JPH10191998A - １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 - Google Patents
１，５ａｇまたはａｄｐの測定法Info
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- JPH10191998A JPH10191998A JP9006321A JP632197A JPH10191998A JP H10191998 A JPH10191998 A JP H10191998A JP 9006321 A JP9006321 A JP 9006321A JP 632197 A JP632197 A JP 632197A JP H10191998 A JPH10191998 A JP H10191998A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血清、血漿、尿、髄液などの被検液中の１，
５ＡＧまたは遊離または形成されたＡＤＰを簡便かつ正
確に測定する方法を提供する。 【解決手段】 １，５アンヒドログルシトールおよびＡ
ＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５アン
ヒドログルシトールおよびＡＤＰのいずれか残りの成分
およびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ酵素蛋白を作用さ
せ、反応によって生成される１，５アンヒドログルシト
ール６リン酸またはＡＭＰを定量してなる１，５アンヒ
ドログルシトールまたはＡＤＰの測定法。 【効果】 生体試料中の１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便
にして高精度で測定することができる。
５ＡＧまたは遊離または形成されたＡＤＰを簡便かつ正
確に測定する方法を提供する。 【解決手段】 １，５アンヒドログルシトールおよびＡ
ＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５アン
ヒドログルシトールおよびＡＤＰのいずれか残りの成分
およびＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ酵素蛋白を作用さ
せ、反応によって生成される１，５アンヒドログルシト
ール６リン酸またはＡＭＰを定量してなる１，５アンヒ
ドログルシトールまたはＡＤＰの測定法。 【効果】 生体試料中の１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便
にして高精度で測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は１，５アンヒドログ
ルシトール（１，５ＡＧ）およびＡＤＰのいずれか一成
分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいず
れか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作
用させ、反応によって生成される１，５アンヒドログル
シトール６リン酸（１，５ＡＧ６Ｐ）またはＡＭＰを定
量することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの定量
法に関し、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中の１，
５ＡＧまたは遊離または形成されたＡＤＰを簡便かつ正
確に測定する臨床検査分野に関するものである。
ルシトール（１，５ＡＧ）およびＡＤＰのいずれか一成
分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいず
れか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作
用させ、反応によって生成される１，５アンヒドログル
シトール６リン酸（１，５ＡＧ６Ｐ）またはＡＭＰを定
量することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの定量
法に関し、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中の１，
５ＡＧまたは遊離または形成されたＡＤＰを簡便かつ正
確に測定する臨床検査分野に関するものである。
【０００２】
【化２】
【０００３】
【従来の技術】１，５ＡＧはヒト髄液、血漿、血清、尿
中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血
漿中の量が低下するすることが報告されている化合物で
あり（日本内科学会誌８０巻、１１９８−１２０４、１
９９１）、近年、糖尿病診断マーカーとして使用されて
いる物質である。
中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血
漿中の量が低下するすることが報告されている化合物で
あり（日本内科学会誌８０巻、１１９８−１２０４、１
９９１）、近年、糖尿病診断マーカーとして使用されて
いる物質である。
【０００４】従来、生体試料中の１，５ＡＧを測定する
方法としてはガスクロマトグラフィー法（糖尿病、２５
巻、１１１５−１１１８、１９８２）、ピラノースオキ
シダーゼを用いて測定する方法（特開昭６３−１８５３
９７号公報、米国特許第４９９４３７７号明細書、ＥＰ
公開２６１５９１号公報）、グルコキナーゼまたはヘキ
ソキナーゼを用いて測定する方法（特開平８−１０７７
９６号公報）などが知られていた。しかしながら、ガス
クロマトグラフィー法は被検液の前処理として１，５Ａ
Ｇのラベル化が必要である上、測定に長時間を要し、多
数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも分
析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠
点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。ま
たピラノースオキシダーゼを用いた１，５ＡＧの測定法
はピラノースオキシダーゼが基質としてピラノース類に
広く作用するため１，５ＡＧを正確に測定することがで
きなかった。また１，５ＡＧをリン酸化する酵素として
ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼが知られていたがヘキ
ソキナーゼおよびグルコキナーゼがグルコースに対して
高い特異性を示し、１，５ＡＧに対する作用が低く、そ
の測定に大量の酵素を用いる必要があり、現実的な測定
とはいえなかった。
方法としてはガスクロマトグラフィー法（糖尿病、２５
巻、１１１５−１１１８、１９８２）、ピラノースオキ
シダーゼを用いて測定する方法（特開昭６３−１８５３
９７号公報、米国特許第４９９４３７７号明細書、ＥＰ
公開２６１５９１号公報）、グルコキナーゼまたはヘキ
ソキナーゼを用いて測定する方法（特開平８−１０７７
９６号公報）などが知られていた。しかしながら、ガス
クロマトグラフィー法は被検液の前処理として１，５Ａ
Ｇのラベル化が必要である上、測定に長時間を要し、多
数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも分
析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠
点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。ま
たピラノースオキシダーゼを用いた１，５ＡＧの測定法
はピラノースオキシダーゼが基質としてピラノース類に
広く作用するため１，５ＡＧを正確に測定することがで
きなかった。また１，５ＡＧをリン酸化する酵素として
ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼが知られていたがヘキ
ソキナーゼおよびグルコキナーゼがグルコースに対して
高い特異性を示し、１，５ＡＧに対する作用が低く、そ
の測定に大量の酵素を用いる必要があり、現実的な測定
とはいえなかった。
【０００５】また、ＡＤＰの測定は、例えばＡＴＰおよ
び基質の存在下にキナーゼによって基質のリン酸化体お
よびＡＤＰを形成する反応を触媒する酵素（キナーゼ）
の反応が関与する酵素活性の測定や基質の定量に有用で
あることが知られている。この基質とキナーゼの関係と
しては、例えばクレアチン、ＡＴＰ／クレアチンキナー
ゼ（ＥＣ２．７．３．２）であり、グリセロール、ＡＴ
Ｐ／グリセロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０）であ
り、コリン、ＡＴＰ／コリンキナーゼ（ＥＣ２．７．
１．３２）であり、ピルビン酸、ＡＴＰ／ピルビン酸キ
ナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）であり、酢酸、ＡＴＰ
／酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）などが挙げら
れ、これらの反応にて形成されるＡＤＰを測定対象とす
るものである。さらに、例えばグリセロール、ＡＴＰ／
グリセロキナーゼの場合に、このグリセロールはトリグ
リセリド、ジグリセリドやモノグリセリドにリパーゼや
膵リパーゼを作用せしめて遊離されたグリセロールでも
よく、またホスファチジルグリセロールにホスフォリパ
ーゼＤを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよ
く、生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリ
ド定量の目的、トリグリセリドやジグリセリドを基質と
した膵リパーゼ活性測定の目的や羊水中のホスファチジ
ルグリセロール定量の目的が挙げられる。
び基質の存在下にキナーゼによって基質のリン酸化体お
よびＡＤＰを形成する反応を触媒する酵素（キナーゼ）
の反応が関与する酵素活性の測定や基質の定量に有用で
あることが知られている。この基質とキナーゼの関係と
しては、例えばクレアチン、ＡＴＰ／クレアチンキナー
ゼ（ＥＣ２．７．３．２）であり、グリセロール、ＡＴ
Ｐ／グリセロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０）であ
り、コリン、ＡＴＰ／コリンキナーゼ（ＥＣ２．７．
１．３２）であり、ピルビン酸、ＡＴＰ／ピルビン酸キ
ナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）であり、酢酸、ＡＴＰ
／酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）などが挙げら
れ、これらの反応にて形成されるＡＤＰを測定対象とす
るものである。さらに、例えばグリセロール、ＡＴＰ／
グリセロキナーゼの場合に、このグリセロールはトリグ
リセリド、ジグリセリドやモノグリセリドにリパーゼや
膵リパーゼを作用せしめて遊離されたグリセロールでも
よく、またホスファチジルグリセロールにホスフォリパ
ーゼＤを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよ
く、生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリ
ド定量の目的、トリグリセリドやジグリセリドを基質と
した膵リパーゼ活性測定の目的や羊水中のホスファチジ
ルグリセロール定量の目的が挙げられる。
【０００６】さらに他のＡＤＰの測定としては、下記の
基質／酵素の関係において基質の測定または酵素活性測
定が挙げられ、例えば尿素、ＡＴＰ／ウレアアミドヒド
ロラーゼ（ＥＣ３．５．１．４５）による形成されるＡ
ＤＰの測定（例えばまた、尿素としては、遊離尿素やク
レアチン／クレアチンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．
５．３．３）の反応にて形成される尿素でもよく、さら
にクレアチンとしてはクレアチニン／クレアチニンアミ
ドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）の反応にて形
成されるクレアチンでもよい）、Ｎ−メチルヒダントイ
ン、ＡＴＰ／Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＥＣ３．
５．２．１４）による形成されるＡＤＰの測定（例えば
また、Ｎ−メチルヒダントインとしてはクレアチニン／
クレアチニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．４．２１）の
反応にて形成されるものが例示される）、Ｌ−グルタミ
ン酸、アンモニア、ＡＴＰ／グルタミンシンセターゼ
（ＥＣ６．３．１．２）による形成されるＡＤＰの測定
（例えばまた、アンモニアとしては、遊離アンモニアや
尿素／ウレアーゼ（ＥＣ３．５．１．５）の反応にて形
成されるものが例示される）、Ｌ−アスパラギン酸、α
−ケトグルタル酸、アンモニア、ＡＴＰ／アスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、グルタミンシ
ンセターゼによる形成されるＡＤＰの測定に基づくＧＯ
Ｔ活性測定、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、アン
モニア、ＡＴＰ／アラニンアミノトランスフェラーゼ
（ＧＰＴ）、グルタミンシンセターゼによる形成される
ＡＤＰの測定に基づくＧＰＴ活性測定などが挙げられ
る。
基質／酵素の関係において基質の測定または酵素活性測
定が挙げられ、例えば尿素、ＡＴＰ／ウレアアミドヒド
ロラーゼ（ＥＣ３．５．１．４５）による形成されるＡ
ＤＰの測定（例えばまた、尿素としては、遊離尿素やク
レアチン／クレアチンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．
５．３．３）の反応にて形成される尿素でもよく、さら
にクレアチンとしてはクレアチニン／クレアチニンアミ
ドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）の反応にて形
成されるクレアチンでもよい）、Ｎ−メチルヒダントイ
ン、ＡＴＰ／Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＥＣ３．
５．２．１４）による形成されるＡＤＰの測定（例えば
また、Ｎ−メチルヒダントインとしてはクレアチニン／
クレアチニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．４．２１）の
反応にて形成されるものが例示される）、Ｌ−グルタミ
ン酸、アンモニア、ＡＴＰ／グルタミンシンセターゼ
（ＥＣ６．３．１．２）による形成されるＡＤＰの測定
（例えばまた、アンモニアとしては、遊離アンモニアや
尿素／ウレアーゼ（ＥＣ３．５．１．５）の反応にて形
成されるものが例示される）、Ｌ−アスパラギン酸、α
−ケトグルタル酸、アンモニア、ＡＴＰ／アスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、グルタミンシ
