DE10236329A1

DE10236329A1 - Ein hochsensitiver und kontinuierlicher Protein Tyrosin-Phosphatase (PTPase) Test unter Verwendung von 6,8 Difluoro-4-methyl-umbelliferylphosphat (DiFMUP)

Info

Publication number: DE10236329A1
Application number: DE2002136329
Authority: DE
Inventors: Stefan Dipl.-Ing. Welte; Norbert Dr. Tennagels; Stefan Dr. Petry
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2002-08-08
Publication date: 2004-02-19

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Protein-Tyrosin-Phosphatase in biologischem Material unter Verwendung von 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP).

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Protein-Tyrosin-Phosphatasen insbesondere unter neutralen Bedingungen mittels 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat.

Im Stand der Technik offenbart sind Verfahren zum Nachweis der Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase, wobei das Substrat p-Nitrophenylphosphat (p-NPP) verwendet wird. Solche Nachweisverfahren finden sich in Standardhandbüchern der Biochemie wie beispielsweise in "Current protocols in protein science: John E. Coligan (ed.), Ben M. Dunn (ed.), Hidde L. Ploegh (ed.), David W. Speicher (ed.), Paul T. Wingfield (ed.); SBN: 0-471-11184-8; Loseblattwerk, laufend erneuert; Verlag John Wiley & Sons. "Aus dem p-NPP entsteht durch die Einwirkung einer Phosphatase p-Nitrophenol. P-Nitrophenol ist wegen seiner intensiven Gelbfärbung im alkalischen Bereich photometrisch nachweisbar Dieses Testverfahren weist allerdings einige ungünstige Eigenschaften auf. Der Test eignet sich nicht zur direkten Bestimmung der Enzymaktivität, da er nach dem "Time-Stop"-Prinzip durchgeführt wird. Die Enzymreaktion wird hierbei nach Ablauf einer bestimmten Zeitdauer durch Zugabe von Natronlauge unterbrochen. Der pH-Wert-Anstieg führt zu einem Farbumschlag des entstandenen p-Nitrophenols ins Gelbe, dessen Absorption photometrisch bestimmt wird und ein Maß für die vorhandene Menge an p-Nitrophenol darstellt. Dieses Testprinzip ist für enzymkinetische Untersuchungen beispielsweise zur Bestimmung des Hemmtyps recht umständlich. Da eine Vielzahl von Meßpunkten erforderlich sind, müssen entsprechend viele miteinander koordinierte Einzelansätze aufgebaut werden.

Das Substrat ist außerdem licht-, temperatur- und pH empfindlich. Im Bereich des physiologischen pH-Wertes neigt es zu langsamer Zersetzung.

Einige der zu untersuchenden Tyrosinphosphatasen haben das Aktivitätsmaximum mit pNPP als Substrat im sauren Bereich. PTP1B beispielsweise zeigt bei einem pH-Wert von 5,6 den stärkeren Umsatz. Beim physiologischen pH-Wert von 7,0 hingegen arbeitet PTP1B mit pNPP als Substrat nur noch mit 30 % des maximalen Umsatzwertes. Dadurch werden relativ hohe Mengen des Enzyms benötigt, wodurch sich die Kosten entsprechend verteuern. Ein weiterer negativer Faktor dieses Testverfahrens liegt darin, daß bisweilen andere im Test vorhandene Komponenten wie Puffer, Salze oder anderes (Testsubstanzen) eine Absorption im gelben Bereich aufweisen. Dafür sind entsprechende Hintergrundkontrollen erforderlich.

Als weiterer Nachweis der Aktivität von Protein-Tyrosin-Phosphatasen ist der Malchitgrün-Phosphopeptidtest beschrieben (Martin et al. (1985) Journal of Biological Chemistry, 260, pp. 14932 und Harder et al. (1994) Biochemical Journal, 298, pp. 395). Hierbei wird das durch die Phosphatase aus ihrem Substratpeptid freigesetzte anorganische Phosphat durch das Malachitgrün-Reagenz photometrisch nachgewiesen. Neben der Anfälligkeit der photometrischen Bestimmung durch beispielsweise Verunreinigungen oder pH-Empfindlichkeit und der Umständlichkeit des Timestop-Verfahrens, ist ein weiterer Nachteil, daß für jede Phosphatase das spezifische Substratpeptid in hoher Konzentration bereitgestellt werden muß, welches das Verfahren im allgemeinen recht kostspielig werden lässt.

