JPH0575397B2

JPH0575397B2 -

Info

Publication number: JPH0575397B2
Application number: JP60098282A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Kondo; Masao Kageyama
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1985-05-09
Filing date: 1985-05-09
Publication date: 1993-10-20
Also published as: EP0201333A2; EP0201333A3; JPS61257199A; US4812398A; EP0201333B1; DE3680381D1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、体液中のアミラーゼ活性測定用試薬
及び測定方法に関するものである。（従来の技術）アミラーゼは、唾液、膵液、尿、血清などの体
液中に存在する酵素である。臨床検査の領域にお
いてアミラーゼ活性は急性あるいは慢性の膵炎、
膵臓ガンなどの膵疾患、流行性耳下腺炎などの唾
液腺疾患、腎不全、慢性肝疾患、マクロアミラー
ゼ血症などの診断に日常的に測定されている重要
な項目の一つである。従来から、アミラーゼ活性を測定するには、以
下に示す種々の原理に基づく方法及び試薬が用い
られている。その測定原理は、大きく４大別する
ことができる。 (1) ヨード澱粉反応を利用するアミロクラスチツ
ク法。 (2) 澱粉から生成する還元糖量を測定するサツカ
ロゲニツク法。 (3) 色素結合澱粉からの遊離色素を測定するクロ
モゲニツク法。 (4) 澱粉（主としてアミロペクチン）による濁度
を測定する濁度法。上記４方法は、いずれも基質として澱粉あるい
は高分子量のアミロース又はアミロペクチンを使
用するものであるが、これらはその品質、性状が
一定せず、しかもアミラーゼによる鎖切断の数と
測定値との関係が不明確であるという根本的な欠
点を有している。そのうえ、(1)の方法は吸光度低
下測定法であるための分析精度が低いこと、(2)の
方法は煮沸操作が必要なこと及び生成するオリゴ
糖断切間に発色強度の差があること、(3)の方法は
反応時間が長いこと及び濾過あるいは遠心分離操
作が必要なこと、さらに(4)の方法は基質の均一化
が困難で、しかも直線範囲が狭いことなど種々の
欠点を有するものであつた。そこで、近年、これらの欠点を伴わない、特に
アミラーゼによる鎖切断回数と測定値との間の化
学量論的な関係が把握できる方法として、鎖長の
明確なオリゴ糖を基質とし、共役酵素を用いてア
ミラーゼ活性を測定する方法及び試薬が開発され
るに到つた。その測定方法を大別すると以下の３
種に分類できる。 (5) 鎖長の明確なオリゴ糖を基質とし、アミラー
ゼによる鎖切断後、共役酵素としてα−グルコ
シダーゼ（以下α−Glucと略記する。）あるい
はマルトースホスホリラーゼ（以下MPと略記
する。）を用いてグルコースを遊離させ、この
グルコースを公知の手段で測定する方法。 (6) 鎖長の明確なオリゴ糖を基質とし、アミラー
ゼによる鎖切断後、生成するマルトースを公知
の手段で測定する方法。 (7) Ｐ−ニトロフエニル基あるいは置換芳香族基
（アグリコン）を還元末端にグルコシド結合さ
せた鎖長の明確なオリゴ糖を基質とし、アミラ
ーゼによる鎖切断後、共役酵素としてグルコシ
ダーゼを作用させ、遊離したＰ−ニトロフエニ
ルあるいはアグリコンの可視部の吸収を測定す
る方法。しかしながら、(7)の方法は発色の不安定性（PH
や温度の変動による影響を受け易い）及びその再
現性が悪いという欠点の他に、基質自体が水溶液
中で一般的に不安定で、しかもアミラーゼによる
水解速度が対応するオリゴ糖自身に比べて遅いと
いう欠点もある。また、この方法では内部標準物
質を用いるという煩雑な操作を必要とする。さらに、近年、分析精度の向上に伴つて、体液
中のアミラーゼは、唾液腺由来アミラーゼ（以下
Ｓと略記する。）と膵液由来アミラーゼ（以下Ｐ
と略記する。）から成り立つていることが明らか
にされ、体液中のアミラーゼ活性を測定する際に
は両臓器由来のアミラーゼ間で差がない基質が望
まれるようになつた。この点において、公知文献
（クリニカルケミストリー、Clin.Chem、31巻
14頁、1985年）によれば、一般に置換基が還元末
端に導入されたオリゴ糖基質では、Ｐ活性／Ｓ活
性の比が対応するオリゴ糖基質に比べて大きい。
例えばＰ−ニトロフエニルマルトヘプタオースで
はＰ活性／Ｓ活性は1.72〜1.77であるが、対応す
るマルトヘプタオースではＰ活性／Ｓ活性は1.45
〜1.50である。また、マルトペンタオース（以下
G₅と略記する。）ではＰ活性／Ｓ活性は1.0と極め
て有利な基質である。このように、体液中のアミ
