NL8401375A

NL8401375A - Werkwijze ter bepaling van cathepsine b in aanwezigheid van andere proteolytische enzymen, en verbindingen die hier nuttig voor zijn.

Info

Publication number: NL8401375A
Application number: NL8401375A
Authority: NL
Original assignee: Kimberly Clark Co
Priority date: 1983-04-28
Filing date: 1984-05-01
Publication date: 1984-11-16
Also published as: DK201084D0; IT8448107A0; IT1182706B; AU2743284A; DE3415636A1; FI841686A; GB2140423A; GB8410841D0; SE8402305L; ES8604691A1; DK201084A; ES531962A0; KR850002289A; BR8401996A; SE8402305D0; FR2545503A1; FI841686A0

Description

» V *

Werkwijze ter bepaling van cathepsine B in aanwezigheid van andere proteolytische enzymen, en verbindingen die hier nuttig voor zijn.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het meten van cathepsine B activiteit in aanwezigheid van andere proteolytische enzymen, zoals trypsine. De uitvinding heeft verder betrekking op nieuwe substraten, die zeer specifiek zijn 5 voor cathepsine B. De werkwijze volgens de uitvinding is bijzonder nuttig voor het bepalen van abnormale niveaus van cathepsine B activiteit in lichaamsfluida, zoals mensenbloed en in lichaamsweefsels.

Proteïnasen zijn enzymen, die proteïne en poly-10 peptideketens verteren. Deze enzymen zijn zeer selectief voor splitsingsplaatsen van de polypeptisesubstraten. Deze enzymactivi-teit wordt zeer nauwkeurig geregeld in een normaal biologisch systeem. Een verbreking van deze regeling kan leiden tot ernstige biologische consekwenties. Talrijke ziektetoestanden worden toege-15 schreven aan dergelijke verbrekingen of verstoringen in de activiteit van proteïnases (zie A.J. Barrett, ed. (1979) Proteinases in Mammalian Cells and Tissues, North-Holland, New York; A.J. Barrett en J.K. McDonald (1980) Mammalian Proteases: A Glossary and Bibliography, deel 1, Academic Press, New York).

20 Cathepsine B is een normaal lysosomaal cysteine (thiol) proteinase. Onlangs is aangetoond (zie A.J. Barrett en J.K. McDonald, op. cit.; M. Sandler, ed. (1980) Enzyme Inhibitors as Drugs, University Park Press, Baltimore) dat een klaarblijkelijke verbreking van de regeling van cathepsine B activiteit kan 25 leiden tot een aantal ziektetoestanden. Verscheidene ziektes geassocieerd met collageen en structurele glycoproteïneafbraak zijn jn verband gebracht met toegenomen cathepsine B activiteit. In het 8401375 ϊ + Μ -2- bijzonder is een correlatie tussen cathepsine B activiteit en metastatische ziekte gesuggereerd door verscheidene onderzoekingen; waaronder de verhoging van cathepsine B of cathepsine B achtige activiteit in het bloed van patiënten met metastatische ziekte 5 (zie R.J. Pietras c.s. (19781 Obstet. Gynecol. 52; 321-327; R.J. Pietras, c.s. (1979) Gynecol. Oncol. 7; 1-171. Bijgevolg zal een methode voor de nauwkeurige en selectieve beproeving van cathepsine B activiteit in de lichaamsfluida van zoogdieren een nuttig diagnostisch hulpmiddel zijn, zoals het opsporen of het 10 in de gaten houden.

De beproeving van verscheidene enzymactiviteiten zijn routineprocedures in het klinisch laboratorium. Typisch bestaan dergelijke proeven uit het in contact brengen van het enzymebevattende monster met een synthetisch substraat (gedefini-15 eerd als de stof of verbinding waarop het enzyme inwerkt) dat selectief gesplitst wordt door dat enzyme in producten, die van kleur veranderen: enzyme substraat producten 20 (geen kleur) ^ (gekleurd) of

(gekleurdl (geen kleurI

Substraten voor cathepsine B zouden dus peptide 25 of peptideachtige verbindingen zijn, die bij splitsing analyse van de producten mogelijk maken. Proeven die gebruikt wordt voor cathepsine B (zoals besproken in A.J. Barrett, op.cit.; R.J. Pietras, op. cit; A.J. Barrett (19801. Biochem. J. 187: 909-9121 hebben peptidesubstraten omvat, waarin één of meer argi-3Q nyl of lysylaminozuren verbonden zijn met een door enzyme afsplits-bare indicatorgroep (bijvoorbeeld Bz-Arg-NA, CBZ-Lys-PNP, CBZ—Arg-Arg-MNA, CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC, CBZ-Phe-Arg-AMC; zie afkor- 8401375 •4 V' - - 3 - tingen hieronder). Hoewel de selectieve splitsing van synthetische substraten door cathepsine B nog niet geheel .£>e.grepen wordt, zullen deze op het ogenblik gebruikte substraten, vanwege de aard van hun positief geladen groepen, ook splitsbaar zijn door de 5 trypsineachtige (serine) proteasen. De cathepsine B proeven onder toepassing van één van deze lysyl of arginylsubstraten in zoogdier-lichaamsfluida worden dus bemoeilijkt door de aanwezigheid van overvloedige trypsineachtige proteasen. In het bijzonder is niet bekend hoe men een hoge specifiteit voor en opsporing van cathepsine 10 B activiteit kan bereiken in aanwezigheid van trypsine en trypsineachtige enzymen.

Het is daarom een doel van de uitvinding te voorzien in substraten, die zeer specifiek zijn voor cathepsine B.

Het is een ander doel van de uitvinding te voorzien in een selec-15 tieve proef op cathepsine B activiteit in aanwezigheid van andere proteolytische enzymen, bijvoorbeeld van trypsine. Het is nog een andere doel van de uitvinding cathepsine B activiteit te bepalen in zoogdierlichaamsfluida en weefsels. Verdere doeleinden van de uitvinding zullen duidelijk worden uit de volgende beschrijving.

20 De uitvinding voorziet in een werkwijze voor het beproeven van cathepsine B activiteit in zoogdierlichaamsfluida of weefsels door de snelheid te meten, waarmee een indicatorgroep (X) wordt vrijgemaakt bij splitsing van een synthetisch peptide-substraat, dat zeer selectief is voor cathepsine B. Substraten, 25 waarin geschikte indicatorgroepen zijn opgenomen, geschikt voor het bepalen van cathepsine B, hebben de algemene formule

Z-R2-Rj-X

30 en zouten ervan, waarin X een kern is, die afsplitsbaar is door cathepsine B aan de Rj-X binding en opspoorbaar is nafsplitsing, 8401375 4 9 - 4 -

Rj een aminozuurgroep is met de L-configuratie aan het a-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep (C ) en die niet positief geladen is binnen het pH-traject van de proef-omstandigheden, en die bij voorkeur een polaire zijketen heeft, 5 en waarin de zijketen bij voorkeur 2-8 koolstofatomen heeft, R£ een hydrofobe aminozuurgroep is, bij voorkeur fenylalanyl, met de L-configuratie aan het α-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep (C ), en die bij voorkeur een zij-keten heeft van de formule -CE^-Y, waarin Y gekozen is uit de 10 groep bestaande uit lager alkyl, fenyl, gesubstitueerd fenyl en indool, en Z een aminoblokkeringsgroep is, die de selectieve binding van cathepsine B aan de Rj en R2 groepen niet verstoort.

