Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
besteht deshalb darin, ein weiteres Testverfahren für Protein-Tyrosin
Phosphatasen zur Verfügung
zu stellen, welches zuverlässiger
und wirtschaftlicher anwendbar ist.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Nachweis der enzymatischen Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase
in biologischem Material, wobei
- a] biologisches
Material oder eine Präparation
aus biologischem Material bereitgestellt wird,
- b] 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) bereitgestellt
wird,
- c] das biologische Material oder die Präparation aus biologischem Material
aus a] mit dem DiFMUP aus b] in einer wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht wird,
- d] das dann entstehende 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl fluorometrisch
nachgewiesen wird.
Die Präparation aus dem biologischen
Material besteht bevorzugt aus einer Protein Tyrosin Phosphatase
aus der Gruppe LAR, CD 45, PTP alpha, PTP 1 B, TCPTP, YOP, CDC 25,
PTEN, SHP1,2. Die Präparation
des biologischen Materials kann in unterschiedlichen Reinheitsstufen
vorliegen. Es kann sich bei der Präparation aus dem biologischen
Material um ganze Zellen, Aufschlüsse von Zellen, mit Zellbestandteilen
und/oder Organellen angereicherter Proben oder um gereinigte Proteine
handeln.
Die Konzentration des 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphats
(DiFMUP) beträgt
beim Inkontaktbringen mit dem biologischen Material oder der Präparation
aus biologischem Material bevorzugt 10 bis 250 μM. Besonders bevorzugt beträgt die Konzentration
des DiFMUP 50 bis 100 μM.
Der pH-Wert der wäßrigen Lösung, in welchem das Inkontaktbringen
des biologischen Materials oder der Präparation aus biologischem Material mit
dem DiFMUP erfolgt, liegt bevorzugt zwischen 5,0 und 8,0 und besonders
bevorzugt zwischen 6,0 und 7,5. In einer nochmals besonders bevorzugten Ausführungsform
beträgt
dieser pH-Wert 7,0.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren
zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer
Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, wobei
- a]
eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
- b] biologisches Material oder eine Präparation aus biologischem Material
bereitgestellt wird,
- c] 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) bereitgestellt
wird,
- d] die chemische Verbindung aus a], sowie das biologische Material
oder die Präparation
aus biologischem Material aus b] und das DiFMUP aus c] miteinander
in einer wäßrigen Lösung in
Kontakt gebracht werden,
- e] die Menge des dann entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyls
fluorometrisch bestimmt wird,
- f] das Resultat der Menge des entstehenden 6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyls
aus e] verglichen wird mit dem Resultat der Menge des entstehenden
6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyls
in einem Kontrollansatz.
Ein Kontrollansatz zeichnet sich
insbesondere dadurch aus, daß beim
Inkontaktbringen des biologischen Materials oder der Präparation
aus biologischem Material mit DiFMUP entweder keine chemische Verbindung
im Sinne des zuvor genannten Verfahrensschritts a) beteiligt ist
oder die Wirkung der chemischen Verbindung in Bezug auf eine Protein-Tyrosin-Phosphatase
der gewählten
Ausführungsform
bereits bekannt ist. Solche chemischen Verbindungen, welche im Kontrollansatz
verwendet werden und deren Wirkung auf eine Protein-Tyrosin-Phosphatase bereits
bekannt ist, können
insbesondere Vanadat, Vanadium organische Verbindungen, Pervanadat,
Okadaic-Säure,
NaF, Dephostasin, modifizierte Peptide oder andere Verbindungen
sein.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen
des Verfahrens zur Identifizierung einer Verbindung, welche die
Aktivität
einer Protein-Tyrosin-Phosphatase
modifiziert, soll diese Modifizierung aus einer Stimulierung, Hemmung
oder der Stabilisierung der Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase
bestehen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens zur Identifizierung einer Verbindung, welche die
Aktivität
einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifziert, wird diese Protein-Tyrosin-Phosphatase
ausgewählt
aus der Gruppe umfassend aus der Gruppe LAR, CD 45, PTP alpha, PTP 1B,
TC-PTP, CDC 25, PTEN, YOP, SHP1,2., PTP1B.
