JPH0513958B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素基質としてエステラーゼの影響
下でアルカリ性PH値でアルカリホスフアターゼ
（EC3.1.3.1.）によつて特異的に有色陰イオンを生
成する新規の燐酸モノエステル並びにその塩並び
にこの燐酸エステルもしくは相応する塩の製法及
びアルカリホスフアターゼの検出及び光度測定に
よる測定方法及び試薬に関する。 〔従来の技術〕 アルカリホスフアターゼ（AP）は例えば肝蔵、
骨、小腸、腎蔵、胆汁中に及び僅かに胎盤中に存
在する。血漿中のAP−活性の上昇は特に肝蔵疾
患及び骨格疾患の検出のために診断上重要であ
る。高められたAP−濃度は例えばパジエツト病、
骨肉腫、黄疸、肝炎及び同様の病状において認め
られる。 アルカリホスフアターゼはその生理学的な要求
値を越えると、最近は診断学上の助剤として重要
になつた。すなわち例えばこの酵素は酵素免疫検
定のための指標酵素として使用される。 従つて臨床化学並びに診断学ではアルカリホス
フアターゼの定量的測定のための簡単に取扱うこ
とができかつ同時に良好に再現可能な方法が必要
である。通例この目的には、添加された特異的基
質からAPの作用による加水分解によつて生じる
化合物の直接的光度測定又は螢光光度測定を用い
る。アルカリホスフアターゼによつて遊離される
化合物とは、発色体もしくはメゾメリ−安定化さ
れたアルコール、特特にフエノール誘導体及びホ
スフエート基である。通例前者が定性的もしくは
定量的に測定される。 比色測定において並びに螢光測定の際に、空値
（試料無し、すなわちAP無し）の並行又は後続の
実施は、変換しなかつた基質の場合により存在す
る吸収による干渉を認識するために、推奨され
る。 ｐ−ニトロフエニルホスフエート、ナフチルホ
スフエート及びフエノールフタレインジホスフエ
ートもしくは相応する誘導体のほかに、フエノー
ルフタレインモノ燐酸もしくはその塩がAP−基
質として適当である（米国特許第3331857号明細
書及び米国特許第3331862号明細書）。しかしなが
ら遊離のフエノールフタレイン量の検出が試料中
に存在する他の化合物によつて誤認される限り
は、これらの化合物はアルカリホスフアターゼの
測定には不満足である。それというのも多数の血
清成分、例えばビリルビンはAP−基質から遊離
された前記のフエノレートのように約400〜
450nmでの吸収最高値を有するからである。 従つて、今日ではチモールフタレインモノ燐酸
もしくは良好な水溶性の故に相応するナトリウム
−及びアンモニウム塩がアルカリホスフアターゼ
の測定のための基質として有利に使用される
（Clin.Chem.16巻、431〜436頁（1970年）；Clin.
Chem.19巻、1135〜1138頁（1973年）；特開昭58
−158199号明細書（1983年）。遊離されたチモー
ルフタレインは吸収−もしくは放射スペクトルで
約595nmでの最高吸収帯を示す。しかしながらこ
れらの物質における欠点は、一方では、腸−及び
胎盤−APにおける不十分な感受性、他方では、
反応速度測定ではなくその代りに再緩衝作用段階
（Umpufferungs schritt）を含む終点測定を実施
しなければならないという事情である。 ｏ−クレゾールフタレインモノ燐酸は、今日、
通例、AP−基質として使用されるもう１つのフ
エノールフタレイン誘導体である。この基質の助
けで、アルカリ性ホスフアターゼの連続的並びに
不連続的測定が可能であり、それというのも遊離
されたｏ−クレゾールフタレインはチモールフタ
レインと対照的に酵素的AP−測定に最適なPH−
範囲ですでに吸収するからである。しかしながら
遊離されれたｏ−クレゾールフタレインの分光測
定は溶血性試料の存在で妨害され、それというの
もｏ−クレゾールフタレイン陰イオンの吸収最高
値は約570nmであるからである。 〔発明が解決しようとする課題〕 従つて本発明の課題はアルカリホスフアターゼ
の測定のための新規の基質を得ることであり、こ
れは十分な水溶性のほかに、酵素の影響下で、可
能な限り長い波長の吸収最高値を特徴としかつ従
つて光度測定の際に他の試料成分、例えば特に溶
血反応生成物によつて影響されない又はほんの僅
か影響される加水分解生成物を遊離するという特
性を有する。更に新規のAP−基質は十分に安定
でなければならずかつ簡単でかつ経済的に有利な
合成により高い純度で得られなければならない。 〔課題を解決するための手段〕 この課題は、アルカリエステラーゼ、特にアル
