DE69304259T2

DE69304259T2 - Bestimmungsverfahren für Serumcholinesterase

Info

Publication number: DE69304259T2
Application number: DE1993604259
Authority: DE
Inventors: Bruce Edward Babb; Ronald Henry Engebrecht; Stephen Carl Hasselberg
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1992-06-01
Filing date: 1993-06-01
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2013-06-02
Also published as: EP0572986A1; SG64890A1; JPH06166662A; CA2095495A1; EP0572986B1; JP2801499B2; CA2095495C; DE69304259D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die klinische Chemie. Insbesondere betrifft sie ein Element und ein Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität sowie disubstituierte Benzoylcholin-Derivate zur Verwendung als Substrate in diesem Element.
Cholinesterase (speziell Serum-Cholinesterase oder Pseudocholinesterase) ist ein Serumenzym, das sich als wertvoll bei der Diagnose von Lebererkrankungen und Pestizid-Vergiftungen und zur Identifizierung von Personen, die nicht zur Metabolisierung des Muskel-Relaxationsmittels Suxamethonium (Succinyldicholin) befähigt sind, geeignet ist.
Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Cholinesterase bekannt. Alle diese bekannten Verfahren verwenden Cholinester als Substrat (vgl. beispielsweise EP-A-0 241 915 und EP-A-0 160 980). Cholinesterase hydrolysiert das Substrat und bildet aus dem Ester Cholin und die entsprechende Säure.
Bei den gebräuchlichsten Substraten Butyrylthiocholinf Propionylthiocholin und Benzoylcholin ergeben sich mit Cholinesterase sehr hohe Reaktionsgeschwindigkeiten. Wenn die hydrolysierende Wirkung von Cholinesterase auf das Substrat zu rasch abläuft, ist es sehr schwierig, die Reaktionsgeschwindigkeit bei manuellem oder mechanischem Betrieb genau zu verfolgen. Somit ist es schwierig, die Menge an vorhandener Cholinesterase mit ausreichender Genauigkeit zu bestimmen. Somit erfordern die üblicherweise verwendeten Substrate eine Verdünnung der Testprobe, was für die Ergebnisse einen gewissen ungenauigkeitsfaktor darstellt. Die Gründe für Ungenauigkeiten bei der verdünnung werden in der US-Anmeldung SN 763 383 der gleichen Anmelderin erörtert.
Außerdem zeigen diese Substrate hohe Geschwindigkeiten der alkalischen (nicht-enzymatischen) Hydrolyse (eine Hydrolyse, die spontan unter basischen Bedingungen abläuft), was es erforderlich macht, Leerwerte abzulesen. Da die alkalische Hydrolyse stark pH-abhängig ist, wird der Test üblicherweise bei einem nahezu neutralen pH-Wert, der für das Enzym suboptimal ist, durchgeführt. Als optimaler pH-Wert wird üblicherweise ein Wert zwischen 8 und 8,5 angesehen.
Ferner variiert die Aktivität von Serum-Cholinesterase zwischen einzelnen Personen beträchtlich. Aufgrund dieser Tatsache und aufgrund der vorerwähnten hohen Hydrolysegeschwindigkeit der Substrate weisen zahlreiche analytische Systeme keinen ausreichend breiten dynamischen Bereich auf, um den normalerweise bei Patienten auftretenden Aktivitätsbereich abzudecken. Um dieses Problem zu lösen, müssen weitere Verdünnungen von Proben hoher Aktivität vorgenommen werden.
Daher ist ein Substrat zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität mit einer niedrigen Geschwindigkeit der durch Cholinesterase katalysierten Hydrolyse, der Stabilität gegenüber alkalischer Hydrolyse, einem breiten dynamischen Bereich und einem hohen Grad an Genauigkeit erwünscht. Somit ist es wünschenswert, den Test im Bereich des pH-Optimums von 8-8,5 oder in der Nähe davon durchzuführen.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Substrat mit einer langsamen Geschwindigkeit der durch Cholinesterase katalysierten Hydrolyse und einem hohen Grad an Genauigkeit bereit. Kurz zusammengefaßt, wird gemäß einem Aspekt der Erfindung ein Substrat der folgenden Formel bereitgestellt
in der R und R¹ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Alkoxy oder Amino (-NR²R³) bedeuten, worin R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl bedeuten, und X ein Anion bedeutet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Serum- Cholinesterase bereitgestellt, das einen Träger umfaßt, auf dem sich nacheinander ausgehend vom Träger und in Fluidkontakt mindestens eine Reagenzschicht und eine Verteilungsschicht befinden, wobei in der Reagenzschicht folgende Bestandteile enthalten sind:
