, 75 ml CH 3 CN, 128 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 16 % PF = 244-

247 o C El D (DMF) = -27,36 HPLC ( 35 % CH 3 CN/65 % H 20)

17,1 mn, 93,8 %.

1 H-NMR: 6 0,73-1,0, c, 6 p; 61,30-1,54, c, 2 p; 61,54-1,83, c, 2 p; 61,83-2,10, c, lp; 62,40, s 3 p; 4 2,83-3,12, c, 2 p; 3,94, t, lp;'64,43, q, lp; 65,05, s, 2 p; 65,42, s, 2 p; 65,98, t, lp; 66,28, s, lp; d 7,20-7,43, c, 5 p; 6 7,44-7,49, c, 2 p; 6 7,72, d, lp; 67,77, d, lp; 8,19,

d, lp; 610,46, s, lp.

* MS: ion moléculaire père = 566 Analyse élémentaire: calculé pour C 29 H 35 N 507, C 61,58 %, H 6,24 %, N 12,38 %; trouvé C 61,86 %, H 6,27 %,

N 12,44 %.

Exemple 5: CBZ-L-Trp-L-Cit-AMC a été préparé ainsi qu'in-

diqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 16 ml HO Ac, 37 ml CH 3 CN, 96 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 17 %, PF = 235-

238 o C ld 125 (DMF) = -23,75 HPLC ( 45 % CH 3 CN/55 % H 20)

5,2 mn, 95,6 %.

1 H-NMR: 61,30-1,54, c, 2 p; 61,54-1,83, c, 2 p; 62,40, s, 3 p; 62,82-3, 40, c, 4 p; 64,33-4,54, c, 2 p; f 4,96, s, 2 p; 6 ,43, s, 2 p; 65,99, t, lp; 66,27, s, lp; 66,95, t, lp;d 7,05, t, lp; 67,10-7,45, c, 8 p; 67,50, d, lp; d 7,65, d, lp; d 7,73, d, lp; d 7,80, d, lp; 68,33, d, lp; 610,49,

s, lp; d 10,79, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 653.

Analyse élémentaire: calculé pour C 35 H 36 N 607, C 64,41,% H 5,56 %, N 12,88 %; trouvé C 64,46 %, H 5,48 %,

H 12,94 %.

Exemple 6: CBZ-L-Phe-L-Ala-AMC a été préparé ainsi qu' indiqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 18 ml HO Ac, 27 ml CH 3 CN, 29 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 31 %.

PF = 232-234 C l I 25 (DMF) = -23,41 HPLC: ( 55 % CH 3 CN/

%H 20) 6,8 mn, 98,2 %.

1 H-NMR: 61,36, d, 3 p; 62,40, s, 3 p; 62,74, t, lp; 62,98-

3,13, c, lp; 64,33, c: lp; d" 4,46, c, lp; 64,94, s, 2 p; cr 6,28, s, lp; d 7,12-7,40, c,10 p; 67,44-7,56, c, 2 p; & 7,74, d, lp; 67,78, d, lp; 68, 40, d, lp; 610,43, s, lpo MS: ion moléculaire père = 528 Analyse élémentaire: calculé pour C 30 H 29 N 306, C 68,30 %, H, 5,54 %, N 7,96 %; trouvé C 68,57 %, H 5,58 %,

N 7,96 %.

Exemple 7: CBZ-L-Val-L-Ala-AMC a été préparé ainsi qu'in-

diqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans lgétape 3, et la recristallisation dans 100 ml HO Ac, 104 ml CH 3 CN, 67 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 31 % PF = 260-

2650 C t Le| 25 (DMF) = -34,51 HPLC ( 45 % CH 3 CN/55 % H 20)

6,8 mn, 98,7 %.

1 H-NMR: 60,82-0,96, c, 6 p; 61,33, d, 3 p; 1,88-2,07, c, lp; 62,40, s, 3 p; d 3,92, t, lp; d 4,44, c, lp; '5,05, s, 2 p; 66,28, lp; d 7,26-7,42, c, 5 p; 67,45-7,52, c, 2 p;

7,73, d, lp; 67,76, d, lp; 68,25, d, lp; 610,39, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 480 Analyse élémentaire: calculé pour C 26 H 29 N 306, C 65,12 %, H 6,10 %, N 8,76 %; trouvé C 65,59 %, H 6,02 %,

N 8,79 %.