De volgende afkortingen worden in deze beschrij- 15 ving gebruikt:

Aminozuren (alle verondersteld L te zijn, tenzij anders vermeld)

Phe L-fenylalanyl

Cit L-citrullyl

Ala L-alanyl 20 Arg arginyl

Lys lysyl ω (IK^iArg N -nitroargmyl (Ts)Arg NW-tosylarginyl (of N^p-tolueensulfonylarginyl)

Trp tryptofyl 1 25 Met methionyl

Asp aspartyl (TFA)Lys Ne-trifluoracetyllysinyl (CBZ)Lys N -carbobenzyloxylysyl

Val valyl 30 Leu leucyl

Ile isoleucyl

Nala naftylalanyl 8401375 w * m P4 - 5 -

Amineblokkeringsgroepen CBZ carbobenzyloxy

Bz benzoyl t-BOC t-butyloxycarbonyl 5

Chromoforen en fluorofoxen AMC 7-amino 4-methylcumarine HMC 7-hydroxy 4-methylcumarine AFC 7-amino 4-trifluormethylcumarine 10 (PCT patent WO 80/02295) AQ 6-aminochinoline NA 2-naftylamine MNA 4-oethoxy 2-naftylamine PNP para-nitrofenol 15 PNA para-nitroaniline

Synthetische reagentia'én'oplosmiddelen TEA triethylamine DCC N ,N ’ -dicyclohexylcarbèèiimide 20 DMF N,N-dimethylformamide THF tetrahydrofuran DMSO dimethyl sulf oxyde HOAc azijnzuur HBr/HOAc azijnzuur verzadigd met HBr 25 Pd-PEI palladium polyethyleeniminekatalysator

Diversen EDTA ethyleendiaminetetraazijnzuur, dinatriumzout mmol millimolen 30 mm millimeter nm nanometer /o?*5 (DMF) optische rotatie bij 589 nm, 25°C, in DMF oplos middel 8401375 ψ - 6 -

Bis-Tris 2,2-bis(hydroxymethyl) 2,2’,2"-nitrilotriethanol HPLC hoge kwaliteitsvloeistofchromatografie onder toe passing van een Alltech (Deerfield, 111.) kolom van 4,6 x 250 mm, C18; stroomsnelheid 1 ml/min.; 5 detector: UV 340, 313, 280 en 254 nm.

Het oplosmiddel voor de mobiele fase, de verblijfduur en de benaderde zuiverheid zijn in elk voorbeeld weergegeven.

MS massaspectroscopie onder toepassing van een Micro 10 Mass VG7070H instrument met een snelle atoombom- bardement probe (9KV Xenon) en monster opgelost in DMSO/glycerol.

*H-NMR protonnucleaire magnetische resonantie bij een

Bruker 270 MHz instrument onder gebruikmaking van 15 dg-DMS0 oplosmiddel en tetramethylsilan als een interne standaard bij een chemische verschuiving (δ) van 0,0. De chemische verschuivingen o, de pieksplitsing: s = single, d = doublet, t = triplet, q = quartet, qn = quintet, se = sextet, 20 c = complex multiplëtjen het aantal protonen (lp = 1 proton) zijn weergegeven bij elk voorbeeld.

MP smeltpunt (ongecorrigeerd, Fisher-Jofess apparaat) HPLC(Prep) hoge kwaliteitsvloeistofchromatografie onder toe passing van een Alltech (Deerfield, 111.) kolom 25 van 10 x 250 mm, C18, stroomsnelheid 2 ml/min.; detector: UV 340 nm. Het mobiele faseoplosmiddel en de verblijfsduur zijn weergegeven in elk voorbeeld.

De peptidesubstraatverbindingen worden gedefinieerd 30 onder gebruikmaking van de volgende correlaties van de formule aan de structuur voor de duidelijkheid. De algemene formule is als volgt: 8401375 - 7 -

Z - R2 - Rj - X

De structurele formule hiervan is weergegeven op het formuleblad als formule 1, waarin R^ de zijketen is voor de 5 Rj aminozuurgroep, en R^ de zijketen voor de R2 aminozuurgroep.

X is een kern, die afsplitsbaar is door cathepsine B aan de Rj-X binding en die gemeten kan worden na afsplitsing. Voorbeelden van X zijn AMC, AFC, AQ, BMC, PNP, RNA.

Onder zouten van deze verbindingen vallen alle 10 kristallisatiezouten, zoals het geval zou kunnen zijn indien X was AQ en deze kern het hydrochloridezout vormt.

Rj is een aminozuurgroep met de L-configuratie aan het met tXj aangeduide koolstofatoom, dat niet positief geladen is onder de omstandigheden van de proef. De Rj aminozuurgroep moet 15 bijvoorbeeld niet positief geladen zijn in het pH-traject van 4-8.

Rg is een zijketen van Rj, bij voorkeur met 2-8 koolstof atomen. Voorbeelden ervan zijn -CH^ indien Rj = Ala, een groep van de formule 2, indien Rj * (NC^) Arg, een groep van de formule 3, indien Rj - Cit, een groep van de formule 4, indien Rj 20 * (Ts) Arg, en een groep van de formule 5, indien Rj = (TFA) Lys.

De L-configuratie is nodig voor het binden van cathepsine B. Het doel van het uitsluiten van positief geladen groepen is potentiële reacties met trypsineachtige enzymen te vermijden, die de besproeving of opsporing zouden verstoren.

25 R^ is een hydrofobe aminozuurgroep, bij voorkeur

Phe, met de L-configuratie aan het koolstofatoom. De L-confi guratie is nodig voor het binden van cathepsine B. De hydrofobe aminozuurgroep bevordert ook de binding van het substraat aan cathepsine B.

30 R^ is een zijketen van R2, bij voorkeur van de formule 8401375 - 8 - -ch2-y waarin Y een alkylgroep is met 1-8 koolstofatomen, fenyl, gesubstitueerd fenyl of indolyl. Voorbeelden van R^ zijn onder andere 5 die van de formule 6, indien R2 = Trp, -CH2“C^i indien R2 = Phe, -CH2-CH-(CH^)2’ inzien R2 = Leu, en —CH—(CH^)£> indien R2 = Val.

Z is minder belangrijk dan Rj en R2, maar is nuttig voor het maken van kleine veranderingen in affiniteit van de verbinding voor cathepsine B. Deze Z-groep kan een eenvoudige 10 aminobeschermende groep zijn, zoals CBZ, BOC of Bz. Ook kan Z een andere geblokkeerde aminozuurgroep zijn, zoals CBZ -£fcfl) Ala.

In ieder geval mag de Z-groep niet tussenbeide komen bij de selectieve binding van cathepsine B aan de Rj en R2 groepen.

De chemische structuren voor de peptides, die be-15 sproken worden in deze beschrijving en verschijnen in de voorbeelden, zijn als volgt: »

No. Verbinding Of substraat 1. CBZ - Phe - Cit - AMC van de formule 7 20 2. CBZ - Leu- Cit- AMC van de formule 8 3. CBZ - He - Cit - AMC van de formule 9 4. CBZ - Val - Cit - AMC van de formule 10 5. CBZ - Trp - Cit - AMC van de formule 11 6. CBZ - Phe - Ala - AMC van de formule 12 25 7. CBZ - Val - Ala - AMC van de formule 13 8. CBZ - Trp - Ala - AMC van de formule 14 9. CBZ - Phe - (N02) Arg - AMC van de formule 15 10. 11. CBZ - (DcfL) - Ala - Phe - Cit - AMC van de formule 16 12. CBZ - Phe - Met - AMC van de formule 17 30 13. CBZ - Phe - (Ts) Arg- AMC van de formule 18 14. CBZ - Phe - (CBZ) Lys - AMC van de formule 19 15. CBZ - Phe - (TFA) Lys - AMC van de formule 20 8401375 - 9 - 16. CBZ - Phe - Trp - AMC van de formule 21 17. CBZ - Nala - Cit - AMC van de formule 22 18. CBZ - Phe - Arg - AFC van de formule 23 19. CBZ - Ala - Arg - Arg - AFC van de formule 24 5 20. BZ - Val - Lys - Lys - Arg - AFC van de formule 25

De synthese van de peptidesubstraten kan worden uitgevoerd op talrijke in het algemeen aanvaarde peptidesynthese-methoden. Ter illustratie volgen drie van deze syntheses: 10

Methode A: de groep Z-R2 wordt gekoppeld aan de Rj-X groep door het DCC gemengde anhydride of andere typische koppe-lingsmethode.

Methode Bt het te voren gesynthetiseerde complete peptide Z-R^-Rj 15 wordt gekoppeld aan de indicatorgroep X onder gebruik making van het DCC, gemengde anhydride of andere aanvaardbare koppelingsmethode.

Methode C; achtereenvolgende koppeling van de groepen Z, R2, Rj wordt gevolgd door de koppeling van de indicatorgroep 20 X onder toepassing van het DCC gemengde anhydride of andere aanvaardbare koppelingsmethode.

