Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych, chromogenicznych substratów dla enzymów.Substraty wytwarzane sposobem wedlug wynalazku nadaja sie do oznaczania czynnika Xa (E.C. 3, 4, 21, 6) albo do badania reakcji, powodujacych wytwarzanie sie tego czynnika iilhibitujacych jego dzialanie lub powoduja¬ cych jego niweczenie, a nawet do oznaczania czynników, wplywajacych na przebieg takich reakcji albo bioracych w nich udzial.Czynnik X jest kluczowa substancja w szeregu reakcji, prowadzacych do krzepniecia krwi. Pobudzanie czynnika X powoduje wytwarzanie czynnika Xa, bedacego pro¬ teolitycznym enzymem, od którego zalezy bezposrednio przemiana protrombiny w trómbine, polegajaca na roz¬ szczepianiu dwóch wiazan peptydowych w czasteczce protrombiny. Te dwa miejsca rozszczepiania sa poprze¬ dzane przez dokladnie taka sama sekwencje aminokwasowa: -Ile-Glu-Gly-Arg- Prosta metoda oznaczania scinajacego czynnika Xa jest bardzo cenna dla celów diagnostycznych. Najlepszymi ze znanych dotychczas odczynników do oznaczania czynnika Xa sa chromogeniczne substraty peptydowe z sekwencja aminokwasowa -Ile-Glu-Gly-Arg-, odpowiadajaca sek- wenqi poprzedzajacej miejsca rozszczepiania naturalnego substratu protrombiny. Substrat w postaci benzoilo-Ile- -Glu-Gly-Arg-p-hitroanilidu (S-2222), bedacy najlepszym substratem z tego szeregu, ma sekwencje aminokwasowa identyczna z wyzej opisana czescia naturalnego substratu.Substrat ten znalazl juz zastosowanie w klinicznych ozna- czaniach np. antyczynnika Xa i heparyny (A. N. Teien, M. Lie i U. Abildgaard, Throitibosis Research 8, 413, 1976). Metoda ta jest oparta na nastepujacej reakcji: Xa Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNa ? Bz-Ile-Glu-Gly- 5 -Arg-OH + pNa Uwolniony p-nitroanilid (pNA) ma maksimum absorpcji swiatla, rózniace sie od odpowiedniej wartosci dla substratu i przebieg enzymatycznej reakcji mozna latwo sledzic, mierzac wzrost absorpcji przy dlu¬ gosci fali 405 milimikronów, proporcjonalny do ilosci io aktywnego czynnika Xa.L. Aureli* G. Claeson* G. Karlsson i P. Friberger w pu¬ blikacji Peptides 1976, str. 191, Protokól z XIV Europej¬ skiego Symopzjum Peptydowego, odbytego w Weipor, Belgia, 1976, opisali liczne syntetyczne substraty dla 15 czynnika Xa. Aminokwasy w naturalnej sekwencji byly rózne i kolejno zastepowano je innymi, podobnymi amino¬ kwasami, ale w zadnym przypadku nie otrzymano sub¬ stratu lepszego niz S-2222. Nawet bardzo male zmiany w naturalnej sekwencji* takie jak zastapienie Ile przez Leu, 20 dawaly substraty o znacznie mniejszej czulosci.Nowe chromogeniczne substraty, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, stanowia zwiazki lub sole zwiazków o wzorze: Ri-Ile-A-Gly-Arg-NH-Ra, w którym Rj oznacza grupe acylowa, korzystnie grupe acetylowa lub behzoilowa* 25 R2 oznacza grupe p-nitrofenylowa, p-naftylowa albo 4-me- toksy-p-naftylowa, to jest grupy aromatyczne dajace w wyniku enzymatycznej hydrolizy chromoforowy