Als anderes Substrat zum Nachweis von Protein-Tyrosin-Phosphatasen ist 3,6-Fluorescein Diphosphate beschrieben (Journal of Biomolecular Screening 4, 327–334, 1999). Es ermöglicht im Gegensatz zu den beiden oben genannten Substraten zwar die direkte Messung der Enzymaktivität, allerdings sind die spektralen Eigenschaften dieses Substrats für Messungen im Bereich des physiologischen pH-Wertes noch nicht besonders gut.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein weiteres Testverfahren für Protein-Tyrosin Phosphatasen zur Verfügung zu stellen, welches zuverlässiger und wirtschaftlicher anwendbar ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der enzymatischen Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase in biologischem Material, wobei

a] biologisches Material oder eine Präparation aus biologischem Material bereitgestellt wird,
b] 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) bereitgestellt wird,
c] das biologische Material oder die Präparation aus biologischem Material aus a] mit dem DiFMUP aus b] in einer wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht wird,
d] das dann entstehende 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl fluorometrisch nachgewiesen wird.

Die Präparation aus dem biologischen Material besteht bevorzugt aus einer Protein Tyrosin Phosphatase aus der Gruppe LAR, CD 45, PTP alpha, PTP 1 B, TCPTP, YOP, CDC 25, PTEN, SHP1,2. Die Präparation des biologischen Materials kann in unterschiedlichen Reinheitsstufen vorliegen. Es kann sich bei der Präparation aus dem biologischen Material um ganze Zellen, Aufschlüsse von Zellen, mit Zellbestandteilen und/oder Organellen angereicherter Proben oder um gereinigte Proteine handeln.

Die Konzentration des 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphats (DiFMUP) beträgt beim Inkontaktbringen mit dem biologischen Material oder der Präparation aus biologischem Material bevorzugt 10 bis 250 μM. Besonders bevorzugt beträgt die Konzentration des DiFMUP 50 bis 100 μM.

Der pH-Wert der wäßrigen Lösung, in welchem das Inkontaktbringen des biologischen Materials oder der Präparation aus biologischem Material mit dem DiFMUP erfolgt, liegt bevorzugt zwischen 5,0 und 8,0 und besonders bevorzugt zwischen 6,0 und 7,5. In einer nochmals besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt dieser pH-Wert 7,0.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, wobei

a] eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
b] biologisches Material oder eine Präparation aus biologischem Material bereitgestellt wird,
c] 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) bereitgestellt wird,
d] die chemische Verbindung aus a], sowie das biologische Material oder die Präparation aus biologischem Material aus b] und das DiFMUP aus c] miteinander in einer wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht werden,
e] die Menge des dann entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyls fluorometrisch bestimmt wird,
f] das Resultat der Menge des entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyls aus e] verglichen wird mit dem Resultat der Menge des entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyls in einem Kontrollansatz.

Ein Kontrollansatz zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß beim Inkontaktbringen des biologischen Materials oder der Präparation aus biologischem Material mit DiFMUP entweder keine chemische Verbindung im Sinne des zuvor genannten Verfahrensschritts a) beteiligt ist oder die Wirkung der chemischen Verbindung in Bezug auf eine Protein-Tyrosin-Phosphatase der gewählten Ausführungsform bereits bekannt ist. Solche chemischen Verbindungen, welche im Kontrollansatz verwendet werden und deren Wirkung auf eine Protein-Tyrosin-Phosphatase bereits bekannt ist, können insbesondere Vanadat, Vanadium organische Verbindungen, Pervanadat, Okadaic-Säure, NaF, Dephostasin, modifizierte Peptide oder andere Verbindungen sein.

In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, soll diese Modifizierung aus einer Stimulierung, Hemmung oder der Stabilisierung der Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase bestehen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifziert, wird diese Protein-Tyrosin-Phosphatase ausgewählt aus der Gruppe umfassend aus der Gruppe LAR, CD 45, PTP alpha, PTP 1B, TC-PTP, CDC 25, PTEN, YOP, SHP1,2., PTP1B.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert und welche durch vorstehend beschriebenes Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, identifiziert wurde. Diese Verbindung hat bevorzugt eine Masse zwischen 0,1 bis 50 kDa, weiterhin bevorzugt zwischen 0,1 bis 5 kDa und weiterhin bevorzugt zwischen 0,1 bis 3 kDa. Die Verbindung kann ein Protein, eine Aminosäure, ein Polynucleotid, ein Nucleotid, ein Naturstoff oder eine aromatische Kohlenwasserstoftverbindung sein. Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, welches mindestens eine wie vorstehend beschriebene Verbindung umfaßt, die durch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifizier, identifiziert wurde. Das Arzneimittel umfaßt weiterhin Formulierungshilfsstoffe für ein Arzneimittel und/oder polymere Zusatzstoffe.,

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Verbindung, welche durch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.