カリホスフアターゼの作用下で、長波の吸収性陰
イオンに変換される本発明による１−ナフトール
フタレインモノホスフエートにより解決される。
本発明は、一般式： 〔式中R¹及びR²は同じ又は異なつていてよく、
各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、M¹及
びM²は同じ又は異なつていてよく、各々陽子、
アルカリ金属−、アルカリ土類金属−、アンモニ
ウム−、ジシクロヘキシルアンモニウム−、テト
ラアルキルアンモニウム−又はアルカノールアン
モニウム陽イオンを表わす〕化合物及びその互変
異性転換生成物に関する。 全ての一般式の１−ナフトールフタレインモ
ノホスフエートは新規の化合物である。これをフ
エノール化学から自体公知の方法により製造する
ことができる。 殊に、自体公知の方法で、一般式： 〔式中Ｍは陽子、アルカリ金属−、アルカリ土
類金属−、アンモニウム−、ジシクロヘキシルア
ンモニウム−、テトラアルキルアンモニウム−又
はアルカノールアンモニウム陽イオンを表わす〕
の１−ナフトールフタレインもしくはその塩を、
一般式： 〔式中R³及びR⁴は同じ又は異なつていてよく、
各々ハロゲン原子、アリール−又はアルキルアリ
ール基を表わしかつR⁵は水素原子又はハロゲン
原子を表わす〕の燐化合物と、有機塩基の存在下
で、無水溶剤もしくは溶剤混合物中で反応させか
つ場合により臭素化する。 例えば一般式〔式中R¹及びR²は水素原子を
表わしかつM¹及びM²は前記のものである〕の１
−ナフトールフタレインモノホスフエートと当量
のオキシ塩化燐とをピリジン0.93モルの存在で反
応させてよい。この際、実際には所望のモノホス
フエート〔式中R¹及びR²は水素原子を表わす〕
が少量のジホスフエート及び出発物質と共に生
じ、これはブタノール／リグロイン＝１／１での
振出によりPH10.3で除去される。モノホスフエー
トをジホスフエートから分離することはカラムク
ロマトグラフイーにより達成された。 更に一般式のモノホスフエートをクールター
（Coulter）によるｏ−クレゾールフタレインモノ
ホスフエートの合成（米国特許第3975405号明細
書）と同様にして、一般式の１−ナフトールフ
タレイン及びジベンジルホスフアイトと四塩化炭
素とを、無水テトラヒドロフラン中で有機塩基、
例えばトリエチルアミンの存在で反応させて、式
： 〔式中R′及びR″は各々ベンジル基を表わす〕
のジベンジル燐酸エステルにすることによつて製
造することができる。式の化合物はカラムクロ
マトグラフイーにより精製されかつパラジウム／
炭素の存在で触媒的に活性化された水素により脱
ベンジル化される。更にカラムクロマトグラフイ
ー精製の後に、一般式〔式中R¹及びR²は水素
原子を表わす〕の化合物が得られる。 更にジベンジルホスフアイトの代りにジフエニ
ルホスフアイトも使用できる。従つて式中R′及
びR″がフエニル基を表わす式の化合物が生成
する。フエニル基の離脱はロジウム／木炭の存在
で水素を用いて行なうことができる。同様に１−
ナフトールフタレインをジフエニルホスホリルク
ロリドと反応させかつ保護基をRh／Ｃ−触媒の
存在で水素添加により除去することができる。い
ずれの場合も一般式の化合物が得られる。 更に一般式のモノホスフエートの合成の際に
は、ツヴイエルザツク（A.Zwierzak）の研究
（シンセーシス（Synthesis）1976年、305）によ
り、水性媒体中で相転移触媒作用及び引続く触媒
的脱ベンジル化による一般式のジベンジル燐酸
エステルの製造が適切であることが実証された。
相転移触媒としては例えば四級アンモニウム塩例
えばベンジルトリブチルアンモニウムブロミド及
びベンジルトリエチルアンモニウムブロミド、ホ
スホニウム塩例えばトリフエニルホスホニウムク
ロリド、ポリエチレングリコール及び／又はクラ
ウンエーテル及びこの際例として挙げた化合物の
混合物を使用することができる。カラムクロマト
グラフイーによる精製後に付随する酢酸の除去
は、アンモニア中の化合物の溶解及びHP−20−
吸着カラム（ポリスチロール−ジビニルクロルベ
ンゾール樹脂）上への装入により実施した。水、
イソプロパノール及びアンモニア含有の水での溶
離後に、ほとんど純粋な一般式のモノホスフエ
ートが得られる。酢酸の除去は、メタノール中へ
のジシクロヘキシルアミンの添加及び次のエーテ
ルでの分別沈殿によつても可能である。 エーテル中での一般式〔式中R¹及びR²は水