ンセターゼによる形成されるＡＤＰの測定に基づくＧＯ
Ｔ活性測定、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、アン
モニア、ＡＴＰ／アラニンアミノトランスフェラーゼ
（ＧＰＴ）、グルタミンシンセターゼによる形成される
ＡＤＰの測定に基づくＧＰＴ活性測定などが挙げられ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】まず、本発明者らは
１，５ＡＧに対して特異的に作用する酵素を広く微生物
からスクリーニングしたところ、超高度好熱菌ピロコッ
カス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株の菌体内に存在
する酵素蛋白であるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤ
Ｐ−ＨＫ）がＡＤＰの存在下１，５ＡＧをリン酸化して
１，５ＡＧ６Ｐを形成する反応を触媒することを初めて
発見し、１，５ＡＧの測定においてＡＤＰの存在下に該
酵素蛋白を作用させるか、ＡＤＰの測定において１，５
ＡＧの存在下に該酵素蛋白を作用させることにより１，
５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを形成し、この１，５ＡＧ６Ｐ
またはＡＭＰを定量することにより１，５ＡＧまたはＡ
ＤＰが簡便かつ正確に測定できることを見出した。さら
に、本発明者らは、エッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴ
ＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５アンヒド
ログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼが補酵素の存
在下に１，５ＡＧ６Ｐを基質として還元型補酵素を形成
する反応を触媒することを見出し、好適には１，５ＡＧ
またはＡＤＰの測定において生成された還元型補酵素を
測定することにより達成できることを見出した。
１，５ＡＧに対して特異的に作用する酵素を広く微生物
からスクリーニングしたところ、超高度好熱菌ピロコッ
カス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株の菌体内に存在
する酵素蛋白であるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤ
Ｐ−ＨＫ）がＡＤＰの存在下１，５ＡＧをリン酸化して
１，５ＡＧ６Ｐを形成する反応を触媒することを初めて
発見し、１，５ＡＧの測定においてＡＤＰの存在下に該
酵素蛋白を作用させるか、ＡＤＰの測定において１，５
ＡＧの存在下に該酵素蛋白を作用させることにより１，
５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを形成し、この１，５ＡＧ６Ｐ
またはＡＭＰを定量することにより１，５ＡＧまたはＡ
ＤＰが簡便かつ正確に測定できることを見出した。さら
に、本発明者らは、エッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴ
ＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５アンヒド
ログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼが補酵素の存
在下に１，５ＡＧ６Ｐを基質として還元型補酵素を形成
する反応を触媒することを見出し、好適には１，５ＡＧ
またはＡＤＰの測定において生成された還元型補酵素を
測定することにより達成できることを見出した。
【０００８】即ち、本発明は１，５ＡＧおよびＡＤＰの
いずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよび
ＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する
酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５Ａ
Ｇ６ＰまたはＡＭＰを定量してなる１，５ＡＧまたはＡ
ＤＰを簡便かつ高精度に測定することのできる新規な方
法を提供することを目的とする。
いずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよび
ＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する
酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５Ａ
Ｇ６ＰまたはＡＭＰを定量してなる１，５ＡＧまたはＡ
ＤＰを簡便かつ高精度に測定することのできる新規な方
法を提供することを目的とする。
【０００９】
【化３】
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は上記知見に基づ
いて完成されたもので、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいず
れか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤ
Ｐのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素
蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５ＡＧ６
ＰまたはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５ＡＧ
またはＡＤＰの測定法である。
いて完成されたもので、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいず
れか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤ
Ｐのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素
蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５ＡＧ６
ＰまたはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５ＡＧ
またはＡＤＰの測定法である。
【００１１】
【化４】
【００１２】より好ましくは、本発明は、生成される
１，５ＡＧ６Ｐの定量において、１，５アンヒドログル
シトール６リン酸デヒドロゲナーゼおよび補酵素を作用
せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成
された成分を測定することを特徴とする１，５ＡＧまた
はＡＤＰの測定法である。以下、本発明をより詳細に説
明する。
１，５ＡＧ６Ｐの定量において、１，５アンヒドログル
シトール６リン酸デヒドロゲナーゼおよび補酵素を作用
せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成
された成分を測定することを特徴とする１，５ＡＧまた
はＡＤＰの測定法である。以下、本発明をより詳細に説
明する。
【００１３】本発明に用いられる下記反応を触媒する酵
素蛋白としては１，５ＡＧを基質とし、ＡＤＰを消費し
て１，５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを生成する酵素蛋白であ
れば何ら限定されるものではなく、例えば超高度好熱菌
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６
３８菌株由来ＡＤＰ−ＨＫを用いればよい。超高度好熱
菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３
６３８菌株はドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイク
ロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレンＧｍｂＨ
（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタロ
グ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であ
る。
素蛋白としては１，５ＡＧを基質とし、ＡＤＰを消費し
て１，５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを生成する酵素蛋白であ
れば何ら限定されるものではなく、例えば超高度好熱菌
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６
３８菌株由来ＡＤＰ−ＨＫを用いればよい。超高度好熱
菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３
６３８菌株はドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイク
ロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレンＧｍｂＨ
（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタロ
グ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であ
る。
【００１４】ＡＤＰ−ＨＫ生産菌の培養方法は例えば後
述の培地を用いて、培養温度は菌の生育する温度範囲で
行えばよく、例えば７０〜１１０℃、好ましくは８５〜
１０５℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最
高力価となる培養時間、例えば１〜３日にて目的とする
酵素を採取すればよい。生成された１，５ＡＧ６Ｐの定
量に用いられる１，５アンヒドログルシトール６リン酸
デヒドロゲナーゼ（１，５ＡＧ６ＰＤＨ）としてはエッ
シェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌
体内に存在する１，５ＡＧ６ＰＤＨを用いて測定すれば
よい。１，５ＡＧ６ＰＤＨは下記反応式
述の培地を用いて、培養温度は菌の生育する温度範囲で
行えばよく、例えば７０〜１１０℃、好ましくは８５〜
１０５℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最
高力価となる培養時間、例えば１〜３日にて目的とする
酵素を採取すればよい。生成された１，５ＡＧ６Ｐの定
量に用いられる１，５アンヒドログルシトール６リン酸
デヒドロゲナーゼ（１，５ＡＧ６ＰＤＨ）としてはエッ
シェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌
体内に存在する１，５ＡＧ６ＰＤＨを用いて測定すれば
よい。１，５ＡＧ６ＰＤＨは下記反応式
【００１５】
【化５】
【００１６】で示される通り１，５ＡＧ６Ｐを基質と
し、例えば補酵素として酸化型（チオ）ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（リン酸）〔酸化型（チオ）Ｎ
ＡＤ（Ｐ）〕類を消費して還元型（チオ）ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔還元型（チオ）
ＮＡＤ（Ｐ）〕類を生成する１，５ＡＧ６ＰＤＨであれ
ばなんら限定されるものではない。またこの１，５ＡＧ
６ＰＤＨ生産菌としてはエシェリヒア属に属する１，５
ＡＧ６ＰＤＨ生産菌であれば何ら限定されるものではな
く，１，５ＡＧ６ＰＤＨを生産する能力を有するその変
異株であってもよい。好ましくはエシェリヒア・コリ属
に属する生産菌が考えられ、より好ましいものとしてエ
シェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）はＡ
ＴＣＣに保存され、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログに記
載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られ
た１，５ＡＧ６ＰＤＨが好ましい。
し、例えば補酵素として酸化型（チオ）ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（リン酸）〔酸化型（チオ）Ｎ
ＡＤ（Ｐ）〕類を消費して還元型（チオ）ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔還元型（チオ）
ＮＡＤ（Ｐ）〕類を生成する１，５ＡＧ６ＰＤＨであれ
ばなんら限定されるものではない。またこの１，５ＡＧ
６ＰＤＨ生産菌としてはエシェリヒア属に属する１，５
ＡＧ６ＰＤＨ生産菌であれば何ら限定されるものではな
く，１，５ＡＧ６ＰＤＨを生産する能力を有するその変
異株であってもよい。好ましくはエシェリヒア・コリ属
に属する生産菌が考えられ、より好ましいものとしてエ
シェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）はＡ
ＴＣＣに保存され、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログに記
載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られ
た１，５ＡＧ６ＰＤＨが好ましい。
【００１７】次いで１，５ＡＧ６ＰＤＨを得るに当たっ
て好ましくはエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３
３８４９）を培養するものでこの培養手段としては固体
培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャ
ー等による通気培養である。この培地としては微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源と
してグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクト
ースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリ
プトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウムなどを用いればよい。培養条件としては例えばｐＨ
６．５〜７．５、培養温度は２５〜３７℃で目的とする
酵素が最高力価となる培養時間、例えば１８〜３０時間
にて目的となる酵素を採取すればよい。
て好ましくはエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３
３８４９）を培養するものでこの培養手段としては固体
培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャ
ー等による通気培養である。この培地としては微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源と
してグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクト
ースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリ
プトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウムなどを用いればよい。培養条件としては例えばｐＨ
６．５〜７．５、培養温度は２５〜３７℃で目的とする
酵素が最高力価となる培養時間、例えば１８〜３０時間
にて目的となる酵素を採取すればよい。
【００１８】ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨは
主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体
内から抽出すればよい。ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ
６ＰＤＨの抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分
離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音
波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可
溶性画分を粗酵素液として回収する。このようにして得
られた粗製のＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨ含
有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処
理することにより、精製されたＡＤＰ−ＨＫまたは１，
５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができる。例えばアセトンま
たはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸
アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグ
ラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティ
ークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵
素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＡＤＰ−ＨＫま
たは１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができ、適宜安定化
剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、
アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて
凍結保存または凍結乾燥させてもよい。
主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体
内から抽出すればよい。ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ
６ＰＤＨの抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分
離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩
酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音
波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可
溶性画分を粗酵素液として回収する。このようにして得
られた粗製のＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨ含
有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処
理することにより、精製されたＡＤＰ−ＨＫまたは１，
５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができる。例えばアセトンま
たはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸
アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグ
ラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティ
ークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵
素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＡＤＰ−ＨＫま
たは１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができ、適宜安定化
剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、
アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて
凍結保存または凍結乾燥させてもよい。
【００１９】上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応に使
用するマグネシウムイオンの代わりにマンガンイオンを
放出し得るイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類
としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩
化マグネシウム、塩化マンガンが挙げられるが、なんら
これらに限定されるものではない。上記１，５ＡＧ６Ｐ
ＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸
化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類には酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（酸化型ＮＡＤ）、酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型ＮＡ
ＤＰ）、酸化型３−アセチルニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（酸化型３−アセチルＮＡＤ）、酸化型３
−アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（酸化型３−アセチルＮＡＤＰ）の酸化型３−アセチ
ルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（酸化型デアミノＮＡＤ）、酸化型デ
アミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（酸化型デアミノＮＡＤＰ）の酸化型デアミノＮＡＤ
（Ｐ）（これらを含めて以下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）とい
うこともある）の他に酸化型チオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（酸化型チオＮＡＤ）、酸化型チオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型チ
オＮＡＤＰ）の酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）などが包含され
るが、なんらこれらに限定されるものではない。
用するマグネシウムイオンの代わりにマンガンイオンを
放出し得るイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類
としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩
化マグネシウム、塩化マンガンが挙げられるが、なんら
これらに限定されるものではない。上記１，５ＡＧ６Ｐ
ＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸
化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類には酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（酸化型ＮＡＤ）、酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型ＮＡ
ＤＰ）、酸化型３−アセチルニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（酸化型３−アセチルＮＡＤ）、酸化型３
−アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（酸化型３−アセチルＮＡＤＰ）の酸化型３−アセチ
ルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（酸化型デアミノＮＡＤ）、酸化型デ
アミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（酸化型デアミノＮＡＤＰ）の酸化型デアミノＮＡＤ
（Ｐ）（これらを含めて以下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）とい
うこともある）の他に酸化型チオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（酸化型チオＮＡＤ）、酸化型チオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型チ
オＮＡＤＰ）の酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）などが包含され
るが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２０】本発明における１，５ＡＧの測定の場合、
ＡＤＰ−ＨＫ、１，５ＡＧ６ＰＤＨ、ＡＤＰ、酸化型
（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオンまた
はマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進
行する量であればよく、被検液中１，５ＡＧの含量、反
応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ
−ＨＫおよび１，５ＡＧ６ＰＤＨの濃度は例えば０．１
〜５００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ
程度である。ＡＤＰや酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の
濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、ＡＤ
Ｐの濃度は例えば０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは
０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。酸化型（チオ）ＮＡ
Ｄ（Ｐ）類は例えば０．５〜５０ｍＭ程度、好ましく
は、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオンまた
はマンガンイオンの濃度としては例えば０．１〜 ５０
ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
ＡＤＰ−ＨＫ、１，５ＡＧ６ＰＤＨ、ＡＤＰ、酸化型
（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオンまた
はマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進
行する量であればよく、被検液中１，５ＡＧの含量、反
応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ
−ＨＫおよび１，５ＡＧ６ＰＤＨの濃度は例えば０．１
〜５００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ
程度である。ＡＤＰや酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の
濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、ＡＤ
Ｐの濃度は例えば０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは
０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。酸化型（チオ）ＮＡ
Ｄ（Ｐ）類は例えば０．５〜５０ｍＭ程度、好ましく
は、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオンまた
はマンガンイオンの濃度としては例えば０．１〜 ５０
ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２１】また、ＡＤＰを測定する場合には、上記の
試薬としてＡＤＰを用いる代わりに１，５ＡＧを使用す
ればよく、１，５ＡＧの濃度としては酵素反応を行うの
に十分な濃度として用いればよく、その濃度は例えば
０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０
ｍＭ程度である。本発明の方法は、酵素反応系に悪影響
を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝
液、グッド緩衝液等）を用いて行われる。
試薬としてＡＤＰを用いる代わりに１，５ＡＧを使用す
ればよく、１，５ＡＧの濃度としては酵素反応を行うの
に十分な濃度として用いればよく、その濃度は例えば
０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０
ｍＭ程度である。本発明の方法は、酵素反応系に悪影響
を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝
液、グッド緩衝液等）を用いて行われる。
【００２２】また、測定手法は特に限定されず、エンド
ポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いる
ことができる。測定対象となる被検液としては、例え
ば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。このよう
な被検液としては通常、例えば３〜２００μｌを用いて
