JPH06166662A - 血清コリンエステラーゼを測定するための化合物、組成物、要素及び方法 - Google Patents
血清コリンエステラーゼを測定するための化合物、組成物、要素及び方法Info
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- JPH06166662A JPH06166662A JP13045193A JP13045193A JPH06166662A JP H06166662 A JPH06166662 A JP H06166662A JP 13045193 A JP13045193 A JP 13045193A JP 13045193 A JP13045193 A JP 13045193A JP H06166662 A JPH06166662 A JP H06166662A
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Abstract
に低く且つ精度の高い基質を提供する。 【構成】 本発明の基質は以下の式で示される化合物で
ある。 【化1】 上式中、R及びR1 は、各々独立に、アルキル基、アル
コキシ基、アミノ(−NR2 R3 )基を表し、またR2
及びR3 は、各々独立に、水素、メチル基、エチル基ま
たはプロピル基を表し、そしてX- はアニオンである。
また、該基質を利用した血清コリンエステラーゼの分析
要素及び分析方法も提供する。
Description
には、本発明は、コリンエステラーゼ活性を測定するた
めの要素及び方法に、また該要素において基質として使
用するための二置換ベンゾイルコリン誘導体に関する。
リンエステラーゼまたはプソイドコリンエステラーゼ)
は、肝臓疾患や農薬中毒の診断に、また筋弛緩薬スキサ
メトニウム(スクシニルジコリン)を代謝できない個人
の識別に、有用な血清酵素である。
は各種知られており、これらの既知の方法はどれも基質
としてコリンエステルを使用している。コリンエステラ
ーゼが基質を加水分解し、該エステルからコリンと対応
する酸とが生成する。
チオコリン、プロピオニルチオコリン及びベンゾイルコ
リンは、コリンエステラーゼとの反応速度が非常に高
い。コリンエステラーゼの基質に対する加水分解作用が
あまりに迅速に進行すると、マニュアル操作または機械
的操作によって反応速度を正確に追跡することが非常に
難しい。そうすると、存在するコリンエステラーゼの量
を、いくらかでも精度をもって測定することが困難とな
る。こうして、最も普通に用いられている基質は、試験
検体の希釈を必要とし、検査結果の精度を低下させるこ
とになる。希釈の際に不正確になる理由については、共
有の米国特許出願第 763,383号明細書に記載されてい
る。
(非酵素)加水分解(塩基性条件下で自発的に起こる加
水分解)の速度を示すので、ブランクの測定を必要とす
る。アルカリ加水分解はpHの作用が強いので、試験は通
常中性pH付近で行われるが、これは酵素にとって最適条
件ではない。一般に、最適pHは 8〜8.5 であると考えら
れている。
ステラーゼ活性は個人間でかなり差がある。このため、
先に述べた基質の高い加水分解速度と共に、多くの分析
系は、患者の中で通常見られる活性範囲に適応する十分
に広いダイナミックレンジを有さない。この問題を解決
するには、高活性試料をさらに希釈しなければならな
い。
ゼ触媒加水分解速度が適度に低く、アルカリ加水分解に
対して安定であり、ダイナミックレンジが幅広く、しか
も精度が高いコリンエステラーゼ活性測定用の基質であ
る。また、試験を最適pH範囲の 8〜8.5 で、またはその
付近で実施することも望まれている。
は、コリンエステラーゼ触媒加水分解速度が低く且つ精
度の高い基質を提供する。概略的には、本発明の一態様
によると、以下の式:
ルキル基、アルコキシ基、アミノ(−NR2 R3 )基を
表し、またR2 及びR3 は、各々独立に、水素、メチル
基、エチル基またはプロピル基を表し、そしてX- はア
ニオンである)で示される基質が提供される。
に液絡している少なくとも一つの試薬層と展開層とを表
面に担持する支持体を含んで成り、しかも該試薬層中に
