JPH0356424B2

JPH0356424B2 -

Info

Publication number: JPH0356424B2
Application number: JP58193127A
Authority: JP
Priority date: 1983-10-15
Filing date: 1983-10-15
Publication date: 1991-08-28
Also published as: EP0140256B1; JPS6084253A; DE3476460D1; US4665038A; EP0140256A2; ATE40477T1; EP0140256A3

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なウロビリノーゲン検出用組成物
に関する。ウロビリノーゲンは腸内に出た胆汁から細菌の
還元作用により生じ、一部は門脈から吸収され肝
臓に至り、その大部分は肝細胞により摂取され
て、そのまま胆汁中に排泄されて、腸内に出る。
しかし、その内の一部は観肝臓を通過して大循環
に入り、さらに尿中に出る。尿中ウロビリノーゲンは肝機能障害、溶血性疾
患、腸閉塞に於いて増量する。したがつて、尿中
ウロビリノーゲンの検査はこれらの疾患の診断を
行う上で重要な臨床検査の一つである。ウロビリノーゲンの測定法としては試験紙を用
いる方法が多く使用されており、従来、ｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドがウロビリノーゲン
と縮合して赤紫色に呈色する反応を利用してい
た。しかし、この方法は以下の如き大きな欠点を
有している。即ち、呈色反応が緩慢で判定まで
１分以上を要する。特異性に欠け、ポルホビリ
ノーゲン、インドール、スカトール等により偽陽
性反応が生じる。尿中に多く存在する尿素がＰ
−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応して黄
色に呈色し、判定の妨害をする。などがそれであ
る。最近、これらＰ−ジメチルアミノベンズアルデ
ヒドを用いた方法の欠点を解消した、ジアゾニウ
ム塩を用いた呈色法が各種報告されている。この
方法はウロビリノーゲンに対する反応性が早く、
特異性も高い。一般に、ジアゾニウム塩はビリル
ビンとも反応するが、ジアゾニウム塩の親電子性
の差により、ビリルビンの影響を受けないでウロ
ビリノーゲンを測定することが可能であり、いく
つかの報告がなされている。例えば、フエニル基のオルト又はバラ位に少な
くとも１個のメソメリー性電子対を有する多原子
電子供与基の少なくとも１個を含有し、その際す
べての置換分のハメツトのシグマ値の合計値が、
＋0.4を上回つてはならないもの（特開昭48−
11093）、または芳香族化合物に隣環結合されてい
るか、もしくはビニローグ的に置換されたフエニ
ルー、ピロールー、及びピラゾールジアゾニウム
塩、並びにメソメリー可能な位置に、一個以上の
メソメリー可能な電子対を有する一個以上の多原
子性電子供与基を含むピリジンー、及びピラゾー
ルジアゾニウム塩で、全置換分及び複素原子のハ
メツトのシグマ値の和が＋0.6の値を越えないも
の（特開昭49−44797）、あるいは４−フルオロ−
３−ニトロベンゼンジアゾニウム塩（特開昭52−
493）、またアントラキノン系のジアゾニウム塩
（特開昭55−114954等）がウロビリノーゲン測定
用の化合物として報告されている。しかしながら、これら公知のジアゾニウム塩は
ウロビリノーゲンとの呈色感度がいずれも低く
（分子吸光係数8000〜17000）、又、色調も褐色乃
至橙色がかつたものが多い為、着色の濃い尿では
判定がしづらいという難点がある。本発明者らは、ウロビリノーゲンと特異的に且
つ速かに反応し、又、その呈色感度に於て優れ、
色調も尿自体の色とはかけ離れた色調を呈するウ
ロビリノーゲン測定用呈色薬について鋭意研究を
重ねた結果、下記一般式を有する新規化合物が前
記条件を全て兼ね備え、ウロビリノーゲン測定用
呈色薬として優れていることを見出し、本発明を
完成するに到つた。（式中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇は互いに同
じであつても異なつていてもよく、それぞれ単独
に水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲン
原子を表わし、Ｘは安定化陰イオンを表わす。）即ち、本発明者らは、独自の知見に基き高感度
な発色を呈すると考えられるアントラキノン系、
ナフトキノン系及び９−フルオレノン系等の多環
式化合物のジアゾニウム塩について研究を重ねた
結果、特に前記一般式

