JP2704616B2 - 遊離脂肪酸定量法、並びにその定量法に有用な遊離脂肪酸定量用試薬組成物 - Google Patents
遊離脂肪酸定量法、並びにその定量法に有用な遊離脂肪酸定量用試薬組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遊離脂肪酸、中でも血中遊離脂肪酸定量法
並びに該定量法に有用な試薬組成物に関するものであ
る。 ［従来技術］ 血中遊離脂肪酸（以下NEFAと略称する）の定量は、生
体内の脂質代謝に起因するエネルギー状態を反映するこ
とから、その測定は臨床的に意義のあるものとされてい
る。 NEFAの定量法については、ドールが報告した滴定法
「V.P.Dole,ジャーナル オブ クリニカ インベステ
ィゲーション（J.Clin.Iivest.,）35,150,（1956）］以
後数多くの定量法が報告されている。たとえばNEFAにコ
バルト［ノバク；ジャーナル オブ リピッド リサー
チ（Novak.M.;J.Lipid.Res.,）６,431（1965）］あるい
は銅［ダンコンブ；クリニカ キミカ アクタ（Duncom
be.W.G.;Clin,Chim.Acta）９,122（1964）］を作用させ
て、NEFAのコバルト塩あるいは銅塩として比色定量する
方法、又NEFAにアデノシン３リン酸（以下ATPと略称す
る）及びコエンザイムＡ（以下CoAと略称する）存在下
アシルコエンザイムＡ合成酵素（以下ACSと略称する）
を作用させ、下記反応式Ｉにしたがって生成してくるア
シルコエンザイムＡ（以下アシルCoAと略称する）やア
デノシン１リン酸（以下AMPと略称する）あるいは消費
されるCoAを測定する方法−いわゆる酵素法−等が報告
されている。 反応式I: これらの定量法のなかで、コバルトや銅を利用する比
色法は操作が繁雑なうえ測定精度に劣るため、ACSを利
用した上記反応式Ｉに基づく定量法が一般化した。 特に反応式Ｉに従って生成するアシルCoAをアシルコ
エンザイムＡ酸化酵素（以下ACODと略称する）を用い下
記反応式IIに従って酸化することにより測定する方法
は、測定精度に問題のあるAMPを測定する方法や、NEFA
の定量範囲に制限を受けるCoAの消費量を測定する方法
に比べて操作性、精度、感度等の点で優れていることか
ら現在繁用されている方法である。 反応式II: ところで、ACODによるアシルCoAの酸化反応は試薬と
して反応系に加えたCoAの還元作用による阻害を受け
る。したがってACODを利用するNEFAの定量法を実用化す
るためには、特公昭57−33955のようにＮ−エチルマレ
イミド（以下NEMと略称する）等SH試薬の添加によって
反応式Ｉの反応にあずからなかった未反応のCoAの影響
を抑える必要があった。 しかしACODは活性中心にSH基を有する酵素なので、SH
試薬と長時間接触させておくと構造的破壊を起こすた
め、SH試薬の添加は試薬自体の安定性低下につながるも
のであった。 ［発明の目的］ 本発明は、ACSおよびACODを利用したNEFAの定量法あ
るいは定量用試薬組成物において、従来のものの操作
性、精度、感度等を損なうことなく試薬の安定性を高め
うるNEFAの定量法並びに定量用試薬組成物の提供を目的
としている。 ［発明の構成］ 本発明は、次のステップａ）、ｂ）、及びｃ）を含ん
で成る遊離脂肪酸の定量法において、ステップａ）で遊
離脂肪酸との反応にあずからなかった余剰のコエンザイ
ムＡを、アシルコエンザイムＡ合成酵素以外の酵素によ
って他の物質と反応させ、余剰のコエンザイムＡをアシ
ルコエンザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又は作用
しにくい物質に変換する反応系をステップｂ）と共存さ
せることを特徴とする遊離脂肪酸定量法 ａ）遊離脂肪酸にアデノシン３リン酸とコエンザイムＡ
