HU176983B - Sposob poluchenija specificheskikh khromogennykh novykh proizvodnykh tetrapeptida kak ehnzimnykh substratov - Google Patents
Sposob poluchenija specificheskikh khromogennykh novykh proizvodnykh tetrapeptida kak ehnzimnykh substratov Download PDFInfo
- Publication number
- HU176983B HU176983B HU77KA1497A HUKA001497A HU176983B HU 176983 B HU176983 B HU 176983B HU 77KA1497 A HU77KA1497 A HU 77KA1497A HU KA001497 A HUKA001497 A HU KA001497A HU 176983 B HU176983 B HU 176983B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- group
- glu
- ile
- asp
- gly
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/28—Bound to a nonpeptide drug, nonpeptide label, nonpeptide carrier, or a nonpeptide resin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás uj, specifikus kromogén enzim-szubsztrátumok előállítására. Az uj szubsztrátumok alkalmasak az Xa faktor /E.C. 3, 4, 21.6/meghatározására vagy olyan reakciók tanulmányozására, amelyek során Xa faktor képződik, inhibitálódik vagy átalakul, sőt az uj szubsztrátumok alkalmasak akár olyan faktorok meghatározására, amelyek befolyásolják az említett reakciókat vagy résztvesznek bennük.
Ismeretes, hogy az X faktor a vér koagulálásához vezető reakciósor egyik kulcsfontosságú anyaga. Ha az X faktor aktiválódik, akkor az Xa faktor - amely nem más, mint egy proteolitikus enzim - képződik, amely viszont —2 — közvetlenül felelős a protrombin trombinná való átalakulásáért. Ha a protrombin az Xa faktor hatására trombinná alakul át, akkor molekulájában két enzimkötés felhasad. E két hasítási helyet pontosan ugyanaz az aminosav-sorozat, éspedig az -Ile—Glu—Gly—Arg- sorozat előzi meg.
Az Xa koagulációé faktor meghatározására egy egyszerű módszer rendkívüli diagnosztikai jelentőséggel bir. Az Xa faktor meghatározására eddig ismertté vált legjobb reagensek olyan kromogén peptid-szubsztrátumok, amelyekben -Ile-GlueGly-Arg- aminosav-sorozat, tehát a természetes protombrinban lévő hasítási helyeket megelőző aminosav-sorozattal azonos szekvenciáju aminosav-sorozat van.
Az ebbe a sorozatba tartozó legjobb szubsztrátumnak, a benzoil-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitro-anilidloklrid sójának továbbiakban az egyszerűség kedvéért az S-2222 kódszám alatt fogjuk említeni/ aminosav-szekvenciája pontosan megegyezik a természetes szubsztrát tárgyalt részének szekvenciájával. Az S-2222 szubsztrátumot már a klinikai gyakorlatban alkalmazzák például X a koagulációé faktor és heparin kimutatására [Teien, A.N., Lie, M. és Abilgaard, U.: Thrombosis Research, 8, 413 /1976/ J. E kimutatási módszerek az alábbi reakción alapulnak: Bz-Ile-GlUí-Gly-Arg-pNA } Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + pNA
A felszabaduló p—nitro—anilid /pNA/ fényabszorp— ciójának maximuma eltérő a szubsztrátűmétől, és igy az enzimatikus reakció könnyen követhető a 405 nanométernél jelentkező abszorpció növekedésének mérése utján, amely nöekedés aranyos a reakcióképes Za faktor mennyiségével.
Aurell, L.t Claeson, G., Karlsson, G. és Friberger, P· a Peptides, 1976, 191 /*Proceedings from the ZIVth European Peptide Síymposium in Weipon, Belgium, in 1976”/ szakirodalmi helyen az Za faktorhoz használható igen nagy számú szintetikus szubsztrátumot ismertetnek· E szubsztrátumok szerkezetében az a különbség, hogy a természetes aminosavszekvenciét változtatták, igy például sorra kieserélték a természetes aminosavszekvencia egyes aminosavait más hasonló aminosavakkal, azorbajegyetlen esetben sem kaptak az S-2222-nél jobb szubsztrátumot· A természetes szekvencia akár legkisebb mértékű változtatása, például Ile helyett Leu alkalmazása esetén jóval kisebb érzékenységű szubsztrátumot kaptak*
Azt találtuk, hogy az
Rj— L—Ile.—A— L—Gly — L—Arg —EH—Rg általános képletű kromogén enzimszubsztrátumok - ahol
R-j. jelentése 1-4 szénatomos alifás acilcsoport vagy benzoilcsoport,
R2 jelentése p-nitro-fenil-csoport,
A jelentése L-Aep vagy L-Glu, melyek *r-karboxilcsoportja helyettesítve mán egy 1-4 szénatomos alkil-, 3-8 szénatomos cikloalkil- vagy di(l-4 szénatomosjalkil -amino-(l-4 szénatomoBj-alkil -csoporttal, vagy egy vagy két 1-4 szénatomos alkil-csoporttal, vagy hidroxi-(l-4 szénatomos)-alkil -csoport176983
-4tal helyettesített amidoceoporttal, vagy egy olyan heterociklusos csoporttal, ahol az amidocsoport tagja egy piperidin- vagy morfolingyürünek kiváló kromogén szubsztrátumok, éspedig enzimatikus hidrolíziskor egy általános képletű, kromogén vagy fluoreszcens vegyületet - ahol Rg jelentése a fenti - adnak, amelyet meghatározva közvetve meg tudjuk határozni az Xa faktor mennyiségét.