ラーゼ活性を測定する際には、鎖長の明確なオリ
ゴ糖を基質として使用することが有利と考えられ
る。以上述べてきた観点からは、鎖長の明確なオリ
ゴ糖を基質として用い、(5)及び(6)の方法を採用す
ることが体液中のアミラーゼ活性を測定するうえ
で、極めて有利であると考えられる。ところが、
体液中、特に臨床検査の対象となる血清及び尿中
にはグルコース（内因性グルコースと呼ばれる）
又はマルトース（近年の点滴治療によるマルトー
スで外因性マルトースと呼ばれる）が存在するた
め、反応中間体としてグルコース又はマルトース
を経る(5)及び(6)の方法では、測定値が高めに出る
という傾向がある。それゆえに、これらの方法で
はアミラーゼ活性測定に先立つて、あらかじめそ
れらを除去する必要がある。(5)及び(6)の方法及び
試薬では、この点を克服すべく種々の方策が施さ
れている。それらの方策のうち、酵素を用いない
ものとしてはゲル濾過などのカラムを用いる試薬
（カラム法）がある。一方、酵素を用いるものとしてはヘキソキナー
ゼ（以下HKと略記する。）を用いるもの及びグ
ルコースオキシダーゼ（以下GODと略記する。）
を用いるものがある（酵素法）。例えば、特開昭
55−34007号公報では、内因性グルコース及び外
因性マルトースの消去にα−Gluc，HK、グルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素（以下G6PDHと略
記する。）、乳酸脱水素酵素（以下LDHと略記す
る。）を用いており、また特開昭55−19097号公報
では上記系中のLDHをアミラーゼ活性測定時に
オキサミン酸で失活させる方法を採用している。
特開昭57−47495号公報では、内因性グルコース
をHKで除去し、アミラーゼ活性測定時にHKを
リポラン1400などの陰イオン界面活性剤で失活さ
せている。さらに、特開昭59−203500号公報で
は、内因性グルコースをムタロターゼ、GOD、
カタラーゼを用いる系で除去し、次いでアジ化ナ
トリウムでカタラーゼ反応を停止させている。（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、前記のカラム法は操作が煩雑で
日常検査には使用し難く、一方、上記酵素法でも
上記物質を用いても目的の反応が完全には停止し
ない、あるいは高濃度の上記物質を用いても反応
を停止させるのにかなりの時間を要するという欠
点があるのはもちろん、アミラーゼ活性測定値に
誤差が生じやすいという欠点があつた。上述したごとく、鎖長の明確なオリゴ糖は膵液
由来及び唾液腺由来の両アミラーゼによる作用点
の違いは少なく、しかもその水解速度はレート法
で反応を連続的に追跡するのに十分なほど速く、
アミラーゼ活性の基準化をするのに最も敵した基
質である。それゆえに、これらオリゴ糖を基質と
して用いる方法をより効果的にかつ恒常的に使用
するには、内因性グルコース又は外因性マルトー
スを効果的に除去する方法を組み合わせたアミラ
ーゼ活性測定法及び試薬の開発が強く望まれてい
る。すなわち、内因性グルコース又は外因性マル
トースが十分に除去でき、かつアミラーゼ活性測
定時にこれら除去系が瞬時、かつ完全に停止する
方法及び試薬を開発することが望まれている。（問題点を解決するための手段）本発明者らは、このような要求を満足する試薬
及び方法を種々検討した結果、ホスホグルコース
イソメラーゼ（以下PGIと略記する。）とホスホ
フルクトキナーゼ（以下PFKと略記する。）とで
内因性グルコース又は外因性マルトースの除去反
応を実施することにより、内因性グルコース又は
外因性マルトースの除去効率が飛躍的に向上し、
かつ糖あるいは糖酸のリン酸エステルをPGI活性
の阻害剤として添加すると、アミラーゼ活性測定
時にアミラーゼ活性及び他の共役酵素活性に何ら
影響を与えないという驚くべき知見を得て、本発
明を完成するに到つた。すなわち、本発明はオリゴ糖を基質として体液
中のアミラーゼ活性を測定する試薬において、α
−Gluc又はMP、グリコキナーゼ（以下Glckと
略記する。）G6PDH，PGI，PFK及びアデノシ
ン5′−三リン酸（以下ATPと略記する。）を含有
する第一試薬と、オリゴ糖及び糖あるいは糖のリ
ン酸エステルを含有する第二試薬とからなること
を特徴とする体液中のアミラーゼ活性測定用試薬
及びオリゴ糖を基質として体液中のアミラーゼ活
性を測定する方法において、α−Gluc又はMP，
Glck，G6PDH，PGI，PFK及びATPを含有す
る第一試薬で、体液中にあらかじめ存在するグル
コース又はグルコースとマルトースを除去した
後、オリゴ糖及び糖あるいは糖のリン酸エステル
を含有する第二試薬を添加し、PGI活性を停止せ
しめるとともに、体液中のアミラーゼの作用によ
り生成するオリゴ糖断片をα−Gluc又はMPを用
いてグルコースに変化させ、次いで変化させたグ
ルコースを第一試薬中のGlck及びG6PDHで測定
することを特徴とする体液中のアミラーゼ活性の
