CH637627A5 - Verfahren zur herstellung von spezifischen chromogenen enzymsubstraten und deren verwendung. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von spezifischen chromogenen Enzymsubstraten und deren Verwendung.
Die neuen erfindungsgemäss herstellbaren Substrate sind geeignet, um den Faktor Xa (E.C. 3, 4,21.6) zu bestimmen oder auch zum Studium von Reaktionen, die dazu führen, dass der Faktor Xa gebildet wird, gehemmt wird oder verbraucht wird. Die erfindungsgemäss herstellbaren chromogenen Substrate sind sogar zur Besttimmung solcher Faktoren geeignet, die einen Einfluss auf die zuletzt genannten Reaktionen haben oder an derartigen Reaktionen teilnehmen.
Der Faktor X stellt in einer Reihe von Reaktionen, die zu einer Koagulierung von Blut führen, eine Schlüsselsubstanz dar. Die Aktivierung des Faktors X führt zur Bildung des proteolytischen Enzyms, das als Faktor Xa bezeichnet wird, welches direkt für den Übergang von Prothrombin in Thrombin verantwortlich ist. Die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin durch den Faktor Xa umfasst die Spaltung von zwei Peptidbindungen in dem Prothrombin-molekül. Vor diesen beiden Spaltungsstellen liegt genau die gleiche Aminosäuresequenz vor, nämlich die Sequenz: -Ile-Glu-Gly-Arg-.
Ein einfaches Arbeitsverfahren zur Bestimmung des Koagulationsfaktors Xa wäre also für diagnostische Zwecke sehr wertvoll. Die bisher bekannten am besten geeigneten Reagenzien zur Bestimmung des Faktors Xa bestehen aus chromogenen Peptidsubstraten, welche die folgende Aminosäuresequenz aufweisen: -Ue-Glu-Gly-Arg-, welche der Sequenz entspricht, die vor den Spaltungsstellen des natürlichen Substrates Prothrombin liegt.
Das Substrat Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-Nitroanilid, das auch mit «S-2222» bezeichnet wird, ist das am besten geeignete Substrat der oben angegebenen Reihe und dieses Substrat hat eine Aminosäuresequenz, die identisch mit dem oben beschriebenen Teil des natürlichen Substrates ist. Dieses Substrat Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-Nitroanilid wurde bereits in klinischen Tests angewandt, beispielsweise zur Bestimmung des Antifaktors Xa und zur Bestimmung von Heparin (siehe die Veröffentlichung von A.N. Teien, M. Lie und U. Abildgaard in Thrombosis Research 8,413,1976). Diese Bestimmungsverfahren basieren auf der folgenden Reaktion:
+ Xa
Bz-Ue-Glu-Gly-Arg-pNA Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH +
pNA
Das bei dieser Reaktion freigesetzte p-Nitroanilid, das im oben angegebenen Formelschema mit pNA bezeichnet wird, hat ein leichtes Absorptionsmaximum, das sich von demjenigen des Substrates unterscheidet, und deshalb kann das Fortschreiten der enzymatischen Reaktion leicht verfolgt werden, indem man das Ansteigen der Absorption bei 405 nm bestimmt. Das Ansteigen der Absorption bei dem angegebenen Wellenlängenbereich ist proportional der Menge an aktivem Faktor Xa.