Exemple 8: CBZ-L-Trp-L-Ala-AMC a été préparé ainsi qu'in-

diqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 33 ml HO Ac, 47 ml CH 3 CN, 44 ml H 20 par gramme Le rendement global était de 17 % PF =

248-253 o C l l 25 (DMF) = -16,55 .

HPLC ( 45 % CH 3 CN/55 %H 20) 13,8 mn, 93,4 %.

1 H-NMR: 61,34, d, 3 p; 62,40, s, 3 p; 62,94, c, lp; 63,08-

3,22, c,l E 4,36, se, lp; 64,45, t, lp; 64,95, s, 2 p;d 6,26, s, lp; 6 6, 95,t/lp; 67,05, t, lp; c 7,10-7,40, c, 8 p; 6 7,50, d, lp; 67,66, d, lp; 67,72, d, lp; 67,78,d, lp;cr

8,36 ' d, lp; 610,38, s, lp; 610,79,s,lp.

MS: ion moléculaire père = 567 Analyse élémentaire: calculé pour C 32 H 30 N 406, C 67,83 %, H 5,34 %, N 9,89 %; trouvé C 68,00 %, H 5,42 %,

N 9,96 %.

Exemple 9: CBZ-L-Phe-L-(N 02)Arg-AMC a été préparé ainsi qu'indiqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant

le déblocage par H Br/HO Ac dans l'étape 3, et la recristal-

lisation dans 8 ml HO Ac, 16 ml CH 3 CN, 15 ml H 20 par gramme Le rendement global était de 20 % PF 150-160 C (dec) lIo( 25 (DMF) = -3,80 HPLC ( 55 % CH 3 CN/45 % H 20)

8,8 mn,95,9 %.

1 H-NEIR: 61,4-1,9, c, 4 p; e 2,4, s, 3 p; 62,7-3,1, c, 2 p; 63,19, c, 2 p; 64,34, c, lp; 64,45, c, lp; 64,95, s, 2 p; 66,28, s, lp; 67,10-7,42, c, 13 p; 67,49, d, 2 p; r 7,74,

d, lp; 67,78, d, lp; 68,34, d, lp; c-10,49, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 658.

Analyse élémentaire: calculé pour C 33 H 35 N 408, C 60,27 %, H 5,36 %, N 14,91 %; trouvé C 60,03 %, H 5,41 %,

N 15,09 %.

Exemple 10: CBZ-L-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC a été préparé à partir de CBZ-L-PheL-Cit-AMC (exemple 1) en effectuant le déblocage avec H Br/HO Ac comme dans l'étape 3 ci-dessus, suivi par le couplage peptidique de ce produit de réaction avec CBZ-Ala comme dans l'étape 4 ci-dessus Le produit final a été recristallisé dans 34 ml HO Ac, 44 ml CH 3 CN, 273

ml H 20 par gramme et ensuite purifié pour analyse enzyma-

tique par HPLC (prép 45 % CH 3 CN/55 % H 20, 20 mn) Le ren-

dement brut global était de 40 % PF = 236-240 C lt 125

(DMF) = -39,91 HPLC ( 60 % CH 3 CN/40 % H 20) 6,5 mn, 92,1 %.

1 H-NMR: 61,14, d, 3 p; 61,28-1,54, c, 2 p; 61,54-1,83 c, 2 p; 62,42, s, 3 p; 62,73-3,14, c, 4 p; 64,02, t, lp; 64,44, q, lp; 64,56, c, lp; 65,00, q, 2 p; 65,43, s, 2 p; oc 5,99, t, lp; 6 6,28, s, lp; 67,08-7,40, c, 10 p; 67,45, d, lp; 6 7,53, d, lp; 67,74, d, lp; 67,79, d, lp; 67,90, d, lp;

8,28, d, lp; 610,44, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 685.

Analyse élémentaire: calculé pour C 36 H 40 N 608, C 63,15 %, H 5,89 %, N 12,27 %, trouvé C 63,10 %, H 5,91 %,

N 12,15 %;

Exemple 11: CBZ-D-Ala-L-Phe-L-Cit-ANC a été préparé comme

dans l'exemple 10 en utilisant CBZ-D-Ala et L-Phe-L-Cit-

AMC dans le couplage peptidique final Le produit final a été recristallisé dans 13 ml HO Ac, 36 ml CH 3 CN, 173 ml H 20 par gramme et ensuite purifié pour analyse enzymatique par

HPLC (Prép,45 % CH 3 CN/55 % H 20, 20 mn) Le rendement glo-

bal était de 34 %.