測定方法である。本発明の体液中のアミラーゼ活性測定用試薬
は、内因性グルコース又は外因性マルトースの除
去に係る試薬を第一試薬とし、アミラーゼの酵素
反応を行わせ、かつPGI活性の阻害に係る試薬を
第二試薬とすることが望まれる。第一試薬は、α−GlucあるいはMP，Glck，
G6PDH，PGI，PFK，ATP等が主成分であり、
その他に通常、促進剤、賦活剤等の添加剤なるも
のを含ませることができる。添加剤としては、例
えば硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマ
グネシウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム等
の塩化物、塩化カルシウム、硝酸カルシウム等の
カルシウム塩、Ｎ−アセチルシステイン、グルタ
チオン、２−アミノエチルチオウロニウム臭化
物、チオグリコール酸、システイン、メルカプト
エタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリス
リトール等のチオール化合物、エチレンジアミン
四酢酸ナトリウム又は防腐剤としてのアジ化ナト
リウム等公知のものを支障なく使用することがで
きる。さらに、安定化剤としては、例えばアルブ
ミン、γ−グロブリン等の蛋白質、ポリビニルア
ルコール、ポリエチレングリコール等の水溶性高
分子化合物を適宜使用することができる。第二試薬は、オリゴ糖、NAD（Ｐ）及び糖ある
いは糖酸のリン酸エステル等を主成分とするもの
であり、その他に上記の添加剤を支障なく使用す
ることができる。オリゴ糖としては、鎖長４〜８
のものが有利に使用できるが、特に有利なものは
G₅である。糖あるいは糖酸のリン酸エステルと
しては、例えばエリスロース−４−リン酸（以下
E4Pと略記する。）、６−ホスホグルコン酸（以下
6PGと略記する。）、５−ホスホアラビノン酸、４
−ホスホエリスロン酸等が使用できるが、PGI活
性への阻害の強さ、他の共役酵素活性及びアミラ
ーゼ活性への影響がないこと、安定性及び入手の
容易さから、特にE4P及び6PGを有利に使用する
ことができる。第一試薬の主成分及び添加剤などはPH7.0〜
10.0の緩衝液に溶解するのが好ましく、緩衝液の
種類としては、トリス−塩酸、トリエタノールア
ミン−NaOH、グリシン−KOH、トリシン、ビ
シン、Ｎ−２−ハイドロキシピペラジン、N′−
２−エタンスルホン酸（HEPES）、３−シクロ
ヘキシルアミノプロパンスルホン酸（CAPS）な
ど、通常の使用範囲がPH7.0〜10.0のものであれ
ばよい。より好ましくはトリス−塩酸、
HEPES、トリシン、ビシンのものが有利に使用
される。また、MPを使用する場合、リン酸緩衝
液を使用するか、あるいは上記緩衝液中にリン酸
塩を含ませて使用すればよい。第二試薬の主成分及び添加剤などは、PH3.0〜
7.4の緩衝液に溶解するのが好ましく、緩衝液の
種類として、例えばイミダゾール塩酸、トリス−
塩酸、トリエタノールアミン−塩酸、ピペラジン
Ｎ，N′−ビス（２−エタンスルホン酸）
（PIPES）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスル
ホン酸（MOPS）、酢酸−酢酸ナトリウム、リン
酸緩衝液など通常の使用範囲がPH3.0〜7.4のもの
であればよい。より好ましくは、イミダゾール−
塩酸、PIPES，MOPS、トリス−塩酸のものが
有利に使用される。本発明のアミラーゼ活性の測定用試薬の各成分
の濃度は、一般には次のような濃度が好ましい。
例えば、α−Glucを1.0〜300ユニツト／ml、MP
を0.5〜40ユニツト／ml、Glckを0.1〜40ユニツト
ｍ／、G6PDHを0.1〜40ユニツト／ml、PGIを
0.1〜40ユニツト／ml、PFKを0.2〜100ユニツ
ト／ml、ATPを0.5〜150mM、鎖長４〜８のオリ
ゴ糖を0.5〜50mM、NAD（Ｐ）を0.05〜20mM、
マグネシウム塩類を0.5〜30mM、塩化物を0.5〜
30mM、カルシウム塩類を0.5〜30mM、チオー
ル化合物を0.5〜50mM、アルブミンなどの安定
化剤を0.01〜5.0％、アジ化ナトリウムを0.5〜
50mM、糖あるいは糖酸のリン酸エステルを0.01
〜100mM、またMPを使用する場合、リン酸塩
として1.0〜100mM使用すればよい。より好まし
くは、α−Glucを2.0〜150ユニツト／ml、MPを
1.0〜20ユニツト／ml、Glckを0.2〜20ユニツト／
ml、G6PDHを0.2〜20ユニツト／ml、PGIを0.2〜
20ユニツト／ml、PFKを0.4〜40ユニツト／ml、
ATPを1.0〜80mM、鎖長４〜８のオリゴ糖を0.8
〜25mM、NAD（Ｐ）を0.1〜10mM、マグネシウ
ム塩類を1.0〜20mM、塩化物を1.0〜20mM、カ
ルシウム塩類を0.1〜15mM、チオール化合物を
1.0〜25mM、アルブミンなどの安定化剤を0.02〜
