JPH01160990A - １−ナフトールフタレインモノホスフエート、その製法、アルカリホスフアターゼの測定法及びアルカリホスフアターゼ検出用診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔瀝朶上の利用分野〕 本発明は、酵素基質とし１二ステラーゼの影響下でアル
カリ性ＰＨ値でアルカリホスファターゼ（Ｅ　０．１５
．１．３．１．　）によつ工時異的に存色陰イオンを住
成する新規の燐酸モノエステル並びにその塩並びにこ、
の燐酸エステルもしくは相応する塩の製法及びアルカリ
ホスファターゼの検出及び光度測定による測距方法及び
試薬に関する。

〔従来の技術〕

アルカリホスファターゼ（ＡＸ））は例えば肝蔵、骨、
小腸、腎な、胆汁中に及び僅かに胎盤中に存在する。血
漿中のＡＰ−活性の上昇は特に肝ａ挟恵及び骨格挾患の
検出の窺めに診断上重要である。高められたＡＰ−５度
は例えばパンエツト病、骨肉腫、黄痕、肝炎及び同様の
病状に２いて認められる。

アルカリホスファターゼはその生理学的な要求値を越え
ると、最近は診断学上の助剤として重要になつ九。すな
わち例えばこの酵素は醇索免疫検定のための指標酵素と
して使用される。

従って臨床化学並びに診断学ではアルカリホスファター
ゼの定量的測定のための簡単に増扱うことができかつ同
時に良好に再現可能な方法が必要である。通例−の目的
には、添加された特異的基質からＡＰの作用によるｍ水
分解によって生じる化合物の直接的光度測定又は螢光光
度測定を用いる。アルカリホスファターゼによって遊離
される化合物とは、発色体もしくはメゾメリー安定化さ
れたアルコール、特にフェノール誘導体及びホスフェー
ト基である。通例前者が定性的もしくは定量的に測定さ
れる。

比色測定において島びに螢光測定の際に、空位（試料無
し、すなわちＡＰ魚し）の１行又は後続の実施は、変換
しなかった基質の場合により存在する吸収による干渉を
認識する友めに、推奨される。

ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ナフチルホスフェー
ト及びフェノールフタレインジホスフェートもしくは相
応する誘導体のほかに、フエノールフタレインモノ燐酸
もしくはその塩がＡＰ−基質として適当である（米国特
許第３３３１８５７号明細書及び米国特許第３３５１８
６２号明細書ン。しかしながら遊離のフェノールフタレ
イン量の検出が試料中に存在する他の化合物によって誤
認される限りは、これらの化合物はアルカリホスファタ
ーゼの測定には不満足である。それというのも多数の血
清成分、例えばビリルビンはＡＰ−基質から遊離され九
前記の７エル−トのように約４００〜４５０　ｎｍでの
吸収最高値を有するからである。

従って、今日ではチモールフタレインモノ燐酸もしくは
良好な水浴性の故に相応するナトリウム−及びアンモニ
ウム塩がアルカリホスファターゼの測定の丸めの基質と
してＷ、ｔＩｌに使用される（　０）ｉｎ、ＯＭｍ、　
１６巻、４６１〜４５６）Ｒ（１９７０年）　；　０１
ｉｎ、Ｏｈｅｍ、１９巻、１１３５〜１１３８＊（１９
７３年ン；年間；５８−１５８１９９号明細書（１９８
３年）。遊離され九チモールフタレインは吸収−もしく
は放射スペクトルで約５９５　ｎｍでの最高吸収帯を示
す。しかしながらこれらの物質における欠点は、一方で
は、腸−及び胎盤−ＡＰＧＣシける不十分な感受性、他
方では、反応速度測定ではなくその代シに再緩衝作用段
階（Ｕｍｐｕｆｆｅｒｕｎｇｓ　５ｃｈｒｉｔｔ）を含
む終点測定を実施しなければならないといり事情である
。

０−クレゾールフタレインモノ燐酸は、今日、通例、Ａ
Ｐ−基質として使用されるもう１つの７　！　／　−／
Ｉ／　７　／　Ｌ／ベイン導体である。この基質の助け
で、アルカリ性ホスファターゼの連続的１びに不連続的
測定が可能であり、それというのも遊離された。−クレ
ゾールフタレインはチそ一ルフタレインと対照的に酵素
的ＡＰ−創定測定適なβ−範囲ですでに吸収するからで
ある。

しかしながら遊離され次。−クレゾールフタレインの分
光棚定は溶血性試料の存在で妨害され、それというのも
。−クレゾールフタレイン隘イオンの吸収最高値は約５
７０　ｎｍであるからである。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の蛛題はアルカリホスファターゼの測定の
念めの新規の基質を得ることであり、これは十分な水溶
性のほかに、酵素の影響下で、可能な限り長い波長の吸
収最高値を特徴としかつ従って光度測定の際に他の試料
成分、例えば特に溶血反応生成物によつ工影響されない
又はほんの僅か影響される加水分解生成物を遊離すると
いう特性を有する。更に新規のＡＰ−基質は十分に安定
でなければならずかつ簡単でかつ経済的に有利な合成に
よシ高い純度で得られなければならない。