a) ein Substrat für Serum-Cholinesterase gemäß der vorstehenden Definition;
b) Cholin-oxidase;
c) Peroxidase;
d) ein Farbentwicklungsmittel; und
e) ein Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9. Ferner wird ein Verfahren zur Bestimmung von Serum-Cholinesterase bereitgestellt.
Die enzymatische Hydrolysegeschwindigkeit der vorstehend definierten Substrate ist ausreichend nieder, so daß das zu testende Serum unverdünnt bleiben kann. Diese Substrate sind im Vergleich zu o-Toluoylcholin und anderen üblicherweise verwendeten, vorerwähnten Substraten stabiler gegen alkalische Hydrolyse (die bei einem basischen pH-Wert auftretende spontane Hydrolyse). Bei den vorliegenden Verbindungen kommt es auch im Vergleich zu anderen Substraten, wie 2,3-Dimethoxybenzoylcholin, zu einer geringeren Substrathemmung.
Es ist überraschend, daß die 1,4-disubstituierten Arylcholine der Erfindung diese Vorteile mit sich bringen, insbesondere da mono- und andere disubstituierte Verbindungen (z. B. o-Toluoylcholin und 2,6-Dimethylbenzoylcholin) nicht ebenso gut funktionierten.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Kinetiken unter Darstellung der Reflexionsdichte gegen die Zeit für Wasser und sechs Flüssigkeiten mit einem Gehalt an unterschiedlichen Mengen an Cholinesterase. Der Test wurde unter Verwendung des erfindungsgemäßen Elements in einem EKTACHEM 700- Analysengerät für die klinische Chemie durchgeführt. Das Diagramm zeigt, daß die Steigung der kinetischen Kurven mit ansteigender Cholinesterase-Aktivität zunimmt.
Der hier verwendete Ausdruck "Fluidkontakt" und ähnliche Ausdrücke beziehen sich auf Zonen oder Schichten eines Elements, die miteinander auf solche Weise verbunden sind, daß unter den Anwendungsbedingungen einem Fluid, unabhängig davon, ob es flüssig oder gasförmig ist, im Element eine Passage zwischen diesen Schichten oder Zonen möglich ist.
Ein derartiger Fluidkontakt bezieht sich daher auf die Fähigkeit des Elements die Passage von mindestens einigen Komponenten einer Fluidprobe zwischen Zonen oder Schichten des Elements, für die angegeben ist, daß sie in "Fluidkontakt" stehen, möglich ist. Zonen, die in Fluidkontakt stehen, können aneinandergrenzen, sie können aber auch durch dazwischenliegende Zonen oder Schichten voneinander getrennt sein. Derartige dazwischenliegende Zonen oder Schichten stehen jedoch in diesem Fall ebenfalls in Fluidkontakt und verhindern nicht die Passage des Fluids zwischen den Schichten oder Zonen mit Fluidkontakt.
Der hier zur Beschreibung von analytischen Verfahren verwendete Ausdruck "trocken" bezieht sich auf analytische Verfahren und Techniken, die unter Anwendung chemischer Reagenzien in verschiedenen "berührungstrockenen" Testelementen, wie "Eintauch- und Ablese"-Teststreifen, mehrschichtige Testelemente und dergl., durchgeführt werden. "Trockene" Verfahren benötigen keine Flüssigkeit für die Rekonstitution oder Analyse.
Der hier verwendete Ausdruck "Trockenbelegung" bedeutet, daß die Beschichtungsbelegung als "Trockengewicht" nach normalen Beschichtungs- und Trocknungsverfahren bestimmt wird.
Der hier verwendete Ausdruck "porös" bedeutet voll mit Poren, so daß ein Fluid durch Kapillarwirkung absorbiert werden kann und in andere Schichten, die in Fluidkontakt mit der porösen Schicht stehen, gelangen kann.
Der hier verwendete Ausdruck "reflektiv" bedeutet, daß auf das Element gerichtetes einfallendes Licht nicht durch das Element hindurchgeht, sondern zu einem Photodetektor reflektiert wird, wo die Reflexionsdichte gemessen werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung einer Familie von Cholinesterase-Substraten, die im Vergleich zu den üblichen vorerwähnten Substraten eine langsamere Geschwindigkeit der durch Cholinesterase katalysierten Hydrolyse zeigen. Die langsamere Hydrolysegeschwindigkeit bedeutet, daß weniger Cholin-oxidase, ein teures, beim Test der Cholinesterase-Aktivität verwendetes Kupplungsenzym, benötigt wird. Es bedeutet auch, daß eine genauere Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität erreicht werden kann.
Bei den erfindungsgemäßen Substraten handelt es sich um Arylcholinester der Formel