上記反応系によって反応を行うもので、反応温度として
は例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反
応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイ
ント法では、例えば１〜６０分間、好ましくは１〜１０
分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われてい
る時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
ポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いる
ことができる。測定対象となる被検液としては、例え
ば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。このよう
な被検液としては通常、例えば３〜２００μｌを用いて
上記反応系によって反応を行うもので、反応温度として
は例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反
応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイ
ント法では、例えば１〜６０分間、好ましくは１〜１０
分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われてい
る時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２３】まず、反応によって生成されたＡＭＰは、
簡便には、例えば通常の液体クロマトグラフィー法で測
定すればよい。また酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類から
形成された還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種
々の方法により測定することができるが、通常、簡便か
つ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行
われる。測定波長は還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の種
類によって適宜選択され、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型
３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノＮＡＤ
（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡ
Ｄ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍ付近の波長が選択される。
また還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法と
して、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロ
ブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩
を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート
（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の
作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザ
ン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還
元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
簡便には、例えば通常の液体クロマトグラフィー法で測
定すればよい。また酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類から
形成された還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種
々の方法により測定することができるが、通常、簡便か
つ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行
われる。測定波長は還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の種
類によって適宜選択され、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型
３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノＮＡＤ
（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡ
Ｄ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍ付近の波長が選択される。
また還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法と
して、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロ
ブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩
を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート
（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の
作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザ
ン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還
元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
【００２４】また、被検液中の１，５−ＡＧがごく微量
でそのリン酸化生成物（１，５ＡＧ６Ｐ）も極微量であ
る場合、下記反応式
でそのリン酸化生成物（１，５ＡＧ６Ｐ）も極微量であ
る場合、下記反応式
【００２５】
【化６】
【００２６】
【化７】
【００２７】（式中Ａ１は酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）また
は酸化型ＮＡＤ（Ｐ）のいずれか１種を示し、Ａ２はＡ
１の還元生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）を、Ａ１が酸化型Ｎ
ＡＤ（Ｐ）のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）を示し、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示す。）に示す原理にていわ
ゆる酵素サイクリング反応を形成せしめ、該反応によっ
て変化するＡ２またはＢ１の量を測定することで１，５
ＡＧを高感度に定量することができる。なお、還元型Ｎ
ＡＤ（Ｐ）は波長３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）は波長４０５ｎｍ付近での吸光度により定量する
ことができ、この特徴に基づいてこれらを定量するもの
である。
は酸化型ＮＡＤ（Ｐ）のいずれか１種を示し、Ａ２はＡ
１の還元生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）を、Ａ１が酸化型Ｎ
ＡＤ（Ｐ）のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）を示し、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示す。）に示す原理にていわ
ゆる酵素サイクリング反応を形成せしめ、該反応によっ
て変化するＡ２またはＢ１の量を測定することで１，５
ＡＧを高感度に定量することができる。なお、還元型Ｎ
ＡＤ（Ｐ）は波長３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）は波長４０５ｎｍ付近での吸光度により定量する
ことができ、この特徴に基づいてこれらを定量するもの
である。
【００２８】この酵素サイクリング反応においては酵素
反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液、例えばトリ
ス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノール
アミン緩衝液、グッド緩衝液などで例えばｐＨ８〜１
１、好ましくは９．５〜１０．５が用いられる、還元型
ＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．０１〜０．１ｍＭ、酸化型
チオＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．５〜５ｍＭ、１，５Ａ
Ｇ６ＰＤＨ量は例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度で適
宜ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 などの無機塩を例えば０〜１００
ｍＭの濃度加えて行ってもよい。反応温度としては例え
ば５〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃の反応温度条件
で行えばよく、反応時間しては例えば０．５〜６０分程
度で行えばよい。
反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液、例えばトリ
ス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノール
アミン緩衝液、グッド緩衝液などで例えばｐＨ８〜１
１、好ましくは９．５〜１０．５が用いられる、還元型
ＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．０１〜０．１ｍＭ、酸化型
チオＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．５〜５ｍＭ、１，５Ａ
Ｇ６ＰＤＨ量は例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度で適
宜ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 などの無機塩を例えば０〜１００
ｍＭの濃度加えて行ってもよい。反応温度としては例え
ば５〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃の反応温度条件
で行えばよく、反応時間しては例えば０．５〜６０分程
度で行えばよい。
【００２９】また、被検液中にグルコースが共存するす
る場合は１，５ＡＧに対して作用せずグルコースに特異
性を有する酵素を用いてグルコースを消去した後に１，
５ＡＧの測定を行うことが好ましい。具体的に説明する
と、 １、グルコースオキシダーゼまたはグルコースオキシダ
ーゼおよびカタラーゼ ２、グルコースデヒドロゲナーゼ ３、ヘキソキナーゼ ４、グルコキナーゼ などが挙げられ、好適にはグルコースオキシダーゼおよ
びカタラーゼを用いた消去方法がよい。消去反応を効率
よく行うためにムタロターゼを添加してもよい。添加す
る酵素量としては例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ、好ま
しくは１〜１００Ｕ／ｍｌである。また、上記酵素の反
応生成物を消費する酵素をさらに添加してもよい。
る場合は１，５ＡＧに対して作用せずグルコースに特異
性を有する酵素を用いてグルコースを消去した後に１，
５ＡＧの測定を行うことが好ましい。具体的に説明する
と、 １、グルコースオキシダーゼまたはグルコースオキシダ
ーゼおよびカタラーゼ ２、グルコースデヒドロゲナーゼ ３、ヘキソキナーゼ ４、グルコキナーゼ などが挙げられ、好適にはグルコースオキシダーゼおよ
びカタラーゼを用いた消去方法がよい。消去反応を効率
よく行うためにムタロターゼを添加してもよい。添加す
る酵素量としては例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ、好ま
しくは１〜１００Ｕ／ｍｌである。また、上記酵素の反
応生成物を消費する酵素をさらに添加してもよい。
【００３０】
【発明の実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【００３１】
【参考例１】 ＜ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２０ｍＭ グルコース ２ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ） ０．０２５％ ＮＢＴ １ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ １％ トリトンＸ−１００ ５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） 測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．
０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応
後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５
分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として
酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操
作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の
吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａ
ｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３
７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる
酵素量とし、計算式は下記の通りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×
酵素の希釈倍率 ＜ＡＤＰ−ＨＫの取得＞ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６