〔課題ｔ−解決する九めの手段〕

この課題は、アルカリエステラーゼ、特にアルカリホス
ファターゼの作用下で、長波の吸収性函イオンに変換さ
れる本発明による１−ナフトールフタレインモノホスフ
ェートにより解決される。本発明は、−能代Ｉ： 〔式中Ｒ１及びＨＩＭは同じ又は異なっていてよく、各
々水素厚子又はハロゲン原子を表わし　Ｍｌ及びＭ２は
同じ又は選なっていてよく、各々陽子、アルカリ金属−
、アルカリ土類金属−、アンモニウムー、ジシクロヘキ
シルアンモニウム−、テトラアルキルアンモニウム−又
はアルカノールアンモニウム陽イオンを表わす〕の化合
物及びその互変異性転換生成物に関する。

全ての一能代！の１−ナフトールフタレインモノホスフ
ェートは新規の化合物である。これをフェノール化学か
ら自体公知の方法にょ９８造することができる。

殊に、自体公知の方法で、一般式Ｉ： 〔式中Ｍは陽子、アルカリ金属−、アルカリ土類ｍｌ／
Ａ−、アンモニウム−、ジシクロヘキシルアンモニウム
−、テトラアルキルアンモニウム−又はアルカノールア
ンモニウム１場イオンを表ｂｆ）（７）１−ナフトール
フタレインもしくハソの塩を、−能代Ｉ： Ｒ５−Ｐ　−Ｒ３（１） 〔式中Ｒ３＆びＲ４は同じ又は異なっていてよく、各々
ハロゲン原子、アリール−又はプルキルアリール基１！
−衣わしかりＲｌｓは水素原子又は）ｓｒｓ）ｆン原子
金表わす〕の燐化合物と、有機塩基の存在下で、無水溶
剤もしくは溶剤混合物中で反応さセかつ場合により臭素
化する。

例えば−能代夏〔式中Ｒ１及びＲ１１ｌは水素原子ｔ″
衣わしかつＭｌ及びＭ２は前記のものである〕の１−ナ
フトールツクレインモノホスフェートと当量のオキシ塩
化燐とｔ−セリシン０．９６モルの存在で反応させ工よ
い。この際、実際には所望のモノホスフェ−）ＩＣ式中
Ｒ１及びＲ８は水素原子を表わす〕が少Ｕのジホスフェ
ート及び出発物質と共に生じ、これはブタノール／リグ
ロイン−１／１での振出によ！０ｐＨ１０，３で除去さ
れる。モノホスフェートをジホスフェートから分離する
ことはカラムクロマトグラフィーにより達成された。

更に一般式ｌのモノホスフェートをクールター　（０ｏ
ｕｌｔ・ｒ）による０−クレゾール７タレインモノホス
フエートの合成（米国特許 第３９７５４０５号Ｆ’Ａａ４ｉ　）と同様にして、−
能代１の１−ナフトールフタレイン及びジベンジルホス
ファイトと四塩化炭素とを１無水テトツヒドロフ２ン中
で有機塩基、例えばトリエチルアミンの存在で反応させ
て、式■： 〔式中Ｒ′及びｆは各々ベンジル基を衣わす〕のジベン
ジル燐酸エステルにすることによって製造することがで
きる。弐■の化合物はカラムクロマトグラフィーによυ
和製されかつパラジウム／炭素の存在で触媒的に活性化
された水素によシ脱ベンジル化される。更に力２ムクロ
マトグラフイーａ製の後に、−能代！〔式中Ｒ１及びＲ
２は水素原子を表わす〕の化合物が得られる。

東にジベンジルホスファイトの代りにジフェニルホスフ
ァイトも使用できる。従って式中Ｒ′及びＷ′がフェニ
ル基を表わす式■の化合物が生成する。フェニル基の離
脱はロジウム／木炭の存在で水素を用いて行なうことが
できる。同様に１−す７トールフタレインをジフェニル
ホスホリルクロリドと反応させかつ保映基ｔ−Ｒｈ１０
−触媒の存在で水素添加により除去することができる。

いずれの場合も一能代！の化合物が得られる。

更に一般式Ｉのモノボスフェートの合成の際には、ツヴ
イエルザック（Ａ、Ｚｗｉｅｒｚａｋ　）の研究（シン
セーシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　１９７６年、３０５
）によシ、水性媒体中で相転移触媒作用及び引続く触媒
的脱ペンシル化による一能代■のジベンジル燐酸エステ
ルの製造が適切であることが実征された。相転移触媒と
しては例えば四級アン七ニウム塩例えばペンジルトリプ
チルアンモニクムプｐミド及びペンシルトリエチルアン
モニウムプロミド、ホスホニウム塩例えばトリフェニル
ホスホニウムクロリド、ポリエチレングリコール及び／
又はクラクンエーテル及びこの除例として拳げた化合物
の混合物を使用することができる。カラムクロマトグラ
フィーによるギ５製後に付随する酢酸の除去は、アンモ
ニア甲の化合物の溶解及びｎ　ｐ　−２□−吸Ｑカラム
（ポリスチロール−ジビニルクロルベンゾール樹脂ン上
への装入により実施し九。水、インゾロパノール及びア
ン七ニア含有の水での溶離後に、はとんど純粋な一般式
Ｉのモノホスフェートが得られる。酢酸の除去は、メタ
ノール中へのクシクロヘキンルアミンの添加及び次のエ
ーテルでの分別沈殿によっても可能である。