PF = 194-196 C &l 25 (DMF) = -17,89 .

HPLC: ( 60 % CH 3 CN/40 % H 20) 6,5 mn, 88,4 %.

1 H-NMR: 60,98, d, 3 p; 61,28-1,56, c, 2 p; 61,56-1,88, c, 2 p; 2,41, s, 3 p; o^ 2,78-3,20, c, 4 p; 64,03, t, lp; 6 4,44, c, lp; C 4,58, c, lp; 64, 95, q, 2 p; c 05,42, s, 2 p; 66,00, t, lp; 66,28, s, lp; 67,10-7,38, c, l Op; 7,44, d, lp; & 7,54, d, lp; 67,73, d, lp; 67,80, d, lp; 8,19, d, lp; 5 o 8,24, d, lp '; 60,32, s, lp, MS: ion moléculaire père = 685 Analyse élémentaire; calculé pour C 36 H 40 N 608, C 63,15 %, H 5,89 %, N 12,27 %; trouvé C 62, 97 %, H 5,91 %,

N 12,20 %.

Exemple 12: CBZ-L-Phe-L-Met-AMC a été préparé ainsi qu' indiqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le

déblocage par H Br/HO Ac dans l'étape 3 et la recristallisa-

tion dans 3 ml HO Ac, 10 ml CH 3 CN, 4 ml H 20 par gramme, et ensuite purifié par HPLC Crép 60 % CH 3 CN/40 % H 20, 15 mn) pour dosage enzymatique Le rendement global était de 16 %; PF = 202-209 'C Cl 2 D (DMF) = -3,79 HPLC ( 45 % CH 3 CN/55 %

H 20) 17,3 mn, 85,2 %.

1 H-NMR: 61,85-2,20, c, 2 p; 62,07, s, 3 p; C 2,35-2,62, c, 2 p; d 2,42, s, 3 p; -2,76, t, 2 p; " 4,34, c, lp; 64,53, c, lp; c 4,96, s, 2 p; 66,28 s, lp; 7,14-7,39, c, 10 p; 67,50, d, 2 p; 67,74, d, lp; 67,78, d, lp; " 8, 36, d,

lp; 610,48, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 588 Analyse élémentaire: calculé pour C 32 H 33 N 3065, C 65,40 %, H 5,66 %, N 7,15 %, S 5,46 %; trouvé C 65,76 %,

H 5,77 %, N 7,09 %, S 5,45 %.

Exemple 13: CBZ-L-Phe-L-(Ts)Arg-AMC a été préparé ainsi qu'indiqué dans les étapes 2 à 4 en partant du D -t-BOC (Ts) Arg au lieu du dérivé i<-CBZ dans l'étape 2 Le groupe O-t-BOC a été enlevé par l'acide formique ainsi que décrit ci-dessus avec un rendement de 17 % Le rendement brut global était de 9,2 % et ce produit a été ensuite purifié

par HPLC (Prép 75 % CH 30 H/25 % H 20, 20 mn).

PF = 118-125 C.

12 D (DMF) = + 7,0 HPLC ( 65 % CH 3 CN/35 % H 20) 11,3 mn, ,9 %. 1 HNMR: 61,29-1,58, c, 2 p; 6 1,58-1,86, c, 2 p; & 2,28, s, 3 p; 2,40, s, 3 p; d 2,74, t, lp; 62,92-3,20, c, 3 p;

64,24-4,52, c, 2 p; 64,95, s, 2 p; 66,28, s, lp; d 6,43-

7,11, c, 3 p; 67,11-7,44, c, 14 p; d 7,62, d, 2 p; d 7,75, d,

lp; 67,78 s, lp; 68,34, c, lp; 610,52, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 767 Analyse élémentaire: calculé pour C 40 H 42 N 6085, C 62,65 %, H 5,52 %, N 10,96 %, S 4,18 %, trouvé C 62,04 %, Y 5,66 %,

N 10,90 %, S 4,47 %.

