CN113155787A - 一种突变酶shp2 e76k的活性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，通过以下步骤，化合物配制添加，SHP2 E76K酶添加、底物添加、总体系反应和化合物本底读值检测，其中SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到2ng/uL，取2uL每孔加入到对应孔中，化合物与酶在相应温度下进行预孵育，化合物预孵育的温度为20‑30度，且孵育时间为30‑90分钟，可以直接建立了SHP2蛋白突变型SHP2(E76K)的酶活检测方法，为药物在此靶点上的抑制作用检测提供了方法，直接检测化合物与酶的抑制作用，可快速筛选出有效果的化合物，快速推进药物的研发进度，本发明涉及SHP2 E76K活性检测技术领域。该突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，解决现有技术中耗费大量时间及资金且细胞实验存在一些不稳定因素问题。

Description

一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法
技术领域
本发明涉及SHP2 E76K活性检测技术领域，具体为一种突变酶SHP2 E76K 的活性检测方法。
背景技术
SHP2为蛋白酪氨酸磷酸酶是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达；其与蛋白酪氨酸激酶共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等,属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗。
SHP2(蛋白酪氨酸磷酸酶)作为接头蛋白，募集GRB2和SOS形成复合物，促进KRAS的激活，进一步增强RAS-MAPK信号通路的激活，促进细胞的存活和增殖，有利于肿瘤的生长。但在实际临床治疗中除了野生型蛋白会出现各种蛋白突变，影响治疗效果。本专利中建立了SHP2蛋白突变型SHP2(E76K) 的酶活检测方法，为药物在此靶点上的抑制作用检测提供了方法。在现有中 SHP2(E76K)酶活性检测方法均为细胞实验，需要将E76K突变基因转染到细胞中，细胞需要能高表达SHP2(E76K)蛋白，再进行SHP2(E76K)酶活检测。
此方法将耗费大量时间及资金且细胞实验存在一些不稳定因素，通过本专利方法可直接检测化合物与酶的抑制作用，可快速筛选出有效果的化合物，快速推进药物的研发进度。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，解决了耗费大量时间及资金且细胞实验存在一些不稳定因素问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，包括以下步骤：
步骤1、化合物配制添加，将待测化合物用100％DMSO稀释作为第一个浓度，然后再进行第二个浓度点稀释至第八个浓度点，用1X buffer将待测化合物各梯度稀释成DMSO为10％的工作液，取5uL每孔加到对应孔中，设置双复孔实验，每孔加入18uL配制的反应混合液；
步骤2、SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到 2ng/uL，取2uL每孔加入到对应孔中，化合物与酶在相应温度下进行预孵育；
步骤3、底物添加，化合物预孵育结束后每孔加入25uL底物工作液，DMSO 终浓度为1％；
步骤4、总体系反应，反应体系置于在相应温度下进行反应，反应结束后采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm；
步骤5、化合物本底读值检测，未避免化合物本身带有的荧光值对数据产生影响，需要检测化合物本身的荧光读值，取100％DMSO稀释好的待测化合物各梯度0.5uL到新的化合物板中，加入49.5uL ddH2O进行100倍稀释，此时 DMSO终浓度为1％，采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、 emission:460nm。
优选的，所述步骤1中，稀释的浓度为1-3mM，所述梯度稀释为最高浓度点稀释的2-5倍。
优选的，所述骤1中，反应混合液包括12.5uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT，其中0.5uL DTT为250mm。
优选的，所述步骤2中，化合物预孵育的温度为20-30度，且孵育时间为30-90分钟。
优选的，所述步骤3中，底物工作液包含19.45uL H2O、5uL 5X assay buffer、0.5uL DTT和0.05uL SHP-2Substrate DiFMUP。
优选的，所述DTT和SHP-2Substrate DiFMUP分别为250mM和10mM。
优选的，所述步骤4中，反应体系在20-30度温度下反应20-60分钟。
优选的，所述步骤5中，得出酶反应原始读值减去化合物荧光读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，其计算方式以下；
利用方程式(Sample-Min/Max-Min)*100％将初始值换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(GraphPad Prism中log(inhibitor)vs. response--Variable slope模式得到)。
(三)有益效果
本发明提供了一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
