Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych, chromogenicznych substratów dla enzy¬ mów.Substraty wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku nadaja sie do oznaczania czynnika Xa CE.C. 3, 4, 21.6) albo do badania reakcji powodujacych wy¬ twarzanie sie tego czynnika, inhibitujacych jego dzialanie lub powodujacych jego niweczenie, a na¬ wet do oznaczania czynników wplywajacych na przebieg takich reakcji albo bioracych w nich udzial.Czynnik X jest kluczowa substancja w szeregu reakcji, prowadzacych do krzepniecia krwi. Pobu¬ dzanie czynnika X powoduje wytwarzanie czynnika Xa, bedacego proteolitycznym enzymem, od którego zalezy bezposrednio przemiana protrombiny, w trombine, polegajaca na rozszczepianiu dwóch wia¬ zan peptydowych w czasteczce protrombiny. Te dwa miejsca rozszczepiania sa poprzedzane przez dokladnie taka sama sekwencje aminokwasowa: -Ile-Glu-Gly-Arg-.Prosta metoda oznaczania scinajacego czynnika Xa jest bardzo cenna dla celów diagnostycznych.Najlepszymi ze znanych dotychczas odczynników do oznaczania czynnika Xa sa chromogeniczne substraty peptydowe z sekwencja aminokwasowa -Ile-Glu-Gly-Arg-, odpowiadajaca sekwencji po¬ przedzajacej miejsca rozszczepiania naturalnego substratu protrombiny. Substrat w postaci benzoilo- -Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilidu (S-2222), bedacy najlepszym substratem z tego szeregu, ma sekwen- io u 20 25 30 cje aminokwasowa identyczna z wyzej opisana czescia naturalnego substratu. Substrat ten znalazl juz zastosowanie w klinicznych oznaczeniach np. antyezynnika Xa i heparyny (A. N. Teien, M. Lic i U. Abildgaard, Thrombosis Research 8, 413; 1976).Metoda ta jest oparta na nastepujacej reakcji: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNa ^ - Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+pNa Uwolniony p-nitroanilid (pNA) ma maksimum absorpcji swiatla rózniace sie od odpowiedniej war¬ tosci dla substratu i przebieg enzymatycznej reakcji mozna latwo sledzic, mierzac wzrost absorpcji przy dlugosci fali 405 milimikronów, proporcjonalny d« ilosci aktywnego czynnika Xa.L. Aureli G. Claeson, G. Karlsson i P. Friberger w publikacji Peptides 1976, str. 191, Protokól z XIV Europejskiego Sympozjum Peptydowego, odbytego w Waipor, Belgia, 1976, opisali liczne syntetyczne substraty dla czynnika Xa. Aminokwasy w natu¬ ralnej sekwencji byly rózne i kolejno zastepowano je innymi, podobnymi aminokwasami, ale w zada¬ nym przypadku nie otrzymano substratu lepszego niz S-2222. Nawet bardzo male zmiany w natural¬ nej sekwencji, takie jak zastapienie Ile przez Leu; dawaly substraty o znacznie mniejszej* czulosci.Nowe chromogeniczne substraty wytwarzane* spo¬ sobem wedlug wynalazku stanowia zwiazki lub* sale zwiazków o wzorze: Ri-Ile-A-Gly-Arg-NH-R2, w którym Ri oznacza grupe acylowa, korzystnie grupe acetylowa lub benzoilowa, R2 oznacza grupe p-ni- 110 803110803 trofenylowa, /tf-naftylowa albo 4-metoksy-/?