エーテル中での一能代！〔式中Ｈ１及び′Ｐｔ２は水素
原子ｔ−ｉわしかつＭｌ及びＭ２は前記のものである〕
の１−ナフトールフタレインモノホスフェートのＪｕｔ
化により、−能代■〔式中Ｒ１及びＲ２は水素原子及び
／又は臭素原子を表わす］の相応する２−モツプロム−
及び２．ｚ−ジブロム化合物の混合物が得られる。この
際ホスフェート基じ対してオルト位にある臭ｔａｔ子に
有する式ｌのモツプロム置換化合物が有利に生成される
。

Ｒ１％　Ｒ’の定義にンける１ハロゲン原子”とは、弗
素原子、塩素原子、臭素原子及び沃素思子、殊に塩素原
子及び臭素原子である。

Ｍｌ及びＭ３の定義における１アルカリ金属陽イオン”
とは、リチウム−、ナトリクムー及びカリウムイオンで
あり、この際リチクムー及びナトリウムイオンが有利で
おる。

Ｍｌ及びＭ２の定義における１アルカリ土類金属陽イオ
ン”とは、マグネシウム−、カルシウム−及びバリウム
イオンｔ−ｇ味し、この際カリウムイオンが有オＵであ
る。

Ｍｌ及びＭ２の定義における１テトラブルキルアンモニ
ウム陽イオン”中の１アルキルｌ！Ｉｉ”及び―アルカ
ノールアンモエクム陽イオン１中の１フルカノール基″
は、１〜５個、殊に１又は２個の炭素ぶ子を有する。

Ｒ３及びＲ′の定義における１アルキルアリール基”と
は、１〜３、殊に１〜２個の炭素原子ｔ−有する炭素鎖
及び芳香族基、殊にフェニル基よジなる基であり、この
際ベンジル基が有利である。

本発明のもう１つの目的は、アルカリホスファターゼの
活性を測定するために新規の一般式Ｉの１−す７トール
フタレインモノホスフエートを使用することをおる。

アルカリホスファターゼのための基質としての１−ナフ
トールフタレインモノホスフェートの使用により、従来
公知でおるのよりもツＪらかに鋭敏なＡＰ−試！！ＩＩ
ｉ系が得られる。この新規の基質を生化学並びに臨床化
学の領域で有利にアルカリホスファターゼの活性の測定
に使用することができる。

新規のモノホスフェート基質は、ＰＨ範囲１０〜１１の
水性媒体中でのその良好な泪解性に基づき、光度６（Ｉ
Ｉ定によるホスファターゼ試験で高い反応性及び短かい
′Ｍ命期″を有する。従り１次の利点が結びつい１いる
： ａ）検出限界の低下、 ｂ）短かい反応時間及び Ｃ）より僅少の試料使用及び従って他の試料成分による
同様により僅少な障′＃。

史に新規基質は基質の吸収に比べて遊離された陰イオン
において現われる大きなストークシフトの故に酵素的加
水分解で生じる陰イオンの光度測定により追跡すべき吸
収の増加との極めて僅かな重畳を示すにすぎない。

赤紫色〜青色に変色した陰イオン（λｍａＸ６５０　ｎ
ｍ　）の生成は倉外にも弱アルカリ性条件（例えばｐ）
１８で）下で丁でに行なわれる。それによって、アルカ
リホスファターゼのン占性を光度測定により低い可視ス
ペクトル範囲（６５０〜６７０　ｎｍ　）で連続的御１
定で弱アルカリ性…範囲で、従来時間のかかる非連続的
方法でのみ可能であるような高い検出感度で測定するこ
と及び同時に試料成分、例えばビリルビン及びこの成長
範囲で吸収しない他の浴面反応生成物及び不浴性成分、
例えば混満物による障害を除くことがはじめて可能であ
る。

本発明による１−ナフトールフタレインモノホスフェー
トを極め″Ｃ種々の体液（試料）、例えば血液、血清、
血漿、尿、唾液及びその限外法迄液又は組織抽出液中の
ＡＰ−ｉ性の測定のための酵素基質として使用すること
ができる。

本発明による基質でのアルカリホスファターゼの測定は
濃度植囲１．０〜２０．０　ｍＭで行なうことができる
。本発明による方法の範囲では一般式Ｉの１−ナフトー
ルフタレインモノホスフェート７．０〜８．０　ｍＭの
娘度を頁別に使用する。

式Ｉの１−す７トールフタレインモノホス７エートは、
アルカリホスファターゼを指標酵素として使用し、その
活性を免疫学的反応の実施によ！７　、、ｌ′４査しな
ければならない免疫学的測定方法にも適当である、その
よりな酵素札標反応での免疫学的測定方法は当業者に酵
素免疫検定として公矧である。この方法は蛋白質、多糖
類、ホルモン、薬物及び他の低分子物質の測定に１０−
５〜１ｏ−１２モル／１０）範囲で用いられる。

相分離段階の要求に従って均質及び不均質の試験実施の
間で区別する。もう１つの分類は拮抗及び非拮抗試１１
４Ｉ！Ａ則で行なうことができる。

しかしながら全ての試験原則は酔索−抗ｍ−もしくは酵
素−抗体−複合体で働らく。酵素指檄反応は全ての酵素
免疫検定に共通である。

このような目的に適当な指標酵素はアルカリホスファタ
ーゼである。このような酵素免疫検定におけるアルカリ
ホスファターゼの迎」定は通例、酵素分解されかつ通例
測光的に抑」定される適当なＡＰ−基ＩＲｔ−添加する
ことによって行なわれる。

従ってＡＰ−試験系の改善は、このような酵素免疫検定
で同様に著しい利点をもたらす：１、　より高い感受性
はこの場合も検出限界を更に低下し、短かい反応時間及
びより僅少な試料使用及びそれに伴なう他の試料成分に
よる僅かな障害を可能にする。

