JP2005512600A - 6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いた高感度連続的蛋白質チロシンホスファターゼ(PTPase)試験 - Google Patents
6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いた高感度連続的蛋白質チロシンホスファターゼ(PTPase)試験 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を用いた生物材料中の蛋白質チロシンホスファターゼの検出法に関するものである。
Description
本発明は特に中性条件下における、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いた蛋白質チロシンホスファターゼの検出のための改良方法に関するものである。
従来技術は基質p−ニトロフェニルホスフェート(p-NPP)を用いた蛋白質チロシンホスファターゼ活性の検出の方法を開示している。これらの検出方法は「蛋白質科学の最近のプロトコール:John E. Coligan (編集)、Ben M. Dunn (編集)、Hidde L. Ploegh (編集)、David W. Speicher (編集)、Paul T. Wingfield (編集);SBN:0-471-11184-8;ルースリーフページ、常時更新;John Wiley & Sonsより出版」のような標準的生化学マニュアル中で見つけることが出来る。ホスファターゼの作用によりp−NPPよりp−ニトロフェノールが形成される。p−ニトロフェノールは、アルカリ性領域において黄色に強く発色することに基づいて光度計測法により検出できる。
しかしながら、この試験方法にはいくつかの好ましくない特徴が存在する。この試験はタイム・ストップ原理(time-stop principle)に従って実施されるため、酵素活性を直接測定するのには適していない。この原理に従うと、決められた時間が経過した後に、酵素反応が水酸化ナトリウム溶液を加えることにより停止される。pHの上昇により生成するp−ニトロフェノールの色は黄色に変化し、その吸光度を光度計測法により定量し、それが存在するp−ニトロフェノールの量を知る手段となる。この試験原理は酵素・力学の研究、例えば阻害タイプの決定のためには、むしろ複雑である。非常に多くの実験点が必要とされるため、お互いに関連を持っている対応する数の個別のアッセイを実施しなければならない。
加えて、基質は光、温度及びpHに感受性が高い。それは生理的なpHの領域でゆっくり分解する傾向がある。
pNPPを基質として使用すると、調査すべき一部のチロシンホスファターゼは酸性領域に活性極大を持っている。例えば、PTP1BはpH5.6でより大きい代謝回転(turnover)を示す。他方、pNPPを基質として使用すると、7.0の生理的pHで、PTP1Bは最大代謝回転値の30%でのみ作用する。このために比較的大量の酵素を使うことが必要となり、相応して費用が増加する。この試験法のもう一つの好ましくない要因は、緩衝液、塩又は他の物質(被検物質)のような検体中に存在する他の成分が時々黄色領域で吸収を示すことである。このため適当なバックグランド対照値が必要となる。
蛋白質チロシンホスファターゼ活性の検出のための他の方法として、マラカイトグリーンホスフォペプチド試験が記述されている(Martin et al. (1985) Journal of Biological Chemistry, 260, pp.14932及びHarder et al. (1994) Biochemical Journal, 298, pp.395)。この方法においては、マラカイトグリーン試薬を用いて、ホスファターゼが基質ペプチドより遊離した無機リン酸を光度計測法により測定する。例えば不純物又はpH感受性による光度計測法の本質的な不安定さ及びタイム・ストップ法(time-stop method)の煩雑さとは別に、もう一つの不利な点は、各ホスファターゼに対して特定の基質ペプチドを高い濃度で製造しなければならないことであり、これによりその方法は一般的に費用の高いものとなっている。
3,6−フルオレセインジホスフェートが蛋白質チロシンホスファターゼ検出用の別の基質として記述されている(Journal of Biomolecular Screening 4, 327-334, 1999)。上記の二つの基質とは反対に、この基質は酵素活性を直接測定することを可能にしているが、その一方でこの基質のスペクトルの特徴は、生理的pH領域で測定を実施するためには、特に優れているわけではない。
それ故に、本発明の目的は別の方法を可能にすることである。
本発明は
a)生物材料又は生物材料から得られた生成物を提供すること、
b)6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を提供すること、
c)水溶液中でa)からの生物材料又は生物材料から得られた生成物をb)からのDiFMUPと接触させること、
d)その時形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルを蛍光法で検出することよりなる、生物材料中の蛋白質チロシンホスファターゼの酵素活性を検出するための方法に関するものである。
本発明は
a)生物材料又は生物材料から得られた生成物を提供すること、
b)6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を提供すること、
c)水溶液中でa)からの生物材料又は生物材料から得られた生成物をb)からのDiFMUPと接触させること、
d)その時形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルを蛍光法で検出することよりなる、生物材料中の蛋白質チロシンホスファターゼの酵素活性を検出するための方法に関するものである。