Eine grosse Anzahl an synthetischen Substraten für den Faktor Xa wurde von L. Aureli, G. Claeson, G. Karlsson und P. Friberger in Peptide 1976, Seite 191, Proc. von dem 14. European Peptide Symposium, Weipon, Belgien, 1976 beschrieben. Die Aminosäuren in der natürlichen Sequenz wurden variiert. Sie wurden auch durch andere ähnliche Aminosäuren ersetzt, aber in keinem Fall konnte ein besseres Substrat erzielt werden als das oben beschriebene Substrat mit der Abkürzung S-2222. Sogar sehr geringe Änderungen in der natürlichen Sequenz, wie sie durch einen Ersatz des in der natürlichen Sequenz auftretenden Isoleucins (Ile) durch Leucin (Leu) erreicht werden, führen zu Substraten, welche eine wesentlich geringere Empfindlichkeit besitzen.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein neues chro-mogenes Substrat für Serin-Proteasen zu entwickeln.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von speizifischen chromogenen Enzymsubstraten, welche die folgende allgemeine Formel I
Ri -Ile-A-Gly-Arg-NH-R2 (I)
aufweisen, in welcher
Rj ein Acylrest ist, vorzugsweise der Acetylrest oder der Benzoylrest,
R2 den p-Nitrophenylrest, den ß-Naphthylrest oder den 4-Methoxy-ß-naphthylrest darstellt, d.h. für eine aromatische Gruppierung, die einen Chromophor liefert oder für eine fluoreszierende Verbindung, und zwar dann, wenn dieser fragliche Rest R2 bei der enzymatischen Hydrolyse in Form einer Verbindung der Formel R2-NH2 abgespaltet wird,
A für die Aminosäurereste Asp oder Glu steht, wobei in diesen Aminosäureresten die Carboxylgruppen durch Amid-
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gruppen geschützt sind, wobei die Amide vorzugsweise solche sind, die sich von monosubstituierten oder disubsti-tuierten Alkylaminen, Hydroxyalkylaminen oder substituierten Aminoalkylaminen ableiten oder die Stickstoffatome der Säureamidgruppe von heterocyclischen Aminen stammen und vorzugsweise ein Piperidinring, ein Morpho-linring oder ein Piperazinring sind, ist dadurch gekennzeichnet, dass man von einer entsprechenden Verbindung ausgeht, die der oben angegebenen Formel entspricht, wobei jedoch A einen an der Carboxylgruppe nicht substituierten Rest der Aminosäure Asp oder GIu darstellt, und dass man diese Carboxylgruppe der genannten Aminosäuren in die Amidgruppe überführt, indem man die freie Carboxylgruppe der Aminosäurereste Asp bzw. Glu mit einem entsprechenden Amin umsetzt, wobei die gewünschten Substrate erhalten werden, und die Umsetzung mit dem Amin vorzugsweise nach in der Peptidchemie bekannten Arbeitsverfahren durchgeführt wird.
In der oben angegebenen Formel I bedeutet A einen Rest der Asparaginsäure (Asp) oder der Glutaminsäure (Glu), wobei diese Reste an der Carbonsäuregruppierung substituiert sind, und zwar durch die Überführung in ein entsprechendes Säureamid. Als Beispiele für geeignete Amide seien solche mit einem monosubstituierten oder disub-stituierten Stickstoffatom genannt, wobei als Substituenten Alkylgruppen, Hydroxyalkylgruppen oder substituierte Aminoalkylgruppen oder heterocyclische Gruppen erwähnt seien, wobei im zuletzt genannten Fall das Amidostickstoff-atom einen Teil des heterocyclischen Ringes darstellt, insbesondere eines Piperidinringes, eines Morpholinringes oder eines Piperazinringes.