2.0％、アジ化ナトリウムを1.0〜30mM、糖ある
いは糖酸のリン酸エステルを0.05〜50mM、また
MPを使用する場合、リン酸塩として2.0〜50mM
使用すればよい。このようにして調製した第一試薬と第二試薬は
一定の比率で混合した後に、目的測定物質である
アミラーゼ活性の至適PHである6.0〜7.2となるよ
うに、第一試薬と第二試薬のそれぞれの緩衝液の
濃度を設定すればよい。第一試薬と第二試薬の混
合液比としては、第一試薬：第二試薬が２：１〜
10：１（容量比、以下同じ。）であり、より好まし
くは２：１〜８：１である。第一試薬と第二試薬
の濃度は、例えば第一試薬と第二試薬の混合比率
を２：１、第一試薬のPHを8.0、第二試薬のPHを
6.1、第一試薬と第二試薬を混合した後の最終反
応液のPHを6.6〜6.8という条件に設定すれば、簡
単な実験から求めることができる。例えば第一試
薬を35mM HEPES緩衝液（PH8.0）、第二試薬を
120mM PIPES緩衝液（PH6.1）とすることによ
つて目的を達成することができる。本発明に用いられるGlckとしては、その給源
が特に限定されるものではなく、エーロバクタ
ー・エーロゲネス（Aerobaacter aerogenes）な
どの微生物由来のもの、動物由来のものなどの各
種のものを使用することができるが、なかでも最
適生育温度が50℃ないし85℃である微生物の産生
するものが好ましい。そのような微生物として
は、例えばバチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillusstearothermophilus）、バチルス・サー
モプロテオリテイカス（Bacillus
thermoproteolyticus）、バチルス・アシドカルダ
リウス（Bacillus acido−caldarius）などのバ
チルス属（Bacillus sp.）、サーモアクチノマイ
セス属（Thermoactinomyces sp.）、サーマス
属（Thermus sp.）、サーモミクロビウム属
（Thermomicrobium sp.）などの微生物があげ
られる。これらの中でも特に好ましい微生物とし
ては、バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）があげられ、そ
の具体例としてはATCC7933株、7954株、8005
株、10194株、12980株、NCA1503株、UK563
株、（微工研菌寄第7275号、FERM Ｐ−7275、
昭和58年９月29日寄託）などがある。 G6PDHも、Glckと同様に、その給源が特に限
定されるものではないが、好ましくは補酵素とし
てNADPだけでなく、NADにも作用する
G6PDH（例えばロイコノストツク・メセンテロ
イデス（Leuconostoc mesenteroides）、シユー
ドモナス・フルオレツセンス（Pseudomonas
fluorescens）由来など）、さらに好ましくは
NADP，NADともに補酵素として使用でき、か
つ安定性、保存性に富む好熱性細菌由来の
G6PDHが望ましい。 PGIも、Glckと同様に、その給源が特に限定
されるものではなく、ウサギ筋肉などの動物起源
あるいはパン酵母などの微生物起源のものなど各
種のものを使用することができるが、なかでも安
定性、保存性に富む好熱性細菌（例えばバチル
ス・ステアロサーモフイルス（Bacillus
stearother−mophilus）NCA1503株、2184株な
ど）由来のPGIが望ましい。 PFKも、Glckと同様に、その給源が特に限定
されるものではなく、ウサギ筋肉などの動物起源
あるいはパン酵母、ビール酵母、クロストリジウ
ム属（Clostoridium sp.）、エシエリシア属
（Esche−richia sp.）、バチルス属（Bacillus
sp.）などの微生物起源のものなど各種のものを
使用することができるが、なかでも安定性、保存
性に富む好熱性細菌（例えばバチルス・ステアロ
サーモフイルス（Bacillus stearothermophilus）
NCA1503株、2184株など）由来のPFKが望まし
い。 α−Glucについても、その給源が特に限定さ
れるものではなく、動物起源、植物起源あるいは
微生物起源のものなど各種のものを使用すること
ができる。なかでも、マルトテトラオシド以上の
鎖長のオリゴ糖には作用しないという基質特異性
を有する酵母などの微生物起源のものが望まし
い。 MPは、上述の酵素と同じく、その給源が限定
されるものではないが、特にラクトバチルス・ブ
レビス（Lactobacillus brevis）などのラクトバ
チルス属（Lactobacillus sp.）あるいはナイセ
リア・メニンジテイデイス（Neisseria
meningitidis）などのナイセリア属（Neisseria
sp.）のものが好まれる。また、これらGlck，G6PDH，PGI，PGI，α