の存在下アシルコエンザイムＡ合成酵素を作用させアシ
ルコエンザイムＡを生成させるステップ ｂ）アシルコエンザイムＡにアシルコエンザイムＡ酸化
酵素を作用させるステップ、及び ｃ）アシルコエンザイムＡの酸化によって生じる変化を
測定するステップ 並びに少なくともアデノシン３リン酸、コエンザイムＡ
及びアシルコエンザイムＡ合成酵素を含む第１試薬と、
少なくともアシルコエンザイムＡ酸化酵素を含む第２試
薬から成る遊離脂肪酸定量用試薬組成物であって、第１
試薬及び／又は第２試薬中にステップａ）で遊離脂肪酸
との反応にあずからなかった余剰のコエンザイムＡを、
アシルコエンザイムＡ合成酵素以外の酵素によって他の
物質と反応させ、余剰のコエンザイムＡをアシルコエン
ザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又は作用しにくい
物質に変換する反応系を構成する酵素及び酵素基質を第
１試薬と第２試薬が接触したときにこの反応系の反応が
進行するように配合してなることを特徴とする遊離脂肪
酸定量用試薬組成物である。 本発明におけるステップａ）で遊離脂肪酸との反応に
あずからなかった余剰のコエンザイムＡを、アシルコエ
ンザイムＡ合成酵素以外の酵素によって他の物質、好ま
しくは炭素数２〜10の短鎖脂肪酸もしくは中鎖脂肪酸、
又はアセチルリン酸と反応させ、余剰のコエンザイムＡ
をアシルコエンザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又
は作用しにくい物質に変換する反応系の例としては次の
ようなものが挙げられる。 尚式中、 AcCS:アセチルコエンザイムＡ合成酵素 アセチルCoA:アセチルコエンザイムＡ PTA:ホスホトランスアセチラーゼ ADP:アデノシン２リン酸 ODH:オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ DPN+:ジホスホピリジンヌクレオチド（酸化型） サクシニルCoA:サクシニルコエンザイムＡ DPNH:ジホスホピリジンヌクレオチド（還元型） これら反応系を構成する物質、すなわち酵素基質及び
酵素の使用量は、利用する酵素の活性や化学平衡等を考
慮して、CoAをできるだけ速やかに消費できるように設
定される。具体的に述べると、この酵素基質の量は試料
中のNEFA濃度及びステップａ）で加えたCoAの濃度によ
って左右されるが、反応速度を考慮すると試薬として加
えたCoAの量に対しモル比で数倍程度あるいはそれ以上
の酵素基質を添加するのが好ましい。 一方本発明におけるこれらの反応系は、前記反応式II
に示したACODで触媒される反応と共存することになるの
で、両者の反応に好適なpHに大きな差が生じないように
する必要がある。具体的には前記反応式IIにおけるACOD
としては至適pH6.0〜8.5のものが広く利用されているの
で、このpHの範囲内で反応が進行する反応系を選ぶ必要
がある。 本発明によるNEFA定量法において、ACODの作用により
生じる変化を検出する方法としては次のようなものが挙
げられる。 ACODの作用により生成する過酸化水素を公知の方法で
測定する ACODの作用で消費される酸素量を公知の方法で測定す
る 特に現在臨床検査の分野で繁用されている過酸化水素
の比色法による測定法は、従来のNEFA定量法にも利用さ
れていたものであり、特殊な装置や熟練を要さないので
好ましい方法である。 本発明によるNEFA定量用組成物における前記酵素反応
系を構成する酵素及び酵素基質以外の物質は、従来の酵
素法に基づいたNEFA定量用組成物に用いられていたもの
と同様のものを用いることができる。すなわち第１試薬
あるいは第２試薬中には、リン酸、ホウ酸、クエン酸等
適当な緩衝剤や、必要であれば防腐剤や公知の安定剤等
を加えることも可能である。 又第１試薬あるいは第２試薬中には、ACODの作用によ