in der R und R¹ gleich oder verschieden sind und Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl und dergl.; Alkoxy, wie Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy und dergl.; oder Amino (-NR²R³) bedeuten, worin R² und R³ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl bedeuten, und X ein Anion, wie ein Halogen (Chlor, Brom oder Iod), Methyl, Sulfat, Nitrat und Acetat bedeutet.
In unserem Laboratorium durchgeführte Versuche ergaben, daß die Cholinesterase-Aktivität in bezug auf 2,6- und 2,4,6- substituierte Benzoylcholine entweder fehlt oder für unsere Zwecke zu gering ist. Über ähnliche Ergebnisse berichten J. Thomas und J. R. Stoker, The Effect of Ortho Substitution in the Hydrolysis of Benzoylcholine, 13, Journal of Pharmacy and Pharmacology, (1961), S. 129-138.
Somit ist eine Disubstitution offensichtlich nicht ausreichend, um ein vorteilhaftes Substrat für Cholinesterase zu erhalten. Unerwartete Ergebnisse werden bei Substitution in der o- und p-Position beobachtet. Besonders bevorzugte Mitglieder in dieser Familie von Verbindungen sind: (1) 2-Methyl-4-methoxybenzoylcholin; (2) 2,4-Dimethylbenzoylcholin; und (3) 2,4-Dimethoxybenzoylcholin. Diese Verbindungen weisen die vorstehend beschriebene Formel auf und sind folgendermaßen substituiert: Tabelle I
Verschiedene monosubstituierte Cholinsubstrate sind ebenfalls bekannt, beispielsweise o-Methylbenzoylcholin (o-Toluoylcholin), o-Methoxybenzoylcholin (o-Anisoylcholin) und o- Propoxycholin und dergl. Jedoch erweisen sich, wie aus den Daten von Tabelle 3 hervorgeht, die erfindungsgemäßen Substrate als günstiger, d. h. sie weisen langsamere, durch Cholinesterase katalysierte Aktivitäten auf als die monosubstituierten Substrate.
Die erfindungsgemäßen Substrate werden gemäß folgendem allgemeinen Schema hergestellt:
In einigen Fällen ist die als Ausgangsverbindung (A) verwendete disubstituierte Benzoesäure im Handel erhältlich. Ansonsten kann sie gemäß den Angaben in Beispiel 1 hergestellt werden. Die Herstellung von 2-Methyl-4-methoxybenzoylcholiniodid, die in Beispiel 1 beschrieben ist, ist typisch für das Verfähren zur Herstellung der übrigen erfindungsgemäßen 2,4- disubstituierten Benzoylcholine.
Die chemische Basis für den erfindungsgemäßen Cholinesterase-Test besteht darin, daß das Substrat durch Cholinesterase in der Testprobe hydrolysiert wird und Cholin freisetzt. Das Cholin wird durch die Wirkung der Cholin-oxidase zu Betain oxidiert, wobei 2 Mol Wasserstoffperoxid pro Mol Cholin freigesetzt werden. Aminoantipyrin und Phenol werden sodann mit 2 Mol Peroxid unter Peroxidase-Katalyse oxidativ gekuppelt, wodurch man ein Pigment vom Chinonimin-Typ erhält. Beliebige peroxidativ gekuppelte Farbstoffe eignen sich als Farbentwicklungsmittel. Die Geschwindigkeit der Zunahme der Färbung wird durch Reflexionsdensitometrie verfolgt und in Beziehung zur Cholinesterase-Aktivität in der Probe gesetzt. Der Test beruht auf veröffentlichten Verfahren; vgl. beispielsweise US-A-4 271 310.
Es ergibt sich folgender Reaktionsweg: Cholinesterase Cholin Betain Peroxid Phenol roter Chinonimin-Farbstoff
AAP = Aminoantipyrin, POD = Peroxidase, CHOD = Cholinoxidase.
Die vorstehend beschriebene Reihe von chemischen Reaktionen kann gemäß den Angaben im nachstehenden Beispiel 2 in Lösung durchgeführt werden. Vorzugsweise werden sie mit einem automatisierten Analysengerät, beispielsweise einem EKTACHEM E700-Analysengerät, unter Verwendung eines erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elements, auf das eine auf Cholinesterase-Aktivität zu testende Probe punktförmig aufgesetzt wird, durchgeführt. Für den Test von Flüssigkeiten geeignete trockene analytische Elemente lassen sich gemäß der Lehre von US-A-3 992 158 und US-A-4 357 363 herstellen.
Kurz zusammengefaßt, umfaßt das erfindungsgemäße analytische Element eine Verteilungsschicht und eine oder mehrere auf einem geeigneten Träger schichtförmig aufgebrachte Schichten. Sämtliche Reagenzien können in einer einzelnen, auf dem Träger schichtförmig aufgebrachten Schicht enthalten sein. Vorzugsweise sind die Reagenzien in zwei verschiedenen Reagenzschichten entsprechend den Angaben in nachstehender Tabelle II schichtförmig aufgebracht. Unabhängig davon, ob die Reagenzien in der gleichen oder in unterschiedlichen Schichten des Elements enthalten sind, müssen sämtliche Reagenzien miteinander in Fluidkontakt stehen, was bedeutet, daß die Reagenzien und die Reaktionsprodukte innerhalb einer Schicht zwischen übereinander angeordneten Bereichen von benachbarten Schichten passieren können.