以下のa〜e: a)先に定義した血清コリンエステラーゼの基質; b)コリンオキシダーゼ; c)ペルオキシダーゼ; d)発色試薬;及び e)pH 7〜9 の緩衝液; を含有する、血清コリンエステラーゼ測定用多層分析要
素が提供される。
も提供される。
ので、試験すべき血清を希釈しなくてもよい。また、こ
れらの基質は、先に述べたo-トルオイルコリンやその他
の通常用いられている基質よりも、アルカリ加水分解
(塩基性pHで起こる自発加水分解)に対して安定であ
る。さらに、本発明の化合物による基質阻害は、2,3-ジ
メトキシベンゾイルコリンのような他の基質を用いた場
合よりも少ない。
物(例えば、o-トルオイルコリンや2,6-ジメチルベンゾ
イルコリン)が同様に機能しなかったので、本発明の1,
4-二置換アリールコリンがこれらの利点を提供するであ
ろうことは予測されなかった。
「流体接触」や同様の用語は、使用条件下で、液体また
は気体の流体が要素内の層間または帯域間を通過できる
ように、互いに組み合わされている要素の層または帯域
をさす。それゆえ、このような流体接触は、「流体接
触」状態にあると呼ばれる要素の層間または帯域間を、
流体試料の少なくとも一部の成分が通過できるようにす
る、要素の性能をさす。流体接触状態にある帯域は隣接
していてもよいが、介在帯域または介在層によって分離
されていてもよい。しかしながら、この場合には、この
ような介在帯域または介在層もまた流体接触状態にあっ
て、流体接触層間または流体接触帯域間の流体の通過を
妨害しない。
られている用語「乾式」は、各種の「指触乾燥状態の」
試験要素、例えば「浸漬読取り式」試験片、多層試験要
素、等に含まれている化学試薬を使用して行われる分析
方法や分析技法をさす。「乾式」方法は、再構成または
分析のために液体を必要とすることがない。
量」は、コーティング被覆量が通常の塗工及び乾燥工程
後に「乾燥重量」として測定されていることを示してい
る。
は、流体が、キャピラリー作用によって吸収されて、多
孔質層と流体接触状態にある別の層へ通過できるよう
に、孔で満たされている状態を意味する。
は、要素に当たる入射光が、要素中を透過せずに反射し
て光検出器へ戻り、そこで反射濃度を測定できることを
意味する。
リンエステラーゼ触媒加水分解速度が低いコリンエステ
ラーゼ基質族の製造と使用に関する。加水分解速度がよ
り低いということは、コリンエステラーゼ活性の検定に
用いられるコスト的に関連している酵素であるコリンオ
キシダーゼの必要量が少なくて済むことを意味する。そ
れはまた、コリンエステラーゼ活性のより正確な測定が
実現できることも意味する。
ールコリンエステルである。
なってもよく、アルキル基、例えばメチル、エチル、プ
ロピル、ブチル、イソプロピル、等;アルコキシ基、例
えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、等;
及びアミノ(−NR2 R3 )基であることができ、また
R2 及びR3 は、同じであっても異なってもよく、水
素、メチル基、エチル基またはプロピル基であることが
でき、そしてX- はアニオン、例えばハロゲン(クロ
ロ、ブロモまたはヨード)メチル、スルフェート、ニト
レート及びアセテートである。
及び2,4,6-置換ベンゾイルコリンに対するコリンエステ
ラーゼ活性は、無いかまたは低すぎて、本目的には有用
ではないことが示された。同様の結果が、J. Thomas 及
びJ. R. StokerのThe Effectof Ortho Substitution in
the Hydrolysis of Benzoylcholine, 13 Journal of P
harmacy and Pharmacology 129-138, (1961) に報告さ
れている。
基質としての利点を与えるには十分ではないようであ
る。予測できない結果が、オルト位とパラ位における置
換によって観測される。この族において特に好ましい化
合物は、(1)2-メチル -4-メトキシベンゾイルコリ
ン、(2)2,4-ジメチルベンゾイルコリン及び(3)2,
4-ジメトキシベンゾイルコリンである。これらの化合物
は、上記化学式のうち以下の置換基を有するものであ
る。
ベンゾイルコリン(o-トルオイルコリン)、o-メトキシ