り生じる変化を検出しうる試薬系を共存させることも可
能である。これら試薬系として広く知られているものと
しては、ACODの作用で生成する過酸化水素の比色測定用
試薬系が挙げられる。具体的にはペルオキシダーゼ（以
下PODと略称する）やカタラーゼを利用し、例えば下記
のような反応式に基づいて色素を生成させ、それを比色
定量するものである。 本発明によるNEFA定量用試薬組成物は、溶解状態のみ
ならず乾燥状態で供給することもできる。 本発明における前記酵素反応系を構成する酵素及び酵
素基質は、第１試薬と第２試薬が接触したときにはじめ
て該反応系の反応が進行するように配合する必要があ
る。反応系Ｉを例にとって説明すると、第１試薬中で必
須成分であるATPとCoAが、反応系Ｉの構成員である酢酸
及びアセチルCoAシンセターゼと共存することがないよ
うにすればよい。 ［発明の作用］ 本発明によるNEFA定量法並びに設定量法に有用な試薬
組成物における前記酵素反応系を構成する酵素及び酵素
基質は、前記反応式IIにおけるACODのCoAによる妨害を
次のような機序で抑える作用を有する。すなわち、前記
反応式ＩでNEFAとの反応にあずからなかった余剰のCoA
を、前記酵素反応系によってACODの作用しないあるいは
作用しにくい物質として、反応の系外へ出してしまうの
である。 つづいて実施例に基づき本発明を更に詳細に説明す
る。 ［実施例］ 実施例1.本発明によるNEFA定量法の感度 以下に示す第１試薬及び第２試薬を用いて実際にNEFA
の定量を行い、測定感度を調査した。 ・第１試薬 リン酸緩衝液（pH6.8） 50mM ATP 2mM 塩化マグネシウム６水和物 5mM ４−アミノアンチピリン 2mM CoAリチウム塩 0.2mM ACS（比活性 2U/mg蛋白） 0.3mg/ml トリトンＸ−100 0.1g/dl ・第２試薬 リン酸緩衝液（pH6.8） 50mM Ｎ−エチル−Ｎ−（ｏ−メチルスルホンアミドエチ
ル）ｍ−トルイジン 2mM POD（比活性 100U/mg蛋白） 0.04mg/ml ACOD（比活性20U/mg蛋白） 0.25mg/ml トリトンＸ−100 0.05g/dl 以下に示すCoAとACSを除く前記反応系Ｉ又はIIを構成す
る酵素及び酵素基質 −反応系Ｉ− アセチルCoA合成酵素（比活性 1.4U/mg蛋白） 5mg/ml 酢酸 2mM −反応系II− ホスホトランスアセチラーゼ（比活性70U/mg蛋白）0.
1mg/ml アセチルリン酸 2mM 尚試料としてはオレイン酸ナトリウム30.45mgをトリ
トンＸ−100の5g/溶液10mlに溶解後、同溶液で全量を
100mlとしたものを用いた。測定操作は次のとおりであ
る。 試料50μと第１試薬1mlを混合し、37℃で５分間反
応させる 更に第２試薬2mlを加え、37℃で５分間反応させた後5
55nmにおける吸光度を測定する 従来法として第２試薬中の前記酵素反応系の構成員に
かえてNEM 1mMを加えたものを用いて同様の操作により
定量を行って、得られた結果を比較した。結果は第１表
に示すとおりである。尚表中の数値は、前記酵素反応系
あるいはNEM等を利用しなかった場合の光学的密度（以
下ODと略称する）を100としたときの比を表わす。 尚NEMを利用した場合のODは0.24程度であった。 実施例2.従来法との相関 実施例１で用いたものと同一の試薬を用い、血清15検
体を試料として本発明法及び従来法によりNEFAを定量
し、本発明法の従来法との相関々係を調査した。 NEFA値は、実施例１と同様の操作によって得られたOD
と、試料にかえて精製水50μを用いて得られた試薬ブ
ランクのODから下記計算式により算出した。尚標準試料
としてはオレイン酸の1000μEq/（30.45mg/dl、実施
例１で調製したものと同一）溶液を用いた。結果は第２