Beim Träger kann es sich um ein beliebiges, dimensionsstabiles und vorzugsweise ein nicht-poröses und durchsichtiges (d. h. strahlungsdurchlässiges) Material handeln, das elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein strahlungsdurchlässiger Träger ist besonders bevorzugt, um eine Verstärkung und Erleichterung der Bestimmung von nachweisbaren Veränderungen, die in derartigen Elementen ablaufen, unter Verwendung verschiedener Strahlungsnachweisverfahren zu erreichen. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element soll mit dem vorgesehenen Nachweisverfahren (Reflexions-, Transmissions- oder Fluoreszenzspektroskopie verträglich sein. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Polystyrol, Polyester (z. B. Poly-(ethylenterephthalat)), Polycarbonate, Celluloseester, z. B. Celluloseacetat und dergl.
Mindestens eine Reagenzschicht ist schichtformig auf den Träger aufgebracht. Die Reagenzschicht bzw. die Reagenzschichten enthalten die Indikatorzusammensetzung mit einem oder mehreren Reagenzien, die in einem oder mehreren synthetischen oder natürlichen Bindemittelmaterialien, wie Gelatine oder anderen natürlich vorkommenden Kolbiden, dispergiert sind, sowie verschiedene synthetische hydrophile Polymere, wie Poly-(acrylamid), Poly-(vinylpyrrolidon), Poly- (acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrrolidon), Copolymere der vorstehenden Produkte und Polymere oder Copolymere, an die vernetzbare Monomere addiert worden sind. Die Reagenzschicht kann einen Puffer enthalten. Zu geeigneten Puffern gehören Phosphat, Pyrophosphat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), 2-{[Tris-(hydroxymethyl)-methyl)-amino}-1-ethansulfonsäure (TES) und weitere Puffer mit pH-Werten im Bereich von 7,0 bis 8,5. Der Puffer kann in einer beliebigen oder in sämtlichen Schichten des Elements vorliegen oder er kann in einer separaten Schicht vorliegen, die frei von den übrigen Reagenzien ist.
Verschiedene Tenside, wie Olin-10G , TX-405 , Zonyl FSN (eine Familie von nicht-ionogenen Tensiden auf der Basis von Octylphenoxypolyethoxyethanol der Fa. Rohm und Haas) und dergl., können gegebenenfalls in der Reagenzschicht enthalten sein. Fakultative Bestandteile sind ferner mehrere unterschiedliche Vernetzungsmittel, wie Bisvinylsulfonylmethan, Glutaraldehyd und dergl.
Das Element wird mit einer porösen, reflektiven Verteilungsschicht zur gleichmäßigen Verteilung der flüssigen Testprobe über das Element hinweg versehen. Die Verteilungsschicht kann die Reagenzien enthalten, jedoch handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine getrennte Schicht, wie in der nachstehenden Tabelle II gezeigt ist. Materialien zur Verwendung in den Verteilungsschichten sind auf dem Gebiet der Herstellung von trockenen analytischen Elementen bekannt, wie beispielsweise in US-A-4 258 001 und den vorstehend aufgeführten Patenten ausgeführt wird.
Eine beispielhafte Verteilungsschicht ist in nachstehender Tabelle II aufgeführt. Von Bariumsulfat abweichende Pigmente können verwendet werden, beispielsweise Titandioxid. Andere Bindemittel als Celluloseacetat können eingesetzt werden, beispielsweise verschiedene Polyurethane und andere Polymere. Andere Tenside als TC-405 können verwendet werden, beispielsweise TX-100 .
Weitere fakultative Schichten, beispielsweise Unterschichten, strahlungsblockierende Schichten und dergl., können gegebenenfalls enthalten sein. Die Schichten des Elements können eine Vielzahl von anderen wünschenswerten, jedoch fakultativen Komponenten enthalten, einschließlich Tenside, Verdickungsmittel, Puffer, Härter, Antioxidantien, Kuppler, Lösungsmittel und andere aus dem Stand der Technik bekannte Materialien. Die Mengen dieser Bestandteile liegen ebenfalls im Ermessen des Fachmanns.