−Gluc及びMPを製造する場合には、抽出、精製
法などについては公知技術を適宜組み合わせれば
よい。次に、本発明の測定方法について説明すると、
まず内因性グルコース又は外因性マルトースの除
去反応は、以下の２つの方法で行うことが可能で
ある。 (a) マルトースα−Gluc ――――――−→ ２・グルコースグルコース＋ATPGluc ――――−→ グルコース −６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸PGI ――――−→ フラクトース−６−リン酸フラクトース−６−リン酸＋ATPPFK ――――−→ フラトクース１，６−ジリン酸＋ADP (b) マルトース＋無機リン酸MP ―――−→ グルコース＋グルコース−１−リン酸グルコース＋ATPGluc ――――−→ グルコース −６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸PGI ――――−→ フラトクース−６−リン酸フラクトース−６−リン酸＋ATPPFK ――――−→ フラクトース−１，６−ジリン酸＋ADP また、アミラーゼ活性測定反応は、グルコース
の重合度が４〜８のような鎖長の明確なオリゴ糖
を基質として用いるわけであるが、例えばG₅を
基質として用いた場合、以下の反応が進行する。 G₅アミラーゼ ――――――−→ マルトース＋マルトトリオースここで生成したオリゴ糖断片をグルコースに変
換してアミラーゼ活性を測定する方法として、例
えばα−Gluc用いる反応としては、 (c) マルトース及びマルトトリオース α−Gluc ―――――−→ ５・グルコースグルコース＋ATPGluc ――――−→ グルコース −６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸＋ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（リン酸）（以下NAD（Ｐ）と略記する。） G6PDH ――――――−→ ６−ホスホグルコン酸＋還元型NAD（Ｐ）（以下NAD（Ｐ）Ｈと略
記する。）となり、NAD（Ｐ）Ｈの340nmの吸光度増加を追
跡することとなる。また、MPを用いる反応とし
ては、 (d) マルトース＋無機リン酸MP ――−→ グルコース＋グルコース−１−リン酸グルコース＋ATPGluc ――――−→ グルコース −６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸＋NAD（Ｐ） G6PDH ――――――−→ ６−ホスホグルコン酸＋NAD（Ｐ）Ｈとなり、NAD（Ｐ）Ｈの340nmの吸光度増加を追
跡することとなる。したがつて、(a)と(c)の反応系の組み合わせでは
α−GlucとGlckは共有することとなり、一方、
(b)と(d)の反応系の組み合わせではMPとGlckを共
有することとなる。また、(a)と(d)及び(b)と(c)の反
応系の組み合わせではGlckのみを共有すること
となる。さらに、上記(c)及び(d)の反応系以外に、
例えば(c)及び(d)で生成するグルコースをGOD−
ペルオキシダーゼ（以下PODと略記する。）の反
応系、ピラノースオキシダーゼ（以下PyODと略
記する。）−PODの反応系、グルコースデヒドロ
ゲナーゼ（以下GDHと略記する。）の反応系など
の公知技術を用いて測定してもよく、また(d)で生
成するグルコース−１−リン酸にβ−ヒスホグル
コムターゼ（以下βPGMと略記する。）と
G6PDHを作用させて測定してもよい。その他、
これらの酵素を膜などに固定化し、謂る酵素電極
として測定してもよい。本発明の測定方法における実施態様について、
G₅を基質として用い、またα−Glucを用いる方
法、すなわち(a)と(c)の反応系の組み合わせを例と
して具体的に説明する。第一試薬としてα−
Gluc，Glck，G6PDH，PGI，PFK，ATP、塩
化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウ
ム、Ｎ−アセチルシステイン、アルブミン、アジ
化ナトリウム、EDTAを35mM HEPES緩衝液
（PH8.0）に溶かした溶液を調製し、これに人血清
あるいは人尿を所定量加え、人血清あるいは人尿
中にあらかじめ含まれているグルコースあるいは
マルトースを(a)の反応系に従つて、フラクトース
−1.6−ジリン酸にまで変換する。次いで、G₅，
NAD（Ｐ）及びE4P（あるいは6PG）、アジ化ナト
リウムを120mM PIPES緩衝液（PH6.1）に溶か
した第二試薬を加え、第二試薬中のE4P（あるい
は6PG）で、PGI活性を瞬時に停止させ、(c)の反
応式に従つて人血清あるいは人尿に含まれるアミ
ラーゼ活性を測定する。共役酵素としてMPを用
いる(b)と(d)の反応系の組み合わせ、あるいは(a)と
(d)、(b)と(c)の反応系の組み合わせでも同様であ