【】で示される９−フル
オレノン−２−ジアゾニウム塩及びその誘導体
が、ウロビリノーゲンと特異的に反応し、極めて
鮮明な赤色を、極めて高感度に呈色することを見
出し、これを呈色薬として用いる体液中のウロビ
リノーゲン検出用組成物を提供する本発明を完成
するに到つた。一般に、ジアゾニウム塩はウロビリノーゲンと
反応して茶褐色に呈色するものが多く、尿自身の
色に類似して、着色の濃い尿では判定が困難な場
合があつたが、本発明のジアゾニウム塩はウロビ
リノーゲンと殆んど瞬間的に反応し、かつ非常に
特異な赤色色素を生成する特徴を有する。因に、
前記一般式〔〕で示される本発明のジアゾニウ
ム塩に於て、R₁〜R₇が全て水素である９−フル
オレノン−２−ジアゾニウム塩をウロビリノーゲ
ンの検出に用いた場合、ジアゾカツプリング化合
物のλmaxは500nmであり、分子吸光係数εは
2.06×10⁴である。また、本発明のジアゾニウム塩はビニルビンに
よつて呈色が妨害されないという大きな利点をも
有している。従つて、尿中のウロビリノーゲンを
検出する上で、極めて正確な判定が可能となり、
斯業に貢献するところ甚だ大なるものがある。本発明に係る一般式〔〕で示される化合物に
於て、R₁〜R₇で示されるアルキル基としては特
に制限はないが、一般にはメチル、エチル、プロ
ピル等の低級アルキル基であり、アルコキシ基と
してはメトキシ、エトキシ等の低級アルコキシ基
であり、ハロゲンとしては、Cl、Br、Ｆ、Ｉの
いずれにしてもよい。又安定化陰イオン、即ち安
定なジアゾニウム塩として使用する為のXとし
ては、クロライド、サルフエート、テトラフルオ
ロボレート、テトラクロロチンケート、トリフル
オロメチルスルホネート、ヘキサフルオロアンチ
モネート、アリールスルホネート等のアニオンが
用いられるが、特にテトラフルオロボレートは安
定性が良好な為、より好ましい。ジアゾニウム塩とウロビリノーゲンの反応は、
酸性のPH条件で強い呈色を得ることが出来、呈色
の安定性も向上する。このような酸性のPHを与
え、かつ常温で固体である有機及び無機の酸類及
び塩類としてはスルホサリチル酸、シユウ酸、マ
レイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、スルフ
アミン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸水素カ
リウム、メタリン酸などがあり、これらは単独で
若しくは数種の混合により使用することが出来
る。固体の酸類又は／及び塩類は、試験用組成物と
して吸収性のある担体、例えば紙、ポリエステ
ルフリース、ポリアミドフリース、ガラス繊維な
どに含浸乾燥させて使用することが出来る。本発明によるジアゾニウム塩は、ウロビリノー
ゲンと殆んど瞬間的に反応して赤色に呈色し、ビ
リルビンに対してはほとんど発色を示さないが、
ウロビリノーゲンとの反応促進剤としては一般
に、アニオン性界面活性剤が使用されており、本
発明によるジアゾニウム塩に於ても、他の公知の
ジアゾニウム塩の場合と同様にアニオン性界面活
性剤、特にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウムなどを使用すること
によつて呈色の感度を向上させることが出来る。本発明の試験紙の製造に際して、一般式〔〕
で示されるジアゾニウム塩は含浸溶液100ml当り
0.01〜１ｇが至適使用範囲であるが、特に、0.02
〜0.1ｇが最適である。有機酸及び無機酸又は塩
類は100ml当り１〜30ｇが至適使用範囲であるが、
特に５〜20ｇが最適である。アニオン性界面活性
剤は0.01〜２ｇが至適使用範囲であるが、特に
0.1〜１ｇが最適である。含浸溶液の溶剤は水、又は水と混合し得る有機
溶剤で、かつジアゾニウム塩と反応しないものが
使用される。調製した含浸溶液を紙に含浸した後、乾燥さ
せ、試験紙を作製する。接着剤を用い、プラスチ
ツクシート、厚紙等の支持体と試験紙片とを貼合
わせてウロビリノーゲン検出用試験材とする。尿
検体に本発明による試験紙片を含浸、反応させて
生じた試験紙片の呈色度の濃淡よりウロビリノー
ゲン量を測定することができる。本発明に係る試験用組成物は、通常、上記の如
く試験紙による用手法に於て使用され、試験結果
の判定はウロビリノーゲンとの反応によつて生じ