6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl-phosphatase ist kommerziell erhältlich. Beispielsweise vertreibt die Firma Molecular Probes Europe BV (2333 Leiden, The Netherlands) diese Chemikalie. Die Herstellung ist in US 5,830, 912 offenbart.

Biologisches Material ist jedes Material, das genetische Informationen enthält und sich selbst reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Biologisches Material sind beispielsweise Zellen aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Organen wie insbesondere Gehirn, Fettgewebe, Lunge, Herz, Leber, Niere, Milz, Muskel und andere. Biologisches Material sind beispielsweise auch Bakterien oder Pilze wie beispielsweise Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae. Weiterhin umfaßt biologisches Material Zellen aus Zellkulturen.

Die Gewinnung von biologischem Material kann im Falle von Zellen aus tierischen oder menschlichen Geweben durch Biopsie, operative Entnahme, Entnahme mittels Spritzen oder Kathetern oder vergleichbaren Techniken erfolgen. Die so entnommenen Zellen können tiefgefroren, aufgearbeitet oder in Zellkultur genommen werden. Bakterien und Hefezellen werden mittels gebräuchlicher Techniken der Mikrobiologie vermehrt und aufgearbeitet.

Entsprechende Anleitungen hierfür findet der Fachmann in "Current Protocols in Molecular Biology; ed.: F.M. Ansabel et al., Loseblattwerk, laufend erneuert, Ausgabe 2001, Verlag John Wiley & Sons".

Biologisches Material kann auch aus den Zellen einer tierischen Zellkultur bestehen. Solche Zellen sind beispielsweise Mauszellen, Rattenzellen oder Hamsterzellen. Die Zellkulturzellen können primäre Zelltypen oder etablierte Zelllinien sein. Beispiele für etablierte Zelllinien sind Maus 3T3-Zellen, CHO-Zellen oder Hela-Zellen. Haltung, Anzucht und Vermehrung von Zelllinien ist in Standardlehrbüchern beschrieben, wie beispielsweise in "Basic Cell Culture; ed.: J.M. Daris IRL Press, Oxford (1996)". Eine Präparation eines biologischen Materials wird beispielsweise durch Aufschluß des biologischen Materials und sich daran anschließende Reinigungsschritte hergestellt. Methoden zum Aufschluß des biologischen Materials können insbesondere wiederholtes Einfrieren und Auftauen, die Behandlung mit Ultraschall, die Verwendung einer French-Press, die Zugabe von Detergentien und Enzymen oder vergleichbares sein. Sich anschließende Reinigungsschritte bestehen beispielsweise aus differentieller Zentrifugation, der Fällung mit Ammonsulfat oder organischen Lösungsmitteln, der Anwendung von chromatographischen Techniken und anderen. Chromatographische Techniken sind beispielsweise die Polyacrylamidgelektrophorese, Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Gaschromatographie, Massenspektrometrie und anderes sein. Hierfür und insbesondere auch für detaillierte Anweisungen zur Reindarstellung von Proteinen stehen dem Fachmann Lehrbücher zur Verfügung wie insbesondere "Current Protocols in Protein Science, ed.: J. E. Coligan et al., LoseblattwerK, laufend erneuert, Ausgabe 2001, Verlag John Wiley & Sons".

Das Inkontaktbringen des biologischen Materials oder der Präparation aus biologischem Material mit DiFMUP kann in gewöhnlichen Laborgefäßen wie beispielsweise Eppendorf-Gefäßen, Zentrifugen-Röhrchen oder Glaskolben erfolgen.