表に示すとおりである。 ちなみに1000、2000、及び3000μEq/のオレイン酸
標準液を用いて得られた本発明によるNEFAの定量法にお
ける検量線は、第１図及び第２図に示すとおり原点０を
通る直線性の良いものであった。 実施例3.試薬の安定性 実施例１で用いた各第２試薬の安定性を、以下のよう
な方法により調査した。 各第２試薬を、溶液状態で２〜10℃の条件下28日間放
置した後、この試薬を用いて標準試料の定量を行うこと
により反応性を確認した。その結果第３図から第５図に
示すように、試薬中にNEMを含む従来法では、明らかな
反応性の低下が観察された。過酸化水素発色試薬系の安
定性を確認するため標準試料にかえて過酸化水素溶液を
用いて発色状態を観察したが、各試薬間での差はほとん
ど認められず、試薬の反応性の差はACOD活性の差に起因
するものと考えられた。 実際に各第２試薬中のACOD比活性をバイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーシ
ョン（Biochem.Biophys.Res.Comm.）83巻,2号,479頁（1
978）に記載の方法によって測定し、調製直後の比活性
と比較してみたところ、第３表に示すように著しい比活
性の低下が確認された。表中の数値は試薬調製直後のAC
OD活性を100としたときの比（残存活性：％）を示す。 ［発明の効果］ 本発明によれば、ACOD活性の保存安定性に悪影響を及
ぼすと考えられるNEM等のSH試薬を用いずとも従来法の
感度や操作性、精度等を損なうことなくNEFAの定量を行
いうる。又従来法との相関も良好である。 試薬の安定性向上は、溶液状態で供給されることが多
い自動分析装置用試薬において、特に大きな利点となる
ものと考えられる。
並びに該定量法に有用な試薬組成物に関するものであ
る。 ［従来技術］ 血中遊離脂肪酸（以下NEFAと略称する）の定量は、生
体内の脂質代謝に起因するエネルギー状態を反映するこ
とから、その測定は臨床的に意義のあるものとされてい
る。 NEFAの定量法については、ドールが報告した滴定法
「V.P.Dole,ジャーナル オブ クリニカ インベステ
ィゲーション（J.Clin.Iivest.,）35,150,（1956）］以
後数多くの定量法が報告されている。たとえばNEFAにコ
バルト［ノバク；ジャーナル オブ リピッド リサー
チ（Novak.M.;J.Lipid.Res.,）６,431（1965）］あるい
は銅［ダンコンブ；クリニカ キミカ アクタ（Duncom
be.W.G.;Clin,Chim.Acta）９,122（1964）］を作用させ
て、NEFAのコバルト塩あるいは銅塩として比色定量する
方法、又NEFAにアデノシン３リン酸（以下ATPと略称す
る）及びコエンザイムＡ（以下CoAと略称する）存在下
アシルコエンザイムＡ合成酵素（以下ACSと略称する）
を作用させ、下記反応式Ｉにしたがって生成してくるア
シルコエンザイムＡ（以下アシルCoAと略称する）やア
デノシン１リン酸（以下AMPと略称する）あるいは消費
されるCoAを測定する方法−いわゆる酵素法−等が報告
されている。 反応式I: これらの定量法のなかで、コバルトや銅を利用する比
色法は操作が繁雑なうえ測定精度に劣るため、ACSを利
用した上記反応式Ｉに基づく定量法が一般化した。 特に反応式Ｉに従って生成するアシルCoAをアシルコ
エンザイムＡ酸化酵素（以下ACODと略称する）を用い下
記反応式IIに従って酸化することにより測定する方法
は、測定精度に問題のあるAMPを測定する方法や、NEFA
の定量範囲に制限を受けるCoAの消費量を測定する方法
に比べて操作性、精度、感度等の点で優れていることか
ら現在繁用されている方法である。 反応式II: ところで、ACODによるアシルCoAの酸化反応は試薬と
して反応系に加えたCoAの還元作用による阻害を受け
