RU2418072C1 - Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus - Google Patents
Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2418072C1 RU2418072C1 RU2010113334/10A RU2010113334A RU2418072C1 RU 2418072 C1 RU2418072 C1 RU 2418072C1 RU 2010113334/10 A RU2010113334/10 A RU 2010113334/10A RU 2010113334 A RU2010113334 A RU 2010113334A RU 2418072 C1 RU2418072 C1 RU 2418072C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- concentration
- bilirubin
- bulirubin
- optical density
- enzyme
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 title claims abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 3
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 claims description 78
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 claims description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 108010015428 Bilirubin oxidase Proteins 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001103808 Albifimbria verrucaria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- KQCMTOWTPBNWDB-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichloroaniline Chemical compound NC1=CC=C(Cl)C=C1Cl KQCMTOWTPBNWDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWFLNTWSAJTXAS-UHFFFAOYSA-N 3,5-dichlorobenzenediazonium Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC([N+]#N)=C1 SWFLNTWSAJTXAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 4-diazoniobenzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=C([N+]#N)C=C1 UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241001451492 Bacillus pumilus ATCC 7061 Species 0.000 description 1
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000008789 Direct Bilirubin Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000003809 bile pigment Substances 0.000 description 1
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPYKTIZUTYGOLE-UHFFFAOYSA-N billirubin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- DADSZOFTIIETSV-UHFFFAOYSA-N n,n-dichloroaniline Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=CC=C1 DADSZOFTIIETSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Исследуемую сыворотку крови инкубируют в натрий фосфатном буфере, содержащем детергент и фермент, окисляющий билирубин. Измеряют оптическую плотность смеси при 450 нм. При этом в качестве фермента используют термостабильную бактериальную оксидазу из Bacillus pumilus, а концентрацию билирубина в образце рассчитывают по разнице величин оптической плотности контрольной и опытной проб, соотнесенной с калибровочным графиком. При определении концентрации билирубина с использованием калибратора концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле: С=(А2-А1/А4-А3)×Ск, где A1, А2 - оптическая плотность пробы после инкубации в присутствии и в отсутствие фермента, соответственно; А3, А4 - оптическая плотность калибратора после инкубации в присутствии и в отсутствие фермента, соответственно; Ск - концентрация билирубина в калибраторе. Наблюдаемое в ходе реакции уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 450 нм прямо пропорционально концентрации общего билирубина в сыворотке. Изобретение предоставляет простой и надёжный способ, показывающий высокую точность анализа. 1 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно - к лабораторной диагностике, и может применяться как для диагностических целей, так и терапевтического наблюдения.
Уровень техники
Билирубин - один из нескольких желчных пигментов, образуется в ретикулоэндотелии печени и селезенки при распаде гемоглобина. В сыворотке крови билирубин присутствует в виде двух основных форм: конъюгированного (связанного с глюкуроновой кислотой) и неконъюгированного (несвязанного, непрямого или свободного) билирубина. Вместе обе формы билирубина составляют общий билирубин крови. Для лабораторной диагностики используют измерения общего и конъюгированного билирубина. Разница между этими показателями составляет величину неконъюгированного билирубина. Определение концентрации различных форм билирубина в крови позволяет судить о количестве разрушающихся эритроцитов, функции клеток печени и транспорте желчи. В связи с этим разработка простого, надежного и экологически безопасного способа определения концентрации билирубина является актуальной.
Известны несколько способов определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови фотометрическими методами. Наибольшее распространение получили прямой фотометрический метод, биохимический диазометод и ферментативный метод.
Прямой (безреагентный) фотометрический метод основан на поглощении сине-зеленого света билирубином и применяется, главным образом, в педиатрии (Yamanouchi I, Yamauchi Y, Igarashi I. Transcutaneous bilirubinometry: Preliminary studies of noninvasive bilirubin meter in the Okayama National Hospital // Pediatrics. 1980. Vol.65. P.195-202).