De algemene procedures voor de meeste van de in de voorbeelden beschreven verbindingen zijn hieronder aangegeven en 25 volgen de algemene methode A: 1. Rj Of R2 + CBZ - Cl —b-— CBZ - Rj of R2

2. CBZ - R, + AMC CBZ - RT - AMC

I anhydride I

30 VH /Pd

3. CBZ - R, - AMC a-feTBSSW - R1 ' “C

4. CBZ - R2 + H2H - R - AMC g^ff&CBZ - R., - Rj - AMC

8401375 - 10 - waarin Rj en R£ verschillende aminozuren voorstellen in de algemene formule, en GBZ wordt gebruikt voor Z en AMC voor X, Gemengd anhydride slaat op het type koppelingsprocedure. De details van reactie 1-4 volgen hieronder.

5 (1) CBZ-C1 reactie: in sommige gevallen zijn de CBZ-R derivaten in de handel verkrijgbaar, in andere worden zij bereid op de volgende wijze: men lost het aminozuur R (25 mmolen) en 50 mmolen natriumbicarbonaat op in 50 ml water in een kolf van 100 ml. Men 10 voegt 27,5 mmol carbobenzyloxychloride toe onder roeren bij kamertemperatuur in 5 porties in de loop van 1 uur. Nadat men de oplossing heeft geroerd gedurende nog 2 uur, extraheert men tweemaal met ether en laat dan druppelen in 100 ml 1M zoutzuur. Het product slaat eerst neer als een halfvaste stof en wordt daarna vast bij 15 staan. Men wast het ruwe product met water, droogt en gebruikt zonder verdere zuivering. De gemiddelde opbrengst is 55%.

• (2) AMC-kóppeling: in een kolf van 50 ml doet men 11,4 mmol geblokkeerd Rj-aminozuur, 15 ml watervrije THF en 11,54 mmol TEA. Nadat 20 de verbinding is opgelost, koelt men de oplossing op ijs, en voegt 11,4 mmol isobutylchloorformiaat toe. Men roert de oplossing gedurende 10 minuten op ijs, en voegt dan een gekoelde oplossing toe van 11,4 mmol AMC in 21 ml DMF. Men zet het roeren op ijs nog gedurende 1 uur voort en daarna bij kamertemperatuur gedurende de 25 nacht. Men filtreert het reactiemengsel en verwijdert het THF uit het filtraat op een roterende verdamper. Men voegt het residu toe aan een scheidsrechter van 125 ml samen met 20 ml en 30 ml 10%’s waterig zoutzuur en schudt krachtig. Na extraheren van de organische fase met een tweede portie waterig zuur, slaat het pro-30 duet in de organische fase neer. Men decanteert de waterige fase en verzamelt het neerslag door filtratie en wast met ether. Men droogt het product en gebruikt het zonder verdere zuivering. De 8401375 - 11 - gemiddelde opbrengst is 41%.

(3) Deblokkering: Men verwijdert de N-carbobenzyloxyblokkerxngs-groep uit Z-Rj-AMC hetzij door behandeling met een broomwaterstof/ 5 ijsazijnoplossing of katalytische hydrogenering. In twee voorbeel den gebruikt men -t-BOC in plaats van CBZ en voert de deblokkering uit door behandeling met mierenzuur.

HBr/HOAc; aan een kolf van 500 ml voegt men 3,8 mmol Z-R^-AMC en 70 ml 33% HBr/HOAc toe. Nadat het monster is opgelost, roert men 10 de oplossing nog gedurende 15 minuten. Men verdunt het reactie- mengsel met 500 ml ether en verzamelt het verkregen neerslag door filtratie onder stikstof. Men brengt het product weer driemaal in suspensie in 100 ml ether en filtreert. Men droogt het product en het gebruikt1, zonder verdere zuivering. De gemiddelde opbrengst is 98%.

15 Katalyt is che hydro genering : &an een drukkolf van 500 ml voegt men 8,5 mmol Z-Rj-AMC, 4 g palladium-polyethyleenimineparels (Pd-PEX) en 200 ml methanol toe. Men zet de kolf onder druk van 140 kPa waterstof en schudt gedurende 6 uren, en laat daarna nog gedurende 18 uren staan. Nadat de katalysator zich heeft afgezet, decanteert 20 men de alkohol en wast de parels tweemaal met 5 ml methanol.

Om de zuivering te helpen bereidt men het hydrochloridezout door toevoegen van 12,5 ml IN waterig zoutzuur. Men verwijdert het oplosmiddel in vacuo en lost het residu weer tweemaal op en verdampt het weer met 50 ml gedenatureerde alkohol. Men verwrijft het residu 25 met gedenatureerde alkohol en laat staan gedurende de nacht. Men verzamelt het product, Rj-AMC door filtratie, wast met gedenatureerde alkohol, droogt in vacuo en gebruikt zonder verdere zuivering. De gemiddelde opbrengst is 78%.

Mierenzuur: Aan een kolf van 500 ml voegt men 1,75 mmol t-B0C-Rj-AMC 30 en 30 ml 97% mierenzuur toe. Nadat de verbinding is opgelost, roert men de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Hieraan voegt men 250 ml ether en 0,2 ml geconcentreerd zoutzuur (om 3 A Π * 1 Ί 3

Sb 1# ' V' - 12 - het HCl-zout te vormen) toe. Men filtreert het witte neerslag af en wast met ether. Na drogen in vacuo gebruikt men het product zonder verdere zuivering.

5 (4) Peptidékoppeling: éan een kolf van 50 ml voegt men 3,2 mmol

Rj-AMC . HBr (of HC1), 25.ml watervrije DMF en 3,2 mmol TEA toe.

Aan een tweede kolf van 50 ml voegt men 3,2 mmol CBZ-R^j 10 ml watervrije DMF en 3,2 mmol TEA toe. Nadat de verbindingen zijn opgelost, -fee;lt men beide oplossingen op ijs, en voegt 3,2 mmol iso-10 butylchloorformiaat toe aan de CBZ-R^ oplossing. Men roert dit reactiemengsel gedurende 10 minuten op ijs, en voegt de gekoelde Rj-AMC oplossing dan toe aan het CBZ-R2 reactiemengsel. Men zet het roeren nog 1 uur op ijs voort en daarna gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Men laat het reactiemengsel dan druppelen in 15 950 ml 5%Ts natriumbicarbonaat in water onder roeren. Men verzamelt het neerslag door filtratie en wast driemaal met water. De gemid-* delde ruwe opbrengst is 90%.

Zuivering; De eindproducten worden gezuiverd door de volgende kristallisatie en in sommige gevallen aanvullende kristallisaties en 20 HPLC. Het CBZ - R2 - Rj - AMG product (2,9 mmol) lost men op in 35 ml ijsazijn onder roeren en zacht verwarmen. Hieraan voegt men 54 ml acetonitril toe en kookt deze oplossing aan een terugvloei-koeler. Men filtreert de hete oplossing en voegt 80 ml water toe aan het filtraat in kleine porties onder verwarming en roeren. Er 25 vormt zich een wit neerslag bij afkcTeling, dat men filtreert en wast met water. Men droogt het geherkristalliseerde product in vacuo en de gemiddelde kristallisatie-opbrengst is 80%. De totale opbrengst en synthetische veranderingen zijn hieronder voor elk voorbeeld weergegeven.

8401375 Λ, 4 - 13 -

Beproeving

De activiteit van cathepsine B wordt nagegaan door de vrijkomingssnelheid van indicatorgroep X op de voet te volgen.

5 De indicatorgroep kan een kern zijn, waarvan de fluorescentie of absorptie verandert bij afsplitsing. Elk van de bekende indicatoren, zoals AMC, HMC, AFC, AQ of PNA kunnen worden gebruikt. Anderzijds kan men een radioactief gemerkte indicator gebruiken.

De beproevingsprocedures voor dit enzyme, cathep-10 sine B, volgen de standaardprocedures en algemene principes, die aanvaard zijn voor enzymen (zoals beschreven in A.J. Barrett, op. cit.; W.P. Jencks (1969) Catalysis in Chemistry and Enzymology, McGraw Hill, New York). Er wordt een stationaire kinetische toestand ingesteld onder gebruikmaking van geschikte enzyme/substraat 15 concentratieverhoudingen (de substraatconcentratie en de Michaelis constante ervan overschrijden die van de enzymeconcentratie sterk) om zo nauwkeurig mogelijke snelheidsinformatie te verkrijgen in de kortst mogelijke laboratoriumtijd.