-nafty- lowa, to je;;t grupy aromatyczne dajace w wyniku enzymatycznej hydrolizy chromoforowy lub flu¬ orescencyjny zwiazek o wzorze R-NH2, A oznacza grupe Asp albo Glu, podstawiona w grupie kar¬ boksylowej przez estryfikacje. Wytworzone grupy estrowe zawieraja rodnik alkilowy o 1—6 atomach wegla, rodnik hydroksyalkilowy o 2—6 atomach wegla, rodnik alkiloaminoalkilowy o 2—6 atomach wegla albo rodnik cykloalkilowy o 5 lub 6 ato¬ mach wegla.Grupe y-karboksylowa naturalnego kwasu glu¬ taminowego, która przy biologicznej wartosci pH ma ladunek ujemny i jest grupa hydrofilowa zgod¬ nie z wynalazkiem zastepuje sie znacznie wieksza grupa, bedaca grupa obojetna i lipofilowa. Ponie¬ waz w wyniku znanych dotychczas zmian natural¬ nej sekwencji -Ile-Glu-Gly-Arg- otrzymywano tylko substraty o posledniej jakosci (L. Aureli, G. Cla- eson, G. Karlsson i P. Friberger, Peptides, 1976, str. 191, Protokól z XIV Europejskiego Sympozjum Peptydowego, odbytego w Weipon, Belgia, 1976), przeto jest faktem wysoce nieoczekiwanym, ze sto¬ sunkowo male zmiany dokonane sposobem wedlug wynalazku powoduja, ze otrzymuje sie substraty o wyraznie lepszych wlasciwosciach (patrz tablica) w porównaniu z najlepszym ze znanych dotychczas substratem S-2222. Najbardziej zaskakujace jest po¬ wazne zmniejszenie stalej Michaelisa (Km), majace najwieksze znaczenie praktyczne substratów wy¬ twarzanych zgodnie z wynalazkiem.Stala Km oznacza stezenie substratu, niezbedne dla osiagniecia polowy maksymalnej predkosci ^mAs • Znane substraty, a takze substraty wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku, maja ograni¬ czona rozpuszczalnosc, totez przy stosowaniu ich W praktyce w roztworze buforowym i w plazmie krwi ich stezenie powinno byc mniejsze od 1 mM.W przypadku substratu S-2222, którego Km = ** 0,83 mM, mozna w pelni wykorzystywac tylko polowe Vnwks, podczas gdy stosujac substraty wy¬ tworzone sposobem wedlug wynalazku, majace .stala Km 2—5 razy mniejsza, mozna znacznie lepiej wykorzystywac predkosc maksymalna. Z tego wzgledu, mierzac wspólczynnik aktywnosci Xa za pomoca substratów wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku uzyskuje sie wyrazne korzysci. Czulosc tych nowych substratów jest o kilkaset procent wyzsza od czulosci S-2222, co umozliwia pomiary wiele dokladniejsze, przy znacznie nizszej granicy czulosci i przy znacznie mniejszej objetosci próbki krwi.Badanie enzymów za pomoca chromogenicznych substratów prowadzone jest korzystnie przy uzyciu m samoczynnych analizatorów, a wieksza czulosc tych nowych substratów umozliwia skracanie czasu re¬ akcji w aparacie do badan i tym samym wykony¬ wanie analiz wiekszej liczby próbek w jednostce czasu. Sposobem wedlug wynalazku nowe substraty wytwarza sie z chromogenicznych albo fluoroscen¬ cyjnych substratów o wzorze Ri-Ile-B-Gly-Arg-NH- -R$, w którym Ri i R2 maja wyzej podane znacze¬ nie i B oznacza nie podstawiona grupe Asp albo Glu z wolna grupa karboksylowa, poddajac