Die Erfindung bezieht sich auch auf
eine Verbindung, welche die Aktivität einer Protein-Tyrosin-Phosphatase
modifiziert und welche durch vorstehend beschriebenes Verfahren
zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität einer
Protein-Tyrosin-Phosphatase modifiziert, identifiziert wurde. Diese
Verbindung hat bevorzugt eine Masse zwischen 0,1 bis 50 kDa, weiterhin
bevorzugt zwischen 0,1 bis 5 kDa und weiterhin bevorzugt zwischen
0,1 bis 3 kDa. Die Verbindung kann ein Protein, eine Aminosäure, ein
Polynucleotid, ein Nucleotid, ein Naturstoff oder eine aromatische
Kohlenwasserstoftverbindung sein. Die Erfindung betrifft auch ein
Arzneimittel, welches mindestens eine wie vorstehend beschriebene
Verbindung umfaßt,
die durch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche
die Aktivität
einer Protein-Tyrosin-Phosphatase modifizier, identifiziert wurde.
Das Arzneimittel umfaßt
weiterhin Formulierungshilfsstoffe für ein Arzneimittel und/oder
polymere Zusatzstoffe.,
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer
Verbindung, welche durch ein Verfahren zur Identifizierung einer
Verbindung, welche die Aktivität einer
Protein-Tyrosin-Phosphatase
modifiziert, identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung von Diabetes.
6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl-phosphatase
ist kommerziell erhältlich.
Beispielsweise vertreibt die Firma Molecular Probes Europe BV (2333
Leiden, The Netherlands) diese Chemikalie. Die Herstellung ist in
US 5,830, 912 offenbart.
Biologisches Material ist jedes Material,
das genetische Informationen enthält und sich selbst reproduzieren
oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Biologisches
Material sind beispielsweise Zellen aus menschlichen oder tierischen
Geweben oder Organen wie insbesondere Gehirn, Fettgewebe, Lunge,
Herz, Leber, Niere, Milz, Muskel und andere. Biologisches Material
sind beispielsweise auch Bakterien oder Pilze wie beispielsweise
Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae. Weiterhin umfaßt biologisches
Material Zellen aus Zellkulturen.
Die Gewinnung von biologischem Material kann
im Falle von Zellen aus tierischen oder menschlichen Geweben durch
Biopsie, operative Entnahme, Entnahme mittels Spritzen oder Kathetern
oder vergleichbaren Techniken erfolgen. Die so entnommenen Zellen
können
tiefgefroren, aufgearbeitet oder in Zellkultur genommen werden.
Bakterien und Hefezellen werden mittels gebräuchlicher Techniken der Mikrobiologie
vermehrt und aufgearbeitet.
Entsprechende Anleitungen hierfür findet
der Fachmann in "Current Protocols in Molecular Biology; ed.: F.M.
Ansabel et al., Loseblattwerk, laufend erneuert, Ausgabe 2001, Verlag
John Wiley & Sons".
Biologisches Material kann auch aus
den Zellen einer tierischen Zellkultur bestehen. Solche Zellen sind
beispielsweise Mauszellen, Rattenzellen oder Hamsterzellen. Die
Zellkulturzellen können
primäre
Zelltypen oder etablierte Zelllinien sein. Beispiele für etablierte
Zelllinien sind Maus 3T3-Zellen, CHO-Zellen oder Hela-Zellen. Haltung,
Anzucht und Vermehrung von Zelllinien ist in Standardlehrbüchern beschrieben,
wie beispielsweise in "Basic Cell Culture; ed.: J.M. Daris IRL Press,
Oxford (1996)". Eine Präparation
eines biologischen Materials wird beispielsweise durch Aufschluß des biologischen
Materials und sich daran anschließende Reinigungsschritte hergestellt.