Exemple 14: CBZ-L-Phe-L-(CBZ) Lys-AMC a été préparé ainsi qu'indiqué dans les étapes 2 à 4 en partant du "(-t-BOC(CBZ)

Lys au lieu du dérivéo<-CBZ dans l'étape 2 Le groupeo -t-

BOC a été enlevé par l'acide formique ainsi que décrit ci-

dessus avec un rendement de 83 % La recristallisation a été effectuée dans 20 ml d'acide acétique, 56 ml CH 3 CN, 127 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 39 % PF = 170-

173 C -i 12 (DMF) = -4,28 HPLC ( 45 % CH 3 CN/55 % H 20)

,3 mn, 97,5 %.

1 H-NMR:6 1,20-1,54, c, 4 p; 61,54-1,82, c, 2 p; 2,40, s, 3 p; 2,76 t, 2 p; 52,88-3,09, c, 2 p; 4,28-4,48, c, 2 p; g 4,96, d, 4 p; g 6,27, s, lp; g 7,10-7,43, c, 17 p; -7,49, t, lp; 7,73, d, lp; 57,77, s, lp; i 8,29, d, lp; 910,47,

s, lp.

MS: ion moléculaire père = 719 Analyse élémentaire: calculé pour C 41 H 42 N 408, C 68,51 %, H 5,89 %, N 7,79 %; trouvé C 68,23 %, H 5,91 %,

N 7,69 %.

Exemple 15: CBZ-L-Phe-L-(TFA) Lys-ANC a été préparé ainsi qu'indiqué dans les étapes 1 à 4 en effectuant le déblocage

par hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recris-

tallisation dans 28 ml CH 3 CN par gramme Le rendement global

était de 9 %.

PF = 208-210 C D 2 (DMF) = -8,15 HPLC ( 45 % CH 3 CN/55 %

H 20) 15,8 mn, 80,4 %.

1 H-NMR: î 1,20-1,45, c, 2 p; 6 1,45-1,61, c, 2 p; F 1,61-1,85, c, 2 p; i 2,42, s, 3 p; J 2,75-3,06, c, 2 p; F 3,18, c, 2 p; f 4,28, se, lp; i 4,48, q, lp; & 4,95, s, 2 p; 36,28, s, lp; c 7,14-7,39, c, l Op; J 7,44-7,54, c, 2 p; i 7,74, d, lp; &

7,78, d, lp; 58,31, d, lp; 59,40, c, lp; J 10,48, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 681.

Analyse élémentaire: calculé pour C 35 H 35 N 407 F 3, C 31,76 %, H 5,18 %, N 8,23 %, F 8,37 %; trouvé C 62,28 %,

H 5,38 %, N 8,30 %, F 8,06 %.

Exemple 16: CBZ-L-Phe-L-Trp-AMC a été préparé ainsi qu'in-

diqué dans les étapes 1 à 4 en effectuant le déblocage par

hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristal-

lisation dans 11 ml HO Ac, 11 ml CH 3 CN, 4 ml H 20 par gramme.

Le rendement gldal était de 31 % PF = 165-167 C 125 (DMF) = + 51,89 HPLC ( 45 % GH 3 CN/55 % H 20) 16,2 mn, 99,4 %. 1 H-NMR: 92,40, s, 3 p;i 2,74, t, 2 p; 2,83-3,30, c, 2 p; & 4,33, qn, lp; 54,76, q, lp; -4,97, s, 2 p; J 6,28, s, lp '6,97,t,1 p; 7,07, t, lp; 7,12-7,38, c, 13 p; C 7, 48, d, lp; 37,63, d, lp; f 7,72,)lp; 67,76, s, lp; 68,38, d, lp; 610,52,

s, lp; J 10,86, s, lp.

MS: ion moléculaire père: 643.

Analyse élémentaire: calculé pour C 38 H 34 N 406, C 71,01 %, H 5,33 %, N 8,72 %; trouvé C 71921 %, H 5,40 %,

N 8,72 %.

Exemple 17: CBZ-L-Nala-L-Cit-AMC a été préparé ainsi qu'in-

diqué dans les étapes 1 à 4 ci-dessus en effectuant le déblocage par l'hydrogénation catalytique dans l'étape 3, et la recristallisation dans 40 ml HO Ac, 86 ml CH 3 CN, 92 ml

H 20 par gramme Le rendement global était de 13 % PF = 225-

227 C kj 2 D (DMF) = -20,3

HPLC ( 60 % CH 3 CN/40 % H 20) 8,0 mn, 99,9 %.