je re- gkcji z alkoholem o 1—6 atomach wegla, z hydro- 10 20 25 35 40 45 50 15 •0 C5 ksyalkiloalkoholem o 2—6 atomach wegla, z amino- alkiloalkoholem o 2—6 atomach wegla lub cykloal- kiloalkoholem o 5 lub 6 atomach wegla. Reakcje te prowadzi sie metoda analogiczna do metod stosowa¬ nych w tego typu reakcjach peptydów.Wynalazek zilustrowano w nizej podanych przy¬ kladach, w których jako czynnik absorpcyjny przy analizie eluatów i produktów metoda chromato¬ grafii cienkowarstwowej stosuje sie plytki szklane z zelem krzemionkowym F254 firmy Merck. Jako rozpuszczalnik stosuje sie uklad zawierajacy chlo¬ roform, metanol, kwas octowy i wode w stosunku objetosciowym 34 : 4 : 9 : 2. Po chromatografii plytki bada sie najpierw w swietle nadfioletowym (254 mi- limikrony) i nastepnie stosujac reakcje chlor/tolu- idyna [G. Pataki, Dunnschichtchromatografie in der Aminosaure — und Peptidchemie, Walter de Cruyter und Co Berlin, str. 125, (1966)] jako metode rozwijania.Skróty stosowane w opisie i zastrzezeniach maja nastepujace znaczenie.Aminokwasy.Skróty odnosza sie do reszt aminokwasów. Wolny aminokwas albo peptyd oznacza sie przez podanie H przy grupie aminowej i OH przy grupie karbo¬ ksylowej. Grupa aminowa jest zawsze podawana po stronie lewej, a grupa karboksylowa po stronie prawej. Jezeli nie zaznaczono inaczej wszystkie stosowane aminokwasy maja konfiguracje L.Arg = arginina Asp = kwas asparaginowy Glu = kwas glutaminowy Gly = glicyna Ile = izoleucyna Leu = leucyna Poza tym stosuje sie nastepujace skróty.Ac = acetyl AcOH = kwas octowy Bz = benzoil DCCI = dwucykloheksylokarbodwuimid DMF = dwumetyloformamid HOBT = a-hydroksybenzotriazol /?-NA = /?-naftyloamid 4-MeO-/?-NA = 4-metoksy-/?-naftyloamid MeOH = metanol OET = etyloksy OMe = metyloksy OizoPr = izopropyloksy pNA = p-nitroanilid QAE = czwartorzedowa aminoetylosefarzo- za (Pharmacia Fine Chemicals) Przyklad I. Bz - Ile - Glu(OMe) - Gly - Arg- -pNA.HCl (ciezar molowy 748,2). Chroniac przed dostepem wilgoci, w temperaturze 0°C, 30 mikro- litrów przedestylowanego SOCl2 dodaje sie do 0,5 ml absolutnego metanolu i po przejsciu ozy¬ wionej reakcji roztwór pozostawia sie na okolo 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym do¬ daje sie 75 mg (0,10 milimola) Bz-Ile-Glu-Gly-Arg- -pNA.HCl (S-2222). Nastepnie miesza sie roztwór w ciagu 5 godzin, po czym odparowuje i oleista pozostalosc rozpuszcza w malej ilosci metanolu i oczyszcza metoda chromatografii zelowej na ko¬ lumnie zawierajacej Sephadex L.H-20 (Pharmacia Fine Chemicals) w metanolu i eluujac metanolem,¦5 110 803 \ Po odparowaniu metanolu czysty ester metylowy rozpuszcza sie w wodzie i liofilizuje. Otrzymuje sie 30 mg produktu (40% wydajnosci teoretycznej) Badanie metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest homogeniczny.Rf =0,33. [alg* =—40,3° (c = 0,5; 50% HOAc(H20).Przyklad II. Bz - Ile - Glu(OET) - Gly - Arg- -pNA.HCl (ciezar molowy 762,2). Chroniac przed