Methoden zum Aufschluß des
biologischen Materials können
insbesondere wiederholtes Einfrieren und Auftauen, die Behandlung
mit Ultraschall, die Verwendung einer French-Press, die Zugabe von
Detergentien und Enzymen oder vergleichbares sein. Sich anschließende Reinigungsschritte bestehen
beispielsweise aus differentieller Zentrifugation, der Fällung mit
Ammonsulfat oder organischen Lösungsmitteln,
der Anwendung von chromatographischen Techniken und anderen. Chromatographische
Techniken sind beispielsweise die Polyacrylamidgelektrophorese,
Hochdruckflüssigkeitschromatographie,
Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Gaschromatographie, Massenspektrometrie
und anderes sein. Hierfür
und insbesondere auch für
detaillierte Anweisungen zur Reindarstellung von Proteinen stehen
dem Fachmann Lehrbücher
zur Verfügung
wie insbesondere "Current Protocols in Protein Science, ed.: J.
E. Coligan et al., LoseblattwerK, laufend erneuert, Ausgabe 2001,
Verlag John Wiley & Sons".
Das Inkontaktbringen des biologischen
Materials oder der Präparation
aus biologischem Material mit DiFMUP kann in gewöhnlichen Laborgefäßen wie
beispielsweise Eppendorf-Gefäßen, Zentrifugen-Röhrchen oder
Glaskolben erfolgen.
Das zugrundeliegende wäßrige Medium
enthält
beispielsweise Puffersubstanzen, Nährmediumbestandteile, einwertige
oder zweiwertige Ionen wie Na+, K+, Ca2+, Cl–,
SO4
2–, PO3
2– oder
andere, weiterhin Proteine, Glycerin oder anderes. Für das Inkontaktbringen
können
bestimmte konstante Bedingungen wie insbesondere die Temperatur,
der pH-Wert, die Ionenbedingungen, die Konzentration eines Proteins, des
Volumens oder andere Faktoren vorteilhaft sein. Dies wird erreicht,
in dem beispielsweise das Inkontaktbringen in konstant temperierten
Inkubationsvorrichtungen, in Gegenwart eines Puffers oder mit den zuvor
genau eingewogenen Mengen der Ionen oder Proteine durchgeführt wird.
Das wäßrige Lösungsmittel
kann insbesondere auch einen bestimmten Anteil eines organischen
Lösungsmittels
wie Dimethylsulfoxid, Methanol oder Ethanol enthalten. Der Gehalt
eines solchen Lösungsmittels
beträgt
aber vorzugsweise nicht mehr als 10 Vol. % des Ansatzes.
Die PTPase (Phosphatase) Protein-Familie umfaßt gegenwärtig etwa
100 verschiedene Mitglieder. Diese können grob unterteilt werden
in rezeptorgekoppelte und cytoplasmatische. Den Phosphatasen ist
das Aminosäuremotiv
(H/V)CX5R(S/T) in der katalytischen Domäne gemeinsam.
Die rezeptorgekoppelten Phosphatasen bestehen gewöhnlich aus einer
extrazellulären
Domäne,
einer einzigen, Transmembranregion und einer oder zwei cytoplasmatischen
PTPase Domänen.
Zu den rezeptorgekoppelten PTPasen werden die LAR (leukocyte common antigenrelated)
und die PTPa gerechnet. Die intrazellulären PTPasen enthalten normalerweise
eine katalytische Domäne
und verschiedene Verlängerungen des
C- oder N-terminalen
Bereichs beispielsweise durch "SH Domänen". Diesen Verlängerungen
werden Funktionen bei der Zielfindung ("targeting") oder Regulation
zugesprochen. Das Enzym PTP1 B wird den cytoplasmatischen PTPasen
zugeordnet. Neben den reinen Tyrosin-Phosphatasen zählt zur
PTPase Familie auch die Gruppe der dualen Phosphatasen. Diese Enzyme
verwenden neben Phosphotyrosin auch Phosphoserin oder Phosphothreonin
als Substrat. Zu dieser Gruppe gehören beispielsweise der Phosphatasen
VHR und cdc25.