Die y-Carboxylgruppe der natürlich vorkommenden Glutaminsäure hat bei biologisch vorkommenden pH-Berei-chen eine negative Ladung und ist hydrophil. In den erfindungsgemäss herstellbaren neuen Enzymsubstraten ist diese Gruppierung durch eine wesentlich grössere Gruppe ersetzt, die neutral reagiert und lipophile Eigenschaften besitzt. Da bisher versuchte Änderungen in der natürlich vorkommenden Sequenz -Ile-Glu-Gly-Arg- nur zu schlechter geeigneten Substraten führten (s. die Veröffentlichung von L. Aureli, G. Claeson, G. Karlsson und P. Friberger in Peptide 1976, Seite 191, Proc. from the 14th European Peptide Symposium, Weipon, Belgien, 1976) ist es als ausserordentlich überraschend zu betrachten, dass die relativ grossen Änderungen, die bei den erfindungsgemäss herstellbaren neuen Substraten im Vergleich zur natürlich vorkommenden Kette vorgenommen wurden, zu Substraten führten, die ganz bedeutend bessere Eigenschaften aufweisen als das bisher bekannte, am besten geeignete Substrat S-2222. Diese Ergebnisse sind auch aus der nachfolgenden Tabelle 1 zu ersehen. Die drastische Erniederung der Michaelis-Konstante, die als Km abgekürzt wird, ist besonders auffallend, und dies ist auch diejenige Verbesserung, die erreicht wurde, welche für die praktische Arbeit von der grössten Bedeutung ist. Die Michaelis-Konstante wird als Substratkonzentration definiert, die benötigt wird, um die Hälfte der maximalen Geschwindigkeit (abgekürzt als Vmax) zu erreichen. Die bisher bekannten Substrate und auch die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Substrate besitzen eine beschränkte Löslichkeit, und aus diesem Grund sollte die Substratkonzentration unterhalb von 1 mMol liegen, wenn man in gepufferter Lösung und im Blutplasma unter praktisch angewendeten Arbeitsbedingungen arbeitet. Unter Verwendung des bisher bekannten Substrates mit der Abkürzung S-2222, das eine Michaelis-Konstante von 0,83 mMol aufweist, kann man nur eine vollständige Verwendung bei der halben maximalen Geschwindigkeit erreichen, während bei den erfindungsgemässen Substraten, die eine 2- bis 5mal niedrigere Michaelis-Konstante besitzen, man die maximale Geschwindigkeit wesentlich besser verwenden kann. Demeptsprechend werden sehr bedeutende Vorteile erhalten, wenn man die Aktivität des Faktors Xa unter Verwendung der neuen erfindungsgemäss herstellbaren Substrate misst. Die Empfindlichkeit der erfindungsgemäss herstellbaren neuen Substrate ist mehrere 100 Prozent höher als diejenige des bisher bekannten Substrates mit der Abkürzung S-2222. Dementsprechend ist es unter Verwendung der erfindungsgemäss herstellbaren neuen Substrate möglich, eine wesentlich höhere Genauigkeit zu erzielen, eine wesentlich tiefere Empfindlichkeitsgrenze zu erreichen und eine starke Senkung des benötigten Volumens der Blutproben zu erzielen.
Enzymprüfungen mit Hilfe von chromogenen Substraten sind sehr geeignet, um in Autoanalysatoren Verwendung zu finden, und die höhere Empfindlichkeit der neuen erfindungsgemässen Substrate bewirkt, dass eine kürzere Reaktionszeit in der Apparatur erforderlich ist, und dementsprechend ist es auch möglich, mehr Proben pro Zeiteinheit zu analysieren, und zwar im Vergleich zu bisher bekannten Substraten.
Die neuen Substrate werden aus chromogenen Substraten oder fluorogenen Substraten hergestellt, welche die Aminosäuresequenz -Ile-Glu-Gly-Arg- bzw. -Ile-Asp-Gly-Arg- aufweisen, und welche einer Amidierung unterworfen wurden, um die entsprechende freie y-Carbonsäure-gruppierung oder ß-Carbonsäuregruppierung nach Arbeitsverfahren, die für den Peptidchemiker allgemein bekannt sind, zu amidieren.
Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Bei der Analyse von Eluaten und Produkten mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie wurden Glasplatten mit Silicagel F254 der Firma Merck als Absorptionsmedium verwendet. Als Entwicklungsmittel wurde ein Lösungsmittelsystem aus Chloroform + Methanol + Essigsäure + Wasser im Volumenverhältnis von 34:4:9:2 verwendet.
Nach der Durchführung der Dünnschichtchromatographie wurden die Platten zuerst im Ultraviolettlicht bei einer Wellenlänge von 254 mm untersucht und anschliessend unter Verwendung der Chlor/Toluidin-Reaktion als Entwicklungsmethodik. Im Zusammenhang mit der Chlor/Toluidin-Reaktion sei auf G. Pataki, Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co. Berlin, Seite 125,1966 hingewiesen.
Die in den vorliegenden Unterlagen verwendeten Abkürzungen besitzen die folgende Bedeutung:
Aminosäuren:
Die Abkürzungen beziehen sich auf die Aminosäurereste. Die freien Aminosäuren oder das freie Ende der Peptide,.
wird so gekennzeichnet, dass H bedeutet, dass eine freie Aminogruppe vorliegt, und -OH bedeutet, dass eine freie Carboxylgruppe vorhanden ist. Dabei befindet sich die Aminogruppe immer an der linken Seite und die Carboxylgruppe an der rechten Seite.