1、该突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，通过建立了SHP2蛋白突变型 SHP2(E76K)的酶活检测方法，为药物在此靶点上的抑制作用检测提供了方法，直接检测化合物与酶的抑制作用，可快速筛选出有效果的化合物，快速推进药物的研发进度，解决现有技术中耗费大量时间及资金且细胞实验存在一些不稳定因素问题。
附图说明
图1为本发明检测方法示意图。
图2为本发明检测方法第一剂量效应曲线示意图；
图3为本发明检测方法第二剂量效应曲线示意图；
图4为本发明检测方法第三剂量效应曲线示意图。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1
实施例1
本发明实提供一种技术方案：一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，包括以下步骤：
步骤1、化合物配制添加，将待测化合物用100％DMSO稀释作为第一个浓度，然后然后再进行第二个浓度点稀释至第八个浓度点，用1X buffer将待测化合物各梯度稀释成DMSO为10％的工作液，取5uL加到对应孔中，设置双复孔实验，每孔加入18uL配制的反应混合液；
步骤2、SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到 2ng/uL，取2uL加入到对应孔中，化合物与酶在温度下孵育成化合物预孵育；
步骤3、底物添加，化合物预孵育结束后每孔加入25uL底物工作液，DMSO 终浓度为1％；
步骤4、总体系反应，反应体系置于在温度下进行反应，反应结束后采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm；
步骤5、化合物本底读值检测，未避免化合物本身带有的荧光值对数据产生影响，需要检测化合物本身的荧光读值，取100％DMSO稀释好的待测化合物各梯度0.5uL到新的化合物板中，加入49.5uL ddH2O进行100倍稀释，此时 DMSO终浓度为1％，采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、 emission:460nm。
进一步的，步骤1中，稀释的浓度为1mM，第二次稀释为第一次稀释的2 倍。
进一步的，步骤1中，反应混合液包括12.5uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT，其中0.5uL DTT为250mm。
进一步的，步骤2中，化合物预孵育的温度为20度，且孵育时间为30 分钟。
进一步的，步骤3中，底物工作液包含19.45uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT和0.05uL SHP-2 Substrate DiFMUP。
进一步的，DTT和SHP-2 Substrate DiFMUP分别为250mm和10mm。
进一步的，步骤4中，反应体系在20度温度下反应20分钟。
进一步的，步骤5中，得出酶反应原始读值减去化合物荧光读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，其计算方式以下；
利用方程式(Sample-Min/Max-Min)*100％将初始值换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(GraphPad Prism中log(inhibitor)vs. response--Variable slope模式得到)。
实施例2
本发明实提供一种技术方案：一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，包括以下步骤：
步骤1、化合物配制添加，将待测化合物用100％DMSO稀释作为第一个浓度，然后再进行第二个浓度点稀释至第八个浓度点，用1X buffer将待测化合物各梯度稀释成DMSO为10％的工作液，取5uL加到对应孔中，设置双复孔实验，每孔加入18uL配制的反应混合液；
步骤2、SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到 2ng/uL，取2uL加入到对应孔中，化合物与酶在温度下孵育成化合物预孵育；
步骤3、底物添加，化合物预孵育结束后每孔加入25uL底物工作液，DMSO 终浓度为1％；
步骤4、总体系反应，反应体系置于在温度下进行反应，反应结束后采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm；
步骤5、化合物本底读值检测，未避免化合物本身带有的荧光值对数据产生影响，需要检测化合物本身的荧光读值，取100％DMSO稀释好的待测化合物各梯度0.5uL到新的化合物板中，加入49.5uL ddH2O进行100倍稀释，此时 DMSO终浓度为1％，采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、 emission:460nm。
进一步的，步骤1中，稀释的浓度为2mM，梯度稀释为最高浓度点稀释的 3倍。
进一步的，步骤1中，反应混合液包括12.5uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT，其中0.5uL DTT为250mm。
进一步的，步骤2中，化合物预孵育的温度为25度，且孵育时间为60 分钟。
进一步的，步骤3中，底物工作液包含19.45uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT和0.05uL SHP-2 Substrate DiFMUP。
进一步的，DTT和SHP-2 Substrate DiFMUP分别为250mm和10mm。
进一步的，步骤4中，反应体系在25度温度下反应45分钟。
进一步的，步骤5中，得出酶反应原始读值减去化合物荧光读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，其计算方式以下；