Den Phosphatasen LAR, PTPa, SHP-2
und PTP1B werden wichtige Funktionen im Insulin vermittelten Signalweg
zugesprochen. Diese PTPasen assoziieren mit dem Insulinrezeptor
und katalysieren die Dephosphorylierung. Möglicherweise spielen diese
PTPasen einzeln oder in Kombination eine Rolle bei der Pathogenese
der Insulinresistenz. (Biochemistry 38, 3793-3803, 1999; S. 3799).
PTP1B ist ein negativer Regulator
des von Insulin stimulierten Signaltransduktionswegs, das heißt, das
Protein schaltet das von Insulin induzierte Signal wieder ab. Vermutlich
geschieht die Unterbrechung des Signalwegs durch direkte Dephosphorylierung
des Insulinrezeptors. PTP1B wird auch bei einem großen Prozentsatz
von Patienten mit Brustkrebs überexprimiert.
Darüberhinaus
zeigt das Enzym Wechselwirkungen mit dem "epidermal growth factor".
Für das
Enzym konnten zwei Aryl-Phosphat-Bindetaschen nachgewiesen werden.
Eine befindet sich direkt im aktiven Zentrum, eine weitere an einer
dem katalytischen Zentrum benachbarten Stelle außerhalb von diesem. (Biochemistry
38, 3793-3803, 1999).
Die Weiterleitung und Beendigung
von vielen intrazellulären
Signalen wird durch Tyrosinphosphorylierung der beteiligten Faktoren
gesteuert. Den Phosphorylierungszustand legt eine genau ausbalancierte
Aktivität
sich ergänzender
Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK) und Phosphatasen (PTPase) insbesondere
Protein-Tyrosin-Phosphatasen
fest. PTPasen sind als Enzyme verantwortlich für die selektive Dephosphorylierung
von Phospho-Tyrosin-Resten. PTPasen funktionieren im Zusammenspiel
mit den Protein-Tyrosin-Kinasen vielfältig in unterschiedlichen biologischen
Prozessen bei der Vermittlung von Signalen durch beispielsweise
Wachstumsfaktoren oder Hormone. Diese Signaltransduktionsmechanismen
spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des zellulären Stoffwechsels,
des Wachstums, der Differenzierung oder Mobilität. Die fehlerhafte Regulierung
von Signalwegen wird für
einige pathologische Prozesse als eine der ursächlichen Bedingungen diskutiert.
Dazu zählen
beispielsweise Krebs, einige immunologische und neurologische Krankheiten
sowie Diabetes vom Typ II und Obesitas.
Die Bereitstellung einer chemischen
Verbindung erfolgt beispielsweise durch chemische Synthese. Dem
Fachmann sind die Standardsynthesemethoden geläufig. Die chemische Verbindung
kann Teil einer Sammlung chemischer Verbindungen sein, wie sie durch
Lagerung und Katalogisierung der chemischen Verbindungen aus abgeschlossenen
Syntheseprogrammen entstehen (sogenannte "chemical libraries").
Die Verbindung kann in anderen Fällen
von einem Mikroorganismus insbesondere einem Bakterium, aber auch
von einem Pilz oder einer Pflanze gebildet worden sein (Naturstoff).
Geeignete pharmazeutische Verbindungen für die orale
Verabreichung können
in separaten Einheiten vorliegen, wie zum Beispiel Kapseln, Oblatenkapseln,
Lutschtabletten oder Tabletten, als Pulver oder Granulate, als Lösung oder
Supension in einer wäßrigen oder
nicht-wäßrigen Flüssigkeit,
oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in Öl-Emulsion.