Das zugrundeliegende wäßrige Medium enthält beispielsweise Puffersubstanzen, Nährmediumbestandteile, einwertige oder zweiwertige Ionen wie Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Cl^–, SO₄ ^2–, PO₃ ^2– oder andere, weiterhin Proteine, Glycerin oder anderes. Für das Inkontaktbringen können bestimmte konstante Bedingungen wie insbesondere die Temperatur, der pH-Wert, die Ionenbedingungen, die Konzentration eines Proteins, des Volumens oder andere Faktoren vorteilhaft sein. Dies wird erreicht, in dem beispielsweise das Inkontaktbringen in konstant temperierten Inkubationsvorrichtungen, in Gegenwart eines Puffers oder mit den zuvor genau eingewogenen Mengen der Ionen oder Proteine durchgeführt wird. Das wäßrige Lösungsmittel kann insbesondere auch einen bestimmten Anteil eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylsulfoxid, Methanol oder Ethanol enthalten. Der Gehalt eines solchen Lösungsmittels beträgt aber vorzugsweise nicht mehr als 10 Vol. % des Ansatzes.

Die PTPase (Phosphatase) Protein-Familie umfaßt gegenwärtig etwa 100 verschiedene Mitglieder. Diese können grob unterteilt werden in rezeptorgekoppelte und cytoplasmatische. Den Phosphatasen ist das Aminosäuremotiv (H/V)CX₅R(S/T) in der katalytischen Domäne gemeinsam. Die rezeptorgekoppelten Phosphatasen bestehen gewöhnlich aus einer extrazellulären Domäne, einer einzigen, Transmembranregion und einer oder zwei cytoplasmatischen PTPase Domänen. Zu den rezeptorgekoppelten PTPasen werden die LAR (leukocyte common antigenrelated) und die PTPa gerechnet. Die intrazellulären PTPasen enthalten normalerweise eine katalytische Domäne und verschiedene Verlängerungen des C- oder N-terminalen Bereichs beispielsweise durch "SH Domänen". Diesen Verlängerungen werden Funktionen bei der Zielfindung ("targeting") oder Regulation zugesprochen. Das Enzym PTP1 B wird den cytoplasmatischen PTPasen zugeordnet. Neben den reinen Tyrosin-Phosphatasen zählt zur PTPase Familie auch die Gruppe der dualen Phosphatasen. Diese Enzyme verwenden neben Phosphotyrosin auch Phosphoserin oder Phosphothreonin als Substrat. Zu dieser Gruppe gehören beispielsweise der Phosphatasen VHR und cdc25.

Den Phosphatasen LAR, PTPa, SHP-2 und PTP1B werden wichtige Funktionen im Insulin vermittelten Signalweg zugesprochen. Diese PTPasen assoziieren mit dem Insulinrezeptor und katalysieren die Dephosphorylierung. Möglicherweise spielen diese PTPasen einzeln oder in Kombination eine Rolle bei der Pathogenese der Insulinresistenz. (Biochemistry 38, 3793-3803, 1999; S. 3799).

PTP1B ist ein negativer Regulator des von Insulin stimulierten Signaltransduktionswegs, das heißt, das Protein schaltet das von Insulin induzierte Signal wieder ab. Vermutlich geschieht die Unterbrechung des Signalwegs durch direkte Dephosphorylierung des Insulinrezeptors. PTP1B wird auch bei einem großen Prozentsatz von Patienten mit Brustkrebs überexprimiert. Darüberhinaus zeigt das Enzym Wechselwirkungen mit dem "epidermal growth factor". Für das Enzym konnten zwei Aryl-Phosphat-Bindetaschen nachgewiesen werden. Eine befindet sich direkt im aktiven Zentrum, eine weitere an einer dem katalytischen Zentrum benachbarten Stelle außerhalb von diesem. (Biochemistry 38, 3793-3803, 1999).

Die Weiterleitung und Beendigung von vielen intrazellulären Signalen wird durch Tyrosinphosphorylierung der beteiligten Faktoren gesteuert. Den Phosphorylierungszustand legt eine genau ausbalancierte Aktivität sich ergänzender Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK) und Phosphatasen (PTPase) insbesondere Protein-Tyrosin-Phosphatasen fest. PTPasen sind als Enzyme verantwortlich für die selektive Dephosphorylierung von Phospho-Tyrosin-Resten. PTPasen funktionieren im Zusammenspiel mit den Protein-Tyrosin-Kinasen vielfältig in unterschiedlichen biologischen Prozessen bei der Vermittlung von Signalen durch beispielsweise Wachstumsfaktoren oder Hormone. Diese Signaltransduktionsmechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des zellulären Stoffwechsels, des Wachstums, der Differenzierung oder Mobilität. Die fehlerhafte Regulierung von Signalwegen wird für einige pathologische Prozesse als eine der ursächlichen Bedingungen diskutiert. Dazu zählen beispielsweise Krebs, einige immunologische und neurologische Krankheiten sowie Diabetes vom Typ II und Obesitas.

