JPH0327299A - グルコースを含有する試料中の１，５―アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は糖尿病の診断マーカーとして有用な１、５−ア
ンヒドログルシトール（以下ＡＧという）の定量法に関
する。

（従来の技術〉 ＡＧはヒ１へ体液中に含まれ糖尿病の診断マーカーとし
て有用であるが、その存在量は少なくアセチル化等の前
処理をしてガスクロマ１・グラフィにより定量するか、
試料をイオン交換樹脂等で処理して多量に存在するグル
コースを除去してからＡＧを酵素的方法で定量していた
。

（発明が解決すべき課題） しかし従来の技術では前処理が繁雑で時間がかかり、ま
た機器の保守、管理のため分析試料数に制限があるため
、より簡便にグルコースを除去できかつＡＧを定量でき
る方法が要望されていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは研究の結果、試料中のグルコー又をグルコ
キナーゼ、ヘキソキナーゼの様なグルコース６位リン酸
化酵素とアデノシン３リン酸（以下ＡＴＰという〉でグ
ルコース６リン酸（以下Ｇ６Ｐという）とし、これを更
にＧ６Ｐ脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（酸化型以−ｙ；’ＮＡｐｐという）で酸
化するεグルコースを完全に消去しうること、そして生
じたＮＡＤＰの還元型（以下ＮＡＤＰＨという）はＡＧ
の酵素的定量に際［７影饗するのでこの消去液にＮＡＤ
ＰＨを補酵素とずる酸化還元酵素並びに該酸化還元酵素
の基質を加えて反応さぜてるか、ＮＡＤＰＨ脱水素酵素
でＮＡＤＰ｝Ｉを酸化しｌ．：後であれば試料中のＡＧ
をＡＧ酸化酵素を用いて測定できることを見出だした。

即ち本発明はグルコース及びＡＧを含有ずる試料ノ＼グ
ルコース６位リン酸ＩＬ酵素（以下Ｇ６Ｐ化酵素という
），ＡＴＰ，Ｇ６Ｐ脱水酵素、ＮＡＤＰ及び（１）ＮＡ
ＤＰＨを補酵素とする酸化還元酵素並びに該酸化還元酵
素の基質又は（２）ＮＡＤＰＩ−｛脱水素酵素を添加、
反応してグルコース及び生或するＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを
消去して後、該試料中の六〇をＡＧ酸化酵素を用いて定
量することを特徴とするグルコース及びＡＧを含有する
試料中のＡＧの定量法に関する。

本発明で用いられる試料と１〜では、ＡＧ及びグルコー
スを含むことが予測されるものなら特に制限は無く、例
えば血液、尿、髄液などの体液や、植物、動物組織など
の抽出物およびそれらの除蚤白物などがあげられる。

本発明で用いられるＧ６Ｐ化酵素εしては、グルコキナ
ーゼ、ヘキソキナーゼなどがあげられる。これらの酵素
及び本発明で用いられるＧ６Ｐ脱水素酵素はｌＵＰＡＣ
−ＩＵＢの命名法で、それぞれ［２．７．１．１］．［
２．７．１、２．］，［１．１．１．４９３と分類しう
るものであれば、特に制限は無く市販のものを使用しう
る。それらの使用量は試料中のグルコース量により異な
るが、概ね試料Ｏ．ｌｍｌあたり０．１〜１０単位であ
る。

グルコースのリン酸化に必要なＡＴｆ）量は試料中のグ
ルコース量により異なるが、通常１−・１０ｍＭで良い
。

Ｇ６Ｐ脱水素酵素による反応に必要なＮＡＤＰ量は試料
中のグルコース量により異なるが通常１−　１０ｒｒｔ
Ｍで良い。

本発明で用いられるＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを酸化する酵素
はＮＡＤＰＨを補酵素とする酸化還元酵素及びＮＡＤＰ
Ｈに直接作用する脱水素酵素であり、代表的なものとし
てはそれぞれグルタミン酸脱水素酵素［１．４．１．．
３］　，［１．４．１．４］及びＮＡＤＰＨ脱水素酵素
［１．６．９９．１］，［１．６．９９．２］があげら
れる。それらの使用量は試料０．１ｒｎｌあたり通常０
．１〜１０単位である。ＮＡＤＰＨを補酵素とする酸化
還元酵素を用いる反応には被還元基質が必要であり、例
えばグルタミン酸脱水素酵素の場合は２−ケ１−グルタ
ル酸と塩化アンモニューｊ８の様なアンモニューム塩が
試料０．ｌｍｌ辺りそれぞれ１〜５　０　ｍ　Ｍ及び１
〜１　０　０　ｒｒｔ　Ｍ程度の濃度で用いられる。

Ｇ６Ｐ化反応及びＧ６Ｐ脱水素反応の際には反応を促進
する１．め、塩化力リューム及び酢酸マグネシコー−ム
の様なカリューム、マグネシュームの無機、有機塩類を
添加することが望ましくそれぞれ通常１〜５０ｍＭの濃
度で用いられる。

Ｇ６Ｐ化反応、Ｇ６Ｐ脱水素反応及びＮＡＤＰ■」消去
反応は通常］〜５０ｒｎＭ，ｐＨ６〜ＩＯのバッファ一
中で２０〜５０　　Ｃ、望ましくは２５〜３７　　Ｃで
５〜１０分程度行われる。使用できるバッファーとして
は、リン酸バッファ一、１〜リス塩酸バッファ一等があ
る。