Diese Zusammensetzungen können
nach jeder geeigneten pharmazeutischen Methode zubereitet werden,
die einen Schritt umfaßt,
bei dem der Wirkstoff und der Träger
(der aus einem oder mehreren zusätzlichen
Bestandteilen bestehen kann) in Kontakt gebracht werden. Im allgemeinen
werden die Zusammensetzungen durch gleichmäßiges und homogenes Vermischen
des Wirkstoffs mit einem flüssigen und/oder
feinverteilten festen Träger
hergestellt, wonach das Produkt, falls erforderlich, geformt wird.
So kann beispielsweise eine Tablette hergestellt werden, indem ein
Pulver oder Granulat einer Verbindung verpreßt oder geformt wird, gegebenenfalls
mit einem oder mehreren zusätzlichen
Bestandteilen. Gepreßte Tabletten
können
durch Tablettieren der Verbindung in frei fließender Form, wie beispielsweise
einem Pulver oder Granulat, gegebenenfalls gemischt mit einem Bindemittel,
Gleitmittel, inertem Verdünner und/oder
einem (mehreren) oberflächenaktiven/dispergierenden
Mittel in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Geformte
Tabletten können
durch Formen der pulverförmigen,
mit einem inerten flüssigen
Verdünnungsmittel
befeuchteten Verbindung in einer geeigneten Maschine hergestellt
werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen,
die für
eine perorale (sublinguale) Verabreichung geeignet sind, umfassen
Lutschtabletten, die eine Verbindung mit einem Geschmacksstoff enthalten, üblicherweise
Saccharose und Gummi arabicum oder Tragant, und Pastillen die eine
Verbindung in einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin oder
Saccharose und Gummi arabicum umfassen.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen
für die
parenterale Verabreichung umfassen vorzugsweise sterile wäßrige Zubereitungen
einer Verbindung, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen
Empfängers
sind. Diese Zubereitungen werden vorzugsweise intravenös verabreicht,
wenngleich die Verabreichung auch subkutan, intramuskulär oder intradermal
als Injektion erfolgen kann. Diese Zubereitungen können vorzugsweise hergestellt
werden, indem die Verbindung mit Wasser gemischt wird und die erhaltene
Lösung
steril und mit dem Blut isotonisch gemacht wird. Injizierbare erfindungsgemäße Zusammensetzungen
enthalten im allgemeinen von 0,.1 bis 5 Gew.-% einer aktiven Verbindung.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen
für die
rektale Verabreichung liegen vorzugsweise als Einzeldosis-Zäpfchen vor.
Diese können hergestellt
werden, indem man eine Verbindung mit einem oder mehreren herkömmlichen
festen Trägern,
beispielsweise Kakaobutter, mischt und das entstehende Gemisch in
Form bringt.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen
für die
topische Anwendung auf der Haut liegen vorzugsweise als Salbe, Creme,
Lotion, Paste, Spray, Aerosol oder Öl vor. Als Träger können Vaseline,
Lanolin, Polyethylenglykole, Alkohole und Kombinationen von zwei
oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Der Wirkstoff
ist im allgemeinen in einer Konzentration von 0,1 bis 15 Gew.-%
der Zusammensetzung vorhanden, beispielsweise von 0,5 bis 2 %.
Auch eine transdermale Verabreichung
ist möglich.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für transdermale Anwendungen
können
als einzelne Pflaster vorliegen, die für einen langzeitigen engen
Kontakt mit der Epidermis des Patienten geeignet sind. Solche Pflaster
enthalten geeigneterweise den Wirkstoff in einer gegebenenfalls
gepufferten wäßrigen Lösung, gelöst und/oder
dispergiert in einem Haftmittel oder dispergiert in einem Polymer. Eine
geeignete Wirkstoff-Konzentration beträgt ca. 1 % bis 35 %, vorzugsweise
ca. 3 % bis 15 %.