生物材料より得られる生成物は、好ましくはLAR、CD 45、PTP alpha、PTP 1B、TCPTP、YOP、CDC 25、PTEN及びSHP 1,2のグループよりの蛋白質チロシンホスファターゼを含有する。生物材料より得られる生成物は異なった段階の純度で存在してもよい。生物材料より得られる生成物は全細胞、破壊細胞、細胞成分及び/又はオルガネラに富んだサンプル、又は精製した蛋白質でもよい。
生物材料又は生物材料より得られる生成物と接触させた時、6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)の濃度は、好ましくは10〜250μMである。さらに好ましくは、DiFMUPの濃度は50〜100μMである。
その中で生物材料又は生物材料より得られる生成物をDiFMUPと接触させるのに用いる水溶液のpHは、好ましくは5.0と8.0の間であり、さらに好ましくは6.0と7.5の間である。なお特に好ましい実施態様においては、このpHは7.0である。
本発明はまた、
a)化学物質を提供すること、
b)生物材料又は生物材料より得られる生成物を提供すること、
c)6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を提供すること、
d)水溶液中でa)からの化学物質およびb)からの生物材料又は生物材料より得られる生成物及びc)からのDiFMUPとをお互いに接触させること、
e)その時形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルの量を蛍光法で定量すること、
f)形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルのe)からの量と、コントロールアッセイで形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルの量とを比較することよりなる、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための方法に関するものである。
a)化学物質を提供すること、
b)生物材料又は生物材料より得られる生成物を提供すること、
c)6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を提供すること、
d)水溶液中でa)からの化学物質およびb)からの生物材料又は生物材料より得られる生成物及びc)からのDiFMUPとをお互いに接触させること、
e)その時形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルの量を蛍光法で定量すること、
f)形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルのe)からの量と、コントロールアッセイで形成される6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルの量とを比較することよりなる、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための方法に関するものである。
とりわけコントロールアッセイは、生物材料又は生物材料より得られる生成物をDiFMUPと接触させる時、化学物質が前述の段階a)に含まれないか、又は化学物質の作用が選ばれたタイプの蛋白質シロシンホスファターゼとの関連においてすでにわかっているという事実によって特徴づけられている。コントロールアッセイで用いられ、蛋白質チロシンホスファターゼに対する作用がすでに分かっている化合物は、特にバナジン酸塩、バナジウム有機化合物、パーバナジン酸塩(pervanadate)、オカダ酸、NaF、デホスタシン(dephostasin)、修飾されたペプチド又は他の化合物であることができる。
蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物の同定方法の種々の好ましい実施態様において、この修飾には蛋白質チロシンホスファターゼの活性の刺激、阻害又は安定化が含まれる。
蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物の同定方法の他の好ましい実施態様において、この蛋白質チロシンホスファターゼは、LAR、CD45、PTP alpha、TC-PTP、CDC25、PTEN、YOP、SHP1,2及びPTP1Bグループを含むグループから選ばれる。
本発明はまた、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾し、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための上記の方法によって同定された化合物に関するものである。この化合物は好ましくは0.1と50kDaの間、さらに好ましくは0.1と5kDaの間、なおさらに好ましくは0.1と3kDaの間の質量を持つ。その化合物は蛋白質、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、天然物又は芳香族炭化水素化合物であることができる。本発明はまた、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための方法によって同定された、上述のような化合物を少なくとも一つ含有する医薬品に関するものである。さらにその医薬品は医薬品を剤形するための補助物質及び/又は重合添加物を含有する。