lub fluorescencyjny zwiazek o wzorze R-NH2, A oznacza grupe Asp albo Glu, podstawiona w grupie karboksylowej 30 przez aminowanie. Wytworzone grupy amidowe zawieraja 109 588109 588 1 lub 2 rodniki alkilowe, zawierajace po 1—6 atomów wegla, 1 lub 2 rodniki hydroksyalkilowe o 2—6 atomach wegla albo 1 lub 2 rodniki alkiloaminoalkilowe o 2—6 atomach weg}a. lub tez stanowfa czesc szescioczlónówego pierscienia heterocyklicznego.Grupe y-karboksylowa naturalnego kwasu glutamino¬ wego, która przyr»biQlogicznej wartosci pH ma ladunek ji]emn$ i jejT*gjfflJBhydrofilowa, zgodnie z wynalazkiem zastepuje sie znacznie wieksza grupa, bedaca grupa obo¬ jetna i lipofilowa.Poniewaz w wyniku znanych dotychczas zmian natural¬ nej sekwencji -Ile-Glu-Gly-Arg- otrzymywano tylko sub- straty o posledniej jakosci (L. Aureli, G. Claeson, G. Karl- sson i P. Friberger, Peptides, 1976, str. 191, Protokól z XIV Europejskiego Sympozjum Peptydowego, odbytego w Weipor, Belgia, 1976), przeto jest faktem wysoce nie¬ oczekiwanym, ze stosunkowo male zmiany, dokonane sposobem wedlug wynalazku, powoduja, ze otrzymuje sie substraty o wyraznie lepszych wlasciwosciach (patrz tablica I) w porównaniu z najlepszym ze znanych dotych¬ czas substratem S-2222. Najbardziej zaskakujace jest powazne zmniejszenie stalej Michaelisa (Km), majace najwieksze znaczenie praktyczne substratów, wytwarzanych zgodnie z wynalazkiem. Stala Km oznacza stezenie sub- stratu, niezbedne dla osiagniecia polowy maksymalnej predkosci Vmaks.Znane substraty, a takze substraty, wytwarzane sposo¬ bem wedlug wynalazku, maja ograniczona rozpuszczalnosc, totez przy stosowaniu ich w praktyce w roztworze bufo¬ rowym i w plazmie krwi ich stezenie powinno byc mniejsze od 1 mM.W przypadku substratu S-2222, którego Km = 0,83 mM, mozna w pelni wykorzystywac tylko polowe Ymaks., pod¬ czas gdy stosujac substraty, wytworzone sposobem wedlug wynalazku, majace stala Km 2—5 razy mniejsza, mozna znacznie lepiej wykorzystywac predkosc maksymalna.Z tego wzgledu, mierzac wspólczynnik aktywnosci Xa za pomoca substratów, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, uzyskuje sie wyrazne korzysci. Czulosc tych nowych substratów jest o kilkaset procent wyzsza od czulosci S-2222, co umozliwia pomiary wiele dokladniejsze, przy znacznie nizszej granicy czulosci i przy znacznie mniejszej objetosci próbki krwi.Badanie enzymów za pomoca chromogenicznych sub¬ stratów przeprowadza sie korzyptnie przy uzyciu samo¬ czynnych analizatorów, a wieksza czulosc nowych sub¬ stratów umozliwia skracanie czasu reakcji w aparacie do badan i tym samym wykonywanie analiz wiekszej liczby próbek w jednostce czasu.Sposobem wedlug wynalazku nowe substraty wytwarza sie z chromogenicznych substratów o wzorze Ri-Ile-B-Gly- ^Arg-NH-R23 w którym Rt i R2 maja wyzej podane znacze¬ nie i B oznacza nie podstawiona grupe Asp albu Glu z wolna grupa karboksylowa, które poddaje sie reakcji z amina, taka jak alkiloamina o 1—6 