wilgocia, w temperaturze —10°C, 60 mikrolitrów przedestylowanego SOCI2 dodaje sie do 1,0 ml absolutnego etanolu, utrzymuje w temperaturze po¬ kojowej w ciagu 30 minut i dodaje 150 mg S-2222.Po zakonczeniu reakcji trwajacej okolo 15 godzin (próba metoda chromatografii cienkowarstwowej) roztwór odparowuje sie, 'oleista pozostalosc roz¬ puszcza w malej ilosci 30% roztworu wodnego kwasu octowego i oczyszcza metoda chromatogra¬ ficzna na kolumnie zawierajacej Sephadex C-15 (Pharmacia Fine Chemicals) w 10% roztworze wod¬ nym kwasu octowego. Czysty ester etylowy od¬ dziela sie z eluatu przez liofilizacje, otrzymujac 70 mg produktu (46% wydajnosci teoretycznej).Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest jednorodny.Rf =0,40; [a]2,0 =—37,7° (c = 0,5 w HOAc(H20).Przyklad III. Bz-Ile-Glu(OizoPr) - Gly - Arg- -pNA.CHl (ciezar molowy 776,3). Synteze prowadzi sie sposobem opisanym w przykladzie II, ale nie w etanolu, lecz w absolutnym izopropanolu. Re¬ akcja trwa 16 godzin, po czym chromatografuje sie i liofilizuje jak w przykladzie II, otrzymujac 90 mg produktu (58% wydajnosci teoretycznej). Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wyka¬ zuje, ze produkt jest jednorodny, Rf = 0,44; [a]™ — = 36,4° (c = 0,5 w 50% HOAc(H20).Przyklad IV. Bz-Ile-Glu(0-cykloheksylo)-Gly- -Arg-pNA.HCl (ciezar molowy 833,3). 60 mikroli¬ trów SOCI2 dodaje sie do 1,0 ml bezwodnego cyklo- heksanolu i po uplywie 1 godziny w temperaturze pokojowej dodaje sie 200 mg S-2222. Po uplywie okolo 12 godzin reakcja dobiega konca i wówczas roztwór odparowuje sie i pozostalosc chromatogra¬ fuje, a* nastepnie liofilizuje produkt jak podano w przykladzie II,. otrzymujac 170 rag produktu (75% wydajnosci teoretycznej). Analiza metoda chroma¬ tografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest jednorodny, Rf =0,50; [a]2^ =—38,6° (c = 0,5 w 50% HOAc(H20).Przyklad V. Bz-Ile-Glu-[0-CH2CH2N(CH3)2]- -Gly-Arg-pNA.HCl (ciezar molowy 859,8). 75 mg (0,10 milimola) S-2222 i 100 mg (0,8 milimola) Chlo¬ rowodorku dwumetyloaminoetanolu rozpuszcza sie w 1,0 ml bezwodnego dwumetyloformamidu, po czym dodaje 10 mililitrów pirydyny, 10 mg (0,074 mi¬ limola) HOBT i na koniec 25 mg (0,12 milimola) DCCI. Po uplywie okolo 24 godzin odsacza sie wy¬ dzielony dwucykloheksylomocznik i przesacz odpa¬ rowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista po¬ zostalosc rozpuszcza sie w malej ilosci metanolu zawierajacego 5% wody i oczyszcza na kolumnie wymieniacza jonowego QAE-25 w postaci chlorku.Jako eluent stosuje sie równiez metanol zawiera¬ jacy 5% wody, otrzymujac chlorowodorek estru dwumetyloaminowego podanego wyze;j peptydu nie zawierajacy innych peptydów, ale nieco zanieczysz¬ czony, np. chlorowodorkiem dwumetyloaminoeta¬ nolu. Frakcje glówna odparowuje sie i oczyszcza na kolumnie zawierajacej Sephadex C-15 (Phar- f macia Fine Chemical), eluujac 10% HOAc(H20).Roztwór czystego estru liofilizuje sie, otrzymujac 60 mg produktu (58% wydajnosci teoretycznej).Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest jednorodny, Rf = 0,50; 10 Md° = —35,0° (c = 0,5; 50% HOAc(H20).Przyklad VI. Bz-Ile-Asp(OizoPr) - Gly - Arg- -pNA.HCl, ciezar molowy 762,3. Do 0,5 ml. bezwod¬ nego izopropanolu dodaje sie 30 mikrolitrów desty¬ lowanego. SOCl2 i po uplywie 30 minut w tempera- 1* turze pokojowej dodaje sie 73 mg (0,10 milimola) Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA.HCl (ciezar molowy 720,2).Po uplywie okolo 18 godzin reakcja dobiega konca i wówczas roztwór odparowuje sie, pozostalosc chromatografuje i liofilizuje, jak opisano, w przy- 20 kladach II, III i IV. Otrzymuje sie 32 mg (42% wy¬ dajnosci teoretycznej) jednorodnego produktu, Rf = 0,46; [a]2,3 = —22,7° (c = 0,5 w HOAc(HjQ),.; Przyklad VII. Bz - Ile - Asp(OEt) - Gly - Arg- n -pNA.CHl, ciezar molowy 748,2. Zwiazek ten wy¬ twarza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie VI, ale stosujac etanol zamiast izopro¬ panolu. Otrzymuje sie 28 mg (37% wydajnosci te¬ oretycznej) jednorodnego produktu, 30 Rf = 0,40; [a] g = —23,5° (c = 0,5 w 50% HOAc(H2Ó).Przyklad VIII. Bz-Ile-Glu-(OMe)-Gly-Arg-/?- -NA.HC1, ciezar molowy 753,3. (a) 0,1 mg trypsyny (trypsyna wieprzowa, Novo) do¬ daje sie do roztworu 400 mg (0,53 milimola) estru * metylowego S-2222 (przyklad I) w 240 ml 0,1 fn wodnego roztworu NaHC03 o wartosci pH 8,2. *P© uplywie 30 minut wszystek pNA odszczepia sie i wówczas dodaje sie 3 ml stezonego kwasu octo^ wego, uzyskujac wartosc pH 4,2. Produkt-liofilizuje sie, rozpuszcza w metanolu i chromatografuje na kolumnie Sephadex LH-20 w metanolu i eluuje metanolem, po czym chlorowodorek czystego kwasru Bz-Ile-Glu-(OMe)-Gly-Arg-OH liofilizuje ^sie, otrzyj- ^ mujac 286 mg produktu, co stanowi 87% wyc^-f nosci teoretycznej. Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze produkt jest jedno¬ rodny Rf = 0,14. (b) 50 mikrolitrów PC13 (0,055 milimola) rozpuszcza 50 sie w 1 ml bezwodnej pirydyny i chlodzac w kapieli lodowej dodaje do roztworu 158 mg (0,11 milimola) /?-naftyloaminy w 5 ml bezwodnej pirydyny, po czym miesza sie w ciagu 30 minut i nastepnie do 1/10 otrzymanego klarownego roztworu dodaje sie 55 58,2 mg (0,10 milimola) produktu otrzymanego w sposób opisany w ustepie (a). Mieszanine pozosta¬ wia sie na okres 48 godzin, po czym odparowuje i pozostalosc rozpuszcza sie w kilku ml 90% roz¬ tworu wodnego etanolu, a nastepnie oczyszcza na M kolumnie zawierajacej QAE.25 w postaci chlorku, eluujac 90% etanolem. Frakcje zawierajaca czysty /?