De bepaling van de cathepsine B activiteit wordt 20 uitgevoerd door een kleine hoeveelheid van een lichaamsfluïdummon-ster (1-50 microliter) toe te voegen aan een waterige oplossing met een pH, waarbij cathepsine B actief is, gewoonlijk pH 5-6,5, bij voorkeur pH 5,5, die EDTA en een thiolactivator (biologisch antioxydant of ander geschikt reductiemiddel) zoals cysteine of 25 dithiothreïtol bevat. Na een korte activeringsperiode, zoals 1-2 minuten, voegt men het substraat, opgelost in een verenigbaar oplosmiddel, zoals methanol, ethanol, acetonitril of DMF, toe in een klein volume (20 microliter) zodanig dat de concentratie van het substraat aanzienlijk groter is dan de enzymeconcentratie (bij 30 voorkeur tenminste 100 maal). De temperatuur wordt ingesteld op een vast punt, bij voorkeur in het traject van kamertemperatuur tot ongeveer 37°C. Nadat het monster en het substraat zijn gemengd, 8401375 - 14 - kan de concentratie aan afgesplitste indicator worden gemeten mettertijd in een spectrofotometer, spectrofluorometer of oplichtings-teller of andere bekende organen, die wel bekend zijn in de techniek en geen deel van de uitvinding uitmaken.

5 Men maakt een standaardkromme van bekende vrije indicatorconcentraties om een schaal te hebben ter vergelijking met onbekende monsters. De berekeningen zullen als volgt zijn voor een fluorescente indicator:

10 Vergelijking 1; A . B - C

specifiek (A f luorescentie-eenheden/min ) (B , , , \ = N / fluorescentie-eenheden' 15 (C yM indicator/min.) waarin A is verkregen uit de meting met hét monster, B uit de standaardkromme en G het resultaat is. De term πμΜη slaat op micromolen per liter. Op dergelijke wijze worden berekeningen ge-20 maakt bij andere indicatoren. Deze berekeningen leveren een snelheid uitgedrukt in concentratie van de vrije indicatorgroep X en de verandering ervan mettertijd. Deze snelheid kan direct in verband worden gebracht met de snelheid van de substraatafsplitsing door het enzyme en dus kan de mate^enzyme-activiteit hieruit worden 25 afgeleid.

De uitvinding zal nu op niet-beperkende wijze meer in detail worden toegelicht met de volgende voorbeelden:

Substraatsyiitheses 30

Voorbeeld 1: men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC zoals in detail uiteengezet in bovengenoemde trappen 1-4 waarbij men de kataly- 8401375 - 15 - tische hydrogeneringsdeblokkering gebruikt in trap 3 en herkris-talliseert uit 17 ml HOAc, 74 ml CH„CN, 140 ml H„0 per gram. De J ΛΡ * totale opbrengst is 14%. MP = 227-230 C. /Ü7^ (DMF) = -22,77 . HPLC (70% CH30H/30% H20) 9,6 min., 97,3%.

5 ÏH-NMR: δ 1,30-1,55, c, 2p; δ 1,55-1,81, c, 2p; δ 2,40, 3, 3p; θ 2,75, t, lp; δ 2,90-310, c, 3p; δ 4,28-4,40, c, lp; δ 4,40-4,51, c, lp; δ 4,94, s, 2p; δ 5,43, s, 2p; δ 6,00, t, lp; δ 6,28, s, lp; δ 7,10-7,39, c, ΙΟρ; δ 7,48, d, lp; δ 7,51, d, lp; δ 7,80, d, lp; δ 8,35, d, lp; δ 10,51, s, lp. MS; moedermolekuulion » 614.

10 Elementair analyse

Berekend voor ^33^35^5^7* C 64,59%, H 5,75%, N 11,41%

Gevonden C 64,81%, H 5,77%, N 11,61%

Voorbeeld 2: men synthetiseert CBZ-L-Leu-L-Cit-AMC zoals in detail 15 beschreven in de bovengenoemde trappen 1-4 onder toepassing van de katalytische hydrogeneringsdeblokkering in trap 3, en herkris-tallisatie uit 17 ml HOAc, 36 ml CH^CN, 136 ml H^O per gram. De totale opbrengst is 19%. Iff = 196-198°C. /a/^ (DMF) = -25.79°. HPLC, (45% CH3CN/55% H20) 9,8 min., 99,9%.

20 ÏH-HMR: δ 0,87, 2d, 6p; δ 1,44, t, 3p; δ 1,54-1,77, c, 4p; δ 2,39, s, 3p; δ 2,86-3,10, c, 2p; δ 4,10, q, lp; δ 4,43, q, lp; δ 5,04, s, 2p; δ 5,42, s, 2p; δ 5,98, t, lp; δ 6,27, s, lp; δ 7,24-7,53, c, 7p; δ 7,72, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 8,16, d, lp; δ 10,46, s, lp.

MS: moedermolekuulion - 580.

25 Elementair analyse

Berekend voor C^H^H^Oyï C 62,16%, H 6,43%, N 12,08%

Gevonden C 62,59%, H 6,50%, N 12,06%

Voorbeeld 3; Men synthetiseert CBZ-L-Ile-L-Cit-AMC als in detail 30 beschreven in de bovengenoemde trappen 1-4 onder toepassing van de katalytische hydrogeneringsdeblokkering in trap 3, en herkris-tallisatie uit 20 ml HOAc, 34 ml CH3CH, 54 ml H20 per gram. De 8401375 * · - 16 - totale opbrengst is 19%. MP = 240-242°C. /a/j^ (DME) = -28.16°.

HPLC (50% CH3CN/50% H20) 7,1 min., 91,8%.

]H-NMR: δ 0,73-0,93, c, 6p; δ 1,00-1,80, c, 7p; δ 2,40, s, 3p; δ 2,86-3,12, c, 2p; δ 3,96, t, lp; δ 4,43, q, lp; δ 5,05, s, 2p; 5 δ 5,43, s, 2p; δ 5,99, t, lp; δ 6,27, s, lp; δ 7,25-7,42, c, 6p; δ 7,49, d, lp; δ 7,72, d, lp; 6 7,78, s, lp; δ 8,20, d, lp; δ 10,46, s, lp.

MS: moeder molekuulion = 580.

Elementair analyse 10 Berekend voor ConH__Nc0,: C 62,16%, H 6,43%, N 12,08% JU J/ Dl

Gevonden C 62,24%, H 6,36%, N 12,14%

Voorbeeld 4: Men synthetiseert CBZ-L-Val-L-Cit-AMC zoals in detail beschreven in de bovengenoemde trappen 1—4 waarbij men de kataly-15 tische hydrogeneringsdeblokkering gebruikt in trap 3 en herkris-talliseert uit 24 ml HOAc, 75 ml CH^CN, 128 ml H^O per gram. De totale opbrengst is 16%. MP » 244.247°C. /Ü7p5 (DMF) = -27,36°.

HPLC 835% CH3CN/65% H20) 17,1 min., 93,8%.

^H-NMR: δ 0,73-1,0, c, 6p; δ 1,30-1,54, c, 2p; δ 1,54-1,83, c, 2p; 20 δ 1,83-2,10, c, lp; δ 2,40, s, 3p; δ 2,83-3,12, c, 2p; δ 3,94, t, lp; δ 4,43, q, lp; δ 5,05, s, 2p; δ 5,42, s, 2p; δ 5,98, t, lp; δ 6,28, s, lp; δ 7,20-7,43, c, 5p; δ 7,44-7,49, c, 2p; δ 7,72, d, lp; δ 7,77, d, lp; δ 8,19, d, lp; δ 10,46, s, lp.

''MS; moeder molekuulion « 566.

25 Elementair analyse

Berekend voor ^29^35^5^7: C 61,58%, H 6,24%, N 12,38%

Gevonden C 61,86%, H 6,27%, N 12,44%

Voorbeeld 5: Men synthetiseert CBZ-L-Trp-L-Cit-AMC als in detail 30 beschreven in de bovengenoemde trappen 1-4 onder toepassing van de katalytische hydrogeneringsdeblokkering in trap 3, en herkris-tallisering uit 16 ml HOAc, 37 ml CH3CN, 96 ml per gram. De 3401375 * ψ - 17 - totale opbrengst is 17%. MP = 235-238°C. (DMF) = -23,75°.

HPLC: (45% CH3CN/55% H20), 5,2 min., 95,6%.