本発明はまた、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾し、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための上記の方法によって同定された化合物に関するものである。この化合物は好ましくは0.1と50kDaの間、さらに好ましくは0.1と5kDaの間、なおさらに好ましくは0.1と3kDaの間の質量を持つ。その化合物は蛋白質、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、天然物又は芳香族炭化水素化合物であることができる。本発明はまた、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための方法によって同定された、上述のような化合物を少なくとも一つ含有する医薬品に関するものである。さらにその医薬品は医薬品を剤形するための補助物質及び/又は重合添加物を含有する。
本発明はまた、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定するための方法によって同定された化合物の、糖尿病治療のために医薬品を製造する目的での使用に関するものである。
6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスファターゼは市販品が入手可能である。例えば、Molecular Probes Europe BV社(2333 ライデン、オランダ)がこの化学品を市販している。その製造は米国特許第5,830,912号に開示されている。
生物材料は遺伝子情報を含むどの材料でもよいし、大腸菌又はサッカロミセス・セレビシエのような細菌又は真菌でもよい。生物材料はまた細胞培養からの細胞を含有する。
動物又はヒトの組織からの細胞の場合は、生物材料はバイオプシー、外科的除去法、又は注射器もしくはカテーテルを用いた除去、又はそれに相応する技術によって得ることが出来る。このようにして取り出された細胞は強く冷凍するか、使用するか又は培養に供することが出来る。細菌及び酵母細胞は通常の細菌学的手法によって増殖して使用する。
当業者は「Current Protocols in Molecular Biology;編集:F. M. Ansabel et al., ルースリーフ出版物、常時更新、2001年版、John Wiley & Sonsより出版」の中に、この目的のための適当な教示を見つけるであろう。生物材料はまた動物細胞の培養からの細胞を含むことが出来る。そのような細胞の例はマウス細胞、ラット細胞又はハムスター細胞である。細胞培養による細胞は初代細胞タイプ又は確立した細胞株でよい。確立した細胞株の例はマウス3T3細胞、CHO細胞又はHela細胞である。細胞株の維持、成長及び増殖については、標準の教科書、例えば「Basic Cell Culture;編集:J. M. Daris IRL Press, オックスフォード (1996)」の中に記載されている。
生物材料から得られる生成物は、例えば生物材料の破壊によって及びそれに続く精製段階によって作成される。生物材料の破壊の方法は、特に凍結及び解凍の繰り返し、音波処理、フレンチプレスの使用又は界面活性剤及び酵素の添加等である。それに次ぐ精製段階は、例えば分別遠心法、硫酸アンモニウム又は有機溶媒による沈殿、クロマトグラフ法等の使用を含む。クロマトグラフ法の例はポリアクリルアミドゲル電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトフラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量スペクトロメトリー等である。この目的のために、特に蛋白質の精製に関する詳細な教示のためにも、特に「Current Protocols in Protein Science、編
集:J. E. Coligan et al.、ルースリーフ出版物、常時更新、2001年版、John Wiley & Sonsより出版」のような教科書が当業者には入手可能である。
集:J. E. Coligan et al.、ルースリーフ出版物、常時更新、2001年版、John Wiley & Sonsより出版」のような教科書が当業者には入手可能である。
生物材料又は生物材料から得られた生成物を、エッペンドルフ管、遠沈管又はガラス製フラスコのような通常の実験室容器中でDiFMUPと接触させることが出来る。基礎となる水性培地は、例えば緩衝物質、栄養培地組成物、Na+、K+、Ca2+、Cl-、SO4 2-及びPO3 2-のような一価又は二価に荷電したイオン、又は他のイオン、及びそれに加えて、蛋白質、グリセロール又はもう一つの物質を含有する。接触させるためには、特に温度、pH、イオン条件、蛋白質の濃度、体積又は他の要因のような、特定の一定条件が都合がよい。これは、例えば、緩衝物質の存在下又は前もって正確に秤量された量のイオン又は蛋白質を使用することによって、一定温度に保たれた培養器具中で接触を実施することによって達成される。特に水性溶媒はまた、ジメチルスルホキシド、メタノール又はエタノールのような有機溶媒を特定の割合で含有することが出来る。しかしながら、そのような溶媒の容量は混合物の体積で10%を超えないことが好ましい。
PTPase(ホスファターゼ)蛋白質ファミリーは現在約100の異なったメンバーから成っている。これらのメンバーは大まかに受容体共役蛋白質及び細胞質蛋白質に分けられる。ホスファターゼは触媒ドメイン中にアミノ酸モチーフ(H/V) CX5R(S/T)を共通に有している。受容体共役ホスファターゼは通常細胞外ドメイン、単一の膜貫通領域及び1個又は2個の細胞質PTPaseドメインより成り立っている。LAR(白血球共通抗原関連)蛋白質及びPTPα蛋白質は受容体共役PTPaseに属すると考えられている。細胞内PTPaseは通常触媒ドメイン及び、例えば“SHドメイン”の結果としてのC端末又はN端末の種々の延長を含んでいる。これらの延長はターゲティング又は制御において機能するとみなされている。酵素PTP1Bは細胞質PTPaseとみなされている。純粋のチロシンホスファターゼに加えて、PTPassファミリーはまた二重ホスファターゼのグループを含んでいる。ホスフォチロシンに加えて、これらの酵素はまた基質としてホスフォセリン又はホスフォスレオニンを利用している。例えば、このグループはホスファターゼVHR及びcdc25を含んでいる。