３８の培養培地組成 ０．１％ 酵母エキス ０．５％ トリプトン ０．７２％ マルトース ２．３９％ ＮａＣｌ ０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4 ０．０７％ ＫＣｌ ０．０２％ ＮａＨＣＯ3 ０．０１％ ＫＢｒ ０．０３％ Ｈ3ＢＯ4 １．０８％ ＭｇＣｌ2 ０．１５％ ＣａＣｌ2 ０．００２５％ ＳｒＣｌ2 ０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ ０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ ０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3 ０．０００５％ ＭｎＳＯ4 ０．００１４％ ＦｅＳＯ4 ０．０００２％ ＮｉＣｌ2 ０．０００１％ ＣｏＳＯ4 ０．０００１％ ＺｎＳＯ4 ０．００００１％ ＣｕＳＯ4 ０．０００００１％ Ｎａ2 Ｗｏ4 ０．０００００１％ Ｎａ2 Ｍｏ4 ０．１％ システイン塩酸塩 上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５
００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２
０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１
０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培
養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２
００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植
し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ
／ｍｌの培養液２００ｌを得た。 ＜ＡＤＰ−ＨＫの精製＞得られた培養液２００ｌを遠心
分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄
した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波
破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８
０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応
後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５
分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として
酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操
作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の
吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａ
ｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３
７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる
酵素量とし、計算式は下記の通りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×
酵素の希釈倍率 ＜ＡＤＰ−ＨＫの取得＞ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６
３８の培養培地組成 ０．１％ 酵母エキス ０．５％ トリプトン ０．７２％ マルトース ２．３９％ ＮａＣｌ ０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4 ０．０７％ ＫＣｌ ０．０２％ ＮａＨＣＯ3 ０．０１％ ＫＢｒ ０．０３％ Ｈ3ＢＯ4 １．０８％ ＭｇＣｌ2 ０．１５％ ＣａＣｌ2 ０．００２５％ ＳｒＣｌ2 ０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ ０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ ０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3 ０．０００５％ ＭｎＳＯ4 ０．００１４％ ＦｅＳＯ4 ０．０００２％ ＮｉＣｌ2 ０．０００１％ ＣｏＳＯ4 ０．０００１％ ＺｎＳＯ4 ０．００００１％ ＣｕＳＯ4 ０．０００００１％ Ｎａ2 Ｗｏ4 ０．０００００１％ Ｎａ2 Ｍｏ4 ０．１％ システイン塩酸塩 上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５
００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２
０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１
０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培
養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２
００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植
し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ
／ｍｌの培養液２００ｌを得た。 ＜ＡＤＰ−ＨＫの精製＞得られた培養液２００ｌを遠心
分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄
した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波
破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８
０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【００３２】この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠
心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得
た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透
析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）
のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジ
エントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モ
ルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出され
た。
心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得
た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透
析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）
のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジ
エントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モ
ルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出され
た。
【００３３】この得られた活性画分に４Ｍとなるように
ＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈ
ｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社
製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、
４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を
行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣ
ｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得られ
た活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌ
に５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペ
ンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカ
ラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結
果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画
分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥し
て５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
ＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈ
ｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社
製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、
４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を
行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣ
ｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得られ
た活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌ
に５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペ
ンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカ
ラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結
果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画
分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥し
て５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３４】ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通り
であった。 ＜ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質＞ （１）酵素作用 基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
であった。 ＜ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質＞ （１）酵素作用 基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【００３５】
【化８】
【００３６】（２）基質特異性 基質特異性を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】（３）分子量 トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３
０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−Ｈ
Ｋの分子量は１０００００±５０００であった。 （４）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）
であった。
０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−Ｈ
Ｋの分子量は１０００００±５０００であった。 （４）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）
であった。
【００３９】（５）至適温度は８０〜１００℃であるこ
とから高度好熱性酵素と認められた。
とから高度好熱性酵素と認められた。
【００４０】
【参考例２】 ＜１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌の培養＞エシェリヒア・コ
リ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の培養培地組成 ０．５％ 肉エキス １．５％ ソルビトール １．０％ トリプトン １．５％ ビール酵母エキス 上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５０ｍｌを
３００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２
０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア．コリＤ
Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の菌体懸濁液１ｍｌを移植
し、攪拌させながら、３０℃で１５時間培養し、種培養
液とした。上記培地成分と消泡剤ＦＳアンチフォーム０
２８（ダウコーニング社製）を０．３％含む液体培地５
ｌを１０ｌ容ジャー２ヶにおいて滅菌した後に種培養液
を移植し、３７℃で培養液のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで
６．５以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら２
４時間培養し、培養力価１５ｍＵ／ｍｌの培養液１０ｌ
を得た。 ＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの精製＞得られた培養液１０ｌを
遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して
１．２ｌに調整し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ・
Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行い、
菌体破砕液を得た。
リ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の培養培地組成 ０．５％ 肉エキス １．５％ ソルビトール １．０％ トリプトン １．５％ ビール酵母エキス 上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５０ｍｌを