A Glu természetes /jwhelyzetü karboxilcsoportját amely biológiai pH-kon negatív töltésű és hidrofil karakterű - a találmány értelmében tehát egy jóval nagyobb méretű, semleges és lipofil karakterű csoporttal helyettesítjük. Tekintettel arra, hogy az -Ile-Glu-Gly-Arg- természetes szekvencia korábban végrehajtott változtatása csak negatív eredményt hozott /lásd Aurell, L. és munkatársai korábban említett publikációját/, rendkívül meglepőnek kell tekintenünk, hogy a találmány értelmében végrehajtott, viszonylag nagy mértékű szerkezetváltoztatás ellenére is a találmány szerinti szubsztrátumoknak alapvetően jobbak a tulajdonságaik /lásd a későbbiekben ismertetésre kerülő
I. táblázatot/, mint az eddig ismert legjobb szubsztrátumé, az S-2222-é. A líichaelis-konstans /Km/ drasztikus mértékű csökkenése a leginkább meglepő és a gyakorlati munka szempontjából a találmány szerinti szubsztrátqmok alkalmazása esetében elérhető legfontosabb előny. A/Km-et/ugy definiáljuk, mint azt 8 ezubsztrátum-koncentrációt, amely a maximális sebesség /Vmax/ felének eléréséhez szükséges.
Az eddig ismert szubsztrátumok és a találmány szerinti szubsztrátumok korlátozottan oldhatók és igy a gyakorlati munka során puffercldatokban és vérplazmában dolgozva koncentrációjukat 1 millimól alatt kell tartani. Az
S-2222 esetében - amelynek/Km/értéke egyenlő 0,83 millimóllal - csak a/Vmax/'felét lehet kihasználni, mig a találmány szerinti szubsztrátumok esetében - amelyek/Km/értéke kétszer-ötször kisebb - a maximális hidrolizisaebességet jobban ki lehet használni. így nyilvánvaló előnyök jelentkeznek, ha az Xa faktor aktivitásának meghatározását a találmány szerinti szubsztrátumok valamelyikével végezzük. Érzékenységük ugyanis az S-2222-énél néhány száz százalékkal nagyobb, ami jóval nagyobb pontosságot, alapvetően alacsonyabb érzékenységi küszöböt és a vérminta térfogatának jelentős mértékű csökkentését teszi lehetővé.
A találmány szerinti kromogén szubsztrátumok segítségével végzett enzimanalizisek felettéb alkalmasak automatikusan működő analizátorokban való végrehajtásra, és nagyobb érzékenységükre tekintettel az analizátorokban rövidebb reakcióidőkre van szükség, amiáltal egy adott időegységen belül több minta analizálható.
A találmány szerinti I általános képletű szubsztrátumokat és sóikat úgy állítjuk elő, hogy egy megfelelő I általános képletű, de A helyén helyettesitetlem Asp vagy Glu aminosavat hordozó vegyületet észterré vagy amiddá alakítunk úgy, hogy az Asp vagy Glu szabad karboxilcsoportjat a peptidkemiaban jól ismert módszerek valamelyikével egy alkohollal vagy aminnal
- 6 reagáltatjuk, és kívánt esetben a kapott terméket ismert módon sóvá alakítjuk. Kiindulási anyagként tehát vagy B-helyzetben szabad karboxilcsoportot hordozó, -Ile-Glu-Gly-Arg- vagy -Ile-Asp-Gly-Arg- szekvenciáju kromogén vagy fluorogén anyagokat használunk.
A találmányt közelebbről az alábbi kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani.