ホスファターゼLAR、PTPα、SHP-2及びPTP1Bはインスリンを介するシグナル経路において、重要な作用を果たすとみなされている。これらのPTPaseはインスリン受容体と関連し、脱リン酸を触媒している。これらのPTPaseはおそらくインスリン耐性の病理学において単独で又は共同して役割を果たしているのかもしれない(Biochemistry 38, 3793-3803, 1999;p.3799)。
PTP1Bはインスリン刺激シグナル伝達経路のネガティブ制御因子である。すなわち、その蛋白質はインスリンによって誘導されたシグナルのスイッチを再度切る。おそらく、シグナル経路はインスリン受容体が直接脱リン酸化されることによって停止される。PTP1Bはまた乳癌患者の大半において過剰発現している。加えて、その酵素は“上皮細胞増殖因子”と相互作用をしている。その酵素は二つのアリールホスフェート結合ポケットを有することが証明されている。一つは直接的に活性中心に存在し、他は触媒センターに隣接する部位においてこの外側に存在する。(Biochemistry 38, 3793-3803, 1999)
多くの細胞内シグナル伝達と伝達の中止は、関与する因子のチロシン・リン酸化によって制御されている。相補的蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)及びホスファターゼ(PTPase)、特に蛋白質チロシンホスファターゼの正確に平衡のとれた活性がそのリン酸化状態を確立している。
酵素として、PTPaseはホスフォチロシン残基を選択的に脱リン酸化する。蛋白質チロシンキナーゼと相互作用をする時、PTPaseは極めて多様な生物学的プロセスで、例えば成長因子又はホルモンに起因するシグナルの伝達において機能を発揮している。これらのシグナル変換のメカニズムは細胞の代謝、成長、分化又は運動の制御において、重要な役割を果たしている。
シグナル経路の不完全な制御は多くの病理的プロセスの原因の一つであると考えられている。これらのプロセスは、例えば、癌、いくつかの免疫学的及び神経学的病気、並びにII型糖尿病及び肥満をも含んでいる。
例えば、化学物質は化学合成の手段によって提供される。当業者は標準的な合成法には精通しているものである。化学物質は、今までに実施された合成プログラムから化学物質を蓄積し目録を作成(化学ライブラリーと名づけられている)することによって作成されるような、化学物質の集合の一部である。他の場合、化合物は微生物、特に細菌又はそれ以外に真菌もしくは植物(天然物)によって生成されていることが出来る。
経口投与に適当した医薬化合物は、カプセル、カッシェ剤、サッキング錠剤もしくは錠剤、又は粉末もしくは顆粒剤、水溶液又は水溶性もしくは非水溶性の液体の懸濁液、又は水中油型もしくは油中水型乳液のような別々のユニットに存在する。これらの組成物は、活性化合物及び添加物(1個又はそれ以上の付加成分より成ることが出来る)を接触させる段階を含む適当な医薬品の製造方法のいずれかに従って製造することが出来る。一般に、組成物は活性化合物と液体及び/又は細かく砕かれた固体添加物を一様及び均等に混ぜ合わせることによって製造され、必要ならばその後に成形される。
このように、例えば錠剤は、化合物の粉末又は顆粒を、場合によっては一個又はそれ以上の付加成分と一緒に圧縮又は剤形することによって製造できる。
このように、例えば錠剤は、化合物の粉末又は顆粒を、場合によっては一個又はそれ以上の付加成分と一緒に圧縮又は剤形することによって製造できる。
圧縮錠剤は、粉末又は顆粒のような自由に流れる形態の化合物を、場合によっては適当な機械の中で、結合剤、グリダント(glidant)、不活性稀釈剤、及び/又は(いくつかの)表面活性剤/分散剤と混ぜ合わせ、錠剤化することによって製造できる。成形錠剤は適当な機械の中で不活性液体稀釈剤でしめらせた粉末化合物を剤形することによって製造できる。
経口(舌下)投与に適した医薬品組成物は、芳香物質、慣習的には蔗糖及びアラビアゴム又はトラガカントと共に化合物を含むサッキング剤(sucking tablets)、ならびにゼラチン及びグリセロール又は蔗糖及びアラビアゴムのような不活性基剤中に化合物を含むトローチ剤を含んでいる。
非経口投与に適した医薬組成物は、好ましくはその生成物がそれを受ける人の血液と好ましくは等張である、化合物の滅菌した水性の生成物を含んでいる。これらの生成物は、例えば、注射剤として皮下、筋肉内又は皮内に投与が出来たとしても、静脈内投与することが好ましい。これらの生成物は好ましくはその化合物と水とを混合し、その結果生じる溶液を滅菌し、血液と等張にすることによって製造出来る。本発明による注射可能な組成物は、一般に活性化合物の重量で0.1〜5%を含有している。
直腸投与に適した医薬組成物は、好ましくは単回用量の座薬の型で存在する。
これらは化合物と一個又はそれ以上の通常の固形添加物、例えばココアバターと混ぜ合わせ、その結果生じる混合物を剤形化することによって製造出来る。
これらは化合物と一個又はそれ以上の通常の固形添加物、例えばココアバターと混ぜ合わせ、その結果生じる混合物を剤形化することによって製造出来る。
皮膚への局所使用に適した医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、スプレー、エアロゾル又はオイルの型で存在する。使用出来る添加物はバセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール類及びこれらの物質の2個又はそれ以上の組み合わせである。活性化合物は一般に組成物の重量で0.1〜15%の濃度、例えば0.5〜2%の濃度で存在する。