素原子を表わしかつM¹及びM²は前記のものであ
る〕の１−ナフトールフタレインモノホスフエー
トの臭素化により、一般式〔式中R¹及びR²は
水素原子及び／又は臭素原子を表わす〕の相応す
る２−モノブロム−及び２，2′−ジブロム化合物
の混合物が得られる。この際ホスフエート基に対
してオルト位にある臭素原子を有する式のモノ
ブロム置換化合物が有利に生成される。 R¹〜R⁵の定義における“ハロゲン原子”とは、
弗素原子、塩素原子、臭素原子及び沃素原子、殊
に塩素原子及び臭素原子である。 M¹及びM²の定義における“アルカリ金属陽イ
オン”とは、リチウム−、ナトリウム−及びカリ
ウムイオンであり、この際リチウム−及びナトリ
ウムイオンが有利である。 M¹及びM²の定義における“アルカリ土類金属
陽イオン”とは、マグネシウム−、カルシウム−
及びバリウムイオンを意味し、この際カルシウム
イオンが有利である。 M¹及びM²の定義における“テトラアルキルア
ンモニウム陽イオン”中の“アルキル基”及び
“アルカノールアンモニウム陽イオン”中の“ア
ルカノール基”は、１〜５個、殊に１又は２個の
炭素原子を有する。 R³及びR⁴の定義における“アルキルアリール
基”とは、１〜３、殊に１〜２個の炭素原子を有
する炭素鎖及び芳香族基、殊にフエニル基よりな
る基であり、この際ベンジル基が有利である。 本発明のもう１つの目的は、アルカリホスフア
ターゼの活性を測定するために新規の一般式の
１−ナフトールフタレインモノホスフエートを使
用することである。 アルカリホスフアターゼのための基質としての
１−ナフトールフタレインモノホスフエートの使
用により、従来公知であるのよりも明らかに鋭敏
なAP−試験系が得られる。この新規の基質を生
化学並びに臨床化学の領域で有利にアルカリホス
フアターゼの活性の測定に使用することができ
る。 新規のモノホスフエート基質は、PH範囲10〜11
の水性媒体中でのその良好な溶解性に基づき、光
度測定によるホスフアターゼ試験で高い反応性及
び短かい遅滞期を有する。従つて次の利点が結び
ついている： ａ 検出限界の低下、 ｂ 短かい反応時間及び ｃ より僅少の試料使用及び従つて他の試料成分
による同様により僅少な障害。 更に新規基質は基質の吸収に比べて遊離された
陰イオンにおいて現われる大きなストークシフト
の故に酵素的加水分解で生じる陰イオンの光度測
定により追跡すべき吸収の増加との極めて僅かな
重畳を示すにすぎない。 赤紫色〜青色に変色した陰イオン
（λmax650nm）の生成は意外にも弱アルカリ性
条件（例えばPHを８で）下ですでに行なわれる。
それによつて、アルカリホスフアターゼの活性を
光度測定により低い可視スペクトル範囲（650〜
670nm）で連続的測定で弱アルカリ性PH範囲で、
従来時間のかかる非連続的方法でのみ可能である
ような高い検出感度で測定すること及び同時に試
料成分、例えばビリルビン及びこの波長範囲で吸
収しない他の溶血反応生成物及び不溶性成分、例
えば混濁物による障害を除くことがはじめて可能
である。 本発明による１−ナフトールフタレインモノホ
スフエートを極めて種々の体液（試料）、例えば
血液、血清、血漿、尿、唾液及びその限外瀘過液
又は組織抽出液中のAP−活性の測定のための酵
素基質として使用することができる。 本発明による基質でのアルカリホスフアターゼ
の測定は濃度範囲1.0〜20.0mMで行なうことがで
きる。本発明による方法の範囲では一般式の１
−ナフトールフタレインモノホスフエート7.0〜
8.0mMの濃度を有利に使用する。 式の１−ナフトールフタレインモノホスフエ
ートは、アルカリホスフアターゼを指標酵素とし
て使用し、その活性を免疫学的反応の実施により
調査しなければならない免疫学的測定方法にも適
当である。そのような酵素指標反応での免疫学的
測定方法は当業者に酵素免疫検定として公知であ
る。この方法は蛋白質、多糖類、ホルモン、薬物
及び他の低分子物質の測定に10^-5〜10^-12モル／
の範囲で用いられる。相分離段階の要求に従つ
て均質及び不均質の試験実施の間で区別する。も
う１つの分類は拮抗及び非拮抗試験原則で行なう
ことができる。 しかしながら全ての試験原則は酵素−抗原−も
しくは酵素−抗体−複合体で働らく。酵素指標反
応は全ての酵素免疫検定に共通である。 このような目的に適当な指標酵素はアルカリホ
スフアターゼである。このような酵素免疫検定に
おけるアルカリホスフアターゼの測定は通例、酵