A kiviteli példákban említett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat a Merek cég által gyártott Silicagel je^ésü anyaggal bevont üveglapokon hajtjuk végre, futtatóazerként kloroform, metanol, ecetsav és viz 34 : 4 í 9 : 2 arányú elegyét használva. A futtatás végrehajtása után a lemezeket először ibolyántúli fényben /254 nanométernél/ tanulmányozzuk, majd a klór/toluidin módszerrel /Pataki, G.: ”Dünnschichtchromatografie in dér Aminosaure- und Peptidchemie, 125. oldal; a könyv 1966-ban a Walter de Gruyter Co. nyugatberlini cég gondozásában jelent meg/ előhívjuk.
A leírásban használt rövidítéseket az alábbiakban ismertetjük. Megjegyezzük,hogy az aminosavakkal kapcsolatban használt rövidítések aminosavakból leszármaztatható maradékra utalnak. A szabad aminosavat vagy peptidet az aminocsoportnál egy H- jelöléssel, illetve a karboxilcsoportnál egy OH- jelöléssel jelezzük. Ha csak másképpen nem jelezzük, a felhasznált aminosavak mind L-konfigurációjuak.
- 7 176983
Arg β arginin
Asp = aszparaginsav
Glu a glutaminaav
Gly = glicin
Ile = izoleucin
Leu = leucin
További rövidítések:
Ac = acetilcaoport
AcOH » ecetsav
Bz = benzoilcaoport
DCCI diciklohexil-karbodiimid
DMF = dimetil-formamid
Et^N = trietil-amin
HOBT s öc-hidroxi-benztriazol
HOSu a N-hidroxi-szukcinimid
MeOH s metanol
OEt = etoxicsoport
OMe = metoxicsoport
OpNp ss p-nitro-fenoxicsoport
OisoPr a izopropoxicsoport pNa 8 p-nitro-anilid
QAE = kvaterner amino-etil-Sepharose /a Pharmacia Fine Chemicala uppsalai svéd cég terméke/
SOC12 = tionil-klorid
TLC = vékofltrétegkromatográfiás vizsgálat
1« példa
Bz-Ile-Glu/OMe/-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly: 748,2/ előállítása
- 8 176983
Nedvesség kizárása mellett 0 °C-on 0,5 ml vízmentes metanolhoz 30 mikroliter desztillált SOCl2-ot adunk. A kezdetben élénk reakció befejeződése után a kapott oldatot szobahőmérsékleten közel 15 percen át állni hagyjuk, majd 75 mg /0,1 millimól/ Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNa . HCÉ-ot /vagyis az S-2222 jelzésű anyagot/ adunk hozzá. A kapott oldatot ezután 5 órán át keverjük, majd bepároljuk. A visszamaradó olajat kis mennyiségű metanolban oldjuk, majd a kapott oldatot
Sephadex LH-20 márkanevű gyantát /gyártja a Pharmacia Pine Chemicals/ metanolban tartalmazó oszlopon kromatografáljuk metanollal eluálva. Az eluátumból a metanol eipárologtatása után kapott tiszta metilésztert vízben oldjuk, majd a vizes oldatot liofilizáljuk. Hozam: 30 mg /40 %/
TBC tanúsága szerint a termék homogén, Rf « 0,33. a -40,3° /c a 0,5( HOAc és H20 1 : 1 arányú elegye/.
2. példa
Bz-Ile-Glu/OEt/-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly: 762,2/ előállítása
Nedvesség kizárása mellett -10 °C-on 1,0 ml vízmentes etanolhoz 60 mikroliter desztillált SOClg-ot adunk, majd a kapott oldatot 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk és ezután még 150 mg S-2222-t adunk hozzá. Miután a reakció közel 15 óra elteltével befejeződik /TLC tanúsága szerint/, a reakcióelegyet bepároljuk és a kapott olajat 30 %-os vizes HOAc-oldatból kis mennyi
- 9 176983 séggel felvesszük. Az igy kapott oldatot ezután Sephadex G 15 gyantát /gyártja a Pharmacia Fine Chemicals/ 10 %-os vizes HOAc-oldatban tartalmazó oszlopon átbocsátjuk, az eluátumból elkülönített tiszta etilésztert pedig liofilizáljuk.
Hozam: 70 mg /46 %/.
TLG tanúsága szerint homogén, Rf = 0,40.
s -37,7° /c 0,5z víz és HOAc 1 : 1 arányú elegye/
3. példa
Bz-Ile-Glu/OisoPr/-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly:
776,3/ előállítása
A cím szerinti vegyület előállítását a 2. példában ismertetett módon végezzük azzal a különbséggel, hogy etanol helyett vízmentes izopropanolt használunk. A reakció 16 óra elteltével fejeződik be. A reakcióelegy kromatografálását, majd a termék liofilizálását a 2. példában ismertetett módon végezzük.