Falls nicht ausrücklich andere Angaben vorliegen, sind alle Aminosäuren die hier genannt sind die L-Konfiguration dieser Aminosäuren.
Die Abkürzungen der Aminosäuren bedeuten das folgende:
Arg = Arginin
Asp = Asparaginsäure
Glu = Glutaminsäure
Gly = Glycin
Ile = Isoleucin
Leu = Leucin
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Die weiteren hier verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:
Ac
= Acetyl
AcOH
= Essigsäure
Bz
- Benzoyl
DCCI
= Dicyclohexylcarbodiimid
DMF
= Dimethylformamid
Et3N
= Triäthylamin
HOBT
= a-Hydroxybenzotriazol
HOSu
= N-Hydroxy-succinimid
MeOH
= Methanol
OEt
= Äthoxy
OMe
= Methoxy
OpNp
= p-Nitrophenoxy
OisoPr
= iso-Propoxy pNA
= p-Nitroanilid
QAE
= quaternäre Amino-äthylsepharose (Pharmacia
J
Fine Chemicals)
SOCl2
= Thionylchlorid
Beispiel 1
Herstellung von Bz-Ue-Glu(OMe)-Gly-Arg-pNA • HCl
Das im Titel genannte Produkt hat ein Molekulargewicht von 748,2.
Unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen wurden bei einer Temperatur von 0 °C 30 jxl an destilliertem SOCl2 zu 0,5 ml an absolutem Methanol zugegeben. Nachdem die erste lebhafte Reaktion beendet ist, lässt man die Lösung etwa 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen und gibt dann 75 mg (0,10 mMole) an Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA • HCl zu, nämlich dem Reagens mit der Bezeichnung S-2222. Die Lösung wird 5 Stunden lang gerührt und dann zur Trockene eingedampft. Das so erhaltene Öl wird in einer kleinen Menge Methanol aufgelöst und durch Gelchromatographie auf einer Säule gereinigt, die Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) in Methanol enthält, und als Elutionsmittel wird ebenfalls Methanol verwendet. Nach dem Abdampfen des Methanols erhält man den reinen Methylester, der in Wasser gelöst wird und lyophilisiert wird. Die Ausbeute beträgt 30 mg und entspricht 40% der theoretischen Ausbeute.
Das Produkt erwies sich nach der Dünnschichtchromatographie als homogen und es besass einen Rf-Wert von 0,33.
Die optische Drehung war:
[a]D20 -40,3° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Beispiel 2
Herstellung von Bz-Ile-Glu(OEt)-Gly-Arg-pNA • HCl
Das im Titel genannte Produkt hat ein Molekulargewicht von 762,2.
Unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen werden bei einer Temperatur von —10 °C 60 pl an destilliertem SOCl2 zu 1,0 ml absolutem Äthanol gegeben. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur werden 150 mg an dem im Beispiel 1 verwendeten Reagens der Abkürzung S-2222 zugegeben. Sobald die Reaktion beendet ist, was nach den Ergebnissen der Dünnschichtchromatographie nach etwa 15 Stunden der Fall ist, wird die Lösung abgedampft. Das so erhaltene Öl wird in einer kleinen Menge an 30prozentiger Essigsäure in Wasser aufgelöst und durch Chromatographie auf einer Säule, die Sephadex G 15 (Pharmacia Fine Chemicals) in lOprozentiger Essigsäure in Wasser enthält, gereinigt. Der aus dem Eluat erhaltene reine Äthylester wird lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 70 mg, entsprechend 46% der theoretischen Ausbeute.
Das Produkt erwies sich nach der Dünnschichtchromatographie als rein und besass einen RrWert von 0,40.
Die optische Drehung war:
[a]D20 -37,'7°, (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Beispiel 3
Herstellung von Bz-Ile-Glu(OisoPr)-Gly-Arg-pNA • HCl
Das im Titel genannte Produkt besitzt ein Molekulargewicht von 776,3.