ベンゾイルコリン(o-アニソイルコリン)、o-プロポキ
シコリン、等もまた知られている。しかしながら、表3
のデータが示すように、本発明の基質の方が良好、すな
わち、一置換基質よりもコリンエステラーゼ触媒活性が
低い。
って製造される。
(A)は市販されているが、そうでない場合には、それ
を実施例1に記載のように合成することができる。実施
例1に記載の2-メチル -4-メトキシベンゾイルコリンヨ
ージドの製法が、本発明のその他の2,4-二置換ベンゾイ
ルコリンを合成するために用いられる典型的な方法であ
る。
基本は、試験試料中のコリンエステラーゼによって基質
を加水分解させて、コリンを遊離させることである。そ
のコリンをコリンオキシダーゼの作用により酸化させて
ベタインとし、コリン1モル当たり2モルの過酸化水素
を遊離させる。次いで、アミノアンチピリンとフェノー
ルをペルオキシダーゼで触媒した2モルのペルオキシド
によって酸化カップリングさせて、キノンイミン型顔料
を生成させる。過酸化カップリングしたいずれの色素も
発色試薬として有用であろう。色の増加速度を反射濃度
計でモニターし、これが試料中のコリンエステラーゼ活
性と関連する。その検定法は、公表されている手順に基
づくものであり、例えば米国特許出願第 4,271,310号明
細書を参照されたい。
ン、POD=ペルオキシダーゼ、ChOD=コリンオキ
シダーゼである。
施例2に記載するように溶液中で行うことができる。好
ましくは、コリンエステラーゼ活性を検定すべき試料を
点着した本発明の乾式分析要素を使用して、EKTACHEM
(商標)E700アナライザーのような自動分析装置で行わ
れる。液体の検定に有用な乾式分析要素は、米国特許出
願第 3,992,158号及び同第 4,357,363号明細書の教示に
従い製作することができる。
適当な支持体の表面に塗布された1層以上の層と展開層
とを含んで成る。すべての試薬が、支持体表面に塗布さ
れている単一の層中に存在してもよい。好ましくは、以
下の表2に示したように、別個の二つの試薬層に試薬を
塗布する。要素の同じ層中または別の層中のどちらに含
まれるにせよ、すべての試薬が互いに流体接触状態にな
ければならない。つまり、試薬と反応生成物が、層内部
を通過し且つ隣接層の重畳領域間を通過できることを意
味する。
を透過する、寸法安定性があり、しかも好ましくは非孔
質且つ透明(すなわち、輻射線透過性)な適当な任意の
材料であることができる。輻射線透過性支持体は、各種
の輻射線検出法を利用して、これらの要素中で起こる検
出可能な変化の測定を向上及び促進することが特に好ま
しい。特定の要素に対する支持体の選定は、所期の検出
様式(反射、透過または蛍光分光分析法)に適合しなけ
ればならない。有用な支持体材料には、ポリスチレン、
ポリエステル[例えば、ポリ(エチレンテレフタレー
ト)]、ポリカーボネート、セルロースエステル[例え
ば、酢酸セルロース]、等が含まれる。
塗布される。試薬層は、1種以上の合成または天然バイ
ンダー材料、例えばゼラチンまたはその他の天然コロイ
ド、並びに別の合成親水性ポリマー、例えばポリ(アク
リルアミド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アク
リルアミド−コ−N−ビニル−2−ピロリドン)、上記
ポリマーのコポリマー、及び架橋性モノマーを添加した
ポリマーまたはコポリマー、に分散させた1種以上の試
薬を含んで成る指示薬組成物を含有する。
な緩衝液には、ホスフェート、ピロホスフェート、トリ
ス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)、2
{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}−1
−エタンスルホン酸(TES)及びpH範囲 7.0〜8.5 の
その他の緩衝液が含まれる。緩衝液は、要素のいずれか
の層またはすべての層に存在しても、あるいはその他の
試薬を含まない別の層中に存在してもよい。
ばOlin-10G(商標)、TX-405(商標)、Zonyl FSN (商
標)(Rohm and Haas より市販されている一連のオクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール系非イオン性界面