]H-NMR: δ 1,30-1,54, c, 2p; δ 1,54-183, c, 2p; δ 2,40, s, 3p; δ 2,82-3,40, c, 4p; δ 4,33-4,54, c, 2p; δ 4,96, s, 2p; δ 5,43, s, 5 2ρ; δ 5,99, t, Ip; δ 6,27, s, lp; δ 6,95, t, lp; δ 7,05, t, Ip; δ 7,10-7,45, c, 8p; δ 7,50, d, lp; δ 7,65, d, lp; δ 7,73, d, lp; δ 8,33, d, lp; θ 10,49, s, lp; δ 10,79, s, lp, MS; moeder molekuulion = 653.

Elementair analyse 10 Berekend voor C^H^NgO^ C 64,41%, H 5,56%, N 12,88%

Gevonden C 64,46%, H 5,48%, N 12,94%

Voorbeeld 6: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-Ala-AMC als in detail beschreven in de bovengenoemde trappen 1-4 onder toepassing van 15 de katalytische hydrogeneringsdeblokkering in trap 3 en herkristal-lisatie uit 18 ml HOAc, 27 ml CH^CN, 29 ml K^O per gram. De totale opbrengst is 31%. Iff =.232-234°C. [ÖJ^ (DMF) = -23.41°.

HPLC; (55% CH3CN/45% H20), 6,8 min., 98,2%.

*H-HMR; δ 1,36, d, 3p; δ 2,40, s, 3ρ; δ 2,74, t, lp; δ 2,98-3,13, 20 c, lp; δ 4,33, c, lp; δ 4,46, c, lp; δ 4,94, s, 2p; δ 6,28, s, lp; δ 7,12-7,40, c, ΙΟρ; δ 7,44-7,56, c, 2p; δ 7,74, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 8,40, d, lp; δ 10,43, s, lp.

MS; moeder molekuulion — 528.

Elementair analyse 25 Berekend voor C^H^l^Og: C 68,30%, H 5,54%, N 7,96%

Gevonden C 68,57%, H 5,68%, N 7,96%

Voorbeeld 7; Men synthetiseert CBZ-L-Val-L-Ala-AMC als beschreven in de trappen 1-4 hierboven onder toepassing van de katalytische 30 hydrogeneringsdeblokkering van trap 3 en herkristalliseert uit 100 ml HOAc, 104 ml CH3CN, 67 ml H20 per gram. De totale opbrengst is 31%. m = 260-2S5°C. (DMF) - -34.51°. HPLC (45% CH.CN/ 8401375 ·, 1 - 18 - 55% H20) 6,8 min., 98.7%.

]H-NMR: δ 0,82-0,96, c, 6p; δ 1,33, d, 3p; δ 1,88-2,07, c, lp; δ 2,40, s, 3ρ; δ 3,92, t, lp; δ 4,44, c, lp; δ 5,05, s, 2p; δ 6,28, s, lp; δ 7,26-7,42, c, 5ρ; δ 7,45-7,52, c, 2p; δ 7,73, d, lp; 5 δ 7,76, d, lp; δ 8,25, d, lp; δ 10,39, s, lp.

MS: moeder molekuulion = 480.

Elementair analyse

Berekend voor : C 65,12%, H 6,10%, N 8,76%

Gevonden C 65,59%, H 6,02%, N 8,79% 10

Voorbeeld 8: Men synthetiseert CBZ-L-Trp-L-Ala-AMC als beschreven in de bovengenoemde trappen 1-4 onder toepassing van de katalytische hydrogeneringsdeblokkering van trap 3 en herkristalliseert uit 33 ml HOAc, 47 ml CH^CN, 44 ml l^O per gram. De totale opbrengst 15 is 17%. MP = 248-253°C. /a7^5 (DMF) = -16,55°. HPLC (45% CH^N/ 55% H2O), 13,8 min., 93,4%.

^-NMR: δ 1,34, d, 3ρ; δ 2,40, s, 3p; δ 2,94, c, lp; δ 3,08-3,22, c, lp; δ 4,36, se, lp; δ 4,45, t, lp; δ 4,95, s, 2p; δ 6,26, s, lp; δ 6,95, t, lp; δ 7,05, t, lp; δ 7,10-7,40, c, 8p; δ 7,50, d, 20 lp; δ 7,66, d, lp; δ 7,72, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 8,36, d, lp; δ 10,38, s, lp; δ 10,79, s, lp.

MS; moeder molekuulion = 567.

Elementair analyse

Berekend voor ^32^30^4^61 ^ 67,83%, H 5,34%, N 9,89% 25 Gevonden G 68,00%, H 5,42%, N 9,96%

Voorbeeld 9: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-(N02)Arg-AMC als beschreven in trap 1-4 hierboven onder toepassing van de HBr/HOAc deblokkering van trap 3, en herkristalliseert uit 8 ml HOAc, 16 ml 30 CH^CN, 15 ml H2Q per gram. De totale opbrengst is 20%. Iff = 150-160°C (dec.). /Ü7^5 (DMF) = -3,80°.‘HPLC (55% CH3CN/45% H20) 8,8 min., 95.6%.

9401375 - 19 - *H-NMR: δ 1,4-1,9, c, 4ρ; δ 2,4, s, 3ρ; δ 2,7-3,1, c, 2ρ; δ 3,19, c, 2ρ; δ 4,34, c, lp; δ 4,45, e, lp; δ 4,95, s, 2ρ; δ 6,28, s, lp; δ 7,10-7,42, c, 13ρ; δ 7,49, d, 2ρ; δ 7,74, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 8,34, d, lp; δ 10,49, s, lp.

5 MS: moeder molekuulion = 658.

Elementair analyse

Berekend voor : C 60,27%, H 5,36%, N 14,91%

Gevonden C 60,03%, H 5,41%, N 15,09% 10 Voorbeeld 10: Men synthetiseert CBZ-L-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC uit het CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC (voorbeeld 1) door deblokkering met HBr/HOAc als in trap 3 hierboven, gevolgd door peptidekoppeling van het reactieproduct met CBZ-L-Ala als in trap 4 hierboven. Men herkris-talliseert het eindproduct uit 34 ml HOAc, 44 ml GH^CN, 273 ml 15 H2O per gram en verder gezuiverd voor enzymatische analyse door HPLC (Prep., 45% CH0CN/55% Ho0, 20 min.). De totale ruwe opbrengst , is 40%. MP = 236-240 C. /07^ (DMF) = -39,91°. HPLC (60% CH3CN/ 40% H20) 6,5 min., 92,1%.

*H-NMR: δ 1,14, d, 3p; δ 1,28-1,54, c, 2p; δ 1,54-1,83, c, 2p; 20 δ 2,42, s, 3p; δ 2,73-3,14, c, 4p; δ 4,02, t, lp; δ 4,44, q, lp; δ 4,56, c, lp; δ 5,00, q, 2p; δ 5,43, s, 2p; δ 5,99, t, lp; δ 6,28, s, lp; δ 7,08-7,40, c, ΙΟρ; δ 7,45, d, lp; δ 7,53, d, lp; δ 7,74, d, lp; δ 7,79, d, lp; δ 7,90, d, lp; δ 8,28, d, lp; δ 10,44, s, lp.

MC: moeder molekuulion - 685.

25 Elementair analyse

Berekend voor C36H40N608: C 63,15%, H 5,89%, N 12,27%

Gevonden C 63,10%, H 5,91%, N 12,15%

Voorbeeld 11: Men synthetiseert CBZ-D-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC op de-30 zelfde wijze als in voorbeeld 10 onder gebruikmaking van CBZ-D-Ala en L-Phe-L-Cit-AMC bij de eindpepetidekoppeling. Men herkristalli-seert het eindproduct uit 13 ml HOAc, 36 ml CHgCN, 173 ml H^O per «4 013 75 - 20 - gram en verder gezuiverd voor enzymatische analyse door HFLC (Prep., 45% CHgCN/55% 1^0, 20 min.)« De totale opbrengst is 34%.

MP = 194-196°C. /Ü7^5 (DMF) = -17,89°. HPLC (60% CH3CN/40% H20) 6,5 min., 88,4%.

5 *H-NMR: δ 0,98, d, 3ρ; δ 1,28-1,56, c, 2p; δ 1,56-1,88, c, 2p; δ 2,41, s, 3ρ; δ 2,78-3,20, c, 4p; δ 4,03, t, lp; δ 4,44, c, lp; δ 4,58, c, lp; δ 4,95, q, 2p; δ 5,42, s, 2p; δ 6,00, t, lp; δ 6,28, s, lp; δ 7,10-7,38, c, lOp; δ 7,44, d, lp; δ 7,54, d, lp; δ 7,73, d, lp; d 7,80, d, lp; δ 8,19, d, lp; δ 8,24, d, lp; δ 10,32, s, 10 lp.