Typ 2 Diabetes (NIDDM – non insulin
dependent diabetes mellitus) ist charakterisiert durch hohe Glukosewerte
(Hyperglycämie)
im nüchternen
Zustand (> 126mg/dl),
Insulinresistenz in peripheren Geweben wie Muskel oder Fett, einer
erhöhten
Glukoneogenese der Leber, sowie einer ungenügenden Insulinsekretion durch
die pankreatischen β-Zellen. Die
eigentliche Ursache dieser Erkrankung ist noch nicht bekannt. Der
Typ 2 Diabetes tritt sehr häufig
zusammen mit anderen Krankheitsbildern wie Obesitas (Fettleibigkeit),
Hypertriglyceridämie
(erhöhte
Blutfettwerte) und Bluthochdruck auf.
Ein Schlüssel zum Verständnis des
Krankheitsbildes wird in der Insulinresistenz vermutet. Die Insulinresistenz äußert sich
im verringerten Ausmaß der
peripheren Organe auf eine definierte Konzentration von Insulin
zu reagieren. Dies spiegelt sich auf zellulärem Niveau wieder, in der Erhöhung der
Insulinmenge, die benötigt
wird, um einen Effekt durch Insulin auszulösen. Insulin erzeugt in Zellen
von Muskel, Fett und Leber verschiedene Auswirkungen auf den Glukose-
und Fettstoffwechsel wie Erhöhung
der Glukoseaufnahme aus dem Blut, Erhöhung der Glukosestoffwechselrate
oder Inhibierung der Fettsäurespaltung.
Die Entstehung der Insulinresistenz auf zellulärem Niveau wird grundsätzlich mit
verschiedenen Faktoren in Zusammenhang gebracht. Eine wichtige Rolle
dabei spielen der Insulinrezeptor, die Faktoren der Signalkaskade
und die Komponenten des Glukosetransportsystems.
Insulin bewirkt seine biologischen
Funktionen im ersten Schritt über
eine Bindung an den Insulinrezeptor. Dieser unterliegt nach Bindung
des Insulins einer Autophosphorylierung der β-Untereinheit durch die Insulinrezeptorkinase.
Das Signal wird in Muskelzellen zellulär weitervermittelt über IRS
(Insulin Rezeptor Substrat) und PI3K (Phospho-Inositol-3-Kinase)
und führt
zur Stimulierung der Glukoseaufnahme. Insulin bewirkt eine Vielzahl
anderer Effekte, die über
nur teilweise bekannte Mechanismen ablaufen. Bei der intrazellulären Signalvermittlung agieren
spezifische Kinasen und Phosphatasen in abgestimmter Weise zusammen.
Für die
Abschaltung des durch Insulin induzierten Signals reicht die Dissoziierung
des Insulins vom Rezeptor nicht. Die Tyrosinkinaseaktivität des Insulinrezeptors
hält so lange
vor, als die regulatorische Domäne
phosphoryliert bleibt. Die Abschaltung erfolgt über zelluläre PTPasen. Pharmakologisch
wirksame Verbindungen mit Hemmwirkung auf negative Regulatoren des
Insulinsignalweges haben das Potential, die Insulinrezeptordephosphorylierung
zu verzögern.
Dadurch besteht die Möglichkeit,
solche Substanzen zur Verringerung der Insulinresistenz einsetzen
zu können.
Abkürzungen
LAR Leucocyte-Antigen-Related Protein
Tyrosin Phosphatase
CD 45 leucocyte Phosphatase CD 45
YOP
Yersinia Protein tyrosine Phosphatase
PTP alpha Protein tyrosine
Phosphatase alpha
PTP 1B Protein tyrosine Phosphatase 1B
TC-PTP
T cell – Protein
tyrosine Phosphatase
CDC-25 cell-division-control Phosphatase
25
PTEN Phosphatase (dual specific) within chromosome 10
SHP
1,2 src-homology Phosphatase 1,2
Beispiele:
1. Spaltung von DiFMUP in
Abhängigkeit
von der PTP1 B – Enzymkonzentration:
Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen
Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden pro zu analysierender
Enzymkonzentration 135 μl
Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: Proteintyrosinphosphatase PTP1B
in der gewünschten
Endkonzentration (1:
30 – 600
ng/ml); 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Die
Phosphatasereaktion wird durch Zugabe von 15 μl 1 mM DiFMUP-Lösung gestartet
und die Fluoreszenzzunahme (gemessen in RFU) in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358
nm Anregungs- und 455 nm Emissionswellenlänge kontinuierlich über 15 Minuten
gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der Fluoreszenzzuwachs
in Abhängigkeit
von der PTP1B – Endkonzentration,
welcher grafisch dargestellt werden kann (1).