活性剤)、等を任意に含有させてもよい。また、別のい
くつかの架橋剤、例えばビスビニルスルホニルメタン、
グルタルアルデヒド、等も任意である。
状試験試料を要素上で均一に分布させる。展開層が試薬
を含有してもよいが、好ましくは、以下の表2に示した
ように、展開層は別個の層であることが好ましい。展開
層に用いられる材料は、例えば米国特許出願第 4,258,0
01号明細書や先に引用した特許明細書に記載されている
ような、乾式分析要素を製造する当該技術分野ではよく
知られている。
バリウム以外の顔料、例えば二酸化チタンを使用しても
よい。酢酸セルロース以外のバインダー、例えば各種ポ
リウレタン及びその他のポリマーを使用してもよい。TX
-405(商標)以外の界面活性剤、例えばTX-100(商標)
を使用してもよい。
下塗層、輻射線遮蔽層、等を含有させることもできる。
要素の層は、各種のその他の望ましいが任意である成分
を含有してもよく、それらには界面活性剤、増粘剤、緩
衝液、硬化剤、酸化防止剤、カップラー溶剤、及び当該
技術分野で知られているその他の材料、が含まれる。
通常は反射率計、を使用し、例えば米国特許出願第 3,9
92,158号明細書の第14〜15欄及び同第 4,357,363号明細
書の第27欄に記載されている一般に既知の手順を採用し
て、検出することができる。酵素反応では、得られる生
成物を、例えば検定試料と接触している本発明の要素の
有限領域内の反射または透過濃度の変化速度を計測する
ことによって測定する。計測される領域は、一般に 3〜
5 mmである。
する。本発明の原理を、本ケースにより提供される方法
を採用するいずれの分析要素へも有用に導入できること
は、当業者には理解される。また、血清以外の試料中の
コリンエステラーゼ活性を、本要素を使用して検定でき
ることも理解される。
の場合、1単位は、37℃、pH 8.0で1マイクロモルの過
酸化水素を生成させる。ペルオキシダーゼの場合、1単
位は、20℃、pH 6.0でピロガロールから1mGのプルプロ
ガリンを20秒で生成させる。
及び記号は、以下の意味を有する: Brij;ポリオキシエチレンアルコール TX-100(商標)、TX-400(商標);Rohm and Haas 社か
ら市販されているオクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール系非イオン性界面活性剤の種類 TRIS;トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン KS-52 ;2,4-ジ -N-ペンチルフェノール ロイコ色素;2-(3,5-ジメトキシ -4-ヒドロキシフェニ
ル)-4, 5-ビス(p-ジメチルアミノフェニル)イミダゾ
ール
テレフタレート)支持体の表面に試薬層を塗布し、そし
てその試薬層の上に展開層を塗布した。上記層はすべ
て、米国特許出願第 4,357,363号及び同第 3,992,158号
明細書に開示されているような上記乾式検定要素を製造
するための当該技術分野で知られている慣例の塗布技法
を採用して塗布した。
との使用が意図されているが、血清に十分に似ているど
んな流体でも使用可能である。これらには、典型的な対
照流体や熟練(proficiency) 流体が含まれる。
と以外の特別な試料調製はまったく不要である。希釈は
必要ではないが、希釈後の活性が十分に読み取れるなら
ば、希釈してもよい。試料を凍結して活性を長期間維持
することができる。それらを融解して室温にまで到達さ
せてから検定しなければならない。
する。本発明では、適用試料の体積を変更することは可
能であるが、11 mL が好ましい。異なる試料体積に対し
ては別の校正曲線が必要である。分析下の液体試料と分
析要素とを物理的に接触させる。このような接触は、適
当な任意の方法で達成できるが、好ましくは、適当な分
配手段を用いて要素の展開層上に試料液滴を手または機
械で点着する方法によって達成することができる。
れ以外で促進することが望ましい場合もある何らかのコ
ンディショニング、例えばインキュベーション加熱、等
に要素を暴露する。このようなコンディショニングは、