利用方程式(Sample-Min/Max-Min)*100％将初始值换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(GraphPad Prism中log(inhibitor)vs. response--Variable slope模式得到)。
实施例3
本发明实提供一种技术方案：一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，包括以下步骤：
步骤1、化合物配制添加，将待测化合物用100％DMSO稀释作为第一个浓度，然后再进行第二个浓度点稀释至第八个浓度点，用1X buffer将待测化合物各梯度稀释成DMSO为10％的工作液，取5uL加到对应孔中，设置双复孔实验，每孔加入18uL配制的反应混合液；
步骤2、SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到 2ng/uL，取2uL加入到对应孔中，化合物与酶在温度下孵育成化合物预孵育；
步骤3、底物添加，化合物预孵育结束后每孔加入25uL底物工作液，DMSO 终浓度为1％；
步骤4、总体系反应，反应体系置于在温度下进行反应，反应结束后采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm；
步骤5、化合物本底读值检测，未避免化合物本身带有的荧光值对数据产生影响，需要检测化合物本身的荧光读值，取100％DMSO稀释好的待测化合物各梯度0.5uL到新的化合物板中，加入49.5uL ddH2O进行100倍稀释，此时 DMSO终浓度为1％，采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、 emission:460nm。
进一步的，步骤1中，稀释的浓度为3mM，梯度稀释为最高浓度点稀释的 5倍。
进一步的，步骤1中，反应混合液包括12.5uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT，其中0.5uL DTT为250mm。
进一步的，步骤2中，化合物预孵育的温度为30度，且孵育时间为90 分钟。
进一步的，步骤3中，底物工作液包含19.45uL H2O、5uL 5X assay buffer、 0.5uLDTT和0.05uL SHP-2 Substrate DiFMUP。
进一步的，DTT和SHP-2 Substrate DiFMUP分别为250mm和10mm。
进一步的，步骤4中，反应体系在30度温度下反应60分钟。
进一步的，步骤5中，得出酶反应原始读值减去化合物荧光读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，其计算方式以下；
利用方程式(Sample-Min/Max-Min)*100％将初始值换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(GraphPad Prism中log(inhibitor)vs. response--Variable slope模式得到)。
在本实施例中需要说明的是，通过上述三个实施例在不同天进行的实验测试得出以下附图所示得出测试化合物对SHP2 E76K酶活的影响，Max孔:无 SHP2(E76K)酶Blank对照孔初始值，Min孔：1％DMSO对照孔初始值。
以及阳性药RMC4550测试：阳性药物RMC4550在SHP2(E76K)酶上的抑制剂作用，三天的化合物IC50值相符，实验结果显示本专利实验体系稳定，该体系在不同天进行化合物测试时，化合物测试结果稳定可靠，其中细胞实验，化合物测试结果会受到细胞状态的影响，可能会导致在不同天进行的测试实验结果不稳定，在时效性上，本专利方法可在加药当天得到化合物测试结果，而细胞实验中化合物与细胞的作用时间较长，实验周期也随之变长，相较于细胞实验中细胞器构建需要几个月到半年不等，不仅耗时，费力，而且成本高，本专利方法操作简单，方法构建成本相对较低，实验周期短，体系稳定，不仅满足一般通量的化合物筛选，还满足化合物高通量筛选的高效，稳定的实验要求，可为化合物在SHP2(E76K)酶抑制作用高通量筛选提供一种可靠地方法，化合物RMC4550实验排布如下；
化合物RMC4550 N＝1测试
Figure RE-GDA0003097163620000081
Figure RE-GDA0003097163620000091
酶反应荧光值原始数据
57373 31191 31267
60864 37490 41481
61297 46497 50866
60923 58035 57241
22837 62214 58658
22523 60009 58235
23421 63006 61452
21862 61973 59793
化合物荧光值原始数据
Figure RE-GDA0003097163620000092
Figure RE-GDA0003097163620000101
酶活荧光值原始数据-化合物荧光值原始数据
53346 23827 24830
56952 32819 36984
57271 42643 46503
57030 54196 53350
18587 58242 54459
18575 55999 53876
19257 58765 57470
17477 58183 55185
抑制率计算结果
Figure RE-GDA0003097163620000102
Figure RE-GDA0003097163620000111
化合物RMC4550 N＝2测试
Figure RE-GDA0003097163620000112
酶反应荧光值原始数据
Figure RE-GDA0003097163620000113
Figure RE-GDA0003097163620000121
化合物荧光值原始数据
4562 20925 18511