素分解されかつ通例測光的に測定される適当な
AP−基質を添加することによつて行なわれる。 従つてAP−試験系の改善は、このような酵素
免疫検定で同様に著しい利点をもたらす： １ より高い感受性はこの場合も検出限界を更に
低下し、短かい反応時間及びより僅少な試料使
用及びそれに伴なう他の試料成分による僅かな
障害を可能にする。 ２ より有利な測定波長は、一定の反応実施の際
に不溶性成分による、例えば混濁による方法の
妨害を減少させる。 本発明のもう１つの目的は、新規の一般式の
１−ナフトールフタレインモノホスフエートを含
有するアルカリホスフアターゼの活性測定のため
の診断剤である。 診断剤は１種又は数種の本発明による一般式
の基質のほかに、アミノアルコールよりなる適当
な緩衝剤系、例えばＮ−メチル−Ｄ−グルカミ
ン／HCl、ジエタノールアミン／HCl、トリエタ
ノールアミン／HCl及び／又は２−アミノ−２−
メチル−プロパノール(1)／HCl及び場合により
AP−測定に必要なPH範囲で緩衝剤特性を有する
他の物質、並びに場合によりこのような診断剤に
通例使用される他の適当な添加剤、例えば湿潤
剤、安定剤等を含有する。診断剤は、場合により
所望のPH値に緩衝された溶液の形で、凍結乾燥物
として、粉末混合物として、試薬錠剤又は吸収可
能な担体上に吸着させて又はオープンフイルム
（offenen Film）中に存在してよい。 溶液の形の本発明による診断剤は有利に試験に
必要な全試薬を含有する。溶剤としては水又は水
と水溶性有機溶剤、例えばメタノール、エタノー
ル、アセトン又はジメチルホルムアミド、ジオキ
サン、グリコールとの混合物がこれに該当する。
保存性の理由から、試験に必要な試薬を実際の検
査の際にはじめて混合される２種又はそれ以上の
溶液に分けることが有利でありうる。 各々約５〜20mg、殊に約10mgの総重量の凍結乾
燥物の形の診断剤の製造のために、試験のために
必要な全試薬のほかに、慣用の骨格構成要素、例
えばポリビニルピロリドン、及び場合により他の
填料、例えばマンニツト、ソルビツト又はキシリ
ツトを含有する溶液を乾燥させる。 粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断剤は、試験
の成分に常用のガレヌス添加剤を加えかつ顆粒化
することによつて製造することができる。この種
の添加剤は例えば炭水化物、例えば単−、少−又
は多糖類、又は糖アルコール、例えばマンニツ
ト、ソルビツト又はキシリツト、又は他の可溶不
活性化合物、例えばポリエチレングリコール又は
ポリビニルピロリドンである。粉末混合物又は試
薬錠剤は一般に最終重量約30〜200mg、殊に50〜
80mgを示す。 試験テープの形の診断剤の製造のために、吸収
性の担体、殊に瀘紙、セルロース又は合成繊維フ
リースを、やや揮発性の溶剤、例えば水、メタノ
ール、エタノール又はアセトン中の試験テープの
製造に通例使用される必要な試薬の溶液で浸漬さ
せる。これは１回の浸漬段階で行なうことができ
る。しかしながら浸漬を数段階で実施することが
屡々有利であり、この際診断剤の成分の一部分を
各々含有する溶液を使用する。すなわち例えば最
初の段階で緩衝液及び他の水溶性添加剤を含有す
る水溶液で、かつ次いで第２段階で本発明による
アルカリホスフアターゼ−基質を５〜20ミリモ
ル／の濃度で、殊に７〜８ミリモル／の濃度
で含有する溶液で浸漬させてよい。 更に試験テープの形の診断剤の製造のために、
薄膜構成要素及び顔料のほかに基質、緩衝液及び
診断剤のために慣用の他の添加剤が含有されてい
るオープンフイルムを用いることができる。この
際一般式のナフトールフタレインモノホスフエ
ートは２〜20ミリモルの濃度範囲で、殊に7.5〜
11.3ミリモルの濃度で使用される。 完成した試験紙及び試験フイルムをそのものと
して使用し又は自体公知の方法で支持箔に付着さ
せ又は殊に西ドイツ国特許（DE−PS）第
2118455号明細書によるプラスチツク及び編目の
細かい網状物の間で接合させかつ検査すべき体液
（例えば血液、血漿、血清）と結合させることが
できる。 次の例は、本発明による化合物の合成のために
行ないうる数多くの変法のいくつか並びに例えば
アルカリホスフアターゼの活性の測定のための新
規の１−ナフトールフタレインモノホスフエート
の使用を示す。しかしながらそれらは本発明目的
の限定をを示すものではない。 次の化学式で示される基質及び中間体の製造