好ましくは25〜40℃で、最も好ましくは37℃で行われ
る。コンディショニング期間中の反射濃度の変化を観測
するため、通常は 3〜7 分間、好ましくは 5分間、要素
をモニターする。但し、この変化は、20〜25秒といった
短時間で起こったり、また30〜60分間といった長時間で
起こることもある。
ゼ活性の測定方法を、以下の実施例によって説明する。
すべての実施例で使用した分析要素は、本明細書中の表
2に示した要素である。
ゾイルコリンヨージド(化合物1)の製法
ル(中間体A)の製法
に、14グラムの4−メトキシ−2−メチルアニリン(Al
drich 社)をそのまま加えた。大量のアミン塩酸塩が晶
出した。その攪はんスラリーに、硝酸ナトリウム溶液
(50 mL の水に 8 g)をゆっくりと添加した。添加後、
混合物を濾過し、そしてその濾液を反応フラスコへ移し
た。フルオロホウ酸(15 mL の49%溶液)を添加して、
その混合物を氷浴中で冷却した。ジアゾニウム化合物の
テトラフルオロホウ酸塩が晶出した。
アセトン(〜50 mL )に溶解した。その攪はんされてい
るジアゾニウム溶液へ、ヨウ化ナトリウム溶液(25 mL
の水に16 g)を分けて添加した。添加後、窒素発生が止
まるまで(約 5〜10分間)、その溶液を加熱して沸騰さ
せた。ロータリーエバポレーターでアセトンを除去し
た。水(約300 mL)を加えて、その混合物をエーテルで
抽出(200 mLで3回)した。エーテル抽出物を一緒にし
て、重亜硫酸ナトリウム希薄溶液で3回洗浄してヨウ素
を除去し、そして溶媒をロータリーエバポレーターで除
去した。ヘキサンで展開したシリカプレートの薄層クロ
マトグラフは、一つの主生成物を示した。その物質をヘ
プタン(約100 mL)から結晶化すると、10 gの黄色結晶
Aが得られた。構造決定は核磁気共鳴分析(NMR)で
行った。
酸(中間体B)の製法
従いながら、無水ジエチルエーテル(約200 mL)中に金
属マグネシウム(4 g )を含む混合物に、無水ジエチル
エーテル(100 mL)中に中間体A(39 g)を含む溶液を
1滴ずつ添加した。添加後、その反応混合物を1時間加
熱還流した。
(大過剰)とジエチルエーテル(約200 mL)のスラリー
へ注ぎ込み、ドライアイスが溶けるまで静置させ、そし
てその混合物を室温にまで温めた。希塩酸(約200 mL)
を慎重に添加した。その混合物を手で振って混合し、そ
の後焼結ガラス漏斗で濾過した。漏斗上の固体をエーテ
ルと希塩酸で交互に洗浄して、ほとんどすべての固体を
溶解しフィルターを通過させた。濾液を温めて固体を再
溶解させ、水層を分離させ、そしてエーテル層を希塩酸
(200 mL)で洗浄した。エーテルをロータリーエバポレ
ーターで除去し、そしてその残留物を希重炭酸ナトリウ
ム溶液(200 mLで3回)で抽出した。その重炭酸ナトリ
ウム溶液をジエチルエーテル(100 mL)で抽出し、不溶
性不純物を除去した。その後、その水層を濃塩酸で酸性
にし、そして生成物を集めて水で十分に洗浄すると、1
0.5 gの中間体Bが得られた。トルエン、酢酸エチル及
び酢酸(8,2,1)で展開したシリカプレートの薄層
クロマトグラフは、一つの主生成物を示した。構造決定
は核磁気共鳴法で行った。
法
へ、固体中間体B(10 g)を少量ずつ添加した。添加
後、その溶液を30分間加熱還流し、次いでロータリーエ
バポレーターで濃縮した。その残留物をアセトニトリル
(100 mL)に溶解し、そしてアセトニトリル(150 mL)
中にジメチルアミノエタノール(20 g)を含む攪はん冷
却溶液へ1滴ずつ添加した。添加後、その溶液を室温に
まで温めさせ、次いで1時間攪はんした。アセトニトリ
ルをロータリーエバポレーターで除去し、そしてその残
留物を水(100 mL)で処理した。その水性混合物をエー
テル(100 mLで3回)で抽出し、そしてそのエーテル溶
液を冷水(100 mL)で数回洗浄した。エーテル溶液を
(硫酸マグネシウム)乾燥し、次の工程でそのまま使用
した。酢酸エチル/メタノール(9/1)で展開したシ
リカプレートの薄層クロマトグラフは、一つの主スポッ
トを示した。
イルコリンヨージド(化合物1)の製法
テル溶液をヨードメタン(8 g )で処理した。得られた