1 H-NMR: & 1,30-1,56, c, 2 p; & 1,56-1,85, c, 2 p; & 2,40, s, 3 p; i 2,843,22, c, 4 p; 64,38-4,57, c, 2 p;& 4,91, s, 2 p; ,43, s, 2 p; 66,00, t, lp; 66,28, s, lp;& 7,07-7,65, c, 12 p; f 7,74, d, lp; 67,78, d, lp; i 7, 92, d, lp; & 8,22,

d, lp; 8,34, d, lp; 610,50, s, lp.

MS: ion moléculaire père = 664 Analyse élémentaire: calculé pour C 37 H 37 N 507, C 64,59 %, H 5,75 ? N 11,41 %; trouvé C 64,68 %, H 5,87 %,

N 11,40 %.

EXEMPLES DE DOSAGE

La cathepsine B purifiée a été préparée à partir de foie de porc et de foie humain néoplastique en utilisant

les procédés de relargage standards Le dosage a été effec-

tué en utilisant du Bis-Tris O,1 M, un tampon acétate ou

29 2545503

phosphate ayant un p H de 5,5 et contenant 1 m M EDTA De la cystéine ( 5 m M) a été utilisée comme l'activateur thiol, et le tampon contenant l'activateur a été fraîchement préparé tous les jours Un faible volume ( 5}ul) d'un échantillon contenant de la cathepsine B a été mélangé avec 5851 l de tampon frais à 37 C contenant l'activateur thiol dans une cuvette 5 x 5 mm de fluorimètre et laissé incuber à 37 C

pendant 2 minutes, 20 1 du substrat dans le DMF à une con-

centration allant de 0,05 m M à 2 m M ont alors été ajoutés sous agitation L'accroissement de la fluorescence a été contrôlé avec le temps à 37 C pendant plusieurs minutes en utilisant un spectrofluorimètre Perkin Elmer LS-5 Pour l'AMC, la longueur d'onde d'excitation a été de 350 nm, la

longueur d'onde d'émission de 460 nm et pour l'AFC la lon-

gueur d'onde d'excitation a été de 385 nm et la longueur d'onde d'émission de 490 nm Le réglage du fluorimètre a été effectué ainsi: largeur de fentes 5 et 5 mm, réponse du filtre 1, et le facteur d'échelle a été fixé à 0-1,0 Les résultats de l'interaction enzymatique avec les exemples de

substrats 1 à 17 et les produits classiques du commerce CBZ-

Phe-Arg-AFC (Exemple 18), CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC (Exemple 19) et Bz-Val-LysLys-Arg-AFC (exemple 20) sont donnés dans le

tableau 1.

TABLEAU 1

No

2

7

il

12

17

Composé CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC' CBZ-L-Leu-L-Cit-AMC CBZ-L I le-L-Cit-AMC CBZL-Val-L-Cit-AMC CBZ-L-Trp-L-Cit-AMC CBZ-L-Phe-L-Ala-AMC CBZ-L-Val-L-AlaAMC CBZ-L-Trp-L-Ala-AMC CBZ-L-Phe-L-(NO 2)Arg-AMC CBZ-L-Ala-L-Phe-L-CitAMC CBZ-D-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC CBZ-L-Phe-L-Met-AMC' CBZ-L-Phe-L-(Ts)ArgAMC 4 CBZ-L-Phe-L-(Z)Lys-AMC" CBZ-L-Phe-L-(TFA)Lys-AMC' CBZ-L-Phe-L-TrpAMC CBZ-L-Nala-L-Cit-AMC CBZ-Phe-Arg-AF Cs CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC 5 BZ-ValLys-Lys-Arg-AFC 5 Vnax Cathepsine B 0,296 0,116 0,126 0,169 0,034 0,018 0, 069 1 t 025 0,105 0,062 0,614 1,575 0:182

0 > 457

0,01 0 o o 01 0 007

0, 003

0,017 /Km ordre de Trypsine valeur relative

NR 2 2

NR 6

NR 5

NR 3

NR 4

NR 13

NR 14

NR 8

NR 1

NR 7

NR 15

NR 12

NR 9

NR 11

NR 10

NR 17

NR 16

01003 12

0,058 14

0) 077 13

1 AMC a une sensibilité de 0,049,un M/unité de fluorescence

et représente B dans l'équation 1 pour ces calculs.