る。もちろん、先に述べたごとく、GOD−POD
の反応系、PyOD−PODの反応系、GDHの反応
系などでアミラーゼ反応−α−Gluc系あるいは
アミラーゼ反応−MP系によつて生成するグルコ
ースを測定してもよいし、また、アミラーゼ反応
−MP系によつて生成するグルコース−１−リン
酸をβPGM−G6PDHの反応系で測定してもよ
い。このような第一試薬と第二試薬を用いて体液中
のアミラーゼ活性を測定する場合、反応温度とし
ては通常の酵素反応の20〜45℃を使用すればよ
い。第一試薬による内因性グルコース又は外因性マ
ルトースの除去反応時間は特に限定されるもので
はないが、30分以内であれば日常的に使用でき、
また短時間ほど好ましい。また第二試薬添加後の
アミラーゼ活性測定時間を特に限定されるもので
はないが、通常１〜40分の間の測定できるもので
あればよい。（実施例）次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。まず、参考のため、グルコース及びマルトース
の除去反応について具体的に説明する。参考例１ Glck4.8ユニツト／ml、PGI3.6ユニツト／ml、
PFK6.2ユニツト／ml、ATP10mM、Ｎ−アセチ
ルシステイン10mM、硫酸マグネシウム10mM、
塩化カリウム10mM、塩化カルシウム5mM、
EDTA2mMを50mMHEPES緩衝液（PH8.2）に
溶かした溶液を調製した。この溶液１mlを取り37℃に保温後、これに
10000mg／dlグルコース溶液を20μ加えて反応
させ、１分、1.5分、２分、2.5分後の残存グルコ
ース量を市販グルコース定量試薬（ベーリンガ
ー・マンハイム山之内社より購入）を用いて定量
した。その結果、１分間反応後の残存グルコース量は
4200mg／dl、1.5分間反応の残存グルコース量は
1100mg／dl、２分間反応後の残存グルコース量は
65mg／dl、2.5分間反応後の残存グルコース量は
０mg／dlであることが判明した。さらに、上記試
薬にα−Gluc（酵母由来、ベーリンガー・マイハ
イム山之内社より購入）を20ユニツト／ml、及び
牛血清アルブミンを0.1％となるように加えて、
マルトース除去用試薬を調製した。この溶液１ml
を取り、37℃に保温後、これに500mg／dlのマル
トース溶液を20μ加えて反応させ、１分、1.5
分、２分、2.5分後の残存マルトース量をα−
Glucを加えて完全にグルコースに変換せしめた
後に市販グルコース定量試薬を用いて定量した。その結果、残存グルコース量は、１分後205
mg／dl、1.5分間後63mg／dl、２分後11mg／dl、
2.5分後０mg／dlであることが判明した。このよ
うに高濃度グルコース及びマルトースも短時間に
除去できることが判明した。参考例２比較のために、HK（酵母由来、ベーリンガ
ー・マンハイム山之内社より購入）6.0ユニツ
ト／ml、ATP10mM、Ｎ−アセチルシステイン
10mM、硫酸マグネシウム10mM、塩化カリウム
10mM、塩化カルシウム5mM、EDTA2mMを
50mM HEPES緩衝液（PH8.2）に溶かした溶液
を調製した。この溶液１mlを取り、37℃に保温
後、これに10000mg／dlのグルコース溶液を20μ
加えて反応させ、１分、２分、３分、４分、５
分、10分後の残存グルコース量を市販グルコース
定量試薬を用いて定量した。その結果、残存グルコース量は１分後7300mg／
dl、２分後5200mg／dl、３分後3700mg／dl、４分
後2200mg／dl、５分後1300mg／dl、10分後10mg／
dlであることが判つた。実施例１公知文献〔アーキブスオブバイオケミスト
リーアンドバイオフイジイツクス
（Archives of Biochemistry and Biophysics）
144巻、245頁、1971年〕に従つて、バチルス・ス
テアロサーモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）NCA1503株から、菌破砕、
硫安分画、ポリエチレングリコール処理、DEAE
−セルロース（ワツトマン社より購入）クロマト
グラフイー、セフアデツクスＧ−200（フアルマシ
ア社より購入）クロマトグラフイー、再DEAE−
セルロースクロマトグラフイーを経て精製した。
また、PFKを公知文献フエブスレターズ（FEBS
Letters）55巻、282頁、1975年）に従つて、バチ
ルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）NCA1503株から菌破砕、
DEAE−セルロース、DEAE−セフアデツクス
（フアルマシア社より購入）、及びAMP−セフア
ロース（フアルマシア社より購入）の各クロマト
グラフイーを経て精製した。さらに、MPも公知
文献〔アグリカルチユラルアンドバイオリジ
カルケミストリー（Agricultural and
Biological Chemistry）37巻、2813頁、1973年〕