Veränderungen im Element lassen sich mit einer geeigneten spektrophotometrischen Vorrichtung erfassen, üblicherweise mit einem Reflektometer, wobei man sich allgemein bekannter Verfahren bedient, die beispielsweise in US-A-3 992 158, Spalten 14-15 und US-A-4 357 363, Spalte 27 beschrieben sind. Bei einer enzymatischen Reaktion wird das erhaltene Produkt bestimmt, indem man beispielsweise die Geschwindigkeit der Veränderung der Reflexions- oder Transmissionsdichte in einem begrenzten Bereich des erfindungsgemäßen Elements, das mit der Testprobe in Kontakt gebracht worden ist, mißt. Der Meßbereich weist vorzugsweise Abmessungen von 3 bis 5 mm auf.
Ein repräsentatives erfindungsgemäßes Element ist in nachstehender Tabelle II aufgeführt. Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Prinzip in beliebigen analytischen Elementen unter Anwendung des hier bereitgestellten Verfahrens verwirklicht werden kann. Ferner ist ersichtlich, daß die Cholinesterase-Aktivität mit diesem Element neben Seren auch in anderen Proben bestimmt werden kann. Tabelle II Erfindungsgemäßes Element
u = Einheit der Aktivität. Im Fall von Cholin-oxidase bewirkt 1 Einheit die Bildung von 1 Mikromol Wasserstoffperoxid bei 37ºC und beim pH-Wert 8,0. Im Fall von Peroxidase bildet 1 Einheit 1 mg Purpurogallin aus Pyrogallol innerhalb 20 Sekunden bei einem pH-Wert von 6,0 und 20ºC.
Die für das vorstehende Element und im Text angegebenen Bezeichnungen und Symbole haben folgende Bedeutungen:
Brij Polyoxyethylenalkohol
TX-100 und TX-405 Eine Familie von nicht-ionogenen Tensiden auf der Basis von Octylphenoxypolyethoxyethanol der Fa. Rohm und Haas
TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
KS-52 2,4-Di-N-pentylphenol
Leuko-Farbstoff 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)- 4,5-bis-(p-dimethylaminophenyl)-imidazol
Die Reagenzschicht wurde schichtförmig auf einem grundierten, mit Gelatine gewaschenen Poly-(ethylenterephthalat)- Träger aufgebracht. Die Verteilungsschicht wurde schichtförmig auf die Reagenzschicht aufgebracht. Sämtliche vorerwähnten Schichten wurden unter Anwendung herkömmlicher Beschichtungstechniken zur Bildung der vorerwähnten trockenen Testelemente aufgebracht; vgl. beispielsweise US-A-4 357 363 und US-A-3 992 158.
Das erfindungsgemäße Element ist zur Verwendung für Serum- oder Plasmaproben vorgesehen, wobei jedoch beliebige Fluide, die ausreichende Ähnlichkeiten mit Serum aufweisen, verwendet werden können. Hierzu gehören typische Kontrollund Prüffluide.
Mit Ausnahme der Trennung oder Serum von Vollblut ist keine spezielle Probenvorbereitung erforderlich. Eine Verdünnung ist nicht notwendig, jedoch zulässig, vorausgesetzt, daß die Aktivität nach dem Verdünnen für die Ablesung ausreicht. Die Proben können eingefroren werden und behalten ihre Aktivität für lange Zeit. Vor dem Test sollen sie aufgetaut und auf Raumtemperatur gebracht werden.
Beim erfindungsgemäßen Test werden zwischen 5 und 20 µl Probe verwendet. obgleich die Erfindung Variationen hinsichtlich des Volumens der aufgesetzten Proben ermöglicht, werden 11 µl bevorzugt. Für unterschiedliche Probenvolumina sind unterschiedliche Eichkurven erforderlich. Ein physikalischer Kontakt wird zwischen der zu analysierenden flüssigen Probe und dem analytischen Element herbeigeführt. Ein derartiger Kontakt kann auf beliebige geeignete Weise erreicht werden, beispielsweise indem man einen Tropfen der Probe von Hand oder maschinell punktförmig auf die Verteilungsschicht unter Verwendung einer geeigneten Dispensiervorrichtung aufsetzt.
Nach dem Aufbringen der Probe wird das Element in beliebiger Weise einer beliebigen Konditionierbehandlung, beispielsweise Inkubieren unter Erwärmen oder dergl., die zur Beschleunigung oder anderweitigen Erleichterung der chemischen Reaktion erwünscht sein kann, ausgesetzt. Eine derartige Konditionierung wird vorzugsweise bei 25-40ºC und insbesondere bei 37ºC durchgeführt. Während der Konditionierpenode werden etwaige Veränderungen der Reflexionsdichte üblicherweise 3 bis 7 Minuten und vorzugsweise 5 Minuten überwacht, obgleich Veränderungen schon nach 20 bis 25 Sekunden oder noch nach 30 bis 60 Minuten auftreten können.
Die Herstellung der Verbindungen und das Verfahren zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität werden durch die nachstehenden Beispiele erläutert. In sämtlichen Beispielen wird das in Tabelle II aufgeführte analytische Element eingesetzt.