３００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２
０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア．コリＤ
Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の菌体懸濁液１ｍｌを移植
し、攪拌させながら、３０℃で１５時間培養し、種培養
液とした。上記培地成分と消泡剤ＦＳアンチフォーム０
２８（ダウコーニング社製）を０．３％含む液体培地５
ｌを１０ｌ容ジャー２ヶにおいて滅菌した後に種培養液
を移植し、３７℃で培養液のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで
６．５以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら２
４時間培養し、培養力価１５ｍＵ／ｍｌの培養液１０ｌ
を得た。 ＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの精製＞得られた培養液１０ｌを
遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して
１．２ｌに調整し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ・
Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行い、
菌体破砕液を得た。
【００４１】この破砕液を透析チューブを用いて５０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｌに対して
５℃で一夜透析した後、８０００ｒｐｍ、６０分間遠心
分離し、１．０ｌ（酵素活性１２０Ｕ）の上清を得た。
この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＦＦ
（ファルマシア社製）１２００ｍｌ（２．６×３８ｃ
ｍ）のカラムに通し、０〜０．２５ＭのＮａＣｌのリニ
アグラジエントで溶出を行った。その結果、約０．１５
ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（７５Ｕ）が溶出された。
この得られた活性画分に３ＭとなるようにＮａＣｌを溶
解し、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５），
３Ｍ ＮａＣｌで平衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ・ＣＬ４Ｂ（ファルマシア社製）５００ｍｌ
（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、２．５〜０Ｍの
ＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｌに対して
５℃で一夜透析した後、８０００ｒｐｍ、６０分間遠心
分離し、１．０ｌ（酵素活性１２０Ｕ）の上清を得た。
この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＦＦ
（ファルマシア社製）１２００ｍｌ（２．６×３８ｃ
ｍ）のカラムに通し、０〜０．２５ＭのＮａＣｌのリニ
アグラジエントで溶出を行った。その結果、約０．１５
ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（７５Ｕ）が溶出された。
この得られた活性画分に３ＭとなるようにＮａＣｌを溶
解し、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５），
３Ｍ ＮａＣｌで平衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ・ＣＬ４Ｂ（ファルマシア社製）５００ｍｌ
（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、２．５〜０Ｍの
ＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。
【００４２】その結果、約１．２ＭのＮａＣｌ濃度で活
性画分（５０Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を
２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で、一夜透析した
後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝
化したＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社
製）５０ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０
〜１ＭのＮａＣｌ、２０％エチレングリコールのリニア
グラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．６
ＭのＮａＣｌ、１２％エチレングリコールの濃度で活性
画分（３０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分を
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一夜透析
した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で
緩衝化したＲｅｓｏｕｒｃｅ・Ｑ（ファルマシア社製）
６ｍｌのカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニ
アグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．
１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（２８Ｕ）が得られ、
均質な酵素標品を得た。 ＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの理化学的性質＞ （１）作用 １，５ＡＧ６Ｐを補酵素の存在下脱水素し、組成式（Ｃ
6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）の化合物とする下記の反応式
性画分（５０Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を
２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で、一夜透析した
後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝
化したＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社
製）５０ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０
〜１ＭのＮａＣｌ、２０％エチレングリコールのリニア
グラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．６
ＭのＮａＣｌ、１２％エチレングリコールの濃度で活性
画分（３０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分を
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一夜透析
した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で
緩衝化したＲｅｓｏｕｒｃｅ・Ｑ（ファルマシア社製）
６ｍｌのカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニ
アグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．
１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（２８Ｕ）が得られ、
均質な酵素標品を得た。 ＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの理化学的性質＞ （１）作用 １，５ＡＧ６Ｐを補酵素の存在下脱水素し、組成式（Ｃ
6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）の化合物とする下記の反応式
【００４３】
【化９】
【００４４】で表される反応を触媒する。また上記反応
において、１，５ＡＧ６Ｐを２５ｍＭとして用いた場
合、補酵素としての酸化型ＮＡＤＰに対するＫｍ値は
０．０９ｍＭであり、酸化型ＮＡＤに対するＫｍ値は
２．４ｍＭであり、酸化型チオＮＡＤＰに対するＫｍ値
は０．０８ｍＭであり、さらに酸化型チオＮＡＤも補酵
素として作用する。（２）力価の測定法 １，５ＡＧ６ＰＤＨの酵素活性測定法 測定試薬 ５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） １ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ５ｍＭ １，５ＡＧ６Ｐ （ＣＡＰＳ：Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕ− ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ） 測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５
分間予備加温した後、０．０１ｍｌの酵素液添加後０．
５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素
液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この
吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）よ
り酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以
上になる時は酵素液を５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ１０．０）で希釈して測定するものとする。
酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型Ｎ
ＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りで
ある。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×１６．０×酵
素の希釈倍率 （３）基質特異性 上記力価測定法を利用して、その反応液中の１，５ＡＧ
６Ｐの代わりに、種々の基質を用いて、１，５ＡＧ６Ｐ
に対する相対活性を求めた結果を表２に示す。
において、１，５ＡＧ６Ｐを２５ｍＭとして用いた場
合、補酵素としての酸化型ＮＡＤＰに対するＫｍ値は
０．０９ｍＭであり、酸化型ＮＡＤに対するＫｍ値は
２．４ｍＭであり、酸化型チオＮＡＤＰに対するＫｍ値
は０．０８ｍＭであり、さらに酸化型チオＮＡＤも補酵
素として作用する。（２）力価の測定法 １，５ＡＧ６ＰＤＨの酵素活性測定法 測定試薬 ５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） １ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ５ｍＭ １，５ＡＧ６Ｐ （ＣＡＰＳ：Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕ− ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ） 測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５
分間予備加温した後、０．０１ｍｌの酵素液添加後０．
５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素
液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この
吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）よ
り酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以
上になる時は酵素液を５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ１０．０）で希釈して測定するものとする。
酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型Ｎ
ＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りで
ある。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×１６．０×酵
素の希釈倍率 （３）基質特異性 上記力価測定法を利用して、その反応液中の１，５ＡＧ
６Ｐの代わりに、種々の基質を用いて、１，５ＡＧ６Ｐ
に対する相対活性を求めた結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
【００４６】その結果、この酵素は少なくとも１，５Ａ
Ｇ６Ｐに基質特異性を示した。 （３）至適ｐＨ ｐＨ７．０〜９．０は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（□−
□）、ｐＨ９．５〜１０．５は５０ｍＭのＣＡＰＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。至適ｐＨは９〜１０
付近であり、結果を図１に示した。
Ｇ６Ｐに基質特異性を示した。 （３）至適ｐＨ ｐＨ７．０〜９．０は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（□−
□）、ｐＨ９．５〜１０．５は５０ｍＭのＣＡＰＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。至適ｐＨは９〜１０
付近であり、結果を図１に示した。
【００４７】（４）ｐＨ安定性 ｐＨ４．０〜５．５はクエン酸緩衝液（○−○）、ｐＨ
５．５〜７．０はビストリス塩酸緩衝液（●−●）、ｐ
Ｈ７．０〜９．０はトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ
９．５〜１１．０はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−
■）を用いた。５０℃、３０分処理でｐＨ６〜９におい
て安定であり、結果を図２に示した。
５．５〜７．０はビストリス塩酸緩衝液（●−●）、ｐ