MS: moeder molekuulion = 685.

Elementair analyse

Berekend voor C^H^NgOg! C 63,15%, H 5,89%, N 12,27%

Gevonden C 62,97%, H 5,91%, N 12,20% 15

Voorbeeld 12: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-Met-AMC als uiteengezet in bovengenoemde trappen 1-4 onder toepassing van de HBr/HOAc deblokkering van trap 3 en herkristalliseert uit 3 ml HOAc, 10 ml CHgCN, 4ml 1^0 per gram en verder gezuiverd door HPLC (Prep., 20 60% CHgCN/40% H20, 15 min.) voor enzymatische beproeving. De tota le opbrengst is 16%. iff = 202-209°C. h7^5 (DMF) = -3,79°. HPLC (45% CHgCN/55% H20) 17,3 min., 85,2%.

*H-NMR: 6 1,85-2,20, c, 2p; δ 2,07, s, 3p; δ 2,35-2,62, c, 2p; δ 2,42, s, 3p; δ 2,76, t, 2p; δ 4,34, c, lp; δ 4,53, c, lp; δ 4,96, 25 s, 2p; δ 6,28, s, lp; δ 7,14-7,39, c, ΙΟρ; δ 7,50, d, 2p; δ 7,74, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 8,36, d, lp; δ 10,48, s, lp.

MS » moeder molekuulion = 588.

Eleméntair analyse

Berekend voor : ^ 65,40%, H 5,66%, N 7,15%, S 5,46% 30 Gevonden C 65,76%, H 5,77%, N 7,09%, S 5,45% a λ o 1 ;> 7 j * - 21 -

Voorbeeld 13: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-(Ts) Arg-MC als in de trappen 2-4 uitgaande van a-t-BOC(Ts)Arg in plaats van het a-CBZ derivaat van trap 2. Men verwijdert de α-t-BOG groep door mierenzuur als bovenbeschreven met een opbrengst van 17%. De totale ruwe 5 opbrengst is 9,2% en men zuivert dit materiaal verder door HPLC (Prep., 75% CHgOH/25% E^O, 20 min.). MP = 118-125°C.

Zi/β5 + 7»°°* HPLC (65% CH3CN/35% HgO) 11,3 min., 90,9%.

*H-MMR: δ 1,29-1,58, c, 2p; d 1,58-1,86, c, 2ρ; δ 2,28, s, 3p; δ 2,40, s, 3p; δ 2,74, t, lp; δ 2,92-3,20, c, 3p; δ 4,24-4,52, c, 10 2p; d 4,95, s, 2p; δ 6,28, s, lp; δ 6,43-7,11, c, 3p; δ 7,11-7,44, c, I4p; δ 7,62, d, 2p; δ 7,75, d, lp; d 7,78, s, lp; δ 8,34, c, lp; δ 10,52, s, lp.

MS: moeder molekuulion = 767.

Elementair analyse 15 Berekend voor C^H^NgOgS: C 62,65%, H 5,52%, N 10,96%, S 4,18%

Gevonden C 62,04%, H 5,66%, N 10,90%, S 4,47%

Voorbeeld 14: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-(CBZ)Lys-AMC als beschreven in de trappen 2-4 uitgaande van a-t-BOC(CBZ)Lys in plaats 20 van het α-CBZ derivaat van trap 2. Men verwijdert de α-t-BOC groep door mierenzuur als boven beschreven meteen opbrengst van 83%. Men herkristalliseert uit 20 ml azijnzuur, 56 ml CELCN, 127 ml H„0 per rv ^ gram. De totale opbrengst is 39%. MP = 170-173 C. /a/ (DMF) = -4,28°. HPLC (45% CH3CN/55% H20) 15,3 min., 97,5%.

25 ÏH-NMR: δ 1,20-1,54, c, 4p; δ 1,54-1,82, c, 2p; δ 2,40, s, 3p; δ 2,76, t, 2p; d 2,88-3,09, c, 2p; d 4,28-4,48, c, 2p; d 4,96, d, 4p; δ 6,27, s, lp; δ 7,10-7,43, c, 17p; δ 7,49, t, lp; δ 7,77, s, lp; d 8,29, d, lp; δ 10,47, s, lp.

MS: moeder molekuulion =719.

30 Elementair analyse

Berekend voor C^jH^N^Og: C 68,51%, H 5,89%, N 7,79%

Gevonden C 68,23%, H 5,91%, N 7,69% 8401375 - 22 -

Voorbeeld 15: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-(TFA)Lys-AMC als beschreven in de trappen 1-4 onder toepassing van de katalytische hydrogeneringsdeblokkering van trap 3 en herkristalliseert uit 28 ml CH^CN per gram. De totale opbrengst is 9%.

5 MP * 208-210°C. /|7p5 (DMF) = -8,15°. HPLC (45% CH3CN/55% H20) 15,8 min., 80,4%.

!H-NMR; 6 1,20-1,45, c, 2p; δ 1,45-1,61, c, 2p; δ 1,61-1,85, c, 2p; δ 2,42, s, 3p; δ 2,75-3,06, c, 2p; δ 3,18, c, 2p; δ 4,28, se, lp; δ 4,48, q, lp, δ 4,95, s, 2p; δ 6,28, s, lp; δ 7,14-7,39, c, lOp; 10 6 7,44-7,54, c, 2ρ; δ 7,74, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 8,31, d, lp; δ 9,40, c, lp; δ 10,48, s, lp.

MS; moeder molekuulion e 681.

Elementair analyse

Berekend voor C25H35W4°7F3: c 61,76%, H 5,18%, N 8,23%, F 8,37% 15 Gevonden C 62,28%, H 5,38%, N 8,30%. F 8,06%

Voorbeeld 16: Men synthetiseert CBZ-L-Phe-L-Trp-AMC als beschreven in de trappen 1-4 hierboven onder toepassing van de katalytische hydrogeneringsdeblokkering van trap 3 en herkristalliseert uit 20 11 ml aazijnzuur, 11 ml CH^CN, 4 ml water per gram. De totale opbrengst is 31%. MP = 165-167°C. (DMF) = +51.89°. HPLC (45% CH3CN/55% H20) 16,2 min., 99,4%.

hpNMR: δ 2,40, s, 3p; δ 2,74, t, 2p; δ 2,83-3,30, c, 2p; δ 4,33, qn, lp; δ 4,76, q, 2p; δ 6,28, s, lp; δ 6,97, t, lp; δ 7,07, t, lp; 25 δ 7,12-7,38, c, 13p; δ 7,48, d, lp; δ 7,63, d, lp; δ 7,72, d, lp; δ 7,76, s, lp; δ 8,38, d, lp; δ 10,52, s, lp; δ 10,86, s, lp.

MS; moeder molekuulion = 643.

Elementair analyse

Berekend voor C^H^N^Og: C 71,01%, H 5,33%, N 8,72% 30 Gevonden C 71,21%, H 5,40%, N 8,72%

Voorbeeld 17: Men synthetiseert CBZ-L-Nala-L-Cit-AMC als in de 8401375 +· - - 23 - trappen 1-4 hierboven onder toepassing van de katalytische hydro-generingsdeblokkering vantrap 3 en herkristalliseert uit 40 ml azijnzuur» 86 ml CH^CN, en 92 ml water per gram. De totale opbrengst is 13%. MP - 225-227°C. [öf^ (DMF) = -20,3°. HPLC (60% CH3CM/40% 5 H20) 8,0 min., 99,9%.

1H-NMR; δ 1,30-1,56, c, 2p; 5 1,56-1,85, c, 2p; δ 2,40, s, 3p; δ 2,84-3,22, c, 4p; δ 4,38-4,57, c, 2p; δ 4,91, s, 2p; δ 5,43, s, 2pj δ 6,00, t, lp; δ 6,28, s, lp; δ 7,07-7,65, c, 12p; δ 7,74, d, lp; δ 7,78, d, lp; δ 7,92, d, lp; δ 8,22, d, lp; δ 8,34, d, lp; 10 δ 10,50, s, lp.