を、後の実施例で詳説する： (1) R⁶＝PO₃H₂；R⁷＝R⁸＝Ｈ； MG498.5 (2) R⁶＝PO₃H₂；R⁷＝Br，R⁸＝Ｈ MG577.3 (3) R⁶＝PO₃H₂；R⁷＝R⁸＝Br； MG656.2 (4) R⁶＝Ｈ；R⁷＝Br，R⁸＝Ｈ MG497.4 (5) R⁶＝Ｈ；R⁷＝R⁸＝Br； MG576.3 〔実施例〕 例 １ １−ナフトールフタレインモノホスフエート(1)
オキシ塩化燐法 １−ナフトールフタレイン6.27ｇ（0.015モル）
を無水テトラヒドロフラン25ml及び無水ピリジン
１ml（0.014モル）の混合物中に入れ、撹拌下で
オキシ塩化燐1.5ml（0.015モル）を加え、かつ１
時間還流加熱する。次いで反応混合物に2N塩酸
100mlを加えかつ15分間70℃に加熱し、この際暗
色の油状物が析出する。これを分離しかつ2N塩
酸各50mlと共に２回再び10分間70℃に加熱し、分
離し、水150ml中に滴加しかつ濃苛性ソーダ溶液
の添加によりPH10.3に調整する。深緑溶液をｎ−
ブタノール／リグロイン＝１／１（125ml）で１
回、ｎ−ブタノール／リグロイン＝１／３（100
ml）で１回及びリグロイン100mlで１回振出する。
次いで水相を濃塩酸でPH7.3に調整しかつ酢酸エ
ステル各100mlで３回抽出する。水相を回転蒸発
器で濃縮乾固し、この際褐色の非晶質のモノホス
フエート２ｇが得られる。粗生成物を珪酸ゲル−
60−カラム（高さ80cm、φ4.5cm）でクロロホル
ム／メタノール／メチルエチルケトン／酢酸／水
＝75／35／25／５／９を用いて分離する。帯褐色
の非晶質１−ナフトールフタレインモノホスフエ
ート1.05ｇが得られる。収率：理論値の14.1％、
融点226℃、R_f＝前記の展開剤中0.43、
（MG498.5）。 例 ２ １−ナフトールフタレインモノホスフエート(1)
ジベンジルホスフアイト法 １−ナフトールフタレイン83.6ｇ（0.2モル）
を無水テトラヒドロフラン840ml中に溶かし、室
温で無水テトラクロルメタン40ml（0.4モル）を
添加し、次いで20分間以内にジベンジルホスフア
イト39.6ml（0.18モル）及び無水トリエチルアミ
ン82.8ml（0.6モル）を滴加し、この際温度は41
℃に上昇する。室温で17時間撹拌し、この際トリ
エチルアンモニウムクロリドが析出する。この不
溶性物質をひだ付き瀘紙を介して分離しかつ瀘液
を回転蒸発器で濃縮する。残分（暗色油状物159
ｇ）をクロロホルム／メタノール＝９／１（400
ml）中に溶かし、かつ珪酸ゲル−60−カラム（高
さ120cm、φ7.5cm）で精製する。当該のフラクシ
ヨンの濃縮の際にやや不純化された暗色油状物
72.4ｇが得られ、これを珪酸ゲル−60−カラム
（高さ120cm、φ7.5cm）に新たに装入し、展開剤ク
ロロホルム／メタノール＝29／１を用いることに
よつてDC−単一性で得られる。 このように精製されたジベンジルエステル38.2
ｇ非晶質赤色泡状物（R_f＝0.4；展開剤クロロホ
ルム／メタノール＝29／１）を、メタノール／ジ
オキサン＝１／１（500ml）の混合物中で酸化パラ
ジウム１ｇの添加下に4.5時間５大気圧（Atm.）
及び25℃で水素添加する。触媒の吸引瀘過後に黄
色溶液を回転蒸発器で濃縮乾固する。橙色非晶質
生成物26.7ｇが得られる。これを珪酸ゲル−60−
カラム（高さ120cm、φ7.5cm、展開剤クロロホル
ム／メタノール／メチルエチルケトン／酢酸／水
＝75／35／25／５／９）で精製する。粗生成物、
明橙色粉末19.6ｇをエーテル300mlと擦し、生じ
た結晶を吸引瀘過し、エーテルで洗浄しかつ五酸
化二燐及び水酸化カリウム上、50℃で48時間重量
一定になるまで乾燥する。１−ナフトールフタレ
インモノホスフエート17.3ｇが得られる。収率：
理論値の17.4％、融点＞250℃。 付着性酢酸の除去のために、生成物を濃アンモ
ニア350ml中に溶かし、HP−20−吸収樹脂（ポ
リスチロール−ジビニルクロルベンゾ樹脂）20ｇ
を加入混合しかつ回転蒸発器で濃縮する。残分を
HP−20−カラム１上に加え、次いで水５、
10％イソプロパノール7.5及び最後に10％アン
モニア含有の水で溶離させる。アンモニア性水溶
液を真空中で濃縮しかつ残分を重量一定にまで乾
燥させる。純粋な１−ナフトールフタレインモノ
ホスフエート10.5ｇが得られる。収率；理論値の
10.7％、融点＞250℃、R_f＝0.48（展開剤イソプロ
パノール／酢酸−ｎ−ブチル／水＝50／30／20）、