2 NR: pas de réaction 3 L'ordre est basé sur la vitesse de réaction avec la cathepsine B (plus la vitesse est grande, plus l'ordre est bas) et sur la vitesse de réaction avec la trypsine

(plus la vitesse est grande, plus l'ordre est élevé).

4 La valeur relative de ce composé est réduit par suite

de sa faible solubilité et de sa faible vitesse maximale.

AFC a une sensibilité de 0,009 u M/unité de fluorescence

et représente B dans l'équation 1 pour ces calculs.

31 2545503

Ces résultats font apparaître clairement que les

substrats 1 à 17 (tableau 1) de la présente invention pré-

sentent un degré de sélectivité et de sensibilité beaucoup plus élevé pour la détection de la cathepsine B en présence de trypsine que les peptides habituellement utilisés, tels

que les substrats 18 à 20 du tableau 1 ou de peptides analo-

gues présentant un groupe chargé positivement dans la position R 1 (fixé sur X) Les enzymes tryptiques se trouvant normalement dans le sang humain, interfèrent avec la mesure de la cathepsine B Les substrats peptidiques de l'invention évitent ou réduisent les problèmes d'interférence dus aux

enzymes analogues à la trypsine, et ont une sensibilité vis-

à-vis de la cathepsine B de 60 à 350 fois plus grande que

les peptides des exemples 18 à 20.

Conformément à un autre mode de réalisation de l'invention, l'activité de la cathepsine B peut être mesurée qualitativement ou semiquantitativement par mise en contact

d'un échantillon préparé d'un fluide provenant d'un mammi-

fère avec un substrat approprié selon l'invention Des pra-

tiques de laboratoire clinique caractéristiques pour l'obten-

tion de telles analyses peuvent comprendre, par exemple, une analyse cytologique dans laquelle les cellules, tissus et échantillons d'organes sont mis en contact avec le substrat

et autres réactifs dans des buts de coloration sélective.

D'autres analyses cliniques caractéristiques comportent l'utilisation d'une bande test qui contient le substrat incaporé dans un support approprié, relativement inertequi peut être un matériau cellulosique ou non tissé, ou leur combinaison Lorsque l'échantillon est mis en contact avec une bande test, l'échantillon est absorbé par la bande test, provoquant un changement de couleur permettant une analyse

relativement rapide.

32 2545503

Claims

REVENDICATIONS

1 Procédé permettant de déterminer sélectivement l'activité de la cathepsine B dans les matières pouvant contenir de la trypsine et des enzymes analogues à la trypsine, caractérisé en ce qu'il consiste (a) à mélanger un échantillon desdites matières avec un substrat, et ses sels d'acides, de formule

2 1 X

dans laquelle X est un fragment de molécule indicateur libéré par coupure de la liaison R 1-X par la cathe Dsine B et est détectable lors de la coupure,

R est un groupe amino-acide ayant la configura-

i tion L au carbone en alpha du groupe carbonyle et n'est pas

chargé positivement dans l'intervalle de p H auquel s'effec-

tue le dosage, R 2 est un groupe amino-acide hydrophobe ayant la configuration L au carbone en alpha du groupe carbonyle, et Z est un groupe de blocage amino n'interférant pas avec la liaison sélective de la cathepsine B avec les groupes R et R 2, ledit mélange étant réalisé dans un milieu aqueux ayant un p H compris dans un intervalle pour lequel la cathepsine B

est active, et le mélange ayant une concentration en subs-

strat notablement plus grande que la concentration en cathepsine B, et suffisante pour que le groupe X coupé puisse être détectable, et (b) à mesurer la vitesse avec laquelle le groupe

X est coupé du substrat.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un fragment de molécule pouvant être coupé

dont l'émission de fluorescence change lors de la coupure.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est un fragment de molécule pouvant être coupé dont le spectre visible ou ultraviolet change lors de la coupure. 4 Procédé selon la revendication l, caractérisé

en ce que R 1 est un groupe citrullyle.