MS: moeder molekuulion - 664,

Elementair analyse

Berekend voor C^H^N^O^: C 64,59%, H 5,75%, N 11,41%

Gevonden C 64,68%, H 5,87%, N 11,40% 15

Voorbeelden van proeven

Men bereidt gezuiverd cathepsine B uit varkenslever en neoplastische mensenlever onder gebruikmaking van standaard 20 uitzoutprocedures. Men voert de proef uit onder toepassing van een 0,1M bis-tris acetaat of fosfaatbuffer met pH 5,5 en die ImM EDTA bevat. Men gebruikt 10 mmol cysteine als de thiolactivator en de buffer, die de activator bevat, wordt elke dag vers bereid.

Men mengt een klein volume (5 μΐ) monster, dat cathepsine B bevat, 25 met 585 μΐ 37°C verse buffer, die thiolactivator bevat, in een 5 x 5 mm fluorimeter cuvette en incubeert bij 37°C gedurende 2 minuten. Dan voegt men 20 μΐ substraat in DMF toe 'in een concentratie van 0,05-2 mM onder roeren. De toename in fluorescentie wordt nagegaan met de tijd bij 37°C gedurende verscheidene 30 minuten onder toepassing van een Perkin Elmer LS-5 spectrofluori- meter. Voor AMC is de excitatiegolflengte 350 nanometer, de emissie-golflengte 460 nanometer en voor AST is de excitatiegolflengte 8401375 - 24 - 385 nanometer en de emissiegolflengte 490 nanometer. De gebruikte fluorimeterinstellingen zijn: spleetbreedtes: 5 en 5 mm, filter-responsel en de schaalfactor wordt ingesteld op 0-1,0. De resultaten van de enzymatische wisselwerking met de substraatmonsters 5 1-17 en de commerciële standaard CBZ-Phe-Arg-AFC (voorbeeld 18), CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC (voorbeeld 19) en Bz-Val-Lys-Lys-Arg-AFC (voorbeeld 20) zijn weergegeven in tabel A:

Tabel A

10 V /K Rel. volg- max m

Vb. Verbinding_ cathepsine B Trypsine orde v. waarde 1 CBZ-L-Phe-L-Cit-AMC1 0,296 NR2 2 2 CBZ-L-Leu-L-Cit-AMC 0,116 NR 6 15 3 CBZ-L-Ile-L-Cit-AMC 0,126 NR 5 4 CBZ-L-Val-L-Cit-AMC 0,169 NR 3 5 CBZ-L-Trp-L-Cit-AMC 0,148 NR 4 6 CBZ-L-Phe-L-Ala-AMC 0,034 NR 13 7 CBZ-L-Val-L-Ala-AMC 0,018 NR 14 20 8 CBZ-L-Trp-L-Ala-AMC 0,069 NR 8 9 CBZ-L-Phe-L-(N02)Arg-AMC 1,025 NR 1 10 CBZ-L-Ala-L-Phe-L-Cit-AMC 0,105 NR 7 11 CBZ-D-Ala-L-Phe-L-C i t-AMC 0,062 NR 15 12 CBZ-L-Phe-L-Met-AMC4 0,614 NR 12 25 13 CBZ-L-Phe-L-(Ts)Arg-AMC4 1,575 NR 9 14 CBZ-L-Phe-L-(Z)Lys-AMC4 0,182 NR 11 15 CBZ-L-Phe-L-(TFA)Lys-AMC4 0,457 NR 10 16 CBZ-L-Phe-L-Trp-AMC 0,01 NR 17 17 CBZ-L-Nala-L-Ci t-AMC 0,01 NR 16 30 18 CBZ-Phe-Arg-AFC5 . 0,007 0,003 12 19 CBZ-Ala-Arg-Arg-AFC5 0,003 0,058 14 20 BZ-Val-Lys-Lys-Arg-AFC5 0,017 ... 0,077 13 8401375 - 25 - 1) AMC heeft een gevoeligheid van 0,049 μΜ/fluorescentie-eenheid en wordt gebruikt als B in vergelijking 1 voor deze berekeningen.

2) NR - geen reactie.

5 3) De volgorde is gebaseerd op de reactiesnelheid met cathepsine B (des te hoger de snelheid, des te lager de volgorde) en de reactiesnelheid met trypsine (des te hoger de snelheid, des te hoger de volgorde).

4) De relatieve waarde voor deze verbinding is afgenomen vanwege 10 de lage oplosbaarheid en de lage maximum snelheid.

5) AFC heeft een gevoeligheid van 0,009 μΜ/fluorescentie-eenheid en wordt gebruikt als B in vergelijking 1 voor deze berekeningen.

15 Uit deze gegevens blijkt, dat het duidelijk is dat de substraten 1-17 (tabel A) volgens de uitvinding een veel hogere mate van selectiviteit en gevoeligheid hebben voor opsporen van cathepsine B in aanwezigheid van trypsine dan de tegenwoordig gebruikte peptides, zoals de substraten 18-20 in tabel A of der-20 gelijke peptides met een positief geladen groep op de Rj-plaats (verbonden aan X). Daar de tryptische enzymen gewoonlijk gevonden worden in mensenbloed, verstoren deze enzymen de cathepsine B meting. De peptidesubstraten volgens de uitvinding vermijden of reduceren de verstoringsproblemen veroorzaakt door trypsineachtige 25 enzymen en doen de gevoeligheid voor cathepsine B toenemen met 60-350 maal die van de peptides van de voorbeelden 18-20.

Volgens een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding kan men de activiteit van cathepsine B meten op een kwalitatieve of semi-kwantitatieve basis door een bereid monster van het 30 zoogdierfluïdum in contact te brengen met een geschikt substraat volgens de uitvinding. Typische klinische laboratoriumpraktijken voor het verkrijgen van dergelijke analyses kunnen bijvoorbeeld 8401375 f - 26 - cytologie-analyses omvatten, waarbij het cel, weefsel of orgaan-monster in contact wordt gebracht met het substraat of andere reagentia voor selectieve kleuringsdoeleinden. Nog andere typische klinische analyses omvatten een proefstrook, waarin het substraat 5 is opgenomen in een geschikte betrekkelijk inerte drager, wat een cellulose-achtig of niet-geweven materiaal kan zijn, of een combinatie ervan. Wanneer men het monster in contact brengt met een proefstrook, wordt het monster in de proefstrook geabsorbeerd, en leidt tot een kleurverandering voor eenbetrekkelijk snelle ana-10 lyse.

8401375

Claims

1. Werkwijze voor het selectief bepalen van de activiteit van cathepsine B in waterialeh · die t^^&ine 5 en trypsine-achtige enzymen kunnen bevatten, met het kenmerk, dat men a) een monster van genoemdenateddenmengt met een substraat van de formule

10 Z - R2 - Rj - X en de zure zouten ervan, waarin X een indicatorkern is, die vrij komt door splitsing van de Rj-X binding door cathepsine B en die te bepalen is na afsplitsing, Rj een amihozuurgroep is, die de 15 L-configuratie heeft aan het α-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep en die niet positief geladen is binnen het pH traject voor de bepaling, R2 een hydrofobe aminozuurgroep is, die de L-configuratie heeft aan het α-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep, en Z een aminoblokkeringsgroep is, die de selec-20 tieve binding van cathepsine B aan de Rj en R2 groepen niet verstoort, welke menging wordt uitgevoerd in een waterig medium met een pH in het traject, waarin cathepsine B actief is, en het mengsel een concentratie van genoemd substraat bevat, die aanzienlijk groter is dan de concentratie aan cathepsine B en in voldoende 25 concentratie om de afgesplitste X-groep te kunnen bepalen, en b) de afplitsingssnelheid van de X-groep uit het substraat meet.