に従つて、ラクトバチルス・ブレビス（Lacto−
bacillus brevis）ATCC 8287株から、菌破砕、
プロタミン処理、硫安分画、DEAE−セルロース
クロマトグラフイー、ハイドロキシアパタイト、
（和光純薬工業株式会社より購入）クロマトグラ
フイーを経て精製した。 α−Gluc20ユニツト／ml、Glck（バチルス・ス
テアロサーモフイルス（Bacillus stearothermo
−philus）由来、生化学工業株式会社より購入）
4.8ユニツト／ml、PGI3.6ユニツト／ml、PFK6.2
ユニツト／ml、G6PDH（ロイコノストツク・メ
センテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
由来、オリエンタル酵母工業株式会社より購入）
1.8ユニツト／ml、ATP10mM、Ｎ−アセチルシ
ステイン10mM、硫酸マグネシウム10mM、塩化
カリウム10mM、塩化カルシウム5mM、
EDTA2mM、牛血清アルブミン0.1％を35mM
HEPES緩衝液（PH8.2）に溶かした第一試薬を調
製し、次いでG₅（半井化学薬品株式会社より購
入）9.0mM、NADP6.0mM、6PG（オリエンタル
酵母工業株式会社より購入）10mMを120mM
PIPES緩衝液（PH6.1）に溶かした第二試薬を調
製した。アミラーゼ活性の測定は37℃で以下のごとく行
つた。用いた血清及び尿には、ブランク（グルコ
ースを添加しない場合）及びおのおの1000mg／
dl、2000mg／dl、4000mg／dl、8000mg／dlのグル
コースを含ませた。上記第一試薬500μを光路
長１cmのセルに入れ、次に血清あるいは尿試料
10μを添加し、２分間保温（37℃）後、第二試
薬250μを添加し、セル室を同じく37℃の恒温
に保つた分光光度計にて340nmの吸光度変化より
試料中のアミラーゼ活性を求める方法を実施し
た。その結果、第二試薬を添加した直後の血清試料
の初期吸光度（OD₃₄₀）とアミラーゼ活性測定値
はおのおの0.218，132.1ユニツト／、0.220，
132.3ユニツト／、0.217，132.0ユニツト／、
0.225，132.8ユニツト／及び0.212，131.8ユニ
ツト／であり、尿試料の初期吸光度とアミラー
ゼ活性測定値は、おのおの0.280，218.0ユニツ
ト／、0.276，214ユニツト／、0.284，215ユ
ニツト／、0.268，222.0ユニツト／及び
0.278，212.4ユニツト／であることが判つた。別に、マルトース400mg／dlを含む血清試料を
調製し、上記と同様の測定を実施した。その結果、第二試薬添加後の初期吸光度とアミ
ラーゼ活性測定値は0.227，131.6ユニツト／で
あつた。このように、グルコース及びマルトース
の量にかかわらずアミラーゼ活性が正確に測定で
きた。比較例１比較のために、実施例１における第一試薬から
PGIとPFKの両酵素を抜いた以外は実施例１と同
様にして第一試薬及び第二試薬を調製し、実施例
１と同様の検討を行つた。その結果、グルコースを1000mg／dl含有する血
清試料では、初期吸光度が1.429、アミラーゼ活
性測定値が145.5ユニツト／であり、グルコー
スを2000mg／dl以上含有する試料については、初
期吸光度が分光光度計のスケールを超え、測定不
可能であることが判つた。尿試料についても同様に、グルコースを1000
mg／dl含有する試料のみで測定でき、初期吸光度
は1.480、アミラーゼ活性測定値は246.4ユニツ
ト／であつた。また、マルトースを400mg／dl
含む血清試料では、第二試薬添加後の初期吸光度
が1.167であり、アミラーゼ活性測定値は141.5ユ
ニツト／であつた。比較例２比較のために、実施例１における第二試薬から
6PGを抜いた以外は実施例１と同様にして第一試
薬及び第二試薬を調製し、実施例１と同様に血清
試料を用いて検討した。その結果、第二試薬添加直後の初期吸光度とア
ミラーゼ活性測定値は、おのおの0.218，115.5ユ
ニツト／、0.216，114.8ユニツト／、0.210，
116.2ユニツト／及び0.215，114.5ユニツト／
であることが判つた。このように、6PGを添加しない系ではアミラー
ゼ反応とα−Gluc反応によつて生成したグルコ
ースが、PGIとPFKの系に流れ、アミラーゼ活性
値を低く測定する傾向にあることが判明した。実施例２実施例１のα−Glucの代わりにMP8ユニツ
ト／mlを用い、リン酸ナトリウム50mMを含む第
一試薬を調製し、PHを7.5に調製し、また第二試
薬のPHも6.5に調製して実施例１と同様にして検
討した。用いた試料は、実施例１と同じ血清試料
である。その結果、グルコースを含有する血清試料では
第二試薬添加直後の初期吸光度とアミラーゼ活性
測定値は、おのおの0.218，132.1ユニツト／、
0.222，133.1ユニツト／、0.225，181.9ユニツ