R_f＝0.22（展開剤クロロホルム／メタノール／メ
チルエチルケトン／酢酸エステル／水＝75／35／
25／５／９）。 例 ３ １−ナフトールフタレインモノホスフエート(1)
ジベンジルホスフアイト−相転移触媒反応 撹拌機、温度計及び滴下ロートを備えた500ml
３頚フラスコ中で無水クロロホルム100ml及びテ
トラクロルメタン17ml中のジベンジルホスフアイ
ト11ml（0.05モル）の溶液にトリエチルアミン
2.6ml（0.02モル）を加え、１時間室温で撹拌し、
次いで１−ナフトールフタレイン（90％GC）
20.8ｇ（0.05モル）及びテトラブチルアンモニウ
ムブロミド3.23ｇ（0.01モル）を添加しかつ水
100ml中の炭酸カリウム55.3ｇ（0.4モル）の溶液
を25〜30℃で10分間撹拌下に滴加する。更に１時
間後撹拌した後に、有機相を分離し、1N苛性ソ
ーダ溶液各150mlで３回及び水各150mlで３回抽出
し、硫酸ナトリウムを通して乾燥させかつ回転蒸
発器で濃縮させる。褐色油状物19.1ｇが得られ
る。R_f＝0.4（展開剤クロロホルム／メタノール＝
29／１、DC−珪酸ゲル−60−メルク（Merck）。 この物質をメタノール／ジオキサン＝１／１
（300ml）中に溶かしかつPd／C10％1.5ｇの添加
により水素添加する。２時間後に水素吸収は終了
する。触媒の吸引濾過後、反応溶液を濃縮させ
る。赤色樹脂15.4ｇが得られる。これを珪酸ゲル
−60−カラム（高さ105cm、φ5.5cm）でクロロホ
ルム／メタノール／メチルエチルケトン／氷酢
酸／水＝75／35／25／５／９を用いて精製する。
DC−純粋な溶離分を濃縮させる。橙赤色樹脂7.3
ｇが得られる。エーテル100mlの添加及び研磨に
より、吸引濾過、エーテルでの洗浄及び室温での
24時間乾燥後に、僅かに橙色の非晶質粉末6.4ｇ
が得られる。収率：理論値の25.6％、融点＞250
℃、R_f＝0.48（展開剤イソプロパノール／酢酸−
ｎ−ブチル／水＝50／30／20、DC HP TLC−
既製プレート：珪酸ゲル60F254（メルク））、R_f＝
0.32（展開剤クロロホルム／メタノール／メチル
エチルケトン／氷酢酸／水＝75／35／25／５／
９）。 例１〜３により製造した生成物をAPを用いて
硼酸塩緩衝液（PH10.3）の存在で１−ナフトール
フタレイン（λmax.＝650nm，ε＝30 300／
molcm）に変えることができる。 例 ４ ２−モノブロム−１−ナフトールフタレインモ
ノホスフエート(2) ジエチルエーテル50ml中の１−ナフトールフタ
レインモノホスフエート２ｇ（0.004モル）の懸
濁液に、エーテル10ml中の臭素0.4ml（0.008モ
ル）を０℃で撹拌下で10分間滴加する。０〜５℃
で１時間後撹拌し、油状の反応生成物からエーテ
ルを傾瀉除去しかつ残分をリグロイン30mlと撹拌
する。吸引濾過及び分子篩を介して乾燥後ベージ
ユ色の２−モノブロム−１−ナフトールフタレイ
ンモノホスフエート２ｇが得られる。収率：理論
値の86.6％、融点＞160℃（分解）、R_f＝0.32（展
開剤クロロホルム／メタノール／メチルエチルケ
トン／水＝75／35／25／９、DC珪酸ゲルプレー
ト60−メルク）、（MG577.4）。 例 ５ ２，2′−ジブロム−１−ナフトールフタレイン
モノホスフエート(3) 前記例の記載のように実施しかつモル比１−ナ
フトールフタレインモノホスフエート／臭素＝
１：３を使用する。公知のモノブロム化合物のほ
かに所望の２，2′−ジブロム−１−ナフトールフ
タレインモノホスフエートが得られる。分離は珪
酸ゲル60−カラム（高さ68cm、φ35cm、展開剤イ
ソプロパノール／酢酸ｎ−ブチル／水＝50／30／
20）で行なう。ベージユ色の結晶、２，2′−ジブ
ロム−１−ナフトールフタレインモノホスフエー
ト0.61ｇが得られる。収率：理論値の23％、融点
＞240℃（分解）、R_f＝0.25（展開剤クロロホル
ム／メタノール／メチルエチルケトン／水＝75／
35／25／９、DC珪酸ゲル60−メルク）、
（（MG656.2）。 例４及び５により製造した化合物２−モノブロ
ム−及び２，2´−ジブロム−１−ナフトールフタ
レインモノホスフエートをメタノール性溶液中で
硼酸塩緩衝液及び／又はアミノアルコール（PH
10.5）の存在でアルカリ性ホスフアターゼで分解
することができ、この際２−モノブロム−１−ナ
フトールフタレイン（λmax.＝655nm，ε＝25