Hozam: 90 mg /58 %/.
TLC tanúsága szerint homogén, R^ = 0,44.
= -36,4° /c 0,5j víz és HOAc 1 : 1 arányú elegye/·
4. példa
Bz-Ile-Glu/0-ciklohexil/-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly: 833,3/ előállítása
1,0 ml vízmentes ciklohexanolhoz 60 mikroliter
SOClg-ot adunk, majd a kapott oldatot szobahőmérsékleten órán át állni hagyjuk és ezután 200 mg S-2222-t adunk hozzá. Miután a reakció közel 12 óra elteltével befejeződik,
176.983 a reakcióelegyet bepároljuk és a 2. vagy 3. példában ismer tetett módon kromatografáljtkj illetve az elkülönített terméket liofilizáljuk.
Hozam: 170 mg /75 %/·
TLC tanúsága szerint nomogén, 1^=0,50
M20 « -38,6° /c = 0,5( víz és HOAc 1 : 1 arányú elegye/
5· pá-da
Bz-Ile-GluCO-CH^CH^/CH^J-Gly-Arg-pHA . HC1 /molekulasúly:
859,8/ előállítása
1,0 ml vízmentes, desztillált DMF-ban feloldunk 75 mg /0,1 millimól/ S-2222-t és 100 mg /0,8’ millimól/ dimetilamino-etanol-hidrokloridot, majd a kapott oldathoz 10 mikroliter piridint, 10 mg /0,074 millimól/
HOBT-t és végül 25 mg /0,12 millimól/ DCCI-t adunk.
Közel 24 óra elteltével a kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szürletet pedig csökkentett nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot 95 % MeOH és 5 % víz elegyéből kis mennyiségben oldjuk, majd a kapott oldatot QAE-25 ioncserélő gyantát /klorid-formáju/ tartalmazó oszlopon tisztítjuk, eluálószerként az előbb említett oldószerelegyet használva. így a cim szerinti vegyületet kapjuk, anely ugyan mentes más peptidektől, de tartalmaz kisebb mennyiségekben szennyeződéseket, például dimetilamino-etanol-hidrokloridot. JL terméket tartalmazó frakciót ezután bepároljuk, majd Sephadex G 15 gyantát /gyártja a Pharmacia Fine Chemicals/ tazt almazó oszlopon tisztítjuk 10 %-os vizes HOAc-oldattal eluálva. A kívánt végterméket tartalmazó oldatot végül liofilizáljuk.
- 11 176.983
Hozam: 60 mg /58 %/.
TLC tanúsága szerint homogén, s 0,50.
= -35,0° /c = 0,5, víz és HOAc 1 : 1 arányú elegye/.
6. példa
Bz-Ile-Glu£ NH-CH/CH^/2]-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulmeuly:
775,3/ előállítása ml vízmentes desztillált DMP-ban feloldunk
240 mg /0,33 millimól/ S-2222-t és 45 mg /0,39 miniméi/ HOSu-t, majd a kapott oldatot -5 °C-ra hütjük és 120 mg /0,58 millimól/ DCCI-t adunk hozzá· A reakciőelegy hőmérsékletét ezután szobahőmérsékletre emelkedni hagyjuk, majd 4 óra elteltével ismét 0 °C-ra hütjük, a kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük és mossuk. A szülét és a mosófolyadék egyesítése után kapott, közel 2 ml-nyi DMF-os oldatot 0 °C-ra lehűtjük, majd 0,1 ml tiszta izopropil-amint adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten közel 50 órán át állni hagyjuk, majd csökkentett nyomáson bepároljuk és a maradékot először 5 ml vízzel összekeverjük, majd ismét bepároljuk· A kapott terméket ezután közel 4 ml 50 %—os vizes HOAc—oldatban feloldjuk, majd az oldatot Sephadex G15 gyantát 35 %-os vizes HOAc-oldatban tartalmazó oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk. Eluálószerként ugyancsak 50 %-os vizes HQAc-oldatot használunk. A tiszta terméket tartalmazó frakciót bepároljuk, majd QAE 25 gyantát /klorid-formáju/ tartalmazó oszlopon ioncserének vetjük alá és 95% Me OH és 5% vi elegyével eluáljuk.Az eluátumot betároljuk, vízben oldjuk és végül liofilizáljuk,
Hozam: 120 mg /47 %/.