上記各試薬の試料ｌ＼の添加順序は特に制限は無いが通
常、酵素以外の必要成分を試料へ加え次いで酵素混合液
を添加して反応を開始する。

この様にして前処理した試料中のＡＧを酵素を用いて測
定するにはビラノースオキシダーゼ［】．１．３．１０
］あるいはＡＧ酸化酵素を用いる公知の方法、例えばビ
ラノースオキシダーゼを作用させて生ずる過酸化水素を
指標とした定量法に関する特開昭６３−１８５３９７号
公報記載の方法や特開昭６２−７９７８０号公報記載の
方法で行うことができる。

（効果） 実験例Ｉ ＡＧを蒸溜水または２００ｍｇ／ｍｌの濃度のグルコー
ス水溶液で溶解して各種濃度のＡＧ標準液を調整した。

これらの試料を下に示す様に本発明の方法で処理後、Ａ
Ｇをピラノースオキシダーゼ（以下ＰＲＯＤ）で酸化し
、生じた過酸化水素をパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）
　、４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡ）及びＮ一
エチルーＮ一（２−ヒドロキシ・−３−スルフォプロビ
ル）ｒｎ　−　）・−ルイヂン（以下ＴＯＯＳ＞を用い
て発色して吸光度を測定Ｌ　ノ：：。グルコース水溶液
で調整したＡＧ標準液を直接Ｐ　Ｒ．　Ｏ　Ｄで酸化し
発色した場合及び下記の酵素液Ｂからグルタミン酸脱水
素酵素を除去し７″：もので処理した場合をそれぞれ参
考例１及び２として吸光度を測定１−た。

く方法〉 下記の組成の試薬液Ａ及び酵素液Ｂ，Ｃを調整した。２
．５ｒｎｔの試薬液ＡへＡＧ標準液０，１ｍｌと酵素液
Ｂ０。ｌｍｌを加え、３７　　Ｃで３Ｏ分反応後、酵素
液Ｃを０．３ｍｌ加え栄に６０分反応して５　５　５　
ｎ　ｍの吸光度をＪＩＪ定した。参考例１の場合は酵素
液Ｂからグルコース６リン酸脱水素酵素、参考例２の場
合は酵素液Ｂからグルタミン酸脱水素酵素をそれぞれ除
いえ＝酵素液を用いた。

試薬液Ａ １ヘリスー塩酸バッフ７−；　１０ｒｎＭ，ｐＨ９ＡＴ
Ｐ　　　　　　　　　・１　ｒｒｉＭＮＡＤＰ　　　　
　　　　・１ｍＭ 塩化マグネシスーム　　・２　０ｍＭ ２−ケ｝・グルタル酸　　；　１　０ｍＭ塩化アンモニ
ューム　　・２０ｍＭ 酵素液Ｂ リン酸バッファ一　　　；　］　ＯｒｎＭ，ｐＨ７グル
コキナーゼ　　　　：５０ｕ／ｍｌＧ６Ｐ脱水素酵素　
　　；３５ｕ／ｒｎｌグルタミン酸脱水素酵素；　６　
０　ｕ　／　ｍ　１酵素液Ｃ リン酸バッフ７−　　；　２００ｘｎＭ，ｐＨ５．６Ｐ
Ｆこ０［） ＨＲＰ ４　−ＡＡ ＴＯＯＳ ぐ結果〉処理方法、 ；２５ｕ／ｍｌ ；６ｕ／ｒｎｌ ；５ｍＭ ：５１ＴＩＭ ＡＧ濃度による発色度変化 （注）　八Ｇ／開：蒸溜水でＡＧを溶解した３，ＡＧ／
ＧＳ　：グルコース水溶液でＡＧを溶解した。

表の様にグルコースが共存しても本発明の方法によれば
、ＡＧ濃度と発亀度との間には良い直線関係がみられた
。一方、参考例１で直接ＰＲＯＤを用いて発色した場合
は過大な値となりＡＧの定量はできないことは明らかで
ある。まｆＳ９考例２の様にＮＡＤＰＨを消去しない場
合は発色が開，害されＡＧの測定は不可能である。

グルコキナーゼの代わりにヘキソキナーゼを用いて上と
同様の実験を行ったがＡＧの測定は可能であった。

実施例１ ヒ１−ｆｔ［ｌ清中のＡＧをａｌ１定ずるため、５種類
の血清をアミコン社製ＭＰＳ−センＩ・リフリーで除蛋
白した。除蛋白試料及び蒸溜水で溶解したＡＧ標準液を
実験例１の方法に準じて反応、発色しＡＧ標準液による
検量線がら血清中のＡＧ濃度を算出した。同時に除蛋白
試料を従来の方法であるガスクロマトグラフィー法（Ｄ
ｉａｂｅｔｅｓ　　３６．７０９〜・へ．７１５．１９
８７＞でＡ　Ｇ及びグルコース含量を８！１１定した。

く結果〉　本発明の方法とガスクロマ１〜グラフイー法
による血清中のＡＧ及びグルコース濃度表の如く本発明
の方法による結果は、従来の方法であるガスクロマ１・
グラフィーによる結果とほぼ近似し、良い相関を示しグ
ルコースを含む血清中のＡＧをａ（り定できた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. グルコース及び１，５−アンヒドログルシトールを含有
   する試料へグルコース６位リン酸化酵素、アデノシン３
   リン酸、グルコース６リン酸脱水素酵素、ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）及び（１）
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型
   ）を補酵素とする酸化還元酵素並びに該酸化還元酵素の
   基質又は（２）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   リン酸脱水素酵素を添加、反応してグルコース及び生成
   するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還
   元型）を消去して後、該試料中の１，５−アンヒドログ
   ルシトールを１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素
   を用いて定量することを特徴とするグルコース及び１，
   ５−アンヒドログルシトールを含有する試料中の１，５
   −アンヒドログルシトールの定量法