ト／、0.218，133.8ユニツト／及び0.225，
132.5ユニツト／であり、またマルトースを含
有する試料では、おのおの0.228，133.5ユニツ
ト／であることが判明した。実施例１と同様に、グルコース及びマルトース
量にかかわらず、アミラーゼ活性が正確に測定で
きた。比較例４比較のために、HKを用いる反応系を検討し
た。すなわち、HK6.0ユニツト／ml、α−Gluc20
ユニツト／ml、GOD（カビ由来、ベーリンガー・
マンハイム山之内社より購入）100ユニツト／ml、
ムタロターゼ（ブタ腎臓由来、ベーリンガー・マ
ンハイム山之内社より購入）2.0ユニツト／ml、
カタラーゼ（ウシ肝臓由来、ベーリンガー・マン
ハイム山之内社より購入）500ユニツト／ml、４
−アミノアンチピリン0.7mM、ATP 10mM、塩
化ナトリウム10mM、塩化カリシウム5mM、硫
酸マグネシウム10mMを35mM HEPES緩衝液
（PH8.0）に溶かした第一試薬を調製した。また、
POD（西洋ワサビ由来、ベーリンガー・マンハイ
ム山之内社より購入）15ユニツト／ml、G₅
3mM、塩化ナトリウム10mM、塩化カルシウム
5mM、フエノール10mM、酢酸ナトリウム
0.5mM及びリポラン1400 ４％を、120mM
PIPES緩衝液（PH6.1）に溶かした第二試薬を調
製した。測定は、実施例２と同様に実施し、505nmの吸
光度を追跡した。別に、アミラーゼ活性既知の標
準検体を用いて、血清試料中のアミラーゼ活性を
求めた。その結果、2000mg／dlのグルコースを含む血清
試料を用いた場合、アミラーゼ活性測定値は
110.1ユニツト／であり、リポラン1400による
HK活性の停止が不十分である結果を得た。実施例３実施例１における第二試薬中の6PGの代わりに
E4P0.8mMを用いて、実施例１と同様の検討をし
た。その結果、グルコースを含む血清試料では、第
二試薬添加後の初期吸光度とアミラーゼ活性測定
値は、おのおの0.218，132.1ユニツト／，
0.214，130.5ユニツト／、0.212，131.6ユニツ
ト／、0.218，132.5ユニツト／及び0.215，
131.3ユニツト／であり、マルトースを含む血
清試料では0.220，130.8ユニツト／であること
が判つた。実施例１と同様に、グルコース及びマルトース
量にかかわらず、アミラーゼ活性が正確に測定で
きた。（発明の効果）本発明の体液中のアミラーゼ活性測定用試薬及
び測定方法は、アミラーゼ活性測定の基準化に最
適な鎖長４〜８のオリゴ糖を基質として用い、従
来の内因性グルコース及び外因性マルトース除去
における問題点を大巾に克服したものである。す
なわち、PGI及びPFKを用いる新規なアミラーゼ
活性測定用試薬であり、しかもα−Glucあるい
はMP，Glck，PGI，PFK及びATPを主成分と
する第一試薬で高濃度の内因性グルコース及び外
因性マルトースを完璧に２分以内という短時間に
アミラーゼ活性を妨害しない形に変換でき、次い
でオリゴ糖と糖あるいは糖酸のリン酸エステルと
を主成分とする第二試薬を添加することによつ
て、PGI活性を瞬時に完全に停止せしめるととも
に、体液中のアミラーゼ活性を測定するという新
規な方法である。本発明によつて内因性グルコー
ス又は外因性マルトースによる妨害を完全に除去
できたことで、アミラーゼ活性測定値の基準化が
容易となり、またアミラーゼ活性の測定の精度を
増大させることが可能となる。このように、本発
明の体液中のアミラーゼ活性測定用試薬の臨床検
査分野への寄与は多大のものがある。

Claims

【特許請求の範囲】１オリゴ糖を基質として体液中のアミラーゼ活
性を測定する試薬において、α−グルコシダーゼ
又はマルトースホスホリラーゼ、グルコキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ及びアデノシン5′−三リン酸を含有する第一試
薬と、オリゴ糖及び糖あるいは糖のリン酸エステ
ルを含有する第二試薬とからなることを特徴とす
る体液中のアミラーゼ活性測定用試薬。２オリゴ糖を基質として体液中のアミラーゼ活
性を測定する方法において、α−グルコシダーゼ
又はマルトースホスホリラーゼ、グリコキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ及びアデノシン5′−三リン酸を含有する第一試
薬で、体液中にあらかじめ存在するグルコース又
はグルコースとマルトースを除去した後、オリゴ
糖及び糖あるいは糖のリン酸エステルを含有する
第二試薬を添加し、ホスホグルコースイソメラー
ゼ活性を停止せしめるとともに、体液中のアミラ
ーゼの作用により生成するオリゴ糖断片をα−グ
ルコシダーゼ又はマルトースホスホリラーゼを用
いてグルコースに変化させ、次いで変化させたグ
ルコースを第一試薬中のグリコキナーゼ及びグル
コース−６−リン酸脱水素酵素で測定することを
特徴とする体液中のアミラーゼ活性の測定方法。