経皮投与もまた可能である。経皮使用に適した医薬組成物は、患者の表皮にぴったりと長時間接触するのに適した個別のプラスターとして存在しうる。そのようなプラスターは緩衝水溶液中に、適した場合には接着剤中に溶解及び/又は分散して又はポリマー中に分散して活性化合物を適切に含有している。適切な活性化合物濃度は約1%〜35%、好ましくは3%〜15%である。
II型糖尿病(NIDDM−非インスリン依存性糖尿病)は空腹状態(>126mg/dl)での高いグルコース値(高血糖)、筋肉又は脂肪のような末梢組織でのインスリン耐性、肝臓での糖新生の増加及び膵臓β細胞による不適切なインスリン分泌によって特徴づけられている。この病気の実際の原因はまだわかっていない。II型糖尿病は、肥満、高トリグリセリド血漿(血液脂肪値の上昇)及び高血圧のような他の臨床像を伴って頻繁に発症する。
インスリン耐性はその臨床像を理解するためのカギであると考えられている。インスリン耐性は決められたインスリン濃度に対して反応する、末梢臓器の機能低下として表現されている。これは細胞レベルで反映されている、すなわちインスリンに起因する作用を誘発するのに必要なインスリン量の増加に反映されている。筋肉、脂肪及び肝細胞においては、インスリンはグルコース代謝及び脂肪代謝に対して、血液からのグルコースの取り込みの増加、グルコースが代謝される速度の増加又は脂肪酸分解の阻害のような種々の作用を有している。種々の因子が細胞レベルでのインスリン耐性の進展と根本的に関連していると考えられている。インスリン受容体、シグナル・カスケードの因子及びグルコース輸送系の成分がこの問題に関して重要な役割を演じている。
インスリンは第一段階でインスリン受容体に結合することによって、生物学的機能を発揮している。この受容体がインスリンと結合した後、そのβサブユニットがインスリン受容体キナーゼによって自動リン酸化を受ける。筋肉細胞においては、そのシグナルはIRS(インスリン受容体基質)及びPI3K(ホスフォイノシトール-3-キナーゼ)を経由して細胞的に転送され、グルコースの取り込みの刺激へと導く。インスリンは、ほんの一部しか理解されていないメカニズムを経由して起こる多くの他の作用を引き起こす。シグナルの細胞内伝達において、特定のキナーゼ及びホスファターゼは協調して共に作用している。受容体からのインスリンの解離だけでは、インスリンによって誘導されるシグナルのスイッチを切るのには不充分である。制御するドメインがリン酸化されたままである限り、インスリン受容体のチロシンキナーゼ活性は持続する。細胞PTPaseはシグナルのスイッチを切る役割を果たしている。インスリン・シグナル経路のネガティブ制御因子に対して阻害作用を有する薬理学的に活性のある化合物は、インスリン受容体の脱リン酸化を遅らせる能力を持っている。このことは、これらの化合物をインスリンに対する抵抗性を減少させるために使用できる可能性を提示している。
略語:
LAR 白血球抗原―関連蛋白質チロシンホスファターゼ
CD45 白血球ホスファターゼCD45
YOP エルシニア蛋白質チロシンホスファターゼ
PTPalpha 蛋白質チロシンホスファターゼα
PTP1B 蛋白質チロシンホスファターゼ1B
TC−PTP T細胞−蛋白質チロシンホスファターゼ
CDC−25 細胞−分裂−制御ホスファターゼ25
PTEN クロモゾーム10内ホスファターゼ(二重特異性)
SHP1,2 src−相同性ホスファターゼ1,2
LAR 白血球抗原―関連蛋白質チロシンホスファターゼ
CD45 白血球ホスファターゼCD45
YOP エルシニア蛋白質チロシンホスファターゼ
PTPalpha 蛋白質チロシンホスファターゼα
PTP1B 蛋白質チロシンホスファターゼ1B
TC−PTP T細胞−蛋白質チロシンホスファターゼ
CDC−25 細胞−分裂−制御ホスファターゼ25
PTEN クロモゾーム10内ホスファターゼ(二重特異性)
SHP1,2 src−相同性ホスファターゼ1,2
〔実施例〕
1.PTP1B酵素の濃度に依存したDiFMUPの開裂
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。分析する酵素濃度あたり135μlの次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:目的の最終濃度の蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B(図1:30〜600 ng/ml);50 mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。ホスファターゼの反応は15μl の1 mM DiFMUP溶液を加えることによって開始し、蛍光の増加を蛍光ミクロタイタープレート光度計中で励起波長358 nm及び発光波長455 nmで15分間連続的に測定した(RFU中で測定)。酵素活性の測定値はPTP1Bの最終濃度に依存した蛍光の増加であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図1)。
1.PTP1B酵素の濃度に依存したDiFMUPの開裂
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。分析する酵素濃度あたり135μlの次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:目的の最終濃度の蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B(図1:30〜600 ng/ml);50 mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。ホスファターゼの反応は15μl の1 mM DiFMUP溶液を加えることによって開始し、蛍光の増加を蛍光ミクロタイタープレート光度計中で励起波長358 nm及び発光波長455 nmで15分間連続的に測定した(RFU中で測定)。酵素活性の測定値はPTP1Bの最終濃度に依存した蛍光の増加であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図1)。