２、　より有利な測定波長は、一定の反応実施の際に不
溶性成分による、例えば混濁による方法の妨害を減少さ
せる。

本発明のも９１つの目的は、新規の一般式Ｉの１−ナフ
トールフタレインモノホスフェート金含有するアルカリ
ホスファターゼの活性測定の九めの診断剤である。

診断剤は１禎又は数ｌの本発明による一般式Ｉの基質の
ほかに、アミノアルコールよりナル適当な緩価剤系、例
えばＮ−メチル−Ｄ−グルカミン／　ＨＯＩ　、ジェタ
ノールアミン／ａｏｌｂ）ジェタノールアミン／　ＨＣ
ｌ及び／又は２−アミノ−２−メチル−プロパツール（
１１／　ＨＣｌ及び場合によりＡＰ−測定に必要な一範
囲で駁価剤特性を有する他の物質、襲びに場合によりこ
のような診断剤に通例使用される他の適当な添加Ｒす、
例えば湿潤剤、安定剤等を含有する。）診断剤は、場合
により所望のβ値に緩衝されｆｃ溶液の形で、凍結乾燥
物として、粉末混合物として、試薬錠剤又は吸収可能な
担体上に吸着さセて又はオープンフィルム（ｏｆｆｅｎ
ｅｎ　Ｆｉｌｍ　）中に存在してよい。

清液の形の本発明による診断剤は有；ｆｔ＋に試験に必
要な全試薬を官有する。合剤としては水又は水と水浴性
有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン又
はジメチルホルムアミド、ジオキサン、グリコールとの
混合物がこれに該当する。保存性の理由から、試験に必
要な試薬ｔ−実際の検査の際にはじめ工混合される２種
又はそれ以上の浴液に分けることが有利でありうる。

各々約５〜２０ｍｇ、殊に約１０１ｎ９の総Ｍｋの凍結
乾燥物の形の診断剤の製造のために、試験の九めに必要
な全試薬のほかに、慣用の骨格構成要素、例えばポリビ
ニルぎロリドン、及び場合により他の填料、例えばフン
ニット、ソルビット又はキシリットを含有する溶液を乾
燥させる。

粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断剤は、試験の成分に
當用のガレヌス添加剤を加え７１）つ顆粒化することに
よって製造することができる。

このｌの添加剤は例えは炭水化物、例えは単一、少−ス
は多糖類、又は糖アルコール、例えばブンニット、ソル
ビット又はキシリット、又は他の可溶不活性化合物、例
えばポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドン
である。粉末混合物又は試薬錠剤は一般に最終ｍ：ｉｔ
約６０〜２００■、殊に５０〜８０■を示す。

試験テープの形の診断剤の製造のｔめに、吸収性の担体
、殊に濾紙、セルロース又は合成繊維フリースを、やや
揮発性の溶剤、例えば水、メタノール、エタノール又は
アセトン中の試験テープの製造に通例使用される必要な
試薬の溶液で浸漬させる。これは１回の浸漬段階で行な
うことができる。しかしながら浸漬を数段階で実施する
ことが屓々有利であり、この際診断剤の成分の一部分を
各々含有する溶液を使用する。

すなわち例えば最初の段階で緩衝液及び他の水溶性添加
剤を含有する水浴液で、かつ次いであ２段階で本発明に
よるアルカリホスファターゼ−基質ｔ−５〜２０ζリモ
ル／　ｌ　Ｃ）５度で、殊に７〜８ｉリモル／ｌの濃度
で含有する溶液で浸漬させてよい。

更に試験テープの形の診断剤の製造のために、薄膜構成
要素及び顔料のほかに基質、緩衝液及び診断剤のために
慣用の他の添加剤が含有されているオープンフィルムを
用いることができる。

この際−能代ｌのす７トールフタレインモノホス７エー
トは２〜２０ミリモルの濃度範囲で、殊に７．５〜１１
．３　ミ１７モルの濃度で使用される。

完成した試験紙及び試験フィルムをそのものとして使用
し又は自体公知の方法で支持箔に付着させ又は殊に西ド
イツ国特許（ＤＰＩ−Ｐａ、）第２１１８４５５号明細
書によるプラスチック及び編目の細かい網状物の間で接
合させかつ検査すべき体液（例えば血液、血漿、血清）
と結合させることができる。

次の例は、本発明による化合物の合成の九めに行ないう
る数多くの変法のいくつか並びに例えばアルカリホスフ
ァターゼの活性の測定のためのｆｒ規の１−ナフトール
フタレインモノホスフェートの使用を示す。しかしなが
らそれらは本発明目的の限定を示すものではない。