TLC tanúsága szerint homogén, R^ ® 0,39.
M2 d ;' = -30,6° /c = 0,5, MeOH/.
7. példa
Bz-Ile-Olu/ -piperidino/-Gly-Arg-pNA · HC1 /molekulasúly: 802,3/ előállítása
A cim szerinti vegyület a 6. példában ismertetett módon állítható elő azzal a különbséggel, hogy izopropil-amin helyett piperidint hasznaink.
Hozam: 105 mg /40 %/.
TLC-tanúsága szerint homogén, R^ = 0,50.
Mp5 - -34° /c = 0,5y MeOH/.
8. példa
Bz-Ile-GluL K/CH2-CH2-0H/2]-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly: 822,3/ előállítása
A cim szerinti vegyület a 6. példában ismertetett módon állítható elő azzal a különbséggel, hogy izopropil-amin helyett dietanol-amint használunk.
Hozam: 120 mg /45 %/·
TLC tanúsága szerint homogén, R^ = 0,25.
[a]25 = -31° /c = 0,5t MeOH/.
9. példa
Bz-Ile«Asp/OisoPr/-Gly-Arg-pIfA . HC1 /molekulasúly: 762,3/ előállítása
0,5 ml vízmentes izopropanolhoz 30 mikroliter desztillált SOCl2-t adunk, majd a kapott oldatot 30 percen át állni hagyjuk és ezután hozzáadunk 73 mg /0,10 millimól/ Bz-Ile-Asp-Gly-árg-pNA . HCIr-ct /molekulasúly: 720,2/.
- 13 176.983
Miután a reakció közel 18 óra elteltével befejeződik, a reakcióelegyet bepároljuk, kromatografáljuk és liofilizáljuk a 2 - 4, példákban ismertetett módszerekkel analóg módon·
Hozam: 32 mg /42 %/.
TLC tanúsága szerint homogá, Rf » 0,46.
ÖO n fccjp = -22,7 /c = 0,5f HOAc és viz 1 : 1 arányú elegye/.
10. példa
Bz-Ile-Asp/OEt/-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly: 748,2/ előállítása
A cim szerinti vegyület a 9. péBában ismertetett módon állítható elő azzal a különbséggel, hogy izcpropanol helyett etanolt használunk.
Hozam: 28 mg /37 %/.
TLC tanúsága szerint homogén, R^ 0,40.
[oejjp s -23,5° /c o 0,5, HOAc ée viz 1 : 1 arányú elegye/.
11. példa
Bz-Ile-Aapf NH-CH/CH^/gl-Gly-Arg-pNA . HC1 /molekulasúly: 761,3/ előállítása
A cim szerinti vegyületet a 6. péBában ismertetett módon állítjk elő azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként S—2222 helyett Bz—He—Asp—Gly-Arg—pNA . HC1 pepiidet használunk.
Hozam: 100 mg /40 %/·
TLC tanúsága szerint homogén, R^ =* b _20,l° /c a 0,5j MeOH/.
0,40.
176.983
12.példa
Bz-Ile-As p /-m o r±'o linó /—G ly -Ar g -pNA .HC1 / molekulasúly; 818,3/ előállítása.
A cim szerinti vegyület a 11. példában ismertetett módon állítható elő azzal a különbséggel, hogy izopropil-amin helyett morfolint használunk.
Hozam: 95 mg /35 %/·
TLC tanúsága szerint homogén, = 0^46.
fej25 = -24,2° /c · 0,5, MeOH/.
/Vma*/meghatározága /Km/ és /Vmax/értéke a Lineweaver-Burk egyenlet szerint számolható ki:
Km
Vmax
Enzimet és szubsztrátumot egy puffer-oldatban elegyítünk, majd spektrofotometriásán mérjük a hidrolízis sebességét. A szubsztrátum koncentrációját /SQ/ változtatjuk, míg az enzim koncentrációját állandó értéken tartjuk. A reciprok sebességet /*g / függvényében ábráo zoljuk, és a kapott Lineweaver-Burk diagrammból 100 és /Nm&xJ értékét meghatározzuk.