Procédé selon la revendication en ce que R 1 est un groupe nitroarginyle. 6 Procédé selon la revendication

en ce que R 2 est un groupe phénylalanyle.

7 Procédé selon la revendication

en ce que R 2 est un groupe leucyle.

8 Procédé selon la revendication

en ce que R 2 est un groupe tryptophyle.

9 Procédé selon la revendication

en ce que R 2 est un groupe isoleucyle.

1, caractérisé 1, caractérisé 1, caractérisé 1, caractérisé 1, caractérisé Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que R 2 est un groupe valyle.

11 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 2 est un groupe phénylalanyle et R 1 est un groupe citrullyle. 12 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 2 est un groupe phénylalanyle et R 1 est un groupe nitroarginyle. 13 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un groupe valyle. 14 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un groupe tryptophyle. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un groupe

isoleucyle.

16 Procédé pour détecter sine B dans les matières, de doser sélectivement la cathepsine la trypsine et des enzymes analogues risé en ce qu'il consiste:

l'activité de la cathep-

en permettant B, pouvant contenir de

à la trypsine, caracté-

34 2545503

(a) à mettre en contact un échantillon desdites matières avec un substrat, et ses sels

d'acides, de formule: -

Z R R X

2 1.

dans laquelle X est un fragment de molécule indicateur, libéré par coupure de la liaison R -X par 1 la cathepsine B et est détectable lors de la coupure,

R 1 est un groupe amino-acide ayant la configura-

tion L au carbone en alpha du groupe carbonyle et n'est pas

chargé positivement dans l'intervalle de p H auquel s'effec-

tue le dosage, R 2 est un groupe amino-acide hydrophobe ayant la configuration L au carbone en alpha du groupe carbonyle, et Z est un groupe de blocage amino n'interférant pas avec la liaison sélective de la cathepsine B avec les groupes R 1 et R 2,

ladite mise en contact avec le substrat précité étant réali-

sée dans des conditions pour lesquelles ladite cathepsine B est active et à des concentrations pour lesquelles ledit substrat est présent en quantités notablement plus grandes que la concentration en cathepsine B, et (b) à déterminer la fourniture du groupe X coupé

du substrat.

17 Procédé selon la revendication 16,caractérisé en ce que X est un fragment de molécule pouvant être coupé dont

l'émission de fluorescence change lors de la coupure.

18 Procédé selon la revendication 16,caractérisé en ce que X est un fragment de molécule pouvant être coupé dont

le spectre visible ou ultra-violet change lors de la coupure.

19 Procédé selon la revendication 16,caractérisé en

ce que R 1 est un groupe citrullyle.

Procédé selon la revendication 16,caractérisé en

ce que Ri est un groupe nitroarginyle.

21 Procédé selon la revendication 16, caracté-

risé en ce que 22. risé en ce que 23. risé en ce que 24. risé en ce que 25. risé en ce que 26. R 2 est un groupe Procédé selon la R 2 est un groupe Procédé selon la R 2 est un groupe Procédé selon la R est un groupe Procédé selon la R 2 est un groupe Procédé selon la phénylalanyle. revendication leucyle. revendication tryptophyle. revendication isoleucyle. revendication valyle. revendication

16, caracté-

16, caractéri-

sé en ce que R 2 est un groupe phénylalanyle et R 1 est un

groupe citrullyle.

27 Procédé selon la revendication 16, caractéri 2 sé en ce que R 2 est un groupe phénylalanyle et R 1 est un groupe nitroarginyleo

28 Procédé selon la revendication 16, caractè-

risé en ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un

groupe valyle.

29 Procédé selon la revendication 16,caractériséen

ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un groupe tryp-

tophyle. Procédé selon la revendication 16, caractériséen

ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un groupe iso-

leucyle. 31 Composés, et leurs sels d'acides, de formule

Z R 2 R 1 X

dans laquelle: X est un fragment de molécule indicateur pouvant être coupé par rapport à R 1,

R 1 est un groupe amino-acide ayant la configura-

tion L au carbone en alpha du groupe carbonyle et n'est pas chargé positivement, R 2 est un groupe amino-acide hydrophobe ayant la configuration L au carbone en alpha du groupe carbonyle, et

Z est un groupe de blocage amino.