2.PTP1BによるDiFMUPの開裂の濃度依存性
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。どの場合も135μlの次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100 ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50 mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。ホスファターゼ反応は、試験混合溶液中で望まれる最終濃度の10倍の基質(図2:0〜200μM)を含有するDiFMUP溶液の15μlを加えることによって開始し、蛍光ミクロプレート光度計中で358/455 nmで、30秒間隔で15分間蛍光を測定した。酵素活性の測定値はDiFMUP濃度に依存した蛍光の増加(RFU中で測定)であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図2)。ひき続いてこのグラフを用いて、ラインウイーバー・バーク分析法により酵素反応の速度定数を決定することが出来る。このように、PTP1BはKm値が19μM及びVmaxが388000 RFU sec-1 mg-1であることが見つかった。この分析は、他のチロシンホスファターゼに対しても類似の方法で実施出来る。速度定数を表1に示す。
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。どの場合も135μlの次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100 ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50 mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。ホスファターゼ反応は、試験混合溶液中で望まれる最終濃度の10倍の基質(図2:0〜200μM)を含有するDiFMUP溶液の15μlを加えることによって開始し、蛍光ミクロプレート光度計中で358/455 nmで、30秒間隔で15分間蛍光を測定した。酵素活性の測定値はDiFMUP濃度に依存した蛍光の増加(RFU中で測定)であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図2)。ひき続いてこのグラフを用いて、ラインウイーバー・バーク分析法により酵素反応の速度定数を決定することが出来る。このように、PTP1BはKm値が19μM及びVmaxが388000 RFU sec-1 mg-1であることが見つかった。この分析は、他のチロシンホスファターゼに対しても類似の方法で実施出来る。速度定数を表1に示す。
3.ホスフォチロシンホスファターゼ酵素PTPα、LAR、T細胞-PTP、SHP-2、CD45及びYOPの濃度に依存するDiFMUPの開裂
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。分析する酵素当たり及び酵素濃度当たり135μlの次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:目的の最終濃度の蛋白質チロシンホスファターゼ(図3:PTPα:0.5〜1.85μg/ml;LAR:125〜500 ng/ml;T細胞-PTP:66〜330 ng/ml;CD45:50〜400 ng/ml;YOP:50〜400 ng/ml;SHP-2:0.3〜2.4μg/ml);50mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。15μlの1mM DiFMUP溶液を加えることにより、ホスファターゼ反応を開始し、蛍光を蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358/455 nmで、30秒間隔で15分間以上にわたり測定した。酵素活性の測定値は蛋白質チロシンホスファターゼの最終濃度に依存した蛍光(RFUで測定)の増加であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図3)。
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。分析する酵素当たり及び酵素濃度当たり135μlの次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:目的の最終濃度の蛋白質チロシンホスファターゼ(図3:PTPα:0.5〜1.85μg/ml;LAR:125〜500 ng/ml;T細胞-PTP:66〜330 ng/ml;CD45:50〜400 ng/ml;YOP:50〜400 ng/ml;SHP-2:0.3〜2.4μg/ml);50mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。15μlの1mM DiFMUP溶液を加えることにより、ホスファターゼ反応を開始し、蛍光を蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358/455 nmで、30秒間隔で15分間以上にわたり測定した。酵素活性の測定値は蛋白質チロシンホスファターゼの最終濃度に依存した蛍光(RFUで測定)の増加であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図3)。
4.PTP1Bのホスファターゼ阻害剤の阻害効果の定量