Ｈ７．０〜９．０はトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ
９．５〜１１．０はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−
■）を用いた。５０℃、３０分処理でｐＨ６〜９におい
て安定であり、結果を図２に示した。
【００４８】（５）至適温度 上記の力価測定法における測定法を利用して、その温度
条件を変えて酵素反応を行った結果は図３に示す通りで
あって、その至適温度は３７〜５０℃であった。 （６）熱安定性 １，５ＡＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌを含有して成る５０ｍ
Ｍ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を各温度
に３０分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、
１，５ＡＧ６ＰＤＨの残存活性を測定した結果、図４に
示す通りであって、酵素は４５℃付近までは安定であっ
た。
条件を変えて酵素反応を行った結果は図３に示す通りで
あって、その至適温度は３７〜５０℃であった。 （６）熱安定性 １，５ＡＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌを含有して成る５０ｍ
Ｍ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を各温度
に３０分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、
１，５ＡＧ６ＰＤＨの残存活性を測定した結果、図４に
示す通りであって、酵素は４５℃付近までは安定であっ
た。
【００４９】（７）種々の物質による影響 上記の力価測定法において、種々の添加物を加えて、
１，５ＡＧ６ＰＤＨの１，５ＡＧ６Ｐに対する酵素活性
を測定した結果を表３に示す。
１，５ＡＧ６ＰＤＨの１，５ＡＧ６Ｐに対する酵素活性
を測定した結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】（８）分子量 ７８０００±６０００（ＴＳＫｇｅｌ・Ｇ３０００ＳＷ
ＸＬ（東ソー製）ゲル濾過法による） （９）等電点 ４．７±０．５（キャリアアンフォライトｐＨ３．５−
ｐＨ１０（ファルマシア製）を用いる電気泳動法により
測定） （１０）Ｋｍ値 １，５ＡＧ６Ｐに対するＫｍ値：２５ｍＭ （１１）作用機序確認試験 １，５ＡＧ６Ｐ、（酸化型）ＮＡＤＰ、トリエチルアミ
ン重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１，５ＡＧ６ＰＤＨ
を含む反応液を３７℃、８時間反応せしめる。１，５Ａ
Ｇ６Ｐに生成したカルボニル基を２，４−ジニトロフェ
ニルヒドラジンとＨＣｌを加えて反応せしめヒドラゾン
として分離し、マススペクトルを測定することで生成物
が組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）で表されるものであるこ
とが確認された。
ＸＬ（東ソー製）ゲル濾過法による） （９）等電点 ４．７±０．５（キャリアアンフォライトｐＨ３．５−
ｐＨ１０（ファルマシア製）を用いる電気泳動法により
測定） （１０）Ｋｍ値 １，５ＡＧ６Ｐに対するＫｍ値：２５ｍＭ （１１）作用機序確認試験 １，５ＡＧ６Ｐ、（酸化型）ＮＡＤＰ、トリエチルアミ
ン重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１，５ＡＧ６ＰＤＨ
を含む反応液を３７℃、８時間反応せしめる。１，５Ａ
Ｇ６Ｐに生成したカルボニル基を２，４−ジニトロフェ
ニルヒドラジンとＨＣｌを加えて反応せしめヒドラゾン
として分離し、マススペクトルを測定することで生成物
が組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）で表されるものであるこ
とが確認された。
【００５２】
【実施例１】 ＜マグネシウムイオンを用いたときの１，５ＡＧの定量＞ 測定試薬１ ５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） １０．５ｍＭ ＡＤＰ １０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ 測定試薬２ ２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０１２％ ＮＴＢ １１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） ３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ 測定方法 １，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍ
Ｍの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。
測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．
０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２
を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１
ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの
吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに蒸留水を用いた
ものを対象に測定した。図５に示す通り、１，５ＡＧが
定量的に測定できた。
Ｍの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。
測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．
０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２
を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１
ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの
吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに蒸留水を用いた
ものを対象に測定した。図５に示す通り、１，５ＡＧが
定量的に測定できた。
【００５３】
【実施例２】 ＜マンガンイオンを用いたときの１，５ＡＧの定量＞ 測定試薬１ ５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） １０．５ｍＭ ＡＤＰ １０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ 測定試薬２ ２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０１２％ ＮＴＢ １１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） ３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ 測定方法 １，５ＡＧを１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，６ｍＭ，８．４
ｍＭ，１２ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプル
を作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧ
サンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温
後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間
加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止
後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わり
に蒸留水を用いたものを対象に測定した。図６に示す通
り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
ｍＭ，１２ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプル
を作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧ
サンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温
後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間
加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止
後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わり
に蒸留水を用いたものを対象に測定した。図６に示す通
り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５４】
【実施例３】 ＜サイクリング反応を用いた１，５ＡＧの測定＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ２ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ ４０ｍＭ ＫＣｌ ０．０５ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ ３ｍＭ 酸化型チオＮＡＤＰ １Ｕ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ 測定方法 １，５ＡＧを０．１ｍＭ、０．５ｍＭ，１．２５ｍＭ、
２．５ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作
製した。測定試薬０．９９ｍｌに１，５ＡＧサンプル
０．０１ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、の４０５
ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図７に
示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
２．５ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作
製した。測定試薬０．９９ｍｌに１，５ＡＧサンプル
０．０１ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、の４０５
ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図７に
示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５５】
【実施例４】 ＜グルコースの消去系を組み合わせた１，５ＡＧの測定
＞ 測定試薬１ ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５） １００Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ ５０Ｕ／ｍｌ カタラーゼ 測定試薬２ ２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ４ｍＭ ＡＤＰ ５０ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ ２ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ４ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ １０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） ０．０５％ ＮＴＢ ２．０％ トリトンＸ−１００ 測定法 グルコース２ｍＭを含む、１，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍ
Ｍ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，
５ＡＧのサンプルを作製した。測定試薬１の０．５ｍｌ
に１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、
５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７
℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、
反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプル
の代わりに、蒸留水を用いたものを対照に測定した。図
８に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
＞ 測定試薬１ ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５） １００Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ ５０Ｕ／ｍｌ カタラーゼ 測定試薬２ ２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ４ｍＭ ＡＤＰ ５０ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ ２ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ４ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ １０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） ０．０５％ ＮＴＢ ２．０％ トリトンＸ−１００ 測定法 グルコース２ｍＭを含む、１，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍ
Ｍ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，
５ＡＧのサンプルを作製した。測定試薬１の０．５ｍｌ
に１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、
５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７
℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、