Beißpiel 1 - Herstellung von 2-Methyl-4-methoxybenzoylcholin-iodid (Verbindung 1)

Stufe 1: Herstellung von 4-Iod-3-methylanisol (Zwischenprodukt A)

14 g 4-Methoxy-2-methylanilin (Aldrich) wurden als Reinsubstanz zu einer gerührten Aufschlämmung aus Eis und konzentrierter Salzsäure (30 ml) gegeben. Ein großer Teil des Aminhydrochlorids kristallisierte aus. Eine Natriumnitritlösung (8 g in 50 ml Wasser) wurde langsam zu der gerührten Aufschlämmung gegeben. Nach der Zugabe wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde in einen Reaktionskolben übertragen. Fluorborsäure (15 ml einer 49% Lösung) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde in Eis gekühlt. Das Tetrafluorboratsalz der Diazoniumverbindung kristallisierte aus.
Der Feststoff wurde durch Filtration gewonnen und in noch feuchtem Zustand in Aceton ( 50 ml) gelöst. Eine Lösung von Natriumiodid (16 g in 25 ml Wasser) wurde portionsweise zu der gerührten Diazoniumlösung gegeben. Nach der Zugabe wurde die Lösung bis zum Sieden erwärmt, bis die Stickstoffentwicklung nachließ (etwa 5-10 Minuten). Das Aceton wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Wasser (etwa 300 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde mit Ether (3 mal 200 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden zur Entfernung von Iod 3 mal mit verdünnter Natriumbisulfitlösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde sodann mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Ein Dünnschichtchromatogramm auf einer Kieselgelplatte unter Verwendung von Hexan als Laufmittel ergab ein Hauptprodukt. Das Material wurde aus Heptan (etwa 100 ml) kristallisiert. Man erhielt 10 g gelbe Kristalle A. Die Strukturbestimmung wurde durch NMR-Spektroskopie durchgeführt. Stufe 2: Herstellung von 4-Methoxy-2-methylbenzoesäure (Zwischenprodukt B)
Eine Lösung des Zwischenprodukts A (39 g) in wasserfreiem Diethylether (100 ml) wurde tropfenweise mit einem Gemisch aus Magnesiummetall (4 g) in wasserfreiem Diethylether (etwa 200 ml) versetzt, wobei man die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Durchführung einer Grignard-Reaktion beachtete. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde unter Rückfluß erwärmt.
Die Grignard-Lösung wurde in eine Aufschlämmung aus Trockeneis (großer Überschuß) und Diethylether (etwa 200 ml) gegossen und bis zum Schmelzen des Eises und Erwärmen des Gemisches auf Raumtemperatur stehengelassen. Verdünnte Salzsäure (etwa 200 ml wurde vorsichtig zugesetzt. Sodann wurde das Gemisch von Hand geschüttelt und durch einen Sinterglastrichter filtriert. Der Feststoff auf dem Trichter wurde abwechselnd mit Ether und verdünnter Salzsäure gewaschen, bis nahezu der gesamte Feststoff in Lösung ging und den Filter passierte. Das Filtrat wurde zur erneuten Auflösung der Feststoffe erwärmt. Die Wasserphase wurde abgetrennt. Die Etherphase wurde mit verdünnter Salzsäure (200 ml) gewaschen. Nach Entfernen des Ethers mit einem Rotationsverdampfer wurde der Rückstand mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung (3 mal 200 ml) extrahiert. Die Natriumbicarbonatlösung wurde zur Entfernung von unlöslichen Verunreinigungen mit Diethylether (100 ml) extrahiert. Die Wasserphase wurde sodann mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Produkt wurde gewonnen und gründlich mit Wasser gewaschen. Man erhielt 10,5 g des Zwischenprodukts B. Ein Dünnschichtchromatogramm auf einer Kieselgelplatte ergab bei Verwendung von Toluol/Essigsäureethylester und Essigsäure (8:2:1) als Laufmittel ein Hauptprodukt. Die Strukturbestimmung wurde durch NMR- Spektroskopie durchgeführt. Stufe 3: Herstellung des Cholinestere (Zwischenprodukt C)
Das feste Zwischenprodukt B (10 g) wurde in kleinen Portionen zu einer gerührten Lösung von Oxalylchlorid (100 g) gegeben. Nach der Zugabe wurde die Lösung 30 Minuten unter Rückfluß erwärmt und sodann mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in Acetonitril (100 ml) gelöst und tropfenweise zu einer gerührten, gekühlten Lösung von Dimethylaminoethanol (20 g) in Acetonitril (150 ml) gegeben. Nach der Zugabe ließ man die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und rührte sie sodann 1 Stunde. Das Acetonitril wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt (100 ml). Das wäßrige Gemisch wurde mit Ether (3 mal 100 ml) extrahiert. Die Etherlösung wurde mehrmals mit kaltem Wasser (100 ml) gewaschen. Sodann wurde die Etherlösung getrocknet (Magnesiumsulfat) und direkt in der nächsten Stufe eingesetzt. Ein Dünnschichtchromatogramm an einer Kieselgelplatte ergab unter Verwendung von Essigsäureethylester/Methanol (9:1) einen Hauptflecken. Stufe 4: Herstellung von 2-Methyl-4-methoxybenzoylcholiniodid (Verbindung 1) Verbindung
Die Esterlösung von Stufe 3 mit dem Zwischenprodukt C wurde mit Iodmethan (8 g) behandelt. Man ließ die erhaltene Lösung über Nacht bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Kolben stehen. Das weiße feste Produkt wurde abfiltriert und gründlich mit trockenem Ether gewaschen. Man erhielt 18 g der Verbindung 1. Ein Dünnschichtchromatogramm an einer Kieselgelplatte ergab bei Verwendung von Essigsäureethylester/Methanol/Essigsäure (2:2:1) als Laufmittel einen Hauptflecken. Die Struktur wurde durch NMR-Spektroskopie bestätigt.