300／Molcm）及び２，2′−ジブロム−１−ナ
フトールフタレイン）λmax.＝670nm，ε＝27
800／Molcm）が生ずる。 例 ６ ２−モノブロム−及び２，2′−ジブロム−１−
ナフトールフタレイン(4)及び(5) 撹拌機及び温度計を備えた250ml３頚フラスコ
中でジエチルエーテル100ml中に１−ナフトール
フタレイン4.18ｇ（0.01モル）を溶かしかつエー
テル80ml中の臭素2.4ｇ（0.77ml、0.015モル）の
溶液を０℃で撹拌下に２時間かかつて滴加する。
一夜放置後に真空中で濃縮しかつモノ−及びジブ
ロム化合物ほぼ同割合の混合物5.5ｇが得られる。
珪酸ゲル60−メルクでのカラムクロマトグラフイ
ーによる分離は、トルオール／酢酸エステル＝
15／１又はイソプロパノール／酢酸ｎ−ブチル／
水＝50／30／20で行なう。ベージユ色の結晶性ジ
ブロム化合物2.6ｇ（収率：理論値の45％、融点
＞245℃（分解）、R_f＝0.5（展開剤トルオール／酢
酸エステル＝５／１）λmax＝670nm）及びベー
ジユ色の粉末状のモノブロム化合物1.6ｇ（収
率：理論値の30％、融点＞240℃（分解）、R_f＝
0.32（展開剤トルオール／酢酸エステル＝５／
１）、λmax＝655nm）が得られる。 例 ７ キユベツト中の吸光度測光によるアルカリホス
フアターゼの活性測定 ａ 使用溶液の調製： 緩衝溶液：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン１モ
ル／PH−値（1N塩酸で調整）10.2 試薬溶液１： 前記の緩衝溶液中に１−ナフトールフタレイン
モノホスフエート−ナトリウム塩7.5ミリモル／
を溶かす。PH値を検査する（25℃）。 試薬溶液２： 前記の緩衝溶液中に２−ブロム−１−ナフトー
ルフタレインモノホスフエート−ナトリウム塩
7.5ミリモル／を溶かす。PH値を検査する（25
℃）。 試薬溶液３： 前記の緩衝液中に２，2′−ジブロム−１−ナフ
トールフタレインモノホスフエート−ナトリウム
塩7.5ミリモル／を溶かす。PH値を検査する
（25℃）。 基質濃度及びPH値は各々使用される基質に最適
でなければならない。従つて個々の試薬溶液にお
ける基質濃度もしくはPH値について完全に意図さ
れた異なる値が生じうる。完成した試薬溶液は室
温で８時間及び37℃で1.5時間安定である。 酵素溶液 子ウシの腸からの市販のアルカリホスフアター
ゼを前記の緩衝溶液中に溶かす。この溶液の活性
は約3000U／mlである（製造者データに関して）。 試料溶液 試料（例えば遠心分離した血液、血漿、血清）
を必要な場合には緩衝液で希釈する。 ｂ 測定の実施 測定はそのつど挙げられた波長で測光的に行な
われる。 試薬３mlを１cm−キユベツト中で37℃で相応し
て希釈された試料溶液50μ又は酵素溶液50μ
と混合する。単位時間当りの吸光変化（ΔE／分）
及び選択された希釈度から酵素溶液もしくは試料
の活性を公知方法で算出する。キユベツト中の生
じる活性50U／についてΔE／分約220mEが実
測される。

【表】 例 ８ 試験片の反射測光法によるアルカリホスフアタ
ーゼの活性の測定 ａ 吸収性の試薬担体を有する試験片の製造 浸液１： Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン ２モル／ MgCl₂ １ミリモル／ ZnCl₂ 15マイクロモル／ １−ナフトールフタレインモノホスフエート
7.5ミリモル／ PH値（1N塩酸で調整する） 10.2（25℃） 浸液２： Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン ２モル／ MgCl₂ １ミリモル／ ZnCl₂ 15マイクロモル／ ２−ブロム−１−ナフトールフタレインモノホ
スフエート 7.5ミリモル／ PH値（1N塩酸で調整する） 10.2（25℃） 浸液３： Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン ２モル／ MgCl₂ １ミリモル／ ZnCl₂ 15マイクロモル／ ２，2′−ジブロム−１−ナフトールフタレイン
モノホスフエート 7.5ミリモル／ PH値（1N塩酸で調整する） 10.2（25℃） 吸収性の担体（紙、フリース、プラスチツク織
物）を公知方法で浸液で浸漬する。こうして得ら
れる吸収性の試薬担体を公知方法で（西ドイツ国
特許（DE−PS）第2436598号明細書）反射測光