Диазометод (метод Йендрашика-Грофа или его модификации; Watson D. Analytic methods for bilirubin in blood plasma //Clin. Chem. 1961. Vol.7. P.603-625) основан на реакции билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой, 3,5-дихлорфенилдиазонием или 2,4-дихлоранилином с образованием окрашенного продукта (диазобилирубина). Интенсивность окраски раствора конечного продукта пропорциональна концентрации общего билирубина и измеряется фотометрически.
Недостатками известных методов являются: прямой метод - неудовлетворительная воспроизводимость в пограничных с патологией концентрациях билирубина (норма для общего билирубина 8,5-20,5 мкмоль/л), диазометод - высокая токсичность исходных реагентов и нестабильность самого диазореагента (при использовании сульфаниловой кислоты - реагент стабилен не более 7 дней при температуре 2-8°С, для дихлоранилина - не более 10 дней при комнатной температуре). Указанные недостатки устранены в ферментативном способе определения билирубина, прототипе заявляемого способа. В известном способе определение концентрации билирубина основывается на реакции окисления билирубина до биливердина ферментом билирубин оксидазой BOX (КФ 1.3.3.5; Otsuji S. et al. A new enzymatic approach for estimating total and direct bilirubin. Clin. Biochem. 1988. Vol.21. P.33-38). Наблюдаемое в ходе реакции уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 450 нм прямо пропорционально концентрации общего билирубина в сыворотке. Благодаря высокой специфичности фермента к билирубину другие компоненты крови не оказывают влияние на величину измерения. Недостатком прототипа является быстрая инактивация известных в настоящее время билирубин оксидаз (активность BOX, выделенной из грибов Myrothecium verrucaria и используемой в коммерчески доступных наборах, снижается уже при температуре выше 37°С и сохраняется не более 5 дней при 5°С, Tanaka N., Murao S. Purification and some properties of bilirubin oxidase of Myrothecium verrucaria MT-1 // Agric. Biol. Chem. 1982. Vol.46, P.2499-2503).
Сущность изобретения
Технической задачей предлагаемого изобретения является использование в ферментативном способе определения общего билирубина в сыворотке крови термостабильной оксидазы из непатогенных почвенных бактерий Bacillus pumilus, обладающей высокоспецифичной билирубин оксидазной активностью.
Поставленная техническая задача достигается тем, что данный фермент выделяется из предварительно сконструированного штамма-продуцента Escherichia coli 109/рВР4. Штамм-продуцент конструируют с помощью стандартных генно-инженерных методов: ген, кодирующий оксидазу, клонируют с помощью ПЦР-метода в векторную плазмиду pUC18. В результате получается рекомбинантная плазмида рВР4. Клетки штамма E.coli 109, содержащие плазмиду рВР4, и есть искомый штамм-продуцент оксидазы - E.coli 109/рВР4. Способ выделения фермента включает: выращивание клеток, инкубирование клеток в присутствии ИПТГ (индуктора экспрессии оксидазы), получение биомассы центрифугированием и разрушение ее ультразвуком, термообработку грубого экстракта при 70°С, хроматографию на анионообменных смолах, концентрирование конечного препарата.
Сущность предлагаемого способа определения концентрации общего билирубина заключается в следующем: 1) тестируемый образец смешивают с раствором фосфатного буфера, содержащего детергент, проводят измерение оптической плотности полученного раствора при 450 нм на любом фотометрическом оборудовании; 2) к смеси добавляют оксидазу, выдерживают 5 мин при 42°С; 3) проводят вторичное измерение оптической плотности раствора при 450 нм. Разность в величине оптической плотности при первом и втором измерениях прямо пропорциональна концентрации билирубина. Расчет проводят с использованием калибратора или калибровочного графика.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Конструирование штамма-продуцента E.coli 109/рВР4.