る。したがってACODを利用するNEFAの定量法を実用化す
るためには、特公昭57−33955のようにＮ−エチルマレ
イミド（以下NEMと略称する）等SH試薬の添加によって
反応式Ｉの反応にあずからなかった未反応のCoAの影響
を抑える必要があった。 しかしACODは活性中心にSH基を有する酵素なので、SH
試薬と長時間接触させておくと構造的破壊を起こすた
め、SH試薬の添加は試薬自体の安定性低下につながるも
のであった。 ［発明の目的］ 本発明は、ACSおよびACODを利用したNEFAの定量法あ
るいは定量用試薬組成物において、従来のものの操作
性、精度、感度等を損なうことなく試薬の安定性を高め
うるNEFAの定量法並びに定量用試薬組成物の提供を目的
としている。 ［発明の構成］ 本発明は、次のステップａ）、ｂ）、及びｃ）を含ん
で成る遊離脂肪酸の定量法において、ステップａ）で遊
離脂肪酸との反応にあずからなかった余剰のコエンザイ
ムＡを、アシルコエンザイムＡ合成酵素以外の酵素によ
って他の物質と反応させ、余剰のコエンザイムＡをアシ
ルコエンザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又は作用
しにくい物質に変換する反応系をステップｂ）と共存さ
せることを特徴とする遊離脂肪酸定量法 ａ）遊離脂肪酸にアデノシン３リン酸とコエンザイムＡ
の存在下アシルコエンザイムＡ合成酵素を作用させアシ
ルコエンザイムＡを生成させるステップ ｂ）アシルコエンザイムＡにアシルコエンザイムＡ酸化
酵素を作用させるステップ、及び ｃ）アシルコエンザイムＡの酸化によって生じる変化を
測定するステップ 並びに少なくともアデノシン３リン酸、コエンザイムＡ
及びアシルコエンザイムＡ合成酵素を含む第１試薬と、
少なくともアシルコエンザイムＡ酸化酵素を含む第２試
薬から成る遊離脂肪酸定量用試薬組成物であって、第１
試薬及び／又は第２試薬中にステップａ）で遊離脂肪酸
との反応にあずからなかった余剰のコエンザイムＡを、
アシルコエンザイムＡ合成酵素以外の酵素によって他の
物質と反応させ、余剰のコエンザイムＡをアシルコエン
ザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又は作用しにくい
物質に変換する反応系を構成する酵素及び酵素基質を第
１試薬と第２試薬が接触したときにこの反応系の反応が
進行するように配合してなることを特徴とする遊離脂肪
酸定量用試薬組成物である。 本発明におけるステップａ）で遊離脂肪酸との反応に
あずからなかった余剰のコエンザイムＡを、アシルコエ
ンザイムＡ合成酵素以外の酵素によって他の物質、好ま
しくは炭素数２〜10の短鎖脂肪酸もしくは中鎖脂肪酸、
又はアセチルリン酸と反応させ、余剰のコエンザイムＡ
をアシルコエンザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又
は作用しにくい物質に変換する反応系の例としては次の
ようなものが挙げられる。 尚式中、 AcCS:アセチルコエンザイムＡ合成酵素 アセチルCoA:アセチルコエンザイムＡ PTA:ホスホトランスアセチラーゼ ADP:アデノシン２リン酸 ODH:オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ DPN+:ジホスホピリジンヌクレオチド（酸化型） サクシニルCoA:サクシニルコエンザイムＡ DPNH:ジホスホピリジンヌクレオチド（還元型） これら反応系を構成する物質、すなわち酵素基質及び
酵素の使用量は、利用する酵素の活性や化学平衡等を考
慮して、CoAをできるだけ速やかに消費できるように設
定される。具体的に述べると、この酵素基質の量は試料
中のNEFA濃度及びステップａ）で加えたCoAの濃度によ
って左右されるが、反応速度を考慮すると試薬として加