A vizsgálathoz az alábbi reagenseket használjuk: Buffer^ 0,05 mól/literes trisz-/hidroximetil/-aminometán /szokásos rövidítéssel: TRIS/, pH-ja 8,3,
Ioneröesége» 0,25 /BfaCl/;
Enzim: Diagen /6,4 Denson-egység/ diagnosztikai reagensből 1 ampulla 2 ml vízben oldva /Xo iogport tartalmaz,gyártja a Diagnosztic Reagents Ltd oxon,Anglia/
- 15 176.983
Szubsztrátum^ vízben oldva 2 millimól/liter koncentrációban
Módszer: 37 °C-os pufferoldat 2400 - 1850 mikroliter 20 °C-os enzim 50 mikroliter $-os szubsztrátumeldat 50 - 600 mikrolite
2500 nxikoliter
A három komponens összekeverése után az abszorpcióképesség változását (optikai sűrűség változása/perc} 405 nanométernél 37 °C-on mérjük.
Relatív aktivitás^ 37 °C-os puffer 2200 mikroliter °C-os enzim 50 mikroliter °C-os szubsztrátum 250 mikroliter
A három komponens összekeverése után az abszorpcióképesség változását (optikai sűrűség változása/percj 405 nanométeréi 37 °C-on mérjük.
A kapott eredményeket az alábbi I. táblázatban foglaljuk össze.
I. táblázat
A 8
Szubsztrátum Km · 104 Vmax . 10 Relatív aktivitás mól/liter mól/min · U
| S-2222 | 8,3 | 8,6 | 100 | |
| 1. példa rinti | sze- | 2,6 | 8,1 | 230 |
| 2. példa rinti | sz e- | 2,9 | 7,5 | 200 |
| 3. példa rinti | sze- | 2,1 | 7,1 | 220 |
| 6. példa rinti | ΘΖΘ- | 5,6 | 20,0 | 340 |
| 7. példa rinti | eze- | 1,7 | 8,6 | 300 |
176.983
13, példa
Αο~Ι1β-51υ/ρίρ6Γίάίηο/-.01?-ΑΓ£“ρΝΑ>Η01 (molekulasúly
845,4) e 1 ő ál 1 i t ás a
1,69 g (2 mmól) H-Ile-Glu/0Bzl/-Gly-Arg(N02)pNA.TPA-t feloldunk 4 ml DMF-ban és az oldatot -10°C-nál alacsonyabb hőmérsékleten tnetil-aminnal semlegesítjük addig, mig az oldat fölé tartott pH-papir lúgos elszíneződést mutat. A felszabadított aminhoz 435 g (2,2 roméi) AcOpNP-t adunk. 24 óra múlva az oldatot bepároljuk és a kapott olajat metil-alkohol és viz elegyéből kristályosítjuk. A kapott Ac-Ile-Glu/03zl/-Gly-ArgÍNOgJpNA TLC tanúsága szerint tiszta. A kitermelés 1,40 g (89 %).
A le irt módon kapott közti.· termék 1,0 g-ját (1,27 mmól) 30 ml hidrogén-fluoriddal reagáltatjuk O°C-on 1 óra hosszat, majd bepároljuk. A kapott védett terméket feloldjuk 10 %-os vizes ecetsavoldatban és Sephadex G15 oszlopon (gyártja a Pharmaoia Fine Chemicals) kromatográfiásan tisztítjuk 10 ^i-os vizes ecetsavoldattal eluálva,
A tiszta védett terméket tartalmazó frakciót liofilizáljuk, majd ioncserélő kromatográfiának vetjük alá klorid-formában levő QAS-25 gyantával töltött oszlopon, oldószerként és eluálószerként egyaránt 90 % etil-alkohol és 10 % viz elegyét alkalmazva. A kapott tiszta Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA.HCl-t liofilizáljuk; a kitermelés 660 mg (75 %)j ennek 227 mg-ját (0,33 mmól) a 7. példában leirt módon kezeljük. Kitermelés: 117 mg (42 %). TLC tanúsága szerint homogén; 3^=0,47. Hp3 = -31° (c=0,5, MeOH).