Die Bereitstellung einer chemischen Verbindung erfolgt beispielsweise durch chemische Synthese. Dem Fachmann sind die Standardsynthesemethoden geläufig. Die chemische Verbindung kann Teil einer Sammlung chemischer Verbindungen sein, wie sie durch Lagerung und Katalogisierung der chemischen Verbindungen aus abgeschlossenen Syntheseprogrammen entstehen (sogenannte "chemical libraries"). Die Verbindung kann in anderen Fällen von einem Mikroorganismus insbesondere einem Bakterium, aber auch von einem Pilz oder einer Pflanze gebildet worden sein (Naturstoff).

Geeignete pharmazeutische Verbindungen für die orale Verabreichung können in separaten Einheiten vorliegen, wie zum Beispiel Kapseln, Oblatenkapseln, Lutschtabletten oder Tabletten, als Pulver oder Granulate, als Lösung oder Supension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit, oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in Öl-Emulsion. Diese Zusammensetzungen können nach jeder geeigneten pharmazeutischen Methode zubereitet werden, die einen Schritt umfaßt, bei dem der Wirkstoff und der Träger (der aus einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen bestehen kann) in Kontakt gebracht werden. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch gleichmäßiges und homogenes Vermischen des Wirkstoffs mit einem flüssigen und/oder feinverteilten festen Träger hergestellt, wonach das Produkt, falls erforderlich, geformt wird. So kann beispielsweise eine Tablette hergestellt werden, indem ein Pulver oder Granulat einer Verbindung verpreßt oder geformt wird, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen. Gepreßte Tabletten können durch Tablettieren der Verbindung in frei fließender Form, wie beispielsweise einem Pulver oder Granulat, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inertem Verdünner und/oder einem (mehreren) oberflächenaktiven/dispergierenden Mittel in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen der pulverförmigen, mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel befeuchteten Verbindung in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine perorale (sublinguale) Verabreichung geeignet sind, umfassen Lutschtabletten, die eine Verbindung mit einem Geschmacksstoff enthalten, üblicherweise Saccharose und Gummi arabicum oder Tragant, und Pastillen die eine Verbindung in einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum umfassen.

Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung umfassen vorzugsweise sterile wäßrige Zubereitungen einer Verbindung, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers sind. Diese Zubereitungen werden vorzugsweise intravenös verabreicht, wenngleich die Verabreichung auch subkutan, intramuskulär oder intradermal als Injektion erfolgen kann. Diese Zubereitungen können vorzugsweise hergestellt werden, indem die Verbindung mit Wasser gemischt wird und die erhaltene Lösung steril und mit dem Blut isotonisch gemacht wird. Injizierbare erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten im allgemeinen von 0,.1 bis 5 Gew.-% einer aktiven Verbindung.

Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die rektale Verabreichung liegen vorzugsweise als Einzeldosis-Zäpfchen vor. Diese können hergestellt werden, indem man eine Verbindung mit einem oder mehreren herkömmlichen festen Trägern, beispielsweise Kakaobutter, mischt und das entstehende Gemisch in Form bringt.

Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die topische Anwendung auf der Haut liegen vorzugsweise als Salbe, Creme, Lotion, Paste, Spray, Aerosol oder Öl vor. Als Träger können Vaseline, Lanolin, Polyethylenglykole, Alkohole und Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Der Wirkstoff ist im allgemeinen in einer Konzentration von 0,1 bis 15 Gew.-% der Zusammensetzung vorhanden, beispielsweise von 0,5 bis 2 %.

Auch eine transdermale Verabreichung ist möglich. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für transdermale Anwendungen können als einzelne Pflaster vorliegen, die für einen langzeitigen engen Kontakt mit der Epidermis des Patienten geeignet sind. Solche Pflaster enthalten geeigneterweise den Wirkstoff in einer gegebenenfalls gepufferten wäßrigen Lösung, gelöst und/oder dispergiert in einem Haftmittel oder dispergiert in einem Polymer. Eine geeignete Wirkstoff-Konzentration beträgt ca. 1 % bis 35 %, vorzugsweise ca. 3 % bis 15 %.