えたCoAの量に対しモル比で数倍程度あるいはそれ以上
の酵素基質を添加するのが好ましい。 一方本発明におけるこれらの反応系は、前記反応式II
に示したACODで触媒される反応と共存することになるの
で、両者の反応に好適なpHに大きな差が生じないように
する必要がある。具体的には前記反応式IIにおけるACOD
としては至適pH6.0〜8.5のものが広く利用されているの
で、このpHの範囲内で反応が進行する反応系を選ぶ必要
がある。 本発明によるNEFA定量法において、ACODの作用により
生じる変化を検出する方法としては次のようなものが挙
げられる。 ACODの作用により生成する過酸化水素を公知の方法で
測定する ACODの作用で消費される酸素量を公知の方法で測定す
る 特に現在臨床検査の分野で繁用されている過酸化水素
の比色法による測定法は、従来のNEFA定量法にも利用さ
れていたものであり、特殊な装置や熟練を要さないので
好ましい方法である。 本発明によるNEFA定量用組成物における前記酵素反応
系を構成する酵素及び酵素基質以外の物質は、従来の酵
素法に基づいたNEFA定量用組成物に用いられていたもの
と同様のものを用いることができる。すなわち第１試薬
あるいは第２試薬中には、リン酸、ホウ酸、クエン酸等
適当な緩衝剤や、必要であれば防腐剤や公知の安定剤等
を加えることも可能である。 又第１試薬あるいは第２試薬中には、ACODの作用によ
り生じる変化を検出しうる試薬系を共存させることも可
能である。これら試薬系として広く知られているものと
しては、ACODの作用で生成する過酸化水素の比色測定用
試薬系が挙げられる。具体的にはペルオキシダーゼ（以
下PODと略称する）やカタラーゼを利用し、例えば下記
のような反応式に基づいて色素を生成させ、それを比色
定量するものである。 本発明によるNEFA定量用試薬組成物は、溶解状態のみ
ならず乾燥状態で供給することもできる。 本発明における前記酵素反応系を構成する酵素及び酵
素基質は、第１試薬と第２試薬が接触したときにはじめ
て該反応系の反応が進行するように配合する必要があ
る。反応系Ｉを例にとって説明すると、第１試薬中で必
須成分であるATPとCoAが、反応系Ｉの構成員である酢酸
及びアセチルCoAシンセターゼと共存することがないよ
うにすればよい。 ［発明の作用］ 本発明によるNEFA定量法並びに設定量法に有用な試薬
組成物における前記酵素反応系を構成する酵素及び酵素
基質は、前記反応式IIにおけるACODのCoAによる妨害を
次のような機序で抑える作用を有する。すなわち、前記
反応式ＩでNEFAとの反応にあずからなかった余剰のCoA
を、前記酵素反応系によってACODの作用しないあるいは
作用しにくい物質として、反応の系外へ出してしまうの
である。 つづいて実施例に基づき本発明を更に詳細に説明す
る。 ［実施例］ 実施例1.本発明によるNEFA定量法の感度 以下に示す第１試薬及び第２試薬を用いて実際にNEFA
の定量を行い、測定感度を調査した。 ・第１試薬 リン酸緩衝液（pH6.8） 50mM ATP 2mM 塩化マグネシウム６水和物 5mM ４−アミノアンチピリン 2mM CoAリチウム塩 0.2mM ACS（比活性 2U/mg蛋白） 0.3mg/ml トリトンＸ−100 0.1g/dl ・第２試薬 リン酸緩衝液（pH6.8） 50mM Ｎ−エチル−Ｎ−（ｏ−メチルスルホンアミドエチ
ル）ｍ−トルイジン 2mM POD（比活性 100U/mg蛋白） 0.04mg/ml ACOD（比活性20U/mg蛋白） 0.25mg/ml トリトンＸ−100 0.05g/dl 以下に示すCoAとACSを除く前記反応系Ｉ又はIIを構成す
る酵素及び酵素基質 −反応系Ｉ− アセチルCoA合成酵素（比活性 1.4U/mg蛋白） 5mg/ml 酢酸 2mM −反応系II− ホスホトランスアセチラーゼ（比活性70U/mg蛋白）0.