Claims (1)
- SZABADALMI IGÉNYPONTEljárás azR^-L-Ile-A-L-Gly-L-Arg-NH-Rg általános képletű kromogén enzimezubsztrátumok-ahol R jelentése 1-4 szénatomos alkanoil-csoport vagy benzoilcsoport,Rg jelentése p-nitro-fenil-csoport,A jelentése L-Asp vagy L-Glu, melyek cu^karboxilcsoportja helyettesítve van egy 1-4 szénatomos alkil-, 3-8 szénatomos cikloalkil- vagy di(l-4 szénatomo^-alkil -amino-(l-4 szénatomo^-alkil -csoporttal, vagy egy vagy két 1-4 szénatomos alkil-csoporttal vagy hidroxi-(l-4 szénatomos)— alkil -csoporttal helyettesített amidocsoporttal, vagy egy olyan heterociklusos csoporttal, ahol az amidocsoport tagja egy piperidin- vagy morfolingyürünek valamint savaddíciós sóik előállítására, azzal j e 1 lein e z v e , hogy «alamely tárgyi körben megadott általános képletű, de A helyén helyettesítstlen L-Asp vagy L-Glu csoportot hordozó vegyületet a/ olyan vegyületek előállítására, megyek tárgyi körben megadott általános képletében A jelentése α^-karboxilcsoportján észterezőcsoporttal helyettesített L-Asp vagy L-Glu, a megfelelő alkohollal észterezzük^ vagy b/ olyan vegyületek előállítására, melyek tárgyi kör- 18 176983 ben megadott általános képletében A jelentése ^karboxi?.csoportján amidocsoporttal vagy az amidocsoportct tartalmazó heterociklusos csoporttal helyettesített L-Asp vagy L-Glus a megfelelő alifás aminnal vagy nitrogéntartalmú aromás vegyülettel reagáltatjuk,és kívánt esetben az a/ vagy b/ eljárásváltozattal kapott vegyületet savaddíciós sójává alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7613463A SE437153B (sv) | 1976-12-01 | 1976-12-01 | Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU176983B true HU176983B (hu) | 1981-06-28 |
Family
ID=20329625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU77KA1497A HU176983B (hu) | 1976-12-01 | 1977-12-01 | Sposob poluchenija specificheskikh khromogennykh novykh proizvodnykh tetrapeptida kak ehnzimnykh substratov |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4207232A (hu) |
| JP (1) | JPS5369693A (hu) |
| AT (1) | AT358203B (hu) |
| AU (1) | AU514768B2 (hu) |
| BE (1) | BE861295A (hu) |
| CA (1) | CA1098428A (hu) |
| CH (1) | CH637627A5 (hu) |
| DD (1) | DD136896A5 (hu) |
| DE (2) | DE2753653C2 (hu) |
| DK (1) | DK155333C (hu) |
| ES (1) | ES464117A1 (hu) |
| FI (1) | FI773242A (hu) |
| FR (1) | FR2372798A1 (hu) |
| GB (1) | GB1565154A (hu) |
| HU (1) | HU176983B (hu) |
| IL (1) | IL53187A (hu) |
| IT (1) | IT1092154B (hu) |
| NL (1) | NL178600C (hu) |
| NO (1) | NO774092L (hu) |
| PL (2) | PL110803B1 (hu) |
| SE (1) | SE437153B (hu) |
| SU (1) | SU736889A3 (hu) |
| ZA (1) | ZA776460B (hu) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE7801373L (sv) * | 1978-02-07 | 1979-08-08 | Kabi Ab | Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| US4409140A (en) * | 1979-04-23 | 1983-10-11 | Smith Robert E | Substrates and method for determining enzymes |
| CA1161432A (en) * | 1980-02-12 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes |
| EP0046742B1 (en) * | 1980-08-25 | 1984-06-27 | KabiVitrum AB | Peptide substrates for determination of protease activity |
| US4510241A (en) * | 1981-09-03 | 1985-04-09 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| US4406832A (en) * | 1981-09-03 | 1983-09-27 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| US4448715A (en) * | 1981-11-02 | 1984-05-15 | University Of Miami | Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein |
| DE3211254A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| EP0436654A1 (en) | 1988-09-30 | 1991-07-17 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Immunoassays for catalytically-active, serine proteases |
| WO1995004281A1 (en) * | 1993-07-27 | 1995-02-09 | THE UNITED STATES GOVERNMENT, represented by THE ADMINISTRATOR OF THE NATIONAL AERONAUTICS AND SPACE ADMINISTRATION | Quantitative method of measuring cancer cell urokinase and metastatic potential |
| US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
| US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
| US20050159362A1 (en) * | 2003-04-22 | 2005-07-21 | Sircar Jagadish C. | Mediators of reverse cholesterol transport for the treatment of hypercholesterolemia |
| US20060166891A1 (en) * | 2003-04-22 | 2006-07-27 | Sircar Jagadish C | Mediators of reverse cholesterol transport for the treatment of hypercholesterolemia |
| WO2007059511A2 (en) * | 2005-11-15 | 2007-05-24 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