Die Herstellung wird nach demjenigen Verfahren durchgeführt, das im Beispiel 2 beschrieben ist, jedoch anstelle des dort eingesetzten Äthanols wird hier absolutes Isopropanol verwendet. Die Umsetzung ist nach etwa 16 Stunden beendet. Die Chromatographie und das Lyophilisieren werden nach denjenigen Arbeitsverfahren durchgeführt, die im Beispiel 2 beschrieben sind. Die Ausbeute beträgt 90 mg, was 58% der Theorie entspricht. Das Produkt ist entsprechend der Dünnschichtchromatographie homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,44.
Die optische Drehung beträgt:
[a]D20-36,4° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Beispiel 4
Herstellung von Bz-Ile-Glu(0-Cyclohexyl)-Gly-Arg-pNA • HCl
Das im Titel genannte Produkt besitzt ein Molekulargewicht von 833,3.
Man gibt 60 nl S0C12 zur 1,0 ml an trockenem Cyclo-hexanol. Eine Stunde später wurden dann bei Zimmertemperatur 200 mg des in Beispiel 1 verwendeten Reagens mit der Abkürzung S-2222 zugesetzt. Sobald die Umsetzung vollständig ist, was nach etwa 12 Stunden der Fall ist, wird die Lösung eingedampft. Anschliessend wird das Produkt nach denjenigen Arbeitsverfahren, die in Beispiel 2 und 3 beschrieben sind, chromatographiertund anschliessend lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 170 mg, entsprechend 75% der Theorie.
Das erhaltene Produkt ist gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,50.
Die optische Drehung war:
[a]D20—38,6° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Beispiel 5 Herstellung von
Bz-Ile-Glu(0-CH2CH2N(CH3)2)-Gly-Arg-pNA • HCl
Das im Titel genannte Produkt besitzt ein Molekulargewicht von 859,8.
Es wurden 75 mg (0,10 mMole) des in Beispiel 1 beschriebenen Ausgangsmateriales mit der Abkürzung S-2222 und 100 mg (0,8 mMole) an Dimethylaminoäthanol-Hydro-chlorid in 1,0 ml an trockenem destilliertem Dimethylform-amid gelöst und dann wurden 10 p.1 an Pyridin und 10 mg (0,074 mMole) an a-Hydroxybenzotriazol und schliesslich 25 mg (0,12 mMole) an Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Der dabei gebildete Dicyclohexyl-Harnstoff wird nach etwa 24 Stunden abfiltriert und die Dimethylformamidlösung unter vermindertem Druck eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in einer kleinen Menge an einer Mischung aus 95% Methanol + 5% Wasser aufgelöst und auf einer Säule gereinigt, die den Ionenaustauscher QAE-25 in seiner Chloridform enthält. Die gleiche Lösungsmittelmischung wird als Elutionsmittel verwendet. Nach diesem Verfahren wird das Hydrochlorid des Dimethylaminoäthylesters frei von an5
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deren Peptiden erhalten, jedoch enthält dieses Produkt eine gewisse kleine Menge an Verunreinigungen, wie z. B. Dime-thylaminoäthanol-Hydrochlorid..Die Fraktion, die den Di-methylaminoäthylester enthält, wird abgedampft und chromatographisch auf einer Säule gereinigt, die Sephadex G 15 (Pharmacia Fine Chemicals) in einer Mischung aus 1.0% Essigsäure und Wasser enthält. Die dabei erhaltene Lösung des reinen Esters wird lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 60 mg, entsprechend 58% der Theorie.
Das Produkt (entsprechend der Dünnschichtchromatographie) ist homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,50.
Die optische Drehung lieferte die folgenden Ergebnisse: [a]D20 — 35,0° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Beispiel 6
Herstellung von Bz-Ile-(jjlu-Gly-Arg-pNA • HCl CONH-CH(CH3)2
Die im Titel genannte Verbindung besitzt ein Molekulargewicht von 775,3.