次の化学式で示されるＷｓ質及び中間体の製造を、後の
実施例で詳説する： （１）　Ｒ６−ＰＯ３Ｈ２；　Ｒ７−Ｒ８−Ｈ；　　　
ＭＧ　４９８５（２Ｊ　Ｒ’　＝　ＰＯ３Ｈ２；　Ｒ７
−Ｂｒ　、　Ｒ８−ＨＭＧ　５７７．３（３）　Ｒ６−
ＰＯ３Ｈ２；　Ｒ’／　−Ｒ８−ＩＩ　Ｂｒ　；　　　
ＭＧ　６５６．２（４１Ｒ’　＝Ｈ；　　　Ｒ７”Ｂｒ
　、　Ｒ８−ＨＭＧ　４９７．４（５１Ｒ’　＝　Ｈ；
　　　Ｒ＝　Ｒ＝　Ｂｒ　；　　　ＭＧ　５７６．３〔
実施例〕 例　　１ １−ナフトールフタレインモノホス７エー）　ｔｌ）オ
キシ塩化燐法 １−ナフ）−ｈフｐｖイン６．２７９　（０，０１５モ
ル）を無水テトラヒドロフラン２５−及び無水ぜリジン
１−（０，０１４モル）の混合物中に入れ、攪拌下でオ
キシ塩化燐１，５　、ｔ　（０，０１５七ル）ｔ−加え
、かつ１時間還流加熱する。次いで反応混合物に２Ｎ塩
酸１００ｍｊ’（ｉＨ加えかつ１５分間７０℃に加熱し
、この際暗色の油状物が析出する。これを分離しかつ２
Ｎ塩酸各５０Ｒｅと共に２回再び１０分間７０℃に加熱
し、分離し、水１５０ｔｊ中に滴加しかつ濃苛性ソーダ
溶液の添加によシｐｌ（１０，３に調整する。゛深緑溶
液をｎ−ブタノール／リグロイン−１／１（１２５，ｚ
）で１回、ｎ−ブタノール／リグロイン−１／３（１０
０屑ｌ）で１回及びリグロイン１００ｄで１回振出する
。次いで水相を娘塩酸でｐＨ７，３にＲ４！しかつ酢酸
エステル各１００ｄで６回抽出する。水相を回転蒸発器
で濃縮乾固し、この際褐色の非晶質のモノホスフェート
２ｇが得られる。粗生成物を珪酸ゲル−６０−カラム（
高さａＯ−、φ４．５−）でクロロホルム／メタノール
／メチルエチルケトン／酢酸／水−７５／３５／２５１
５／９を用いて分離する。

帯褐色の非晶ＪＡ１−す７トール７タレインモノホスフ
エート１．［ｌ　５．９が得られる。収ｉ：：ｉ論値の
１４．１％、―点２２６　’Ｃｓ　Ｒｆ−前記の展開剤
中０．４３　、（ＭＧ　４９８．５　）。

例　　２ １−ナフトール７メレイン七ノホス７エート（１）ジベ
ンジルホスファイト法 １−ナフトールフタレイン８３．６．９　（０，２モル
）を熱水テトラヒドロフラン８４０ｄ中に清かし、定温
で無水テトラクロルメタン４０ｍＪ（０，４モル）を添
加し、久いて２０分間以内にジベンジルホスファイト３
９．６ｙ（０，１８モルノ及び熱水トリエチルアミン８
２．８　ｓｔｌ　（０，６モルノを滴加し、この原温度
は４１℃に上昇する。協温で１７時間技押し、この際ト
リエチルアンモニワムクロリドが引出する。この不浴性
物質をひだ付ぎ濾紙を介して分＾＾し刀為つ濾液１ｃ回
転蒸発器で級縮する。残分（娼色油状物１５９ｇ）をク
ロロホルム／′メメノール−９／１（４００−）中に溶
かし、かつ珪酸ゲル−６０−カラム（高さ１２０＝−１
φ７．５−＝−）で精製する。当該のフラクションの濃
縮の際にやや不純化された暗色油状物７２．４　ｌＩが
得られ、これ全珪酸ゲルー６０−カラム（高さ１２０偽
、φ７．５偽）に新たに装入し、Ｍ、開削クロロホルム
／メタノール−２９／１に用いることによってＤ〇−単
一性で得られる。

このように精製されたジベンジルエステル３８．２　ｇ
非晶質赤色泡状物（Ｒｆ−０，４；展開剤クロロホルム
／メタノール−２９／１）ｔ″、メタノール／ジオキサ
ン−１／１（５００耐）の混合物中で酸化パラジウム１
ｇの添加下に４．５時間５大気圧（Ａｔｍ、）及び２５
℃で水素添加する。触媒の吸引濾通後に黄色清＊に回転
蒸発器で濃縮乾固する。橙色非晶質住成物２６．７Ｉが
得られる。これを珪酸ゲル−６０−カラム（Ｑさ１２０
鳴、φ７　、５　Ｃ’ａ　％　＆　ＩＡ　剤／ロロホル
ム／メタノール／メチルエチルケトン／酢ば／水−７５
／３５／２５１５／９）で精製する。

粗住成物、ＦｉＡ橙色粉末１９．６９をエーテル６００
ｄと（ξし、生じた結晶を吸引濾通し、エーテルで洗浄
しかつ五酸化二燐及び水酸化カリウム上、５０℃で４８
時間重全一定になるまで乾燥する。

１−ナフトールフタレインモノホスフェート１７．３ｇ
が得られる。収率：理論値の１７．４％、融点〉２５０
°Ｃ０ 付着性酢酸の除去のために、住成物を儂アンモニア３５
０　ｍｌ中に溶かし、！（Ｐ−２０−吸収樹脂（ポリス
チロール−ジビニルクロルベンゾ樹脂）２０ｇを加入混
合しかつ回転蒸発器で濃縮する。残分をＩＩ’−２［］
−カラム１ノ上に加え、次いで水５Ａ、１０％インプロ
パツール７．５ノ及び最後に１０％アン七ニア含有の水
で溶離させる。アンモニア性水溶液を真空中で濃＆、’
ｉしかつ残分ｔ−正量一定にまで乾燥させる。純Ｉ＋　
ｆｔ　１−ナフトール７タレインモノホスフエー）１０
．５＆が得られる。収率：理Ｅ＋’＋ｉｉ値の１０．７
％、融点〉２５０°Ｃ％Ｒｆ−０，４８（最開削イソゾ
ロパノール／酢酸−ｎ−ブチル／水−５０／３０／２０
）、Ｒｆ−０，２２（展開剤クロロホルム／メタノール
／メチルエチルケトン／酢酸エステル／水−７５／３５
／２５１５／９）。