1mg/ml アセチルリン酸 2mM 尚試料としてはオレイン酸ナトリウム30.45mgをトリ
トンＸ−100の5g/溶液10mlに溶解後、同溶液で全量を
100mlとしたものを用いた。測定操作は次のとおりであ
る。 試料50μと第１試薬1mlを混合し、37℃で５分間反
応させる 更に第２試薬2mlを加え、37℃で５分間反応させた後5
55nmにおける吸光度を測定する 従来法として第２試薬中の前記酵素反応系の構成員に
かえてNEM 1mMを加えたものを用いて同様の操作により
定量を行って、得られた結果を比較した。結果は第１表
に示すとおりである。尚表中の数値は、前記酵素反応系
あるいはNEM等を利用しなかった場合の光学的密度（以
下ODと略称する）を100としたときの比を表わす。 尚NEMを利用した場合のODは0.24程度であった。 実施例2.従来法との相関 実施例１で用いたものと同一の試薬を用い、血清15検
体を試料として本発明法及び従来法によりNEFAを定量
し、本発明法の従来法との相関々係を調査した。 NEFA値は、実施例１と同様の操作によって得られたOD
と、試料にかえて精製水50μを用いて得られた試薬ブ
ランクのODから下記計算式により算出した。尚標準試料
としてはオレイン酸の1000μEq/（30.45mg/dl、実施
例１で調製したものと同一）溶液を用いた。結果は第２
表に示すとおりである。 ちなみに1000、2000、及び3000μEq/のオレイン酸
標準液を用いて得られた本発明によるNEFAの定量法にお
ける検量線は、第１図及び第２図に示すとおり原点０を
通る直線性の良いものであった。 実施例3.試薬の安定性 実施例１で用いた各第２試薬の安定性を、以下のよう
な方法により調査した。 各第２試薬を、溶液状態で２〜10℃の条件下28日間放
置した後、この試薬を用いて標準試料の定量を行うこと
により反応性を確認した。その結果第３図から第５図に
示すように、試薬中にNEMを含む従来法では、明らかな
反応性の低下が観察された。過酸化水素発色試薬系の安
定性を確認するため標準試料にかえて過酸化水素溶液を
用いて発色状態を観察したが、各試薬間での差はほとん
ど認められず、試薬の反応性の差はACOD活性の差に起因
するものと考えられた。 実際に各第２試薬中のACOD比活性をバイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーシ
ョン（Biochem.Biophys.Res.Comm.）83巻,2号,479頁（1
978）に記載の方法によって測定し、調製直後の比活性
と比較してみたところ、第３表に示すように著しい比活
性の低下が確認された。表中の数値は試薬調製直後のAC
OD活性を100としたときの比（残存活性：％）を示す。 ［発明の効果］ 本発明によれば、ACOD活性の保存安定性に悪影響を及
ぼすと考えられるNEM等のSH試薬を用いずとも従来法の
感度や操作性、精度等を損なうことなくNEFAの定量を行
いうる。又従来法との相関も良好である。 試薬の安定性向上は、溶液状態で供給されることが多
い自動分析装置用試薬において、特に大きな利点となる
ものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は本発明によるNEFA定量法によって得
られた検量線を、又第３図、第４図及び第５図は、実施
例３における調製直後並びに放置後の各試薬の反応タイ
ムコースを示すグラフである。 尚第１図及び第２図の縦軸は、各標準試料で得られた
ODと試薬ブランクのODの差（ΔOD）を表わす。
られた検量線を、又第３図、第４図及び第５図は、実施
例３における調製直後並びに放置後の各試薬の反応タイ
ムコースを示すグラフである。 尚第１図及び第２図の縦軸は、各標準試料で得られた
ODと試薬ブランクのODの差（ΔOD）を表わす。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．次のステップａ）、ｂ）、及びｃ）を含んで成る遊
離脂肪酸の定量法において、ステップａ）で遊離脂肪酸
との反応にあずからなかった余剰のコエンザイムＡを、
アシルコエンザイムＡ合成酵素以外の酵素によって他の
物質と反応させ、前記余剰のコエンザイムＡをアシルコ
エンザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又は作用しに
くい物質に変換する反応系をステップｂ）と共存させる
ことを特徴とする遊離脂肪酸定量法。 ａ）遊離脂肪酸にアデノシン３リン酸とコエンザイムＡ
の存在下アシルコエンザイムＡ合成酵素を作用させアシ
ルコエンザイムＡを生成させるステップ ｂ）アシルコエンザイムＡにアシルコエンザイムＡ酸化
酵素を作用させるステップ及び ｃ）アシルコエンザイムＡの酸化によって生じる変化を
測定するステップ ２．他の物質が炭素数２〜10の短鎖脂肪酸又は中鎖脂肪
酸である特許請求の範囲第１項に記載の遊離脂肪酸定量
法。 ３．反応系が、酢酸、アデノシン３リン酸及びコエンザ
イムＡからアセチルコエンザイムＡ合成酵素存在下アセ
チルコエンザイムＡ、アデノシン１リン酸及びピロリン
酸を生成する反応系であることを特徴とする特許請求の