Beispiel 2 - Bekannte Substrate im Vergleich mit erfindungsgemäßen Substraten in einem Test in Lösung

Die erfindungsgemäßen Substrate und die herkömmlichen Substrate wurden in einer Lösung gemäß den Angaben in Tabelle III getestet. Tabelle III
Die erfindungsgemäßen Substrate und die herkömmlichen Substrate wurden in Lösung unter Verwendung der in Tabelle III aufgeführten Zusammensetzung getestet. Der Test wurde an einem Cobas Fara II-Zentrifugen-Hochgeschwindigkeitsanalysator bei 37ºC unter Einhaltung einer 6-minütigen Inkubationsdauer durchgeführt. Die Absorptionsablesungen wurden bei 500 nm in Abständen von 10 Sekunden vorgenommen. Die Geschwindigkeit der Absorptionsveränderung, DA/min, wurde berechnet und in bezug zur Cholinesterase-Aktivität gesetzt. Die auf diese Weise mit den neuen Substraten ermittelten relativen Aktivitätswerte sind in Tabelle IV aufgeführt. Tabelle IV
Die Daten zeigen, daß 2,4-disubstituierte Substrate in wünschenswerter Weise niedrigere enzymatische Hydrolysegeschwindigkeiten als die mono-o-substituierten Verbindungen aufweisen.

Beispiel 3 - Analytisches Element mit einer Beschichtung aus 2-Methyl-4-methoxybenzoylcholin als Substrat

Ein Element wurde gemäß den Angaben in Tabelle II hergestellt und mit einem EKTACHEM -Analysator auf sein Verhalten getestet. Wasser und sechs Flüssigkeiten mit variierenden Cholinesterase-Spiegeln (48, 359, 650, 946, 1504 und 1895 U/Liter) wurden auf das Element aufgesetzt und gemäß dem Verfahren von Panteghini und Bonora (J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Bd. 22 (1984), S. 671-676) mit der Abänderung, daß wir das Benzoylcholin gemäß dieser Druckschrift durch gleiche Mengen an o-Toluoylcholin ersetzten, auf die Cholinesterase- Aktivität getestet. Die Ablesung erfolgte bei 670 nm.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, wobei zur Darstellung der Kinetik die Reflexionsdichte gegen die Zeit aufgetragen ist. Das Diagramm zeigt 7 verschiedene Steigungen, entsprechend den 7 getesteten Flüssigkeiten. Dies zeigt den breiten dynamischen Bereich und die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Elements.