器（例えばリフロトロン（Reflotron））と結合し
てAP−活性の測定を可能にするプラスチツク片
上に固定する。 ｂ 吸収性の試薬薄膜を有する試験片の製造 緩衝溶液：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン
２モル／PH値 11.8 薄膜被覆混合物 緩衝溶液をポリビニルアルコール（モウイオー
ル（Mowiol）26／88）の10％（ｖ／ｖ）水溶液
と１：１の比で混合する。引続きPH値を1N塩酸
で10.5に調整する。 薄膜被覆コンパウンド１ 薄膜被覆混合物500ｇに珪土（セラトン
（Celaton）MW25）100ｇ及び１−ナフトールフ
タレインモノホスフエート３ｇを撹拌下で装入す
る。 薄膜被覆コンパウンド２ 薄膜被覆混合物500ｇに珪土（セラトンMW25）
100ｇ及び２−ブロム−１−ナフトールフタレイ
ンモノホスフエート3.5ｇを撹拌下で装入する。 薄膜被覆コンパウンド３ 薄膜被覆混合物500ｇに珪土（セラトンMW25）
100ｇ及び２，2′−ジブロム−１−ナフトールフ
タレインモノホスフエート４ｇを撹拌下で装入す
る。 気泡のない個々の被覆コンパウンドをプラスチ
ツク箔上に例えばドクターを用いて湿潤厚200〜
5000um、殊に300umで塗布する。引続き循環空
気乾燥箱中で1/2時間60℃で乾燥させる。 そうして得られる試薬薄膜担体を公知方法（西
ドイツ国特許（DE−PS）第3130749号明細書）
で、ａ）におけるようにAP−活性の測定を可能
にするプラスチツクテープ上に固定する。 ｃ 測定の実施 ａ）及びｂ）により製造した試験片を適当な反
射測光器、例えばリフロトロンで測定することが
できる。この際反応を公知の方法で試料及び紙−
もしくは薄膜試薬担体の間の接触により出発させ
る。試料中のAP−活性はそのつど挙げられる波
長における減退の時間的変化から測定される：

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： 〔式中R¹及びR²は同じ又は異なつていてよく、
   各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、M¹及
   びM²は同じ又は異なつていてよく、各各陽子、
   アルカリ金属−、アルカリ土類金属−、アンモニ
   ウム−、ジシクロヘキシルアンモニウム−、テト
   ラアルキルアンモニウム−又はアルカノールアン
   モニウム陽イオンを表わす〕の１−ナフトールフ
   タレインモノホスフエート及びその互変異性転換
   生成物。 ２ 一般式： 〔式中R¹及びR²は同じ又は異なつていてよく、
   各々水素原子又はハロゲン原子を表わし、M¹及
   びM²は同じ又は異なつていてよく、各各陽子、
   アルカリ金属−、アルカリ土類金属−、アンモニ
   ウム−、ジシクロヘキシルアンモニウム−、テト
   ラアルキルアンモニウム−又はアルカノールアン
   モニウム陽イオンを表わす〕の１−ナフトールフ
   タレインモノホスフエートを製造するため、一般
   式： 〔式中Ｍは陽子、アルカリ金属−、アルカリ土
   類金属−、アンモニウム−、ジシクロヘキシルア
   ンモニウム−、テトラアルキルアンモニウム−又
   はアルカノールアンモニウム陽イオンを表わす〕
   の化合物を、一般式： 〔式中R³及びR⁴は同じ又は異なつていてよく、
   各々ハロゲン原子、アリール−又はアルキルアリ
   ール基を表わしかつR⁵は水素原子又はハロゲン
   原子を表わす〕の燐化合物と、有機塩基の存在
   で、無水溶剤もしくは溶剤混合物中で反応させ、
   かつ場合により臭素化することを特徴とする、１
   −ナフトールフタレインモノホスフエートの製
   法。 ３ １−ナフトールフタレインを一般式の燐化
   合物と有機塩基の存在で無水溶剤中で反応させか
   つ場合により臭素化することを特徴とする請求項
   ２記載の方法。 ４ 付加的に相転移触媒を添加することを特徴と
   する請求項２又は３に記載の方法。 ５ 請求項１記載の１−ナフトールフタレインモ
   ノホスフエートを使用する、アルカリ性ホスフア
   ターゼの活性の測定法。 ６ 発色体基質として請求項１記載の１−ナフト
   ールフタレインモノホスフエートを使用すること
   を特徴とする、１種又はそれ以上の発色体基質、
   適当な緩衝物質並びに場合により他の慣用の助剤
   を含有する、アルカリホスフアターゼ検出用診断
   剤。