Typ 2 Diabetes (NIDDM – non insulin dependent diabetes mellitus) ist charakterisiert durch hohe Glukosewerte (Hyperglycämie) im nüchternen Zustand (> 126mg/dl), Insulinresistenz in peripheren Geweben wie Muskel oder Fett, einer erhöhten Glukoneogenese der Leber, sowie einer ungenügenden Insulinsekretion durch die pankreatischen β-Zellen. Die eigentliche Ursache dieser Erkrankung ist noch nicht bekannt. Der Typ 2 Diabetes tritt sehr häufig zusammen mit anderen Krankheitsbildern wie Obesitas (Fettleibigkeit), Hypertriglyceridämie (erhöhte Blutfettwerte) und Bluthochdruck auf.

Ein Schlüssel zum Verständnis des Krankheitsbildes wird in der Insulinresistenz vermutet. Die Insulinresistenz äußert sich im verringerten Ausmaß der peripheren Organe auf eine definierte Konzentration von Insulin zu reagieren. Dies spiegelt sich auf zellulärem Niveau wieder, in der Erhöhung der Insulinmenge, die benötigt wird, um einen Effekt durch Insulin auszulösen. Insulin erzeugt in Zellen von Muskel, Fett und Leber verschiedene Auswirkungen auf den Glukose- und Fettstoffwechsel wie Erhöhung der Glukoseaufnahme aus dem Blut, Erhöhung der Glukosestoffwechselrate oder Inhibierung der Fettsäurespaltung. Die Entstehung der Insulinresistenz auf zellulärem Niveau wird grundsätzlich mit verschiedenen Faktoren in Zusammenhang gebracht. Eine wichtige Rolle dabei spielen der Insulinrezeptor, die Faktoren der Signalkaskade und die Komponenten des Glukosetransportsystems.

Insulin bewirkt seine biologischen Funktionen im ersten Schritt über eine Bindung an den Insulinrezeptor. Dieser unterliegt nach Bindung des Insulins einer Autophosphorylierung der β-Untereinheit durch die Insulinrezeptorkinase. Das Signal wird in Muskelzellen zellulär weitervermittelt über IRS (Insulin Rezeptor Substrat) und PI3K (Phospho-Inositol-3-Kinase) und führt zur Stimulierung der Glukoseaufnahme. Insulin bewirkt eine Vielzahl anderer Effekte, die über nur teilweise bekannte Mechanismen ablaufen. Bei der intrazellulären Signalvermittlung agieren spezifische Kinasen und Phosphatasen in abgestimmter Weise zusammen. Für die Abschaltung des durch Insulin induzierten Signals reicht die Dissoziierung des Insulins vom Rezeptor nicht. Die Tyrosinkinaseaktivität des Insulinrezeptors hält so lange vor, als die regulatorische Domäne phosphoryliert bleibt. Die Abschaltung erfolgt über zelluläre PTPasen. Pharmakologisch wirksame Verbindungen mit Hemmwirkung auf negative Regulatoren des Insulinsignalweges haben das Potential, die Insulinrezeptordephosphorylierung zu verzögern. Dadurch besteht die Möglichkeit, solche Substanzen zur Verringerung der Insulinresistenz einsetzen zu können.

Abkürzungen

LAR Leucocyte-Antigen-Related Protein Tyrosin Phosphatase
CD 45 leucocyte Phosphatase CD 45
YOP Yersinia Protein tyrosine Phosphatase
PTP alpha Protein tyrosine Phosphatase alpha
PTP 1B Protein tyrosine Phosphatase 1B
TC-PTP T cell – Protein tyrosine Phosphatase
CDC-25 cell-division-control Phosphatase 25
PTEN Phosphatase (dual specific) within chromosome 10
SHP 1,2 src-homology Phosphatase 1,2

Beispiele:

1. Spaltung von DiFMUP in Abhängigkeit von der PTP1 B – Enzymkonzentration:

Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden pro zu analysierender Enzymkonzentration 135 μl Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: Proteintyrosinphosphatase PTP1B in der gewünschten Endkonzentration (1: 30 – 600 ng/ml); 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Die Phosphatasereaktion wird durch Zugabe von 15 μl 1 mM DiFMUP-Lösung gestartet und die Fluoreszenzzunahme (gemessen in RFU) in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358 nm Anregungs- und 455 nm Emissionswellenlänge kontinuierlich über 15 Minuten gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der Fluoreszenzzuwachs in Abhängigkeit von der PTP1B – Endkonzentration, welcher grafisch dargestellt werden kann (1).