2. Konzentrations-Abhängigkeit
der Spaltung von DiFMUP durch PTP1B.
Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen
Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden je 135 μl Reaktionspuffer
bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100
ng/ml Proteintyrosinphosphatase PTP1b; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM
NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Die Phosphatasereaktion wird durch Zugabe
von 15 μl
DiFMUP-Lösung
gestartet, die das Substrat in 10facher Konzentration der im Testansatz
gewünschten
Endkonzentration enthält
(Abbildung 2: 0 – 200 μM), und die
Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358/455
nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der
Fluoreszenzanstieg (gemessen in RFU) in Abhängigkeit von der DiFMUP-Konzentration,
welche grafisch dargestellt werden kann (2). Aus dieser können im Anschluß mittels
Lineweaver-Burk Analyse die kinetischen Konstanten der Enzymreaktion
ermittelt werden. So ergibt sich für PTP1B ein Km-Wert von 19 μM und ein Vmax
von 388000 RFU sec–1 mg1–.
Analog kann diese Analyse auch für
andere Tyrosinphosphatasen durchgeführt werden. Die kinetischen
Konstanten können
der Tabelle 1 entnommen werden.
3. Spaltung von DiFMUP in
Abhängigkeit
von der Enzymkonzentration der Phosphotyrosin-Phosphatasen PTPalpha,
LAR, T cell-PTP, SHP-2, CD45 und YOP.
Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen
Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden pro Enzym und zu
analysierender Enzymkonzentration 135 μl Reaktionspuffer bereitgestellt,
der die folgenden Komponenten enthält: Proteintyrosinphosphatase
in der gewünschten
Endkonzentration (3:
PTPalpha: 0,5–1,85 μg/ml, LAR:
125–500 ng/ml;
Tcell-PTP: 66 – 330
ng/ml; CD 45: 50–400 ng/ml;
YOP: 50–400
ng/ml; SHP-2: 0,3–2,4 μg/ ml); 50
mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT. Die Phosphatasereaktion
wird durch Zugabe von 15 μl
1 mM DiFMUP-Lösung
gestartet und die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer
bei 358 / 455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten
gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der
Fluoreszenzanstieg (gemessen in RFU) in Abhängigkeit von der Endkonzentration
der Proteintyrosin-phosphatasen , welcher grafisch dargestellt werden
kann (3)
4. Bestimmung der Hemmwirkung
eines Phosphataseinhibitors von PTP1B.
Der Test zur Bestimmung der Hemmwirkung des
Wirkstoffes 2,2-Dioxo-2,3-dihydro-2,6-benzo[1,2,3]oxathiazol-5-yl)-(9-ethyl-9H-carbazol-3-ylmethyl)-amine
mittels DiFMUP-Test erfolgt in einer schwarzen Mikrotiterplatte
bei einer Temperatur von 37°C.
Es werden 120 μl
Reaktionspuffer bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100 ng/ml
Proteintyrosinphosphatase PTP1 B; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM NaCl;
1 mM EDTA;2 mM DTT. Dazu kommen 15 μl der zu testenden Inhibitorlösung in
verschiedenen Konzentrationen. Die Phosphatasereaktion wird durch
Zugabe von 15 μl
1 mM DiFMUP-Lösung
gestartet, und die Fluoreszenz (gemessen in RFU) in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358
/ 455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen. Maß für die Enzymaktivität ist der
Fluoreszenzanstieg, welcher grafisch dargestellt werden kann (1). In Abhängigkeit
der verwendeten Inhibitorkonzentration ergibt sich eine Reduktion
der enzymatischen Aktivität.