例　　３ １−ナフトールフタレインモノホスフェート（１）ジベ
ンジルホスファイト−相転移触媒反応攪拌機、温度計及
び滴下ロートを備えた５００紅６頚フラスコ中で無水ク
ロロホルム１００反りエチルアミン２．６１１Ｊ　（０
，０２モル）ｔ−加え、ＩＦ＃ｆ間室温で攪拌し、次い
で１−ナフトールフタレイン（９０係（）　Ｃ）　２０
．８　ｇ（０，０５モル）及びテトラゾチルアンモニウ
ムプロミド６．２６９　（０，０１モル）？を麻加しか
つ水１００ＩＩＬｅ中の炭酸カリウム５５．３　＆　（
０，４モル）の溶液を２５〜３０℃で１０分間撹拌下に
滴加する。更に１時間後攪拌しｔ後に、有機相を分離し
、１Ｎ苛性ソーダ溶液各１５０ｆｆｉＺで６回及び水苔
１５０Ｉｎ＆で６回抽出し、懺酸ナトリウムを通して乾
燥させかつ回転蒸発器で濃縮させる。褐色油状物１９．
１．９が得られる。Ｒｆ−０，４（展開剤クロロホルム
／メタノール−２９／１、ＤＣ−珪酸ｒルー６０−メル
ク（Ｍｅｒｃｋ　）。

この物質上メタノール／ジオキサン−１／１（３０Ｑｉ
ｔ）中に溶かしかつｐａ／Ｃ１０％１．５ｇの添加によ
り水素添加する。２時間後に水素吸収は終了する。触媒
の吸引濾過後、反応溶液ｔ−濃縮させる。赤色樹脂１５
．４．！ｉ’が得られる。これを珪ｒＩＲｒルー６０−
カラム（高、さ１０５傭、φ５．５σ）でクロロホルム
／メタノール／メチルエチルケトン／氷酢ｒＪＲ／水−
７５／３５／２５１５／９ｔ−用いて精製する。ＤＣ−
純粋な溶離分を濃縮させる。橙赤色樹脂７．５　、！ｉ
ｉ＋が得られる。エーテル１００九の添加及び研磨によ
り、吸引濾過、エーテルでの洗浄及び室温での２４時間
乾燥後に、僅かに橙色の非晶質粉末６．４Ｉが得られる
。収率：理論値の２５．６％、融点〉２５０°０．Ｒｆ
−０，４８（展開剤イングロパノール／酢酸−ｎ−ブチ
ル／水−５０／３０／２０、ＤＣＨＰ　ＴＬＣ−既製グ
レート：珪酸？’に６０Ｆ２５４ｃメにり））、Ｒｆ−
０，３２（展開剤クロロホルム／メタノール／メチルエ
チルクトン／氷酢酸／水−７５７５５／２５１５／９）
。

例１〜３により製造した生成物ｔ−ＡＰを用いて硼酸塩
緩衝液（ｐ）１１０．３）の存在で１−ナフト−＃７り
′イン（λｍａｗ、　＝　６５　Ｑ　ｎｍ　、　ｉ　−
ａ３０３００　ｌ／ｍｏｌ　ｃｍ　）に変えることがで
きる。

例　　４ ２−モノブロム−１−す７トールフタレイン七ノホスフ
エート（２） ジエチルエーテル５０酎中の１−ナフトールフタレイン
モノホス７エー）　２　＆　（０，００４モル）のＳ滴
液に、エーテル１０ｍ１中の臭素０．４ＩｎＩＯ，００
８モル）全０℃で攪拌下で１０分間滴加する。０〜５℃
で１時間後攪拌し、油状の反応生成物からエーテル金傾
瀉除去しかつ残分ｔ−ＩＪグロイン３０１１１６と攪拌
する。吸引濾過及び分子ａｔ介して乾燥後ベージュ色の
２−モツプロム−１−ナフトールフタレインモノホスフ
ェート２ｇが得られる。収率：理調値の８６．６％、融
点〉１６０°Ｃ（分解）、Ｒｆ−０，３２（展開剤クロ
ロホルム／メタノール／メチルエチルケトン／水−７５
／３５／２５／９、ＤＣ珪＃１デルプレート６０−メル
ク）、（Ｍ　Ｏ５７７，４）。

例　　５ ２、’２’−シフロムー１１−フトール７タレイン前記
例の記載のように実施しかつモル比１−す７トール７タ
レインモノホスフエート／臭素−１：３に便用する。公
知のモツプロム化合物のほかに所望の２．２′−シブロ
ム−１−ナフトールフタレインモノホスフェートが得ら
れる。