範囲第１又は２項に記載の遊離脂肪酸定量法 ４．反応系が、アセチルリン酸及びコエンザイムＡから
ホスホトランスアセチラーゼ存在下アセチルコエンザイ
ムＡ及びリン酸を生成する反応系であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の遊離脂肪酸定量法 ５．反応系が、クエン酸、アデノシン３リン酸及びコエ
ンザイムＡからクエン酸開裂酵素存在下アセチルコエン
ザイムＡ、オキザロ酢酸、アデノシン２リン酸及びピロ
リン酸を生成する反応系であることを特徴とする特許請
求の範囲第１又は２項に記載の遊離脂肪酸定量法 ６．反応系が、α−ケトグルタル酸、コエンザイムＡ及
び酸化型ジホスホピリジンヌクレオチドからオキソグル
タル酸デヒドロゲナーゼ存在下サクシニルコエンザイム
Ａ、還元型ジホスホピリジンヌクレオチド、二酸化炭素
及び水素イオンを生成する反応系であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１又は２項に記載の遊離脂肪酸定量
法 ７．アシルコエンザイムＡを酸化して生じた過酸化水素
を測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至
第６項に記載の遊離脂肪酸定量法 ８．過酸化水素を比色法により測定することを特徴とす
る特許請求の範囲第７項に記載の遊離脂肪酸定量法 ９．少なくともアデノシン３リン酸、コエンザイムＡ及
びアシルコエンザイムＡ合成酵素を含む第１試薬と、少
なくともアシルコエンザイムＡ酸化酵素を含む第２試薬
から成る遊離脂肪酸定量用試薬組成物であって、第１試
薬及び／又は第２試薬中にステップａ）で遊離脂肪酸と
の反応にあずからなかった余剰のコエンザイムＡを、ア
シルコエンザイムＡ合成酵素以外の酵素によって他の物
質と反応させ前記余剰のコエンザイムＡをアシルコエン
ザイムＡ酸化酵素の作用しない物質、又は作用しにくい
物質に変換する反応系を構成する酵素及び酵素基質を第
１試薬と第２試薬が接触した時にこの反応系の反応が進
行するように配合してなることを特徴とする遊離脂肪酸
定量用試薬組成物 １０．他の物質が炭素数２〜10の短鎖脂肪酸又は中鎖脂
肪酸、又はアセチルリン酸である特許請求の範囲第９項
に記載の遊離脂肪酸定量用試薬組成物。 １１．第２試薬が更に過酸化水素測定用試薬組成物を含
むことを特徴とする特許請求の範囲第９又は10項に記載
の遊離脂肪酸定量用試薬組成物
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17492787A JP2704616B2 (ja) | 1987-07-15 | 1987-07-15 | 遊離脂肪酸定量法、並びにその定量法に有用な遊離脂肪酸定量用試薬組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17492787A JP2704616B2 (ja) | 1987-07-15 | 1987-07-15 | 遊離脂肪酸定量法、並びにその定量法に有用な遊離脂肪酸定量用試薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6420099A JPS6420099A (en) | 1989-01-24 |
| JP2704616B2 true JP2704616B2 (ja) | 1998-01-26 |
Family
ID=15987151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17492787A Expired - Lifetime JP2704616B2 (ja) | 1987-07-15 | 1987-07-15 | 遊離脂肪酸定量法、並びにその定量法に有用な遊離脂肪酸定量用試薬組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2704616B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09132411A (ja) | 1995-11-02 | 1997-05-20 | Fuji Photo Film Co Ltd | 水酸化アルミニウムの精製方法及びその精製方法を利用した印刷版用支持体の表面処理方法 |
| TW415232U (en) * | 1999-10-26 | 2000-12-11 | Taipei Veterans General Hospit | Electric physiology Faraday box |
| JP2002051769A (ja) * | 2000-08-11 | 2002-02-19 | Azwell Inc | 遊離脂肪酸の測定に有用な液状試薬 |
-
1987
- 1987-07-15 JP JP17492787A patent/JP2704616B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6420099A (en) | 1989-01-24 |
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