Клетки бактерий штамма Bacillus pumilus АТСС 7061 (штамм депонирован в ВКМ под номером В508) выращивают в пробирках со средой LB на качалке при 37°С, собирают центрифугированием и из полученной биомассы стандартным способом (обработка фенолом, хлороформом и осаждение этанолом) выделяют хромосомную ДНК. Ген, кодирующий оксидазу (открытая рамка считывания в геноме В. pumilus под номером ВАТ 3525, нуклеотидную последовательность которого можно найти в базе данных GenBank), амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Реакционная смесь содержит выделенную хромосомную ДНК в качестве матрицы и два олигонуклеотидных праймера, содержащих сайты рестриктаз EcoRI и HindIII, комплементарных началу и концу гена, соответственно. ДНК векторной плазмиды pUC18 и ПЦР-продукт подвергают исчерпывающему гидролизу рестриктазами EcoRI и HindIII и затем лигируют. Лигированную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM109. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, с последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII. В результате получают штамм-продуцент E.coli 109/рВР4.
Пример 2. Выделение оксидазы.
Клетки штамма-продуцента E.coli 109/рВР4 выращивают в среде LB с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл в течение 12-14 часов, инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:50, растят культуру до мутности 0,8 при 30°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют ИГПТ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию при 25°С при 100 об/мин в течение 3-6 часов. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере (0,05 М натрий фосфатный буфер pH 7,6) из расчета 3,5 мл на 1 г биомассы и подвергают ультразвуковой дезинтеграции на дезинтеграторе (MSE, Англия) при температуре 4-5°С. Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин 30 мин на центрифуге J-21 (Beckman, США). Супернатант подвергают термообработке в течение 15 мин при 70°С. Осадок отделяют центрифугированием. Режим центрифугирования, как описано выше. Дальнейшую очистку оксидазы проводят путем хроматографии вначале на Q-сефарозе FF и затем на DEAE-сефарозе FF (Amersham Biosciences). Белок элюируют линейным градиентом 0,1-0,5М NaCl. Пиковые фракции объединяют и концентрируют на мембране (Amicon, 30 kDa). За единицу билирубин оксидазной активности фермента принимают минимальное количество оксидазы, которое в течение 1 мин окисляет 1 мкмоль билирубина при комнатной температуре. Полученный препарат фермента имеет удельную активность по отношению к билирубину 5,6 ед./мг белка и показывает высокую термостабильность (стабилен при 80°С в течение получаса). Полученный препарат фермента сохраняет исходный уровень активности в течение не менее 6 месяцев при температуре 2-8°С.
Пример 3. Определение общего билирубина на спектрофотометре.
а) Приготовление буферного раствора: 0,52 г натрий фосфорнокислый 1-замещенный 2-водный, 3,47 г натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, 0,11 г натрий додецилсульфат (детергент, SDS) растворяют в 100 мл дистиллированной или деионизованной воды. Раствор не токсичен, стабилен при комнатной температуре не менее 1 года. Допускается выпадение осадка (детергента), поэтому перед использованием флакон с буфером следует прогреть при 40-50°С до полного растворения осадка.
б) Проведение измерений: 1) опытная проба - 100 мкл анализируемого образца (сыворотка или белковый раствор калибратора) смешивают с 1000 мкл буферного раствора, добавляют 10 мкл фермента (1000 ед./мл), перемешивают и инкубируют 5 мин при 42°С, проводят измерение оптической плотности при 450 нм на спектрофотометре, в качестве контроля используют воду; 2) контрольная проба - все операции проводят аналогично опытной пробе, но без добавления фермента; 3) концентрацию билирубина в образце рассчитывают путем сравнения разницы между величиной оптической плотности контрольной и опытной проб с калибровочным графиком. При содержании билирубина в сыворотке крови выше 350 мкмоль/л пробу разводят физиологическим раствором, полученный результат умножают на разведение. Калибровочный график строят на основе калибровочных растворов билирубина, приготовленных на растворе альбумина (20 г/л). При определении концентрации билирубина с использованием калибратора (раствор билирубина с известной концентрацией) концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле:
С=(А2-А1/А4-А3)×Сk,
где А2, А1 - поглощение опытной пробы после инкубации без и с ферментом, соответственно;
А4, А3 - поглощение калибратора после инкубации без и с ферментом, соответственно;
Сk - концентрация билирубина в калибраторе.
Пример 4. Определение общего билирубина на полуавтоматическом анализаторе.