36 2545503

32 Composés selon la revendication 31, caracté-

risés en ce que X est un fragment de molécule pouvant être

coupé dont la fluorescence change lors de la coupure.

33 Composés selon la revendication 31, caracté-

risésen ce que X est un fragment de molécule pouvant être coupé dont le spectre visible ou ultra-violet

change lors de la coupure.

34 Composés selon la revendicatin 31, caractéri-

sésen ce que R 1 est un groupe citrullyle.

Composés selon la revendication 31, caracté-

risésen ce que R 1 est un groupe nitroarginyle.

36 Composés selon la revendication 31, caracté-

risés en ce risésen ce térisés en risés en ce risés en ce risés en ce que R est un groupe p 37 Composés selon la que R 2 est un groupe 1 38 Composés selon la ce que R 2 est un groupe 39 Composés selon la que R est un groupe i Composés selon la que R 2 est un groupe 41 Composés selon la que R 2 est un groupe p hénylalanyle. revendication eucyle. revendication tryptophyle. revendication soleucyle. revendication valyle. revendication

31, caracté-

31, carac-

31, caracté-

hénylalanyle et R 1 est un

groupe citrullyle.

42 Composés selon la revendication 31, caracté-

risés en ce que R 2 est un groupe phénylalanyle et R 1 est un

groupe nitroarginyle.

43 Composés selon la revendication 31, caracté-

risés en ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un

groupe valyle.

44 Composés selon la revendication 31, caracté-

risés en ce que R est un groupe citrullyie et R 2 est un

groupe tryptophyle.

Composés selon la revendication 31, caracté-

risés en ce que R 1 est un groupe citrullyle et R 2 est un

37 2545503

groupe isoleucyle.

46 Composés, et leurs sels d'acides, de formule:

R 4 O

I a NH CHBNH c C NE 1-11 NB a x" H

0 3

dans laquelle: R 3 est la chalne latérale d'un groupe amino-acide

qui a la configuration L au carbone en alpha du groupe carbo-

nyle et qui n'est pas chargé positivement, et R 3 contient

de 2 à 8 atomes.

R 4 est la chaîne latérale d'un groupe amino-acide hdyrophobe qui a la configuration L à l'atome de carbone en alpha du groupe carbonyle, et R 4 a la formule suivante:

-CH 2 Y

dans laquelle Y est choisi dans le groupe constitué par les groupes alkyles inférieurs, phényles et phényles substitués et les groupes indole, X est un fragment de molécule indicateur pouvant être coupé par rapport au composé, et

Z est un groupe de blocage amino.

47 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que R 3 est o O

1

CH 2 -CH 2 CH 2 NH C NH 2

48 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que R 3 est NH I

CH 2 CH 2 -CH 2 -NH C NH NO 2

49 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que R 4 est

CH 2 C H

2 6 5

Composés selon la revendication 46, carac-

térisés en ce que R 4 est

CH 2 CH (CH 3)2

38 2545503

51 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que R 4 est H -C Hr È

52 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que R 4 est CH \ ca 3 53 Composés ce que R 4 est

selon la revendication 46, caracté-

CH CH CH

1 2 3 CH 3 54 Composés selon la revendication ce que R 4 est CH 2 C 6 H 5 et R 3 est

46, caracté-

CH 2 CH 2 -CH 2 NH C NH 2

Composés selon la revendication 46, caracté-

ce que R 4 est CH 2 -C 6 H 5 et R 3 est NH

CH 2 CH 2 CH 2 NH NH N 02

56 Composés selon la revendication 46, caracté-

ce que R 3 est CH 2 CH 2 CH 2 NH C NH 2 et I

3 2 2 2 2

R 4 est CH CH 3.

I CH 3

57 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que R est o

CH 2 -CH 2 CH 2 N C NH 2

et R 4 est

C H ÈH

risés en risés en risés en risés en

39 2545503

58 Composés selon la revendicatin 46, caracté-

risés en ce que R 3 est o

CH 2 -CH 2 CH 2 NH -C NH 2

et R 4 est

CH CH 2 CH 3

CH 3

59 Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que X est un fragment de molécule pouvant être

coupé dont la fluorescence change lors de la coupure.

Composés selon la revendication 46, caracté-

risés en ce que X est un fragment de molécule pouvant être coupé dont le spectre visible ou ultra-violet change lors

de la coupure.