2. Konzentrations-Abhängigkeit der Spaltung von DiFMUP durch PTP1B.

Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden je 135 μl Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100 ng/ml Proteintyrosinphosphatase PTP1b; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Die Phosphatasereaktion wird durch Zugabe von 15 μl DiFMUP-Lösung gestartet, die das Substrat in 10facher Konzentration der im Testansatz gewünschten Endkonzentration enthält (Abbildung 2: 0 – 200 μM), und die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358/455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der Fluoreszenzanstieg (gemessen in RFU) in Abhängigkeit von der DiFMUP-Konzentration, welche grafisch dargestellt werden kann (2). Aus dieser können im Anschluß mittels Lineweaver-Burk Analyse die kinetischen Konstanten der Enzymreaktion ermittelt werden. So ergibt sich für PTP1B ein Km-Wert von 19 μM und ein Vmax von 388000 RFU sec^–1 mg^1–. Analog kann diese Analyse auch für andere Tyrosinphosphatasen durchgeführt werden. Die kinetischen Konstanten können der Tabelle 1 entnommen werden.

3. Spaltung von DiFMUP in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration der Phosphotyrosin-Phosphatasen PTPalpha, LAR, T cell-PTP, SHP-2, CD45 und YOP.

Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden pro Enzym und zu analysierender Enzymkonzentration 135 μl Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: Proteintyrosinphosphatase in der gewünschten Endkonzentration (3: PTPalpha: 0,5–1,85 μg/ml, LAR: 125–500 ng/ml; Tcell-PTP: 66 – 330 ng/ml; CD 45: 50–400 ng/ml; YOP: 50–400 ng/ml; SHP-2: 0,3–2,4 μg/ ml); 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Die Phosphatasereaktion wird durch Zugabe von 15 μl 1 mM DiFMUP-Lösung gestartet und die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358 / 455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der Fluoreszenzanstieg (gemessen in RFU) in Abhängigkeit von der Endkonzentration der Proteintyrosin-phosphatasen , welcher grafisch dargestellt werden kann (3)

4. Bestimmung der Hemmwirkung eines Phosphataseinhibitors von PTP1B.

Der Test zur Bestimmung der Hemmwirkung des Wirkstoffes 2,2-Dioxo-2,3-dihydro-2,6-benzo[1,2,3]oxathiazol-5-yl)-(9-ethyl-9H-carbazol-3-ylmethyl)-amine mittels DiFMUP-Test erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden 120 μl Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100 ng/ml Proteintyrosinphosphatase PTP1 B; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Dazu kommen 15 μl der zu testenden Inhibitorlösung in verschiedenen Konzentrationen. Die Phosphatasereaktion wird durch Zugabe von 15 μl 1 mM DiFMUP-Lösung gestartet, und die Fluoreszenz (gemessen in RFU) in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358 / 455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der Fluoreszenzanstieg, welcher grafisch dargestellt werden kann (1). In Abhängigkeit der verwendeten Inhibitorkonzentration ergibt sich eine Reduktion der enzymatischen Aktivität. Die Inhibitorkonzentration, bei welcher der Wirkstoffes 2,2-Dioxo-2,3-dihydro-2,6-benzo[1,2,3]oxathiazol-5-yl)-(9-ethyl-9H-carbazol-3-ylmethyl)-amine die Aktivität der PTP1B um die Hälfte reduziert (IC-50 ) kann mit 3,8 μM ermittelt werden. Zum Vergleich wurde der IC-50 Wert mit dem pNPP-Testverfahren und dem Malchitgrün-Phosphopeptidtest ermittelt. Hierbei ergibt sich für das pNPP-Testverfahren ein IC50 von 5,1 μM und für das Malchitgrün-Phosphopeptidtestverfahren ein IC50 von 3,9 μM. Die korrespondierenden Hemmkurven sind in 4 mitaufgeführt.

5. Charakterisierung des Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors auf PTP1 b.

Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden 120 μl Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100 ng/ ml Proteintyrosinphosphatase PTP1b; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT und einer Inhibitorkonzentration, die sich nach dem zuvor bestimmten IC50 richtet. Die Phosphatasereaktion wird durch Zugabe von 15 μl DIFMUP-Lösung gestartet, der das Substrat mit der 10fachen Konzentrationen der gewünschten Endkonzentration im Endvolumen enthält (2: 0 – 200 μM) und die Fluoreszenz bei in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358-455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen, bis das die Reaktion in die Sättigung geht. Im Anschluß wird ein 10-facher Überschuss der zuvor verwendeten Endkonzentration an Substrat zugesetzt und die Reaktion weiter in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358-455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten verfolgt. In Gegenwart von irreversiblen Inhibitoren kann die Reaktion nicht erneut gestartet werden, bei einem reversiblen Hemmtyp ist dieses möglich (5).