atomach wegla, hydroksyalki- loamina p 2—6 atomach wegla, alkiloaminoalkiloamina o 2—6 atomach wegla, piperydyna albo morfolina. Reakqe te prowadzi sie metoda, analogiczna do metod stosowanych w tego typu reakqach w chemii peptydów.Wynalazek zilustrowano w nizej podanych przykladach, W których jako srodek absorpcyjny przy analizie eluatów i produktów metoda chromatografii cienkowarstwowej stosuje: sie plytki szklane z zelem krzemionkowym F254 firmy Merck, Jako rozpuszczalnik stosuje sie uklad, za¬ wierajacy chloroform, metanol, kwas octowy i wode w sto- 15 25 sunkii objetosciowym 34:4:9:2. Po chromatografii plytki bada sie najpierw w swietle nadfioletowym (254 mili- mikrony) i nastepnie stosuje reakcje ~chlor/toluidyna [G. Pataki, Dunnschichtchromatografie in der Aminosaure 5 — und Peptidchemie, Walter de Gruyter und Co, Berlin, str. 125, (1966)] jako metode rozwijania.Skróty stosowane w opisie i zastrzezeniach maja naste¬ pujace znaczenie.Aminokwasy. Skróty odnosza sie do reszt aminokwasów.Wolny aminokwas albo peptyd oznacza sie. przez podawa¬ nie H przy grupie aminowej i OH przy grupie karboksylo¬ wej. Grupa aminowa jest zawsze podawana po stronie lewej, a grupa karboksylowa po stronie prawej. Jezeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie stosowane aminokwasy maja konfiguracje L.Arg = arginina Asp = kwas asparaginowy Glu = kwas glutaminowy Gly = glicyna Ile = izoleucyna Leu = leucyna Poza tym stosuje sie nastepujace skróty.P-NA = P-naftyloamid 4-MeO-P-NA = 4-metoksy-p-naftyloamid Bzl = benzyl DCCI = dwucyklohaksylokarbodwuimid DMF = dwumetyloformamid HOBT = a-hydroksybenzotriazol HOSu = N-hydroksyimid kwasu bursztynowego 30 TFA = kwas trójchlorooctowy Ac = acetyl OpNp = p-nitrofenoksy pNa = p-nitroanilid QAE = czwartorzedowa aminoetylosefaroza (Pharmacia 35 Fine Chemicals).Przykladl. Zwiazek o wzorze 1, ciezar molowy 775,3. 240 mg (0,33 milimola) S-2222 i 45 mg (0,39 milimola) HOSu rozpuszcza sie w 1 ml bezwodnego, przedestylowa- 40 nego dwumetyloformamidu, roztwór chlodzi do tempera¬ tury —5°G i dodaje 120 mg (0,58 milimola) DCCI, ze¬ zwalajac na ogrzanie sie mieszaniny do temperatury po¬ kojowej. Po uplywie 4 godzin roztwór chlodzi sie ponownie do temperatury 0 °C, odsacza i przemywa wydzielony dwu- 45 cykloheksylomocznik. Otrzymany roztwór w dwumetylo- formamidzie (okolo 2 ml) chlodzi sie do temperatury 0°C i dodaje 0,1 ml czystej izopropyloaminy i utrzymuje w tem¬ peraturze pokojowej w ciagu okolo 70 godzin, po czym odparowuje roztwór pod zmniejszonym cisnieniem, po¬ zostalosc miesza z 5 ml wody i ponownie odparowuje.Otrzymany produkt rozpuszcza sie w okolo 4 ml 50% wod¬ nego roztworu kwasu octowego i oczyszcza na kolumnie, zawierajacej Sephadex G-15 w 33% wodnego roztworu kwasu octowego, stosujac taka sama mieszanine jako eluent.Frakcje, zawierajaca czysty izopropyloamid, odparowuje sie i chromatografuje na kolumnie, zawierajacej czwarto¬ rzedowa aminoetylosefaroze QAE-25 (Pharmacia Fine Chemicale) w postaci 95% metanolu. Eluent odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza w wodzie i liofilizuje, otrzy¬ mujac 120 mg produktu (47% wydajnosci teoretycznej).Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest jednorodny, Rf = 0,39; [a]o = —30,6° (c = 0,5 w metanolu).Przyklad II. Zwiazek o wzorze 2, ciezar molowy 65 802,3. ¦ .--.109 588 5 Zwiazek ten wytwarza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, ale stosujac piperydyne zamiast izopropyloaminy. Otrzymuje sie 105 mg produktu (40% wydajnosci teoretycznej), analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze jest to produkt jednorodny, Rf = 0,50;- [a] d = —34° (c = 0,5 w metanolu).Przyklad III. Zwiazek o wzorze 3, ciezar molowy 822,3.Zwiazek ten wytwarza sie sposobem analogicznym do opisanego w przykladzie I, ale stosujac dwuetanoloamine zamiast izopropyloaminy. Otrzymuje sie 120 mg produktu (43% wydajnosci teoretycznej), a analiza metoda chroma¬ tografii cienkowarstwowej wykazuje, ze jest to produkt jednorodny, Rr = 0,25; [a] u — —31° (c = 0,5 w me- tanolu). , przyklad IV. Zwiazek o wzorze 4, ciezar molowy Zwiazek ten wytwarza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, ale zamiast S-2222 jako produkt wyjsciow^tosuje sie Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA.HCl. OtrzyT muje sie J00 mg (40% wydajnosci teoretycznej) jednorod¬ nego produktu, Rf « 0,40; [a]D = —20,1° (c = 0,5 w metanolu).Przyklad-V. Zwiazek o wzorze 5, ciezar molowy 818,3.Zwiazek ten wytwarza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie IV, ale stosujac morfoline zamiast izopropyloaminy. Otrzymuje sie 95 mg (35% wydajnosci 25 teoretycznej) jednorodnego produktu, Rf = 0,46; [a] d = = —24,*2W:i (c = 0,5 w metanolu).Przyklad VI. Zwiazek o wzorze 6, ciezar molowy 810,4. a) 0,1 mg trypsyny dodaje sie do roztworu 400 mg estru metylowego S-2222 (przyklad I) w 240 ml 0,lm wodnego roztworu NaHG03 o wartosci pH = 8,2. Po uplywie 30 minut pNA odszczepia sie i wówczas dodaje sie 3 ml stezonego kwasu octowego, uzyskujac roztwór o wartosci pH = 4,2. Produkt liofilizuje sie, rozpuszcza w metanolu i chromatografuje na kolumnie Sephadex LH-20 w me¬ tanolu, eluujac metanolem, po czym czysty kwas o wzorze 6a wyosobnia sie przez liofilizacje, otrzymujac 295 mg (88% wydajnosci teoretycznej) produktu, którego wartosc Rf = 0,12. b) 50 mikrolitrów PC13 (0,055 milimola) rozpuszcza sie 1 ml bezwodnej pirydyny i chlodzac w kapieli lodowej dodaje do roztworu 231 mg (0,11 milimola) 4-MeÓ-3- -NA.HC1 w 5 ml bezwodnej pirydyny, po czym miesza w ciagu 30 minut i nastepnie do 1/10 otrzymanego klarow¬ nego roztworu w kapieli lodowej dodaje 65,5 mg (0,10 milimola) zwiazku o wzorze 6a. Mieszanine pozostawia sie na okres 48 godzin, po czym odparowuje i oleista po¬ zostalosc rozpuszcza w kilku ml 90% metanolu, a nastepnie oczyszcza w kolumnie, zawierajacej QAE.25 w postaci chlorku, eluujac 90% metanolem. Frakcje, zawierajaca