溶液を、室温で、密栓したフラスコ内で一晩静置させ
た。白色固体生成物を濾過して集めて、乾燥エーテルで
十分に洗浄すると、18 gの化合物1が得られた。酢酸エ
チル/メタノール/酢酸(2,2,1)で展開したシリ
カプレートの薄層クロマトグラフは、一つの主スポット
を示した。構造は、核磁気共鳴分析で確かめた。
と従来の基質との比較 表2に示したように、本発明の基質と従来技術の基質と
を溶液中で試験した。
に示した組成物を用いて溶液中で試験した。試験は、Co
bas Fara II 遠心高速分析装置で、37℃、6分間のイン
キュベーション時間で行った。500 nmにおける吸光度を
10秒間隔で読み取った。吸光度の変化速度、DA/min、を
算出して、コリンエステラーゼ活性と関連させた。この
ように検定し、新規基質による活性の相対速度を表4に
示す。
オルト−置換化合物よりも、望ましく低い酵素加水分解
速度を有することを示唆している。
トキシベンゾイルコリンのコーティングを有する分析要
素 表2に示したように要素を製作し、その性能をEKTACHEM
(商標)分析装置で試験した。その要素に、水とコリン
エステラーゼ量を変えた6種の流体(48、 359、 650、
946、1504及び1895 U/L)とを点着し、そしてPanteghi
niとBonora(J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 22, 198
4, p.671-6)に記載されている方法に従い(但し、上記
参考文献中のベンゾイルコリンの代わりに等量のo-トル
オイルコリンを使用し)、コリンエステラーゼ活性につ
いて検定した。読み取りは670 nmで行った。
ットした反応速度論として図1に示す。このプロット
は、試験した7種の流体に対応する7種の異なる勾配を
示す。このグラフは、コリンエステラーゼ活性の増加と
共に反応速度論の勾配が増加することを示している。こ
れは、本発明の要素の幅広いダイナミックレンジと精度
を例示している。
分解速度が低く且つ精度の高い基質を提供する。
とについての、反射濃度を時間に対してプロットしたグ
ラフである。
Claims (4)
- 【請求項1】 以下の式: 【化1】 (上式中、R及びR1 は、各々独立に、アルキル基、ア
ルコキシ基、アミノ(−NR2 R3 )基を表し、またR
2 及びR3 は、各々独立に、水素、メチル基、エチル基
またはプロピル基を表し、そしてX- はアニオンであ
る)で示される化合物。 - 【請求項2】 請求項1記載の化合物と、コリンオキシ
ダーゼと、ペルオキシドと、発色試薬と、そしてpH 7〜
9 の緩衝液とを組み合わせて含んで成る、水性試料中の
コリンエステラーゼ活性を測定するための試薬組成物。 - 【請求項3】 支持体から順に液絡している少なくとも
一つの試薬層と展開層とを表面に担持する支持体を含ん
で成り、しかも該試薬層中に以下のa〜e: a)請求項1記載の化合物を含んで成る血清コリンエス
テラーゼの基質; b)コリンオキシダーゼ; c)ペルオキシダーゼ; d)発色試薬;及び e)pH 7〜9 の緩衝液; を含有する、血清コリンエステラーゼ測定用多層分析要
素。 - 【請求項4】 水性液体中の血清コリンエステラーゼの
測定方法において、以下の工程a及びb: a)支持体から順に液絡している少なくとも一つの試薬
層と展開層とを表面に担持する支持体を含んで成り、し
かも該試薬層中に:以下の式: 【化2】 (上式中、R及びR1 は、各々独立に、アルキル基、ア
ルコキシ基、アミノ(−NR2 R3 )基を表し、またR
2 及びR3 は、各々独立に、水素、メチル基、エチル基
またはプロピル基を表し、そしてX- はアニオンであ
る)で示される血清コリンエステラーゼの基質;コリン
オキシダーゼ;ペルオキシダーゼ;pH 7〜9 の緩衝液;
及び該基質と血清コリンエステラーゼとの反応に応じた
検出可能な変化を提供する発色剤;を含有する多層分析
要素を、水性液体試料と接触させる工程;並びに b)こうして得られた検出可能な変化によって試料中の
コリンエステラーゼ活性を測定する工程;を含んで成る
前記測定方法。
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