活性化合物2,2−ジオキソ−2,3−ジヒドロ−2,6−ベンゾ [1,2,3] オキサチアゾール−5−イル)−(9−エチル−9H−カルバゾール−3−イルメチル)アミンの阻害効果の定量試験を37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中でDiFMUP試験を用いて実施した。120μlの容量の次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100 ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50 mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。これに15μlの試験する阻害剤溶液を種々の濃度で加えた。ホスファターゼ反応は15μlの1mM DiFMUP溶液を加えることにより開始し、蛍光を蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358/455nmで、30秒間隔で15分間以上にわたり測定した(RFU中で測定)。酵素活性の測定値は蛍光の増加であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図1)。得られた酵素活性の減少は用いた阻害剤の濃度に依存していた。活性化合物2,2−ジオキソ−2,3−ジヒドロ−2,6−ベンゾ [1,2,3] オキサチアゾール−5−イル)−(9−エチル−9H−カルバゾール−3−イルメチル)アミンがPTP1Bの活性を半分に減少する(IC-50)阻害剤濃度は3.8μMであると定量された。pNPP試験法及びマラカイトグリーンホスフォペプチド試験を用いたCI-50値を比較のために定量した。これらの値の相互の関連性は、pNNP試験法は5.1μMのIC50値を出し、マラカイトグリーンホスフォペプチド試験は3.9μMのIC50値を出していた。対応する阻害曲線を図4に示す。
活性化合物2,2−ジオキソ−2,3−ジヒドロ−2,6−ベンゾ [1,2,3] オキサチアゾール−5−イル)−(9−エチル−9H−カルバゾール−3−イルメチル)アミンの阻害効果の定量試験を37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中でDiFMUP試験を用いて実施した。120μlの容量の次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100 ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50 mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT。これに15μlの試験する阻害剤溶液を種々の濃度で加えた。ホスファターゼ反応は15μlの1mM DiFMUP溶液を加えることにより開始し、蛍光を蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358/455nmで、30秒間隔で15分間以上にわたり測定した(RFU中で測定)。酵素活性の測定値は蛍光の増加であり、これはグラフ上に描くことが出来る(図1)。得られた酵素活性の減少は用いた阻害剤の濃度に依存していた。活性化合物2,2−ジオキソ−2,3−ジヒドロ−2,6−ベンゾ [1,2,3] オキサチアゾール−5−イル)−(9−エチル−9H−カルバゾール−3−イルメチル)アミンがPTP1Bの活性を半分に減少する(IC-50)阻害剤濃度は3.8μMであると定量された。pNPP試験法及びマラカイトグリーンホスフォペプチド試験を用いたCI-50値を比較のために定量した。これらの値の相互の関連性は、pNNP試験法は5.1μMのIC50値を出し、マラカイトグリーンホスフォペプチド試験は3.9μMのIC50値を出していた。対応する阻害曲線を図4に示す。
5.ホスファターゼ阻害剤がPTP1Bに対して発揮する阻害タイプの特定。
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。120μlの容量の次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT及び前もって決めてあるIC50にしたがう阻害剤濃度。最終容積で目的の最終濃度の10倍(図2:0〜200μm)の基質を含有する、DIFMUPの15μl溶液を加えてホスファターゼ反応を開始し、蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358〜455nmで、30秒間隔で15分間、反応が飽和状態になるまで蛍光を測定した。続いて、前もって使用した最終濃度の10倍過剰量の基質を加え、蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358〜455nmで、30秒間隔で15分間反応を連続的に反応をモニターした。不可逆阻害剤の存在下では反応は再度開始することは出来ないが、一方で阻害が可逆タイプの場合はこれが可能であった。(図5)
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。120μlの容量の次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50mM Hepes、pH 6.9;150 mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT及び前もって決めてあるIC50にしたがう阻害剤濃度。最終容積で目的の最終濃度の10倍(図2:0〜200μm)の基質を含有する、DIFMUPの15μl溶液を加えてホスファターゼ反応を開始し、蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358〜455nmで、30秒間隔で15分間、反応が飽和状態になるまで蛍光を測定した。続いて、前もって使用した最終濃度の10倍過剰量の基質を加え、蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358〜455nmで、30秒間隔で15分間反応を連続的に反応をモニターした。不可逆阻害剤の存在下では反応は再度開始することは出来ないが、一方で阻害が可逆タイプの場合はこれが可能であった。(図5)