6. Charakterisierung des Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors auf PTP1 b durch zeitabhängige Inkubation.

Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden 120 μl Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100 ng/ ml Proteintyrosinphosphatase PTP1 b; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT und einer Inhibitorkonzentration, die sich nach dem zuvor bestimmten IC50 richtet. Der Ansatz wird inkubiert und zu definierten Zeitpunkten die Phosphatasereaktion durch Zugabe von 15μl DIFMUP-Lösung gestartet, der das Substrat mit der 10fachen Konzentrationen der gewünschten Endkonzentration im Endvolumen enthält (2: 0 – 200 μM) und die Fluoreszenz bei in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358–455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen.

In Gegenwart von irreversiblen Inhibitoren kommt es in Abhängigkeit von der Vorinkubationszeit zu einer Verringerung der Enzymaktivität, während dieses bei Inhibitoren mit reversiblem Hemmtyp nicht beobachtet werden kann (6).

Verzeichnis der Abbildungen:

1: Spaltung von DiFMUP in Abhängigkeit von der PTP1 B- Enzymkonzentration. 2: Konzentrations-Abhängigkeit der Spaltung von DiFMUP durch PTP1 B.

3: Spaltung von DiFMUP in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration der Phosphotyrosin-Phosphatasen PTPalpha, LAR, TCPTP, SHP 2, CD45 und YOP. 4: Bestimmung der Hemmwirkung eines Phosphataseinhibitors von PTP1B. 5: Charakterisierung des Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors

6: Charakterisierung des Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors durch zeitabhängige Inkubation

Claims

Verfahren zum Nachweis der enzymatischen Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase in biologischem Material, wobei a] biologisches Material oder eine Präparation aus biologischem Material bereitgestellt wird, b] 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) bereitgestellt wird, c] das biologische Material oder die Präparation aus biologischem Material aus a] mit dem DiFMUP aus b] in einer wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht wird, d] das dann entstehende 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl fluorometrisch nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Präparation aus biologischem Material wenigstens eine Protein Tyrosin Phosphatase aus der Gruppe LAR, CD 45, YOP, PTP alpha, PTP 1B, TC-PTP, CDC 25, PTEN, SHP1,2 bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentration des DiFMUP nach Inkontaktbringen 10–250 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des DFMUP 50 bis 100 μM beträgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei der pH-Wert der wäßrigen Lösung in c] zwischen 5,0 und 8,0 liegt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der pH-Wert zwischen 6,0 und 7,5 liegt.
Verfahren nach Anspruch 5 und 8, wobei der pH-Wert 7,0 beträgt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, wobei a] eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, b] biologisches Material oder eine Präparation aus biologischem Material bereitgestellt wird, c] 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) bereitgestellt wird, d] die chemische Verbindung aus a], sowie das biologische Material oder die Präparation aus biologischem Material aus b] und das DiFMUP aus c] miteinander in einer wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht werden, e] die Menge des dann entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl fluorometrisch bestimmt wird, f] das Resultat der Menge des entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl aus e] verglichen wird mit dem Resultat der Menge des entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl in einem Kontrollansatz.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase stimuliert, gehemmt oder aufrechterhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Protein-Tyrosin-Phosphatase aus der Gruppe LAR, CD 45, YOP, PTP alpha, PTP 1B, TC-PTP, CDC 25, PTEN, SHP1,2 ausgewählt wird.
Verbindung identifiziert durch ein Verfahren gemäß Anspruch 8 bis 10.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei die Masse der Verbindung zwischen 0,1 Da bis 50 kDa liegt.
Verbindung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Masse der Verbindung zwischen 0,1 bis 5 kDa liegt.
Verbindung nach Anspruch 11 bis 13, wobei die Masse der Verbindung zwischen 0,1 bis 3 kDa liegt.
Verbindung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Verbindung ein Protein, eine Aminosäure, ein Polysaccharid, ein Zucker, ein Polynukleotid, ein Nukleotid, ein Naturstoff oder eine aromatische Kohlenwasserstoffverbindung ist.
Arzneimittel enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 11 bis 15, Formulierungshilfsstoffe für ein Arzneimittel und/oder polymere Zusatzstoffe.
Verwendung einer Verbindung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.