czysty 4-metoksy-p-naftyloamid, odparowuje sie, po¬ zostalosc rozpuszcza w wodzie i liofilizuje. Otrzymuje sie 24 mg (30% wydajnosci teoretycznej) produktu o wzorze 6. Otrzymany produkt jest jednorodny, jego wartosc Rf = = 0,42 i [cx]d = —31,2° (c *= 0,5 W Metanolu).Przyklad VII. Zwiazek o wzorze 7, ciezar molowy 803,3.Zwiazek ten wytwarza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, stosujac zamiast izopropyloaminy równowazna ilosc morfoliny. Otrzymuje sie 145 mg (55% 6 wydajnosci teoretycznej) zwiazku o wzorze 7. Jest to pro¬ dukt jednorodny o wartosci Rf = 0,35 i [a]^ = —37° (c = 0,5 w 50% roztworze wodnym kwasu octowego).Przyklad VIII. Zwiazek o wzorze 8, ciezar molowy 5 845,4. a) 1,69 mg (2 milimola) JMle-Glu(OBzl)-Gly-Arg(N02) pNA.TFA rozpuszcza sie w 4 ml dwumetyloformamidu i w temperaturze ponizej —10°C traktuje trójetyloamina az do uzyskania odczynu zasadowego, po czym do roz- l° tworu dodaje sie 435 mg (2,2 milimola) AcOpNp. Po uplywie 24 godzin roztwór odparowuje sie i oleista po¬ zostalosc przekrystalizowuje z uwodnionego metanolu, otrzymujac 1,40 mg (89% wydajnosci teoretycznej) Ac- -Ile-Gbl(OBzl)-Gly-Arg(N02)pNA. 15 b) 1,0 g (1,27 milimola) zwiazku, otrzymanego w sposób opisany w punkcie (a)) traktuje sie fluorowodorem w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C, po czym odparowuje i pozostalosc rozpuszcza w 10% roztworze wodnym kwasu octowego, a nastepnie oczyszcza, chromatografujac na" 2D kolumnie Sephadex G 15 w 10% roztworze kwasu octo^ wego, eluujac takim samym roztworem. Frakcje, zawiera¬ jaca czysty produkt zabezpieczony fluorowodorem, lio¬ filizuje sie, a nastepnie chromatografuje na kolumnie QAE.25 w postaci chlorku, eluujac 90% roztworem wodnym 25 kwasu octowego. Czysty Ac^Ile-Glu-Gly-Arg-pNA.HCl wyosobnia sie przez liofilizacje, otrzymujac 660 mg pro¬ duktu (75% wydajnosci teoretycznej). c) 227 mg (0,33 milimola) zwiazku, otrzymanego w spo¬ sób opisany w punkcie (b), poddaje sie reakqi, opisanej 30 w przykladzie Jh ojpyroujae 117 m8 (42% wydajnosci teoretycznej) zwiazku o wzorze 8. Próba na drodze chroma¬ tografii cienkowarstwowej wykazuje, ze zwiazek ten jest 23 produktem jednorodnym, Rf = 0,47 i [a] u = —31° (c = 0,5 w metanolu).Przyklad IX. Oznaczenie Km i Vmaks. Wartosci te oblicza sie z równania Linowearer — Burk: 1 Km 1 1 v0 Vmaks. S0 Vmaks. 40 Enzym i produkt wyjsciowy miesza sie w roztworze buforowym i za pomoca spektrofotometru mierzy predkosc hydrolizy, przy czym zmienia sie stezenie produktu wyjscio¬ wego S0, utrzymujac stale stezenie enzymu. Odwrotnosc 45 predkosci —-nanosi sie na wykres w zaleznosci od odwrot- v0 nosci stezenia produktu wyjsciowego— i oblicza wartosci "" ,:. ¦; -,.... . . ... S0 . , Km i Vniaks. z uzyskanego wykresu Linewearer — Burk'a. 50 Stosuje sie nastepujace odczynniki: Substancja buforowa: trój [trój (hydroksymetylo)amino- metan] o stezeniu 0,05 mola/litr; pH = 8,3; I = 0,25 (NaCl).Enzym: Diagen (6,4 Denson