Claims

1. Verbindung der Formel

in der R und R¹ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Alkoxy oder Amino (-NR²R³), bedeuten, worin R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl bedeuten, und X&supmin; ein Anion bedeutet.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Alkyl die Bedeutung Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl oder Isopropyl hat.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Alkoxy die Bedeutung Methoxy, Ethoxy, Propoxy oder Butoxy hat.

4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei X&supmin; Chlor, Brom, Iod, Methyl, Sulfat, Nitrat oder Acetat bedeutet.

5. Reagenzzusammensetzung zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität in einer wäßrigen Probe, umfassend in Kombination ein Substrat für Serum-Cholinesterase, Cholinoxidase, Peroxidase, ein Farbentwicklungsmittel und einen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Substrat für Serum-Cholinesterase um eine Verbindung der folgenden Formel handelt

in der R und R¹ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Alkoxy oder Amino (-NR²R³), bedeuten, worin R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl bedeuten, und X- ein Anion bedeutet.

6. Mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Serum-Cholinesterase, umfassend einen Träger, auf dem sich nacheinander ausgehend vom Träger und in Fluidkontakt mindestens eine Reagenzschicht und eine Verteilungsschicht befinden, wobei in der Reagenzschicht folgende Bestandteile enthalten sind:

a) ein Substrat für Serum-Cholinesterase;

b) Cholin-oxidase;

c) Peroxidase;

d) ein Farbentwicklungsmittel; und

e) ein Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Substrat für Serum-Cholinesterase um eine Verbindung der folgenden Formel handelt:

in der R und R¹ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Alkoxy oder Amino (-NR²R³), bedeuten, worin R² und R³ jeweils unabhangig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl bedeuten, und X- ein Anion bedeutet.

7. Analytisches Element nach Anspruch 6, umfassend eine erste Reagenzschicht mit einem Gehalt an einem Bindemittelmaterial, Peroxidase, Cholin-oxidase und einem Farbentwicklungsmittel, das eine nachweisbare Veränderung als Antwort auf die Reaktion des Substrats mit Serum- Cholinesterase liefert;

eine zweite Reagenzschicht mit einem Gehalt an dem Substrat;

einen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9 in einer oder beiden Reagenzschichten; und

eine isotrop poröse Verteilungsschicht.

8. Mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Serum-Cholinesterase, wobei das Element einen Träger umfaßt, auf dem in der angegebenen Reihenfolge und in Fluidkontakt folgende Bestandteile angeordnet sind:

eine erste Reagenzschicht mit einem Gehalt an Gelatine, einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9, Peroxidase und mit Phenol gekuppeltem Aminoantipyrin; eine zweite Reagenzschicht mit einem Gehalt an Gelatine, Cholin-oxidase( einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9 und einem Substrat für Serum-Cholinesterase; und

eine isotrop poröse Verteilungsschicht, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat für Serum- Cholinesterase aus der Gruppe 2,4-Dimethylbenzoylcholiniodid, 2-Methyl-4-methoxybenzoylcholiniodid und 2, 4-Dimethoxybenzoylcholiniodid ausgewählt ist.

9. Verfahren zur Bestimmung von Serum-Cholinesterase in einer wäßrigen Flüssigkeit, umfassend folgende Stufen:

a) Kontaktieren einer Probe der wäßrigen Flüssigkeit mit einem mehrschichtigen analytischen Element, das einen Träger umfaßt, auf dem in der angegebenen Reihenfolge ausgehend vom Träger und in Fluidkontakt eine Verteilungsschicht und mindestens eine Reagenzschicht angeordnet sind, wobei die Reagenzschicht folgende Bestandteile enthält:

ein Substrat für Serum-Cholinesterase;

Cholin-oxidase;

Peroxidase;

einen Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9; und

ein Farbentwicklungsmittel, das eine nachweisbare Veränderung in Antwort auf die Reaktion des Substrats mit Serum- Cholinesterase liefert; und

b) Bestimmen der Cholinesterase-Aktivität in der Probe mittels der dabei erhaltenen nachweisbaren Veränderung, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat für Serum- Cholinesterase folgende Formel aufweist

in der R und R¹ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Alkoxy oder Amino (-NR²R³), bedeuten, worin R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Propyl bedeuten, und X ein Anion bedeutet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei der nachweisbaren Änderung um eine Änderung der optischen Dichte handelt.