2 J NH η l! II -(C^J—NHC-NH-SOi—CilHf-CHj —(CH1)J|-NH-CCF3 g -cn-öQ n Y"· ^, ο Λ/ 0 r^V^i Q-o^V^hWo CHj ,CH5 CH3 ( - - ο Ϋ 0 rrS 0=T <Οκ^^ΝΗγΝί^^ΝΗ·^^0^0 NHa / 8 CH3 NH \_CH, 9H* °K 0 r 0 ^ ^Α»Ηγα,„ίΧΧ0 CH» CH3 9h3 />H ^

0 Y 0 yvS 0=\ _ NH 10 8401375 0=/ NHe Kimberly-Clark Corporation, Neenah, Wisconsin, Ver.St.v.Amerika Ο Λ-Ο fH» ii \ n Ο^ν/υ^ηΧΧΛο CH, 12 CHj pM CH3 \!^ιη2· i n γΧ ΝΗΧί)^Χ 0 CH, H 13 /*xy ch3 X Jv_.NH J? Li X \Jto^nh T ΥΝη^Χο ao

0 CHj O CH3 U O-Xwj0\ / °yNH5 m}" '5 Λ NH-NO, o CH, 0 J CHj Q^V'NffV γΝ(<γΝ,,^γ^ X, j; ^ '6 / V^rXiuV'NH A LI I \_Γ * NH o Y^nhXXo^o 84 0 1 3 7 5 l. 17 ^CH3 Kimberly-Clark Corporation, Neenah, Wisconsin, Ver.St.v.Amerika _______________ J ·*- O ch3 O^0^iy«XNHXX^0 / 18 NH NH=( /) ^ NH-SOr^VcHs ^ ch3 Ο^Λί/γ“γΝΗΧΧΧ JO ?* ’9)„ Ch^Y»flX (»Λ~0 20. o WMCFj JO CH3

0 CHj ^ 0^^nrNI:Ü^ Xïx O ( N 22 l ^ NH JT I cf3 °"^ O^»^»-WlNHi5tl0 \ 23 NH 8^01375 ®nh. Kimberly-Clark Corporation, Neenah, Wisconsin, Ver.St.v.Amerika -J - *· nh4© pNH2 ,-nh o 9Hj o r cr NH 24 NH*=( ® NHl NHj® -NH ® 'Y' NHj „ > 25

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat X een afsplitsbare kern is, waarvan de fluorescentie-emissie 30 verandert bij afsplitsing.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat X een afsplitsbare kern is, waarvan het zichtbare of ultra- 8401375 - i > - 28 - violette spectrum verandert bij afsplitsing.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep is.

5. CH - Cïï2 - CHg CHg

59. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin X een af splitsbare kern is, waarvan de fluorescentie verandert bij afsplitsing.

60. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin X een afsplitsbare kern is, waarvan het zichtbare of ultraviolette spectrum verandert bij afsplitsing. 8401375 V *> Z I - Rj . I - R, -1 I I ' I X I I 01 I I I Z-~^_ CH. Lnh *1 . c !NH Ï 1 I <jM 1 I 0 I R> I nH 0 —(CHgjj — NHC—NH—NOi —(CHa).— NH C — NHa. 0

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 5 dat R-j een nitroarginylgroep is.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R^ een fenylalanylgroep is.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R£ een leucylgroep is.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R2 een tryptofylgroep is.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R2 een isoleucylgroep is.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, mét het kenmerk, 15 dat R2 een valylgroep is.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R2 een fenylalanylgroep en Rj een citrullylgroep is.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R2 een fenylalanylgroep en Rj een nitroarginylgroep is.

13. Werkwij ze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep en R2 een valylgroep is.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep en R2 een tryptofylgroep is.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 25 dat Rj een citrullylgroep en R2 een isoleucylgroep is.

16. Werkwijze voor het opsporen van de activiteit van cathepsine B in . materialen . en die is aangepast aan selectieve besproeving op cathepsine B, dat trypsine en tryp- sine-achtige enzymen kan bevatten, met het kenmerk, dat men . materialen ^ , 30. a) een monster van genoemde . m contact brengt met een substraat van de formule 8401375 * - x - * -29- Ζ - R2 - Rj - X en zure zouten daarvan, waarin X een indicatorkern is, die vrij gemaakt wordt door splitsing van de Rj-X binding door cathepsine B 5 en die te bepalen is na afsplitsing, Rj een aminozuurgroep, die de L-configuratie heeft aan het α-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep, en die niet positief geladen is binnen het pH-traject voor de bepaling, R^ een hydrofobe aminozuurgroep is, die de L-configuratie heeft aan het α-koolstofatoom ten opzichte van 10 de carbonylgroep, en Z een aminoblokkeringsgroep is, die de selectieve binding van cathepsine B aan de Rj en R2 groepen niet verstoort, waarbij genoemd contact met het bovengenoemde substraat wordt uitgevoerd onder omstandigheden, waarbij genoemd cathepsine B actief is en bij concentraties, waarbij genoemd substraat aan-15 wezig is in hoeveelheden die aanzienlijk groter zijn dan de concentratie aan cathepsine B, en b) de productie van X afgesplitst uit het substraat bepaalt.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, 20 dat X een afsplitsbare kern is, waarvan de fluorescentie-emissie verandert tij afsplitsing.

18. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat X een afsplitsbare kern is, waarvan het zichtbare of ultraviolette spectrum verandert bij afsplitsing.

19. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep is.

20. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat Rj een nitroarginylgroep is.

21. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, 30 dat R2 een fenylalanylgroep is.

22. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat R2 een leucylgroep is. 8401375 * <► « >· u V - 30 -

23. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat B-2 een tryptofylgroep is.

24. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat S.2 een isoleucylgroep is.

25. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat R2 een valylgroep is.

26. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat R2 een fenylalanylgroep en Rj een citruilylgroep is.

27. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, 10 dat R2 een fenylalanylgroep en Rj een nitroarginylgroep is.

28. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep en R2 een valylgroep is.

29. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep en R2 een tryptofylgroep is.

30. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat Rj een citrullylgroep en R2 een isoleucylgroep is.

31. Verbindingen van de formule Z - R2 - Rj - X 20 en de zuuradditiezouten daarvan, waarin X een indicatorkem is, aangepast om afgeplitst te worden van Rj, Rj een aminozuurgroep is, die de L-configuratie heeft aan het α-koolstofatoom ten opzichte van de-carbonylgroep, en die niet positief geladen is, R2 25 een hydrofobe aminozuurgroep is, die de L-configuratie heeft aan het d-koolstofatoom ten opziehte van de carbonylgroep, en Z een aminoblokkeringsgroep is.

32. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin X een afsplitsbare kern is, waarvan de fluorescentie verandert bij 30 afsplitsing.

33. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin X een afsplitsbare kern is, waarvan het zichtbare of ultraviolette 8401375 * > e Ζ ν - 31 - spectrum verandert bij afsplitsing.

34. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin Rj een citrullylgroep is.

35. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin Rj 5 een nitroarginylgroep is.

36. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 een fenylalanylgroep is.

37. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 een leucylgroep is.

38. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 een trypofylgroep is.

39. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 een isoleucylgroep is.

40. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 15 een valylgroep is.

41. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 een fenylalanylgroep en Rj een citrullylgroep is.

42. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin R2 een fenylalanylgroep en Rj een nitroarginylgroep is.

43. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin Rj een citrullylgroep en R2 een valylgroep is.

44. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin Rj een citrullylgroep en R2 een tryptofylgroep is.

45. Verbindingen volgens conclusie 31, waarin Rj 25 een citrullylgroep en R2 een isoleucylgroep is.

46. Verbindingen volgens formule 1, en de zure zouten daarvan, waarin R^ de zijketen is van een aminozuurgroep, die de L-configuratie heeft aan het a-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep en die niet positief geladen is en R^ 2-8 kool- 30 stofatomen heeft, R^ de zijketen is van een hydrofobe aminozuurgroep, die de L-configuratie heeft aan het α-koolstofatoom ten opzichte van de carbonylgroep en R^ de formule 8401375 * v A * ’V - 32 -- ch2 - Y heeft, waarin Y gekozen is uit een groep bestaande uit lagere alkyl, fenyl, gesubstitueerd fenyl en indoolgroepen, X een indica-5 torkern is aangepast om afgesplitst te worden uit ede. verbinding, en Z een aminoblokkeringsgroep is.

47. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin de formule 3 heeft.

48. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin 10 de formule 2 heeft.

49. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ is - CH2 - C^.

50. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ is - CH2 - CH - (CH3)2·

51. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ de formule 6 heeft.

52. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ is /CH3

20 -CH CH3

53. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ is - CH - CH7 - CH-t 1 J

25 CH3

54. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ is - CH- - C,. H_ en R„ de formule 3 heeft. 2 6 5 3

55. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R^ is -CH- - C£ H- en R- de formule 2 heeft. 2 6 5 3

56. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin R3 de formule 3 heeft en R. is -CH - CH- 4 , 3 CH3 8401375 * r * - 33 -

57. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin Rg de formule 3 heeft en R. de formule 6. 4

58. Verbindingen volgens conclusie 46, waarin Rg de formule 3 heeft en R^ is

9 NHS 84 0 1 3 7 S Kimberly-Clark Corporation, Neenah, Wisconsin, Ver.St.v.Amerika