240 mg (0,33 mMole) des in Beispiel 1 verwendeten Aus-gangsmateriales mit der Abkürzung S-2222 und 45 mg (0,39 mMole) an N-Hydroxy-succinimid werden in einem Milliliter trockenem destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf — 5 °C abgekühlt und dann werden 120 mg (0,58 mMole) an Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Man lässt die Temperatur auf Zimmertemperatur ansteigen und nach 4 Stunden wird die Lösung wieder auf 0 °C abgekühlt und der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird filtriert und gewaschen. Die erhaltene Dimethylformamidlösung, die etwa 2 ml beträgt, wird auf 0 °C abgekühlt und dann werden 0,1 ml an reinem Isopropylamin zugesetzt. Man belässt das Material etwa 70 Stunden lang bei Zimmertemperatur und dampft dann die Lösung unter vermindertem Druck ab, vermischt anschliessend mit 5 ml Wasser und dampft erneut ab. Das Produkt wird in etwa 4 ml einer Lösung aus 50% Essigsäure + Wasser gelöst und chromatographisch auf einer Säule gereinigt, die Sephadex Gl 5 (Pharmacia Fine Chemicals) in einer Mischung aus 33% Essigsäure und Wasser enthält. Die gleiche Lösungsmittelmischung wird auch als Elutionsmittel angewandt. Diejenige Fraktion, die das reine Iso-propylamid enthält, wird abgedampft und einem Ionenaustausch auf einer Säule unterworfen, die quaternäre Amino-äthylsepharose, QAE25 (Pharmacia Fine Chemicals) in ihrer Chloridform in einerMischung aus 95% Methanol -I- 5% Wasser enthält. Das gewonnene Eluat wird abgedampft, in Wasser gelöst und lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 120 mg, entsprechend 47% der theoretischen Ausbeute. Das Produkt ist gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen und es weist einen Rf-Wert von 0,39 auf.
Die optische Drehung ergab die folgenden Werte:
[ct]D25- 30,6° (c 0,5, MeOH)
Beispiel 7
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA * HCl
Herstellung von | f \
CON H )
Das im Titel genannte Produkt besitzt ein Molekulargewicht von 802,3.
Die Herstellung dieses Produktes erfolgt nach demjenigen Arbeitsverfahren, das in Beispiel 6 beschrieben ist, wobei jedoch anstelle des in Beispiel 6 verwendeten Isopropyl-amines jetzt Piperidin eingesetzt wird.
Die Ausbeute beträgt 105 mg, entsprechend 40% der theoretischen Ausbeute.
5 Das Produkt ist entsprechend der Dünnschichtchromatographie homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,50.
Die optische Drehung liefert die folgenden Ergebnisse:
[<x]D25-34c(cO,5, MeOH)
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Beispiel 8
Herstellung von Bz-Ile-(jjlu-Gly-Arg-pNA • HCl
CON(CH2-CH2-OH)2
i5 Die im Titel genannte Verbindung besitzt ein Molekulargewicht von 822,3.
Die Herstellung wurde nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren durchgeführt, jedoch wurde das in Beispiel 6 eingesetzte Isopropylamin jetzt durch Diäthanol-20 amin ersetzt.
Die Ausbeute betrug 120 mg, was 45% der Theorie entsprach.
Das erhaltene Produkt war gemäss der Dünnschichtchromatographie einheitlich, und es besass einen Rf-Wert 25 von 0,25.
Die optische Drehung war wie folgt:
[a]D251 — 31° (c 0,5, Methanol)
30 Beispiel 9
Herstellung von Bz-Ile-Asp(OisoPr)-Gly-Arg-pNA • HCl
Das im Titel genannte Produkt besitzt ein Molekulargewicht von 762,3.
Es wurden 30 jxl an destilliertem SOCl2 zu 0,5 ml trok-35 kenem Isopropanol zugesetzt, und nachdem man 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur beliess, gab man 73 mg (0,10 Mole) an Bz-Ile-Asp-GIy-Arg-pNA • HCl, welches ein Molekulargewicht von 720,2 besitzt, zu. Sobald die Reaktion beendet war, was nach etwa 18 Stunden der Fall war, 40 wurde die Lösung zur Trockene eingedampft und so chro-matographiert und lyophilisiert, wie dies bei den Verfahren gemäss Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben ist.