た色調を、予め作製した標準の色調と一定時間後
に対比して行うが、又、本発明に係る試験用組成
物を溶液状で被験液と接触させ、適当な波長で分
光学的にウロビリノーゲンを定量することも当然
可能であり、自動分析機への応用も期待できる。次に、実施例により本発明を詳細に説明する。参考例１ (1) ９−フルオレノン−２−ジアゾニウム四フツ
化ホウ酸塩の製法２−アミノ−９−フルオレノン12.2ｇを5N
塩酸50mlに懸濁させ、０〜５℃で１時間撹拌す
る。氷冷した40W／Ｖ％亜硝酸ナトリウム水溶
液10mlを前記懸濁液へ10℃以上にならないよう
に滴下し、滴下後30分間撹拌する。反応液に冷水を加えて、ジアゾニウム塩の沈
殿を完全に溶解し、不溶物を去する。液を
０〜５℃で撹拌しながら32.5W／Ｖ％四フツ化
ホウ酸ナトリウム水溶液30mlを滴下し、滴下後
30分間撹拌する。結晶を取して、冷水30mlで
３回洗浄、エチルアルコール30mlで３回洗浄、
エチルエーテル25mlで２回洗浄後、減圧乾燥し
て、９−フルオレノン−２−ジアゾニウム四フ
ツ化ホウ酸塩の黄色結晶12.9ｇ（収率70％）を
得た。 (2) ９−フルオレノン−２−ジアゾニウム四フツ
化ホウ酸塩の確認試験 ΓTLC 吸着剤；シリカゲル展開溶媒；EtOH：ベンゼン（３：７）発色試薬；ヨード TLCスポツト；Rf値0.79の１スポツトを示
した。 ΓUV吸収スペクトル対照；DMF 溶媒；DMF λmaxは、300nmで分子吸光係数は約3.1×
10⁴ ₂₀であつた。 Γ 赤外吸収スペクトル波長約3450cm^-1、1710cm^-1、1600cm^-1、1080
cm^-1および750cm^-1に主な吸収を示した。参考例２〜５ (1) 参考例１の(1)に於て、２−アミノ−９−フル
オレノンの代りに２−アミノ−３−クロロ−９
−フルオレノン、２−アミノ−７−メトキシ−
９−フルオレノン、２−アミノ−３−メチル−
９−フルオレノン又は２−アミノ−３，６−ジ
クロロ−９−フルオレノンを用い、参考例１の
(1)と同様にして、３−クロロ−９−フルオレノ
ン−２−ジアゾニウム四フツ化ホウ酸塩、７−
メトキシ−９−フルオレノン−２−ジアゾニウ
ムサルフエート、３−メチル−９−フルオレノ
ン−２−ジアゾニウム四フツ化ホウ酸塩及び
３，６−ジクロロ−９−フルオレノン−２−ジ
アゾニウム四フツ化ホウ酸塩を夫々合成した。尚、生成物の確認は夫々IRにより行つた。 (2) 各化合物の確認試験 Γ赤外吸収スペクトル３−クロロ−９−フルオレノン−２−ジア
ゾニウム四フツ化ホウ酸塩波長約3445cm^-1、1710cm^-1、1605cm^-1およ
び740cm^-1に主な吸収を示した。７−メトキシ−９−フルオレノン−２−ジ
アゾニウムサルフエート波長約3450cm^-1、2830cm^-1、1715cm^-1、
1600cm^-1および750cm^-1に主な吸収を示した。３−メチル−９−フルオレノン−２−ジア
ゾニウム四フツ化ホウ酸塩波長約3450cm^-1、2840cm^-1、1710cm^-1、
1080cm^-1および750cm^-1に主な吸収を示した。３，６−ジクロロ−９−フルオレノン−２
−ジアゾニウム四フツ化ホウ酸塩波長約3450cm^-1、1710cm^-1、1080cm^-1およ
び740cm^-1に主な吸収を示した。実施例１紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して、40℃で送風乾燥を行い、次いで減圧
乾燥を１時間行つた。 (i) 含浸溶液９−フルオレノン−２−ジアゾニウム四フツ
化ホウ酸塩 40mg スルホサリチル酸 16ｇドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 0.4ｇメタノール 30ml これに水を加え全量100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体ビリルビンより水素接触還元して合成したウ
ロビリノーゲンの乾燥品12mgを正常な尿100ml、
に溶解して、ウロビリノーゲン標準液（添加量
12mg／dl）を調製し、さらに尿で希釈してウロ
ビリノーゲン添加量８mg／dl、４mg／dlの希釈
標準液を調製した。作製した試験紙は尿及びウロビリノーゲン添
加検体と反応して５〜10秒後に次のように呈色
した。