U) (Diagnostic Reagents), 55 1 ampulke rozpuszcza sie w 2 ml wody.Produkt wyjsciowy: 2 milimole produktu wyjsciowego rozpuszcza sie w 1 litrze wody.Sposób postepowania. Miesza sie skladniki nastepujaco: substancja buforowa, 37°C 2400 — 1850 mikrolitrów w enzym, 20°C 50 mikrolitrów produkt wyjsciowy, 37°C 50— 600 mikrolitrów Ilosci skladników dobiera sie tak, aby otrzymac 2500 mikrolitrów mieszaniny, w której nastepnie odczytuje sie zmiane absorbancji, to jest A OD/minute, przy dlugosci 65 fali 405 milimikronów i w temperaturze 37CC.109 588 Wzgledna aktywnosc: Roztwór buforowy, 37 °C Enzym, 20 °C Produkt wyjsciowy, 37°C 2200 mikrolitrów 50 mikrolitrów 250 mikrolitrów Skladniki miesza sie i odczytuje zmiane absorbancji A OD/minute, przy dlugosci fali 405 milimikronów i w tem¬ peraturze 37 °C. Wyniki prób podano w tablicy.Tablica Km, Vmaks. i wzgledna aktywnosc Produkt wyjsciowy Znany S-2222 Produkt z przy¬ kladu I Produkt z przy¬ kladu II Km 104 moli/litr 8,3 5,6 1/7 Vmaks 108 moli/minute U 8,6 20,0 8,6 Wzgledna aktyw¬ nosc 100 340 300 10 15 20 8 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowych, chromogenicznych sub- stratów dla enzymów do laboratoryjnego oznaczania pro- teaz serynowych, a zwlaszcza do celów analitycznych przy oznaczaniu czynnika Xa, które to substraty maja ogólny wzór Rj-Ile-A-Gly-Arg-NH-Rj, w którym Rt oznacza grupe acylowa, korzystnie grupe acetylowa lub benzoilowa, R2 oznacza grupe p-nitrofenylowa, P-naftylowa lub 4-me- toksy-P-naftylowa i A oznacza grupe Asp lub Glu, której grupa karboksylowa jest podstawiona przez aminowanie, tworzac grupe amidowa, zawierajaca 1 lub 2 rodniki alki¬ lowe o 1—6 atomach wegla, 1 lub 2 rodniki hydroksy- alkilowe o 2—6 atomach wegla albo 1 lub 2 rodniki alkilo- aminoalkilowe o 2—6 atomach wegla, lub stanowiaca czesc szescioczlonowego pierscienia heterocyklicznego, znamien¬ ny tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze Ri-Ile-B-Gly-Arg- -NH-R2, w którym Rt i R2 maja wyzej podane znaczenie i B oznacza nie podstawiona grupe Asp lub Glu z wolna grupa karboksylowa, poddaje sie reakcji z amina, taka jak alkiloamina o 1—6 atomach wegla, hydroksyalkiloamina o 2—6 atomach wegla, alkiloaminoalkilóamina o 2—6 atomach wegla, piperydyna albo morfolina, przy czym reakcje te prowadzi sie metoda analogiczna do metod stosowanych w tego typu reakcjach w chemii peptydów Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA- HCl C0NH-CH(CH,) hlzór 1 Vi Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA- HCl COf^jj) Wzór Z Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA- HCl C0N(CH2-CHr0H)2 mor 3 Bz -Ile -Asp-Gly -Arg-pNA- HCl C0NH - CH (CH3) L Nzór 4 Bz-lle -Asp-Gly-Arg-pNA- HCl COt^HjD Wzór 5109 588 Bz-lle -Glu-Gly-Arg-^-MeO-ygNA-Ha CONH-CH-CH3)2 WzórS Bz - Ile -Glu - Gly - Arg - OH CONH-CH(CHj)j.Wzór 6a Bz- Ile - Glu - Gly - Arg - pNA • HCl i aa CON H O \ / Wzór 7 Ac- Ile - Glu - Gly - Arg- pNA • HCl I AA COISI H IMzór 6 PL PL PL PL PL