6.時間依存的培養法による、ホスファターゼ阻害剤がPTP1Bに対して発揮する阻害タイプの特定。
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。120μlの容量の次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50mM Hepes、pH 6.9;150mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT及び前もって決めてあるIC50にしたがう阻害剤濃度。混合液を培養し、最終容量で目的の最終濃度(図2:0〜200μM)の10倍の基質を含有するDiFMUP溶液の15μlを決められた時点で加えて、ホスファターゼ反応を開始し、蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358〜455nmで、30秒間隔で15分間蛍光を測定した。不可逆阻害剤の存在下では、酵素活性の減少は予備培養の時間に依存するが、一方でこの現象は可逆阻害タイプの阻害剤の場合は観察されない(図6)。
反応は37℃の温度で黒色ミクロタイタープレート中で行った。120μlの容量の次の成分を含有する反応緩衝液を用いた:100ngの蛋白質チロシンホスファターゼPTP1B/ml;50mM Hepes、pH 6.9;150mM NaCl;1mM EDTA;2mM DTT及び前もって決めてあるIC50にしたがう阻害剤濃度。混合液を培養し、最終容量で目的の最終濃度(図2:0〜200μM)の10倍の基質を含有するDiFMUP溶液の15μlを決められた時点で加えて、ホスファターゼ反応を開始し、蛍光ミクロタイタープレート光度計中で358〜455nmで、30秒間隔で15分間蛍光を測定した。不可逆阻害剤の存在下では、酵素活性の減少は予備培養の時間に依存するが、一方でこの現象は可逆阻害タイプの阻害剤の場合は観察されない(図6)。
Claims (17)
- a)生物材料又は生物材料から得られた生成物を提供すること、
b)6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を提供すること、
c)水溶液中でa)よりの生物材料又は生物材料から得られた生成物をb)よりのDiFMUPと接触させること、及び
d)その時生成された6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルを蛍光法で検出すること
より成る、生物材料中の蛋白質チロシンホスファターゼの酵素活性を検出する方法。 - LAR、CD45、YOP、PTPalpha、PTP1B、TC−PTP、CDC25、PTEN及びSHP1,2のグループよりの少なくとも1個の蛋白質チロシンホスファターゼが生物材料より得られた生成物として提供される、請求項1に記載された方法。
- 接触後のDiFMUPの濃度が10〜250μMである、請求項1又は請求項2に記載された方法。
- 接触後のDiFMUPの濃度が50〜100μMである、請求項3に記載された方法。
- c)の水溶液のpHが5.0〜8.0である、請求項1〜4のいずれか一項に記載された方法。
- pHが6.0〜7.5である、請求項5に記載された方法。
- pHが7.0である、請求項5または請求項8に記載された方法。
- a)化学物質を提供すること、
b)生物材料又は生物材料から得られた生成物を提供すること、
c)6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)を提供すること、
d)a)からの化学物質とb)からの生物材料又は生物材料から得られた生成物とc)からのDiFMUPとを水溶液中で互いに接触させること、
e)その時生成された6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルを蛍光法で定量すること、及び、
f)コントロールアッセイ中で生成された6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルの量と、生成されたe)での6,8−ジフルオロ−4−メチルウンベリフェリルの量を比較すること
より成る、蛋白質チロシンホスファターゼの活性を修飾する化合物を同定する方法。 - 蛋白質チロシンホスファターゼの活性が刺激、阻害又は維持される、請求項8に記載の方法。
- 蛋白質チロシンホスファターゼがLAR、CD45、YOP、PTPalpha、PTP1B、TC−PTP、CDC25、PTEN及びSHP1,2のグループより選ばれる、請求項8又は請求項9に記載の方法。
- 請求項8〜10のいずれかに記載の方法によって同定された化合物。
- 化合物の質量が0.1〜50kDaである、請求項11に記載の化合物。
- 化合物の質量が0.1〜5kDaである、請求項11又は請求項12に記載の化合物。
- その化合物の質量が0.1〜3kDaである、請求項11〜13のいずれか一項に記載の化合物。
- 化合物が蛋白質、アミノ酸、ポリサッカライド、糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、天然物または芳香族炭化水素化合物である、請求項11〜14のいずれか一項に記載された化合物。
- 請求項11〜15のいずれか一項に記載の少なくとも1個の化合物、医薬品を剤形するための補助物質及び/又は重合体添加物よりなる医薬品。
- 糖尿病治療用の医薬品を製造するための請求項11〜14のいずれか一項に記載の化合物の使用。
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