Die Ausbeute betrug 32 mg, entsprechend 42% der theoretischen Ausbeute.
45 Das erhaltene Produkt war gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen und besass einen Rf-Wert von 0,46.
Die optische Drehung lieferte das folgende Ergebnis: so [a]D23 -22,7° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
Beispiel 10
Herstellung von Bz-Ile-Asp(OEt)-Gly-Arg-pNA • HCl ss Die im Titel genannte Verbindung besitzt ein Molekulargewicht von 748,2.
Das Herstellungsverfahren wurde in der gleichen Weise durchgeführt, wie dies in Beispiel 9 beschrieben ist, jedoch wurde anstatt des in Beispiel 9 eingesetzten Isopropanoles 60 jetzt Äthanol verwendet.
Die Ausbeute betrug 28 mg, entsprechend 37% der theoretischen Ausbeute.
Das erhaltene Produkt war gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen und besass einen Rf-Wert von 65 0,40.
Die opitsche Drehung war wie folgt:
[<x]D23-23,5° (c 0,5, 50% H0Ac/H20)
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Beispiel 11
Herstellung von Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA • HCl
CONH-CH(CH3)2
Die im Titel genannte Verbindung besitzt ein Molekulargewicht von 761,3.
Das Herstellungsverfahren wurde in der gleichen Weise durchgeführt, wie dies in Beispiel 6 beschrieben ist, jedoch wurde als Ausgangsmaterial anstelle des in Beispiel 6 eingesetzten Produktes mit der Abkürzung S-2222jetzt das Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA • HCl verwendet.
Die Ausbeute betrug 100 mg, entsprechend 40% der theoretischen Ausbeute.
Das erhaltene Produkt war gemäss der Dünnschichtchromatographie einheitlich und es besass einen Rf-Wert von 0,40.
Die optische Drehung lieferte den folgenden Wert:
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Ia]D25 -20,1° (c 0,5, MeOH)
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Herstellung von
Beispiel 12 Bz-Ile~Asp-Gly--Arg-pNA CON^ H V)
HCl
Die im Titel genannte Verbindung besitzt ein Molekulargewicht von 818,3.
Das Herstellungsverfahren wurde in der gleichen Weise durchgeführt, wie dies in Beispiel 11 beschrieben ist, jedoch wurde jetzt anstelle des in Beispiel 11 eingesetzten Isopropyl-amines das Morpholin verwendet.
Die Ausbeute betrug 95 mg, entsprechend 35% der theoretischen Ausbeute.
Das Produkt was gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen und besass einen Rf-Wert von 0,46.
Die optische Drehung lieferte den folgenden Wert:
[a]Dzs -24,2° (c 0,5, MeOH)
Bestimmung der Michaelis-Konstante (Km) und der maximalen Geschwindigkeit (Vmax)
Die Michaelis-Konstante (Km) und die maximale Geschwindigkeit (Vmax) werden mit Hilfe der Gleichung von Lineweaver-Burk erhalten. Diese Gleichung lautet wie folgt:
_1_ v
Km
Vmax
_1_
S
Vmax tragen, und der Km-Wert und die maximale Geschwindigkeit (Vmax) werden dann von dem so erhaltenen Linewea-ver-Burk-Diagramm abgelesen. Die erhaltenen Werte sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
Die zur Durchführung der Bestimmung herangezogenen Reagenzien waren die folgenden:
Der verwendete Puffer war Tris (tris(hydroxymethyl)-aminomethan), und zwar 0,05 Mol pro Liter mit einem pH-Wert von 8,3 bei I = 0,25 (NaCl).
Das verwendete Enzym war Diagen (6,4 Denson-Ein-heiten) (Diagnostic Reagents). Dabei wurde eine Ampulle dieses Enzymes in 2 ml Wasser aufgelöst.