-naftyloamid odparowuje sie, pozostalosc rozpu¬ szcza w wodzie i liofilizuje, otrzymujac 16 mg (21% wydajnosci teoretycznej) zwiazku o wzorze 15 podanym w tytule przykladu. Otrzymany produkt'UfriMS l 8 ltai lilmwigeniczny; jego wartosc Rf = 0,43 i [a]D = ^ll^-^^30 (G = 0,5 50% roztwór wodny kwasu octo- ¦J&rzyk.Lad- IX. Oznaczanie Km i Vmaks War¬ to^ U oblicza sie z równania Linewearer ^Burk: 1 Km 1 1 v ~" V * S "" V vo fmaks ^o * maks 8ft*ym i produkt wyjsciowy miesza sie w roztworze taalbfowym i mierzy spektrometrycznie predkosc hydrolizy,, przy czym zmienia sie stezenie produktu wyjsciowego S0, utrzymujac stale stezenie enzymu. (frtiWItotnolc predkosci — nanosi sie na wykres w- zaleznosci od odwrotnosci stezenia produktu ^4&ipw€gó — i oblicza wartosc Km i V maks So * Uzyskanego wykresu Linewearer — Burk?a. Sto- BUjg* sf£ nastepujace odczynniki: S&ifitfftOTja buforowa: trój[trój(hydroksymetylo)ami- nometan] o stezeniu 0,05 mola/litr; pH = 8,3; I = 0,25 (NaCl).En*ym: Dlagen (6,4 Denson U) (Diagnostic Reagents), t ampulke rozpuszcza sie w 2 ml wody.Cstdufct wyjsciowy: 2 milimole produktu wyjscio¬ wego rozpuszcza sie w 1 litrze wody.Sposób postepowania.Miesza sie skladniki nastepujaco: substancja buforowa, 37°C 2400—1850 mikrolitrów enzym20°C 50 mikrolitrów prddUkt Wyjsciowy 37°C 50— 600 mikrolitrów Ilosc skladników dobiera sie tak, aby otrzymac 2500 mikrolitrów mieszaniny, w której nastepnie -Mfcfeytaje-tft zmiane absorpcji, to jest JOD/minute, t*z^ dltegosci fali 405 milimikronów i w tempera- Httrze W^C.Wkgiedn* aktywnosc: Itetwdr bllio¥$wy, 37°C 2200 mikrolitrów lteym K^€ 50 mikrolitrów **odtófct WftJScitfwy, 37°C 250 mikrolitrów.Skltodhikii )£§Mft&< sie i odczytuje zmiane absorpcji ifOB/mfftute, przy dlugosci fali 405 milimikronów t^1* tWfcpwfcttofce 37%. Wyniki prób podano w ta- Kracy* Tablica Km, Vmaks. i wzgledna aktywnosc Produkt wyjsciowy Znany S-2222 Produkt z przy¬ kladu I Produkt z przy¬ kladu 11 Produkt z przy¬ kladu III Km. 10* moli/litr 8,3 2,6 2,9 2,1 moli/mi- nute.U 8,6 8,1 7,5 7,1 Wzgle¬ dna ak¬ tywnosc 100 230 200 220 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowych, chromogenicznych substratów dla enzymów do laboratoryjnego ozna¬ czania proteaz serynowych, a zwlaszcza do celów analitycznych przy oznaczaniu czynnika Xa, które to substraty maja ogólny wzór Ri-IIe-A-Gly-Arg- -NH-R2, w którym Ri oznacza grupe acylowa, ko¬ rzystnie grupe acetylowa lub benzoilowa, R2 ozna¬ cza grupe p-nitrofenylowa, ^-naftylowa lub 4-meto- ksy-/?-naftylowa i A oznacza grupe Asp lub Glu, której grupa karboksylowa jest podstawiona przez estryfikacje, tworzac grupe estrowa zawierajaca rodnik alkilowy o 1—6 atomach wegla, rodnik hy- droksyalkilowy o 2—6 atomach wegla, rodnik alki- loaminoalkilowy o 2—6 atomach wegla albo rodnik cykloalkilowy o 5 lub 6 atomach wegla, znamienny tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze Ri-Ile-B-Gly- Arg-NH-R2, w którym Ri i R2 maja wyzej podane znaczenie i B oznacza nie podstawiona grupe Asp albo Glu z wolna, grupa karboksylowa, poddaje sie reakcji z alkoholem o 1—6 atomach wegla, z hydro- ksyalkiloaikoholem o 2—6 atomach wegla, z amino- alkiloalkoholem o 2—6 atomach wegla lub z cyklo- alkiloalkoholem o 5 lub 6 atomach wegla;, przy czym reakcje prowadzi sie w znany sposób. ii 11 20 so 35 OZGraf. Z.P. Dl-wo, z. 423 (90+15) 4.82 Cena 45 zl PL