【表】実施例２紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して30℃で送風乾燥を行い、次いで減圧乾
燥を行つた。 (i) 含浸溶液９−フルオレノン−２−ジアゾニウム四フツ化
ホウ酸塩 40mg メタリン酸 10ｇラウリル硫酸ナトリウム 0.4ｇメタノール 20ml これに水を加え全量100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体実施例１と同様に調製した。作製した試験紙は、尿と反応して５〜10秒後
に、次のように呈色した。

【表】実施例３紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して、40℃で送風乾燥を行い、次いで減圧
乾燥を１時間行つた。 (i) 含浸溶液３−クロロ−９−フルオレノン−２−ジアゾニ
ウム四フツ化ホウ酸塩 40mg スルホサリチル酸５ｇドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 0.4ｇメタノール 30ml これに水を加え全量100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体実施例１と同様に調製した。作製した試験紙は尿及びウロビリノーゲン添
加検体と反応して５〜10秒後に次のように呈色
した。

【表】実施例４紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して30℃で送風乾燥を行い、次いで減圧乾
燥を１時間行つた。 (i) 含浸溶液７−メトキシ−９−フルオレノン−２−ジアゾ
ニウムサルフエート 40mg シユウ酸８ｇラウリル硫酸ナトリウム 0.4ｇメタノール 20ml これに水を加え全量100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体実施例１と同様に調製した。作製した試験紙は、尿と反応して５〜10秒後
に、次のように呈色した。

【表】実施例５紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して、40℃で送風乾燥を行い、次いで減圧
乾燥を１時間行つた。 (i) 含浸溶液３−メチル−９−フルオレノン−２−ジアゾニ
ウム四フツ化ホウ酸塩 40mg スルホサリチル酸 10ｇドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 0.4ｇメタノール 30ml これに水を加え全量100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体実施例１と同様に調製した。作製した試験紙は尿及びウロビリノーゲン添
加検体と反応して５〜10秒後に次のように呈色
した。

【表】実施例６紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して30℃で送風乾燥を行い、次いで減圧乾
燥を１時間行つた。 (i) 含浸溶液３，６−ジクロロ−９−フルオレノン−２−ジ
アゾニウム四フツ化ホウ酸塩 40mg メタリン酸 10ｇドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム 0.4ｇメタノール 30ml これに水を加え全量を100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体実施例１と同様に調製した。作製した試験紙は、尿と反応して５〜10秒後
に、次のように呈色した。

【表】実施例７紙（クロマト用紙）を下記処方の含浸溶液
に含浸して、40℃で送風乾燥を行い、次いで減圧
乾燥を１時間行つた。 (i) 含浸溶液９−フルオレノン−２−ジアゾニウム四フツ化
ホウ酸塩 100mg メタリン酸 10ｇスルホサリチル酸 1.0ｇラウリル硫酸ナトリウム 0.4ｇ DMF 10ml アセトン 20ml これに水を加え全量100mlとする。 (ii) ウロビリノーゲン添加検体実施例１と同様に調製した。作製した試験紙は、尿と反応して５〜10秒後
に、次のように呈色した。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇は互いに
同じであつても異なつていてもよく、それぞれ単
独に水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲ
ン原子を表わし、Ｘは安定化陰イオンを表わす。）で表わされるジアゾニウム塩及び常温で固体の酸
類又は／及び酸性の塩類を含むことを特徴とする
体液中のウロビリノーゲン検出用組成物。