Die Inhibitorkonzentration, bei welcher der Wirkstoffes 2,2-Dioxo-2,3-dihydro-2,6-benzo[1,2,3]oxathiazol-5-yl)-(9-ethyl-9H-carbazol-3-ylmethyl)-amine die
Aktivität
der PTP1B um die Hälfte
reduziert (IC-50 ) kann mit 3,8 μM
ermittelt werden. Zum Vergleich wurde der IC-50 Wert mit dem pNPP-Testverfahren und
dem Malchitgrün-Phosphopeptidtest
ermittelt. Hierbei ergibt sich für
das pNPP-Testverfahren ein IC50 von 5,1 μM und für das Malchitgrün-Phosphopeptidtestverfahren
ein IC50 von 3,9 μM.
Die korrespondierenden Hemmkurven sind in 4 mitaufgeführt.
5. Charakterisierung des
Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors auf PTP1 b.
Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen
Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden 120 μl Reaktionspuffer
bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100
ng/ ml Proteintyrosinphosphatase PTP1b; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM
NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT und einer Inhibitorkonzentration, die sich
nach dem zuvor bestimmten IC50 richtet. Die Phosphatasereaktion
wird durch Zugabe von 15 μl
DIFMUP-Lösung
gestartet, der das Substrat mit der 10fachen Konzentrationen der
gewünschten
Endkonzentration im Endvolumen enthält (2: 0 – 200 μM) und die Fluoreszenz bei in
einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer
bei 358-455 nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten
gemessen, bis das die Reaktion in die Sättigung geht. Im Anschluß wird ein
10-facher Überschuss
der zuvor verwendeten Endkonzentration an Substrat zugesetzt und
die Reaktion weiter in einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358-455
nm in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten verfolgt. In
Gegenwart von irreversiblen Inhibitoren kann die Reaktion nicht
erneut gestartet werden, bei einem reversiblen Hemmtyp ist dieses möglich (5).
6. Charakterisierung des
Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors auf PTP1 b durch zeitabhängige Inkubation.
Die Reaktion erfolgt in einer schwarzen
Mikrotiterplatte bei einer Temperatur von 37°C. Es werden 120 μl Reaktionspuffer
bereitgestellt, der die folgenden Komponenten enthält: 100
ng/ ml Proteintyrosinphosphatase PTP1 b; 50 mM Hepes pH 6,9; 150 mM
NaCl; 1 mM EDTA;2 mM DTT und einer Inhibitorkonzentration, die sich
nach dem zuvor bestimmten IC50 richtet. Der Ansatz wird inkubiert
und zu definierten Zeitpunkten die Phosphatasereaktion durch Zugabe
von 15μl
DIFMUP-Lösung gestartet,
der das Substrat mit der 10fachen Konzentrationen der gewünschten
Endkonzentration im Endvolumen enthält (2: 0 – 200 μM) und die Fluoreszenz bei in
einem Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Photometer bei 358–455 nm
in Zeitintervallen von 30 Sekunden über 15 Minuten gemessen.
In Gegenwart von irreversiblen Inhibitoren kommt
es in Abhängigkeit
von der Vorinkubationszeit zu einer Verringerung der Enzymaktivität, während dieses
bei Inhibitoren mit reversiblem Hemmtyp nicht beobachtet werden
kann (6).
Verzeichnis der Abbildungen:
1:
Spaltung von DiFMUP in Abhängigkeit
von der PTP1 B- Enzymkonzentration. 2: Konzentrations-Abhängigkeit
der Spaltung von DiFMUP durch PTP1 B.
3:
Spaltung von DiFMUP in Abhängigkeit
von der Enzymkonzentration der Phosphotyrosin-Phosphatasen PTPalpha,
LAR, TCPTP, SHP 2, CD45 und YOP. 4:
Bestimmung der Hemmwirkung eines Phosphataseinhibitors von PTP1B. 5: Charakterisierung des
Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors
6:
Charakterisierung des Hemmtyps eines Phosphataseinhibitors durch
zeitabhängige
Inkubation