分Ｓは珪酸グル６０−カラム（高さ６８儂、φ３５ｃｒ
ｆｔ、展開剤イングロパノール／酢酸ｎ−ブチル／水−
５０／３０／２０）で行なう。ベージュ色の結晶、２．
２’−ジブロム−１−ナフトールフタレインモノホスフ
ェート０．６１９が得られる。収率：理論値の２６％、
融点〉２４０℃（分解）、Ｒｒ　−０，２５（展開剤ク
ロロホルム／メタノール／メチルエチルケトン／水−７
５／３５／２５／９、ＤＣ珪酸グル６０−メルク）、（
Ｍ　（）　６５６．２　）。

例４及び５によシ製造した化合物２−モツプロム−＆ヒ
２　、　’２’−シー／”ロム−１−ナフトール７タレ
インモノホスフエートをメタノール性溶液中で硼酸塩緩
衝液及び／又はアミノアルコール（−１０，５）の存在
でアルカリ性ホスファターゼで分解することができ、こ
の際２−モツプロム−１−ナフトールフタレイン（λｍ
ａｘ、　−６５５ｎｍ　、　ａ　−２５３００４／Ｍｏ
１ｃｍ　）及び２，７−ジブロム−１−ナフトールフタ
レイン（２ｍ１ｌＸ。

−６７０ｎｍ　＊　ｅ　−２７８００Ｊ／Ｍｏ１ｃｍ　
）が生ずる。

例　　６ ２−モツプロム−及び２．２′−ジブロム−１−す７ト
ールフタレイン（４）及び（５）撹拌機及び温度計金偏
えた２５０酩６頚フラスコ中でジエチルエーテル１００
ｔｘＪ中に１−ナフトールフタレイン４．１８９（０，
０１モル）を溶かしかつエーテル８０ＩｎＬ中の臭素２
．４ｇ（０，７７勘、０．０１５モル）の溶液を０℃で
攪拌下に２１１ｅ間かかつて滴加する。−夜放置後に真
空中で濃縮しかつモノ−及びジブロム化合物はぼ同割合
の混合物５．５ｇが得られる。珪酸ｒル６０−メルクで
のカラムクロマトグラフィーによる分離は、ドルオール
／酢酸エステル−１５／１又はイソゾロパノール／酢酸
ｎ−ブチル／水−５０／３０／２０で行なう。ベージュ
色の結晶性ジブロム化合物２．６　、？　（収率：理論
値の４５％、融点〉２４５°０（分解）、Ｒｆ−０，５
（展開剤ドルオール／酢酸エステル−５／１）λｍａｘ
　−６７（ｌ　ｎｍ　）及びベージュ色の粉末状のモツ
プロム化合物１．６．９（収率：理論値の６０％、融点
〉２４０°Ｃ（分解）、Ｒｆ−０，３２（展開剤ドルオ
ール／酢酸エステル−５／１）、λｗａｘ　−６５５ｎ
ｍ　）が得られる。

例　　７ キュペット中の吸光度測光によるアルカリホス緩衝溶液
：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン１モル／１ｐＪ−に出値
（ＩＮ塩酸で調整）　１０．２試薬溶液１： 前記の緩衝溶液中に１−す７トールフタレインモノホス
７エートーナトリウム塩７．５ミリモル／ｌ’（溶かす
。絹値全検査する（２５°Ｃ）。

前記の緩衝溶液中に２−ブロム−１−す７トールフタレ
インモノホスフエートーナトリウム塩７．５　ミ！ｊモ
ル／ｌｋｍかす。−値上検査する（２５℃）。

試薬溶液３： 前記の緩衝液中に２，２′−ジブロム−１−ナフトール
フタレインモノホスフェート−ナトリウム塩７．５ミリ
モル／１７ｉｌ−溶かす。出値を検査する（２５°Ｃ）
。

基’１！１度及び−値は各々使用される基質に最適でな
ければならない。従って個々の試薬ｍ液における基’Ｊ
１度もしくは出値について完全に意図さ扛た異なる値が
生じうる。完成した試薬溶液は室ｌで８時間及び６７℃
で１．５時間安定である。

酵素溶液 子ウシの腸からの市販のアルカリホスファターゼを前記
の緩衝溶液中に溶かす。この溶液の活性は約３００００
／廐である（製造者データに関して）。

試料溶液 試料（例えば遠心分離し次血液、血漿、血清）を必要な
場合には緩衝液で布釈する。

ｂ〕　測定の実施 測定にそのつど挙げられ九波長で測光的に行なわれる。

試薬３【１ｃｆｎ−キュベツト中で３７８Ｃで相応して
希釈され九試料溶液５０μを又は酵素溶液５０μｔと混
合する。単位時間当りの吸光変化（６８７分）及び選択
され几希釈度から酵素溶液もしくは試料の活性全公知方
法で算出する。

キュベツト中の生じる活性５０Ｕ／４について６８７分
約２２０１ｎＥが実測される。

例　　８ 試験片の反射測光法によるアルカリホスファタ浸液１： Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン　　２モル／１Ｍｇ、ｃｔ
、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ミリモ
ル／１ＺｎＣｔ２　　　　　　　　　　　　　　　１５
マイクロモル／１１−ナフトールフタレインモ ノホスフェート　　　　　　　　　　　７．５ミリモル
／を一値（ＩＮ塩酸で調整する）　　　１［１，２（２
５℃）浸液２： Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン　　２モル／１Ｍｇｃｔ２
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ミリモル／１
ＺｎＣ６２１５マイクロモル／１ ２−ブロムー１−す７トール フタレインモノホスフェート　　　７．５ミリそル／を
一値（ＩＮ塩酸で調整する）　　　１０．２（２５°Ｃ
）浸液６； Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン　　２モル／１Ｍｇｃｔ２
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ミリモル／１
ＺｎＣｔ２　　　　　　　　　　　　　　　１５マイク
ロモル／ｌエート　　　　　　　　　　　　　　　　　
　７．５ミ＋、７モル／を一値（ＩＮ塩酸で調整する）
　　　１０．２（２５°Ｃ）吸収性の担体（紙、フリー
ス、グラスチック織物）を公知方法で浸液で浸漬する。