反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプル
の代わりに、蒸留水を用いたものを対照に測定した。図
８に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５６】
【実施例５】 ＜マグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞ 測定試薬１ ５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ １，５ＡＧ １０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ 測定試薬２ ２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０１２％ ＮＴＢ １１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） ３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ 測定方法 ＡＤＰを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの
水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定
試薬１を０．４７５ｍｌにＡＤＰサンプル０．０２５ｍ
ｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５
ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣ
ｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を
ＡＤＰサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に
測定した。図９に示す通り、ＡＤＰが定量的に測定でき
た。
水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定
試薬１を０．４７５ｍｌにＡＤＰサンプル０．０２５ｍ
ｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５
ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣ
ｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を
ＡＤＰサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に
測定した。図９に示す通り、ＡＤＰが定量的に測定でき
た。
【００５７】
【参考例３】 ＜マグネシウムイオンを用いた時のグルコースの定量＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２ｍＭ ＡＤＰ １０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ １ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ 測定方法 グルコースを０．４ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭの水
溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試
薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランク
を対照に測定した。図１０に示すようにグルコースが定
量的に測定できた。
溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試
薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７
℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランク
を対照に測定した。図１０に示すようにグルコースが定
量的に測定できた。
【００５８】
【参考例４】＜マンガンイオンを用いたときのグルコー
スの定量＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２ｍＭ ＡＤＰ １０Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ １ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ２ｍＭ ＭｎＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ 測定方法 グルコースを０．４８ｍＭ，１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，
４．８ｍＭの水溶液に調製し、グルコースサンプルを作
製した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５
ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光
度を試薬ブランクを対照に測定した。図１１に示す通
り、グルコースが定量的に測定できた。
スの定量＞ 測定試薬 ５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２ｍＭ ＡＤＰ １０Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ １ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ ２ｍＭ ＭｎＣｌ2 １０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ 測定方法 グルコースを０．４８ｍＭ，１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，
４．８ｍＭの水溶液に調製し、グルコースサンプルを作
製した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５
ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光
度を試薬ブランクを対照に測定した。図１１に示す通
り、グルコースが定量的に測定できた。
【００５９】
【発明の効果】本発明の測定方法では、１，５ＡＧまた
はＡＤＰの新規な測定法を提供でき、本発明によれば、
生体試料中の１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便にして高精
度で測定することができる。
はＡＤＰの新規な測定法を提供でき、本発明によれば、
生体試料中の１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便にして高精
度で測定することができる。
【図１】図１は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの
至適ｐＨを示す。
至適ｐＨを示す。
【図２】図２は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの
ｐＨ安定性を示す。
ｐＨ安定性を示す。
【図３】図３は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの
至適温度を示す。
至適温度を示す。
【図４】図４は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの
熱安定性を示す。
熱安定性を示す。
【図５】図５は、本発明によってマグネシウムイオンを
用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図６】図６は、本発明によってマンガンイオンを用い
たときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
たときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図７】図７は、本発明によってサイクリング反応を用
いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図８】図８は、本発明によってグルコースの消去系を
用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図９】図９は、本発明によってマグネシウムイオンを
用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示す。
用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示す。
【図１０】図１０は、本発明によってマグネシウムイオ
ンを用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
ンを用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
【図１１】図１１は、本発明によってマンガンイオンを
用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
Claims (7)
- 【請求項１】 １，５アンヒドログルシトールおよびＡ
ＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５アン
ヒドログルシトールおよびＡＤＰのいずれか残りの成分
および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応に
よって生成される１，５アンヒドログルシトール６リン
酸またはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５アン
ヒドログルシトールまたはＡＤＰの測定法。 【化１】 - 【請求項２】 酵素蛋白が、高度好熱性ＡＤＰ依存性ヘ
キソキナーゼである請求項１記載の測定法。 - 【請求項３】 生成される１，５アンヒドログルシトー
ル６リン酸の定量において、１，５アンヒドログルシト
ール６リン酸デヒドロゲナーゼおよび補酵素を作用せし
め、次いで反応によって消費された成分または生成され
た成分を測定することを特徴とする請求項１記載の測定
法。 - 【請求項４】 補酵素が、酸化型（チオ）ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類である請求項３
記載の測定法。 - 【請求項５】 酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（リン酸）類が、酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（リン酸）または酸化型チオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である
請求項４記載の測定法。 - 【請求項６】 生成された成分が、酸化型（チオ）ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類から形
成された還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（リン酸）類である請求項３記載の測定法。 - 【請求項７】 還元型（チオ）ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（リン酸）類が、還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（リン酸）または還元型チオニ
コチアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である請
求項６記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00632197A JP4140929B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00632197A JP4140929B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191998A true JPH10191998A (ja) | 1998-07-28 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00632197A Expired - Fee Related JP4140929B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4140929B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2006134870A1 (ja) | 2005-06-13 | 2006-12-21 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血を用いる血液成分測定方法及び測定キット |
| JP2007518094A (ja) * | 2004-01-16 | 2007-07-05 | エムディエス・ファーマ・サーヴィシーズ | 蛍光に基づくａｄｐの検出システム |
| WO2008072702A1 (ja) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血中の１，５－アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| WO2011126036A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-13 | 株式会社シノテスト | クレアチンキナーゼ活性の測定試薬 |
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-
1997
- 1997-01-17 JP JP00632197A patent/JP4140929B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| J. BIOL. CHEM., vol. Vol.269(26), JPN6008020195, 1994, pages 17537 - 17541, ISSN: 0001061386 * |
| J. BIOL. CHEM., vol. Vol.269(26), JPNX006056864, 1994, pages 17537 - 17541, ISSN: 0000793778 * |
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| JP5982608B2 (ja) * | 2010-03-31 | 2016-08-31 | 株式会社シノテスト | クレアチンキナーゼ活性の測定試薬 |
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