Das verwendete Substrat wurde in Wasser in einer Konzentration von 2 mMol pro Liter aufgelöst. 15 Die Arbeitsmethodik war wie folgt:
Als Ausgangsmaterial wurden 50 (il der Enzymlösung einer Temperatur von 20 °C sowie je nach Bestimmung 50 bis 600 jil der Substratlösung bei einer Temperatur von 37 °C verwendet, wobei eine solche Menge Puffer eingesetzt wurde, 20 dass die Mischung aus Enzymlösung + Substratlösung + Pufferlösung ein Gesamtvolumen von 2500 |il besass, also je nach den Erfordernissen 2400 bis 1850 jxl der Pufferlösung eingesetzt wurden. Die Materialien wurden vermischt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm und einer 25 Temperatur von 37 °C sofort abgelesen und dann nach bestimmten Zeiträumen wieder die Absorption bei dieser Wellenlänge und der angegebenen Temperatur bestimmt, so dass man den Wert AOD/min erhielt.
Bei der Bestimmung der relativen Aktivität wurde wie 30 folgt gearbeitet:
Es wurden die folgenden Materialien verwendet:
Bestandteil:
Menge:
35
45
Die Bestimmung wird durchgeführt, indem man das Enzym und das Substrat in einer Pufferlösung miteinander vermischt und die Geschwindigkeit der Hydrolyse spektro-photometrisch misst. Dabei wird die Konzentration des Substrates (S0) variiert, während die Konzentration des Enzymes konstantgehalten wird. Der reziproke Wert der Geschwindigkeit, also der Wert —wird dann gegen den reziproken
Wert der Substratkonzentration, also den Wert ——, aufge-
So
Puffer bei einer Temperatur von 37 °C 2 200 jil Enzym bei einer Temperatur von 20 °C 50 jxl
Substrat bei einer Temperatur von 37 °C 250 |il i Die Materialien wurden vermischt, und es wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm und einer Temperatur von 37 °C bestimmt. Bei dieser Temperatur wurde laufend die Änderung der Absorption, also der Wert AOD/ min, bestimmt.
Tabelle 1
Bestimmung der Werte Km, Vmax und der relativen Aktivitäten von nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Substraten im Vergleich zum Substrat S-2222
Substrat
Km -104 Mol/1
Vmax • 108 Mol/min • U
Relative Aktivität
55 S-2222
8,3
8,6
100
Beispiel 1
2,6
8,1
230
Beispiel 2
2,9
7,5
200
Beispiel 3
2,1
7,1
220
Beispiel 6
5,6
20,0
340
60 Beispiel 7
1,7
8,6
300
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von spezifischen chromoge-nen Enzymsubstraten, welche die folgende allgemeine Formel I
R i -Ile-A-Gly-Arg-NH-R2 (I)
aufweisen, in welcher
R[ ein Acylrest ist,
R2 den p-Nitrophenylrest, den ß-Naphthylrest oder den 4-Methoxy-ß-naphthylrest darstellt, und
A für die Aminosäurereste Asp oder Glu steht, wobei in diesen Aminosäureresten die Carboxylgruppen durch Ahiidogruppen geschützt sind, dadurch gekennzeichnet,
dass man von einer entsprechenden Verbindung ausgeht, die der oben angegebenen Formel entspricht, wobei jedoch A einen an der Carboxylgruppe nicht substituierten Rest der Aminosäure Asp oder Glu darstellt, und dass man diese Carboxylgruppe der genannten Aminosäuren in die Amid-gruppe überführt, indem man die freie Carboxylgruppe der Aminosäurereste Asp bzw. Glu mit einem entsprechenden Amin umsetzt, wobei die gewünschten Substrate erhalten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R] den Acetylrest oder den Benzoylrest bedeutet.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die bei der Gruppierung A erwähnten Carboxylgruppen geschützt sind durch Bildung von Säure-amidgruppierungen, wobei die Amide solche sind, die sich von monosubstituierten oder disubstituierten Alkylaminen, Hydroxyalkylaminen oder substituierten Aminoalkylaminen ableiten oder die Stickstoffatome der Säureamidgruppe von heterocyclischen Aminen stammen und vorzugsweise ein Pi-peridinring, ein Morpholinring oder ein Piperazinring sind.
4. Verwendung der gemäss dem Verfahren nach Anspruch 1 erhaltenen spezifischen chromogenen Enzymsubstrate für Diagnoseverfahren zur Feststellung von Serin-Proteasen.
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