こうして得られる吸収性の試薬担体を公知方法で（西ド
イツ国特許（ＤＢ−ＰＳ）第２４３６５９８号明細盲）
反射測光器（例えばリフロトロン（Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ
））と結合してＡＰ−活性の測定全可能にするプラスチ
ック片上に固定する。

ｂ）吸収性の試薬薄膜金有する試験片の製造緩衝溶液−
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン２モル／を 一値　　　　　　　　　１１．８ 緩衝溶液ｔポリビニルアルコール（モウイオ−＃　（Ｍ
ｏｗｉｏｌ　）　２６／　８８　）の１０　％　（ｖ／
ｖ）水溶液と１：１の比で混合する。引続きｐＨ値を１
Ｎ塩酸で１０．５に調整する。

薄膜被覆コンパウンド１ 薄膜被α混合物５００．ｌｉ’Ｋｆｆｌ土（セラトン（
Ｃｅｌａｔｏｎ）ＭＷ２５）１００＆及び１−す７トー
ルフタレインモノホスフエー）３Ｆｔａｌ下で装入する
。

薄膜抜機コンパウンド２ 薄膜被α混合物５００ｇに畦土（セラトンＭｗ２５）１
００．！ｉ’及び２−ブロム−１−す７トールフタレイ
ンモノホスフエート３．５９　ｋＮＷ下で装入する。

薄膜被覆コンパウンド３ 薄膜被α混合物５００ｇに珪±（セラトンＭＷ２５）１
００．９及び２，２′−ジブロム−１−ナフトールフタ
レインモノホスフェート４＆−に攪拌下で装入する。

気泡のない個々の被覆コンパウンドをプラスチック箔上
に例えばドクターを用いて湿潤厚２００〜５００ｕｍ、
殊に３００　ｕｍで塗布する。

引続きＩ環空気乾燥箱中で１′２時間６０°Ｃで乾燥さ
せる。

そうして得られる試薬薄膜担体全公知方法（西ドイツ国
特許（ＤＥ−ＰＳ）第３１３０７４９号明細薔）で、ａ
）におけるようにＡＰ−活性の測定を可能にするプラス
チックテープ上に固定する。

Ｃ）測定の実施 ａ）及びｂ）によＶ製造した試験片を適当な反射測光器
、例えはりフロトロンで測定することができる。この際
反応を公知の方法で試料及び紙−もしくは薄膜試薬担体
の間の接触により出発させる。試料中のＡＰ−活性はそ
のつど挙げられる波長における減退の時間的変化から測
定される：

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１及びＲ＾２は同じ又は異なつていてよく、
   各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、Ｍ＾１及びＭ
   ＾２は同じ又は異なつていてよく、各各陽子、アルカリ
   金属−、アルカリ土類金属−、アンモニウム−、ジシク
   ロヘキシルアンモニウム−、テトラアルキルアンモニウ
   ム−又はアルカノールアンモニウム陽イオンを表わす〕
   の１−ナフトールフタレインモノホスフェート及びその
   互変異性転換生成物。 ２、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＾１及びＲ＾２は同じ又は異なつていてよく、
   各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、Ｍ＾１及びＭ
   ＾２は同じ又は異なつていてよく、各各陽子、アルカリ
   金属−、アルカリ土類金属−、アンモニウム−、ジシク
   ロヘキシルアンモニウム−、テトラアルキルアンモニウ
   ム−又はアルカノールアンモニウム陽イオンを表わす〕
   の１−ナフトールフタレインモノホスフェートを製造す
   るため、一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中Ｍは陽子、アルカリ金属−、アルカリ土類金属−
   、アンモニウム−、ジシクロヘキシルアンモニウム−、
   テトラアルキルアンモニウム−又はアルカノールアンモ
   ニウム陽イオンを表わす〕の化合物を、一般式III： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中Ｒ＾３及びＲ＾４は同じ又は異なつていてよく、
   各々ハロゲン原子、アリール−又はアルキルアリール基
   を表わしかつＲ＾５は水素原子又はハロゲン原子を表わ
   す〕の燐化合物と、有機塩基の存在で、無水溶剤もしく
   は溶剤混合物中で反応させ、かつ場合により臭素化する
   ことを特徴とする、１−ナフトールフタレインモノホス
   フェートの製法。 ３、１−ナフトールフタレインを一般式IIIの燐化合物
   と有機塩基の存在で無水溶剤中で反応させかつ場合によ
   り臭素化することを特徴とする請求項２記載の方法。 ４、付加的に相転移触媒を添加することを特徴とする請
   求項２又は３に記載の方法。 ５、請求項１記載の１−ナフトールフタレインモノホス
   フェートを使用する、アルカリ性ホスファターゼの活性
   の測定法。 ６、発色体基質として請求項１記載の１−ナフトールフ
   タレインモノホスフェートを使用することを特徴とする
   、１種又はそれ以上の発色体基質、適当な緩衝物質並び
   に場合により他の慣用の助剤を含有する、アルカリホス
   ファターゼ検出用診断剤。