3995 6063 5957
4020 4521 4594
3970 4021 4345
4421 4224 4193
3880 4147 3720
3780 4377 4465
4127 4003 4173
酶活荧光值原始数据-化合物荧光值原始数据
Figure RE-GDA0003097163620000122
Figure RE-GDA0003097163620000131
抑制率计算结果
8.03 78.97 84.00
-7.70 66.52 60.33
6.45 5.78 4.16
-6.77 -1.64 -3.13
104.11 -5.78 -0.71
101.93 7.41 1.87
90.20 -0.91 2.87
103.75 -4.23 -2.84
化合物RMC4550 N＝3测试
Figure RE-GDA0003097163620000132
Figure RE-GDA0003097163620000141
酶反应荧光值原始数据
63756 53774 55214
71724 39987 37528
68266 54574 53288
71240 60282 65006
18619 63854 63865
22148 63931 68034
22145 64765 71800
23653 66829 65851
化合物荧光值原始数据
4506 32559 34340
4241 5830 6340
4032 4192 4036
4774 4354 4537
3771 4227 3976
4426 3832 4212
3920 4316 4262
4578 3973 4167
酶活荧光值原始数据-化合物荧光值原始数据
59250 21215 20874
67483 34157 31188
64234 50382 49252
66466 55928 60469
14848 59627 59889
17722 60099 63822
18225 60449 67538
19075 62856 61684
抑制率计算结果
10.89 92.01 92.74
-6.66 64.41 70.74
0.26 29.81 32.22
-4.50 17.98 8.29
105.59 10.09 9.53
99.46 9.08 1.14
98.38 8.34 -6.78
96.57 3.20 5.70
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、化合物配制添加，将待测化合物用100％DMSO稀释作为第一个浓度，然后再进行第二个浓度点稀释至第八个浓度点，用1X buffer将待测化合物各梯度稀释成DMSO为10％的工作液，取5uL每孔加到对应孔中，设置双复孔实验，每孔加入18uL配制的反应混合液；
步骤2、SHP2 E76K酶添加，用1X assay buffer将SHP2 E76K酶稀释到2ng/uL，取2uL每孔加入到对应孔中，化合物与酶在相应温度下进行预孵育；
步骤3、底物添加，化合物预孵育结束后每孔加入25uL底物工作液，DMSO终浓度为1％；
步骤4、总体系反应，反应体系置于在相应温度下进行反应，反应结束后采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm；
步骤5、化合物本底读值检测，未避免化合物本身带有的荧光值对数据产生影响，需要检测化合物本身的荧光读值，取100％DMSO稀释好的待测化合物各梯度0.5uL到新的化合物板中，加入49.5uL ddH2O进行100倍稀释，此时DMSO终浓度为1％，采用多标记分析仪读取Fluorescence、excitation:360nm、emission:460nm。
2.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤1中，稀释的浓度为1-3mM，所述梯度稀释为最高浓度点稀释的2-5倍。
3.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述骤1中，反应混合液包括12.5uL H2O、5uL 5X assay buffer、0.5uL DTT，其中0.5uL DTT为250mm。
4.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤2中，化合物预孵育的温度为20-30度，且孵育时间为30-90分钟。
5.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤3中，底物工作液包含19.45uL H2O、5uL 5X assay buffer、0.5uL DTT和0.05uL SHP-2Substrate DiFMUP。
6.根据权利要求5所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述DTT和SHP-2Substrate DiFMUP分别为250mM和10mM。
7.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤4中，反应体系在20-30度温度下反应20-60分钟。
8.根据权利要求1所述的一种突变酶SHP2 E76K的活性检测方法，其特征在于：所述步骤5中，得出酶反应原始读值减去化合物荧光读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，其计算方式以下；
利用方程式(Sample-Min/Max-Min)*100％将初始值换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(GraphPad Prism中log(inhibitor)vs.response--Variableslope模式得到)。
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