| AU2012254169B2 (en) * | 2011-02-25 | 2016-02-25 | Wellstat Diagnostics, Llc | Assays for detecting enzymatic activity |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2527932C2 (de) * | 1974-07-02 | 1983-04-21 | Pentapharm AG, 4052 Basel | Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein |
| SE407058B (sv) * | 1974-12-05 | 1979-03-12 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| CH622286A5 (hu) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag | |
| US4137225A (en) * | 1975-07-11 | 1979-01-30 | Ab Kabi | Novel chromogenic enzyme substrates |
| US4061625A (en) * | 1975-07-11 | 1977-12-06 | Ab Kabi | Novel chromogenic thrombin substrates |
-
1976
- 1976-12-01 SE SE7613463A patent/SE437153B/xx unknown
-
1977
- 1977-10-21 IL IL53187A patent/IL53187A/xx unknown
- 1977-10-27 NL NLAANVRAGE7711791,A patent/NL178600C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-10-31 FI FI773242A patent/FI773242A/fi not_active Application Discontinuation
- 1977-10-31 ZA ZA00776460A patent/ZA776460B/xx unknown
- 1977-11-14 IT IT51808/77A patent/IT1092154B/it active
- 1977-11-14 ES ES464117A patent/ES464117A1/es not_active Expired
- 1977-11-16 US US05/852,006 patent/US4207232A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-11-18 AU AU30771/77A patent/AU514768B2/en not_active Expired
- 1977-11-21 GB GB48288/77A patent/GB1565154A/en not_active Expired
- 1977-11-29 DD DD77202299A patent/DD136896A5/xx unknown
- 1977-11-29 BE BE183005A patent/BE861295A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-11-29 FR FR7735870A patent/FR2372798A1/fr active Granted
- 1977-11-29 PL PL1977216410A patent/PL110803B1/pl unknown
- 1977-11-29 CH CH1461877A patent/CH637627A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-11-29 PL PL1977202501A patent/PL109588B1/pl unknown
- 1977-11-30 SU SU772548501A patent/SU736889A3/ru active
- 1977-11-30 CA CA292,077A patent/CA1098428A/en not_active Expired
- 1977-11-30 NO NO774092A patent/NO774092L/no unknown
- 1977-12-01 DE DE2753653A patent/DE2753653C2/de not_active Expired
- 1977-12-01 DE DE2760116A patent/DE2760116C2/de not_active Expired
- 1977-12-01 AT AT859677A patent/AT358203B/de not_active IP Right Cessation
- 1977-12-01 JP JP14334077A patent/JPS5369693A/ja active Granted
- 1977-12-01 HU HU77KA1497A patent/HU176983B/hu unknown
- 1977-12-01 DK DK535377A patent/DK155333C/da not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-10-22 US US06/086,970 patent/US4276375A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU176983B (hu) | Sposob poluchenija specificheskikh khromogennykh novykh proizvodnykh tetrapeptida kak ehnzimnykh substratov | |
| NO135362B (hu) | ||
| EP0046742B1 (en) | Peptide substrates for determination of protease activity | |
| US4440678A (en) | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes | |
| EP0000063B1 (en) | Dipeptide derivatives of 7-(n-alpha-substituted or non-substituted x-arginyl)-amino-4-methyl-coumarin | |
| EP0004256A1 (en) | Easily split substrates for the quantification of proteases, a process for their production and a method for the quantification of proteases | |
| PL90746B1 (hu) | ||
| DK149333B (da) | Tripeptidderivater samt salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor i legemsvaeskerfra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter | |
| WO1980000351A1 (en) | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes | |
| IE56344B1 (en) | Chromogenic compounds,a process for their preparation and their use | |
| DE2936543A1 (de) | Chromogene verbindungen | |
| EP0076042A1 (en) | Novel substrates for measuring thrombin | |
| US4216142A (en) | Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes | |
| US4217269A (en) | Dipeptide chromogenic substrates | |
| PL103003B1 (pl) | Sposob wytwarzania nowych chromogennych odczynnikow do oznaczania trombiny i podobnych do trombiny enzymow | |
| DE3875359T2 (de) | Dipeptide, verfahren zur herstellung und verwendung in der bestimmung von proteasen. | |
| AU602527B2 (en) | Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use | |
| CA1283500C (en) | Thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase | |
| JP2896605B2 (ja) | 新しいペプチド基質，調整法及びプロティンｃ定量における用途 | |
| US4434096A (en) | Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes | |
| US6121239A (en) | Peptide substrates for the identification of factor Xa | |
| GB2140423A (en) | A method capable of determining cathopsin B in the presence of other proteolytic enzymes and compounds useful therefor | |
| JP2660864B2 (ja) | アミノアセトフェノン誘導体及びそれを用いた酵素活性測定法 | |
| US5362851A (en) | Peptide substrates, method of preparation and use in the determination of protein C | |
| JPS63502897A (ja) | 新規なペプチド誘導体 |