Способ осуществляют аналогично примеру 3 за исключением того, что количество реагентов и анализируемой пробы следует пропорционально изменить в зависимости от объема используемой кюветы (соотношение сыворотки крови к буферу составляет 1:10).
Пример 5. Для проверки точности предлагаемого способа в качестве анализируемого материала используют контрольную сыворотку (уровень 2, фирма "Вектор-Бест-Европа", Россия) с аттестованным средним значением концентрации общего билирубина, например равным 73,9±4,8 мкмоль/л, измеренным по методу Йендрашика-Грофа. Концентрация общего билирубина, определенная с помощью предлагаемого способа, в данном примере в среднем составляет 71,2±1,7 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения не превышает 4%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить концентрацию общего билирубина в сыворотке крови на фотометрическом приборе с использованием нетоксичных, стабильных реагентов, при сохранении высокой точности анализа.
В связи с тем, что использование существенных признаков предлагаемого способа в известных научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данное техническое решение отвечает критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".
Пояснение чертежа
На чертеже представлены данные по линейности определения билирубина, которую оценивают следующим образом: вначале готовят разведения растворов калибратора или сыворотки с известными значениями билирубина (диапазон разведения - 7-244 и 18,5-274 мкмоль/л, соответственно), далее определяют концентрацию билирубина в разведениях предлагаемым способом, затем на основании полученных значений концентраций билирубина строят соответствующий график и рассчитывают уравнение линейной регрессии. На чертеже по оси ординат (у) указаны значения концентраций билирубина, полученные предлагаемым способом, а по оси абсцисс (х) - ожидаемые значения согласно разведению раствора билирубина с известной его концентрацией. Вычисленные уравнения линейной регрессии из графических данных: у=0,971 х+1,292; r=0,998 и у=1,048х-2,626; r=0,995 - для калибратора и сыворотки, соответственно. Высокое значение коэффициента корреляции (r>0,99) в данном диапазоне разведения означает, что линейная область определения билирубина имеет место, по крайней мере, до 274 мкмоль/л. Нижний предел определения - 7,0 мкмоль/л.
Claims (1)
- Способ определения концентрации общего билирубина в образцах сыворотки крови, включающий инкубирование анализируемого образца с ферментом, окисляющим билирубин в натрийфосфатном буфере в присутствии детергента, и измерение оптической плотности смеси при 450 нм, отличающийся тем, что в качестве фермента используют термостабильную бактериальную оксидазу из Bacillus pumilus и концентрацию билирубина в образце рассчитывают по разнице величин оптической плотности контрольной и опытной проб, соотнесенной с калибровочным графиком, а при определении концентрации билирубина с использованием калибратора концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле
С=(А2-А1/А4-А3)·Ск,
где A1, А2 - оптическая плотность пробы после инкубации в присутствии и отсутствии фермента соответственно; А3, А4 - оптическая плотность калибратора после инкубации в присутствии и в отсутствие фермента соответственно; Ск - концентрация билирубина в калибраторе.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010113334/10A RU2418072C1 (ru) | 2010-04-07 | 2010-04-07 | Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010113334/10A RU2418072C1 (ru) | 2010-04-07 | 2010-04-07 | Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2418072C1 true RU2418072C1 (ru) | 2011-05-10 |
Family
ID=44732658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010113334/10A RU2418072C1 (ru) | 2010-04-07 | 2010-04-07 | Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2418072C1 (ru) |
-
2010
- 2010-04-07 RU RU2010113334/10A patent/RU2418072C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| OTSUJI S. et al. A NEW ENZYMATIC APPROACH FOR ESTIMATING TOTAL AND DIRECT BILIRUBIN. Clin. Biochem. 1988. Vol. 21. P.33-38. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wilbanks et al. | Structural basis of the 70-kilodalton heat shock cognate protein ATP hydrolytic activity. I. Kinetic analyses of active site mutants. | |
| CN103013940B (zh) | 具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及其的产品、方法和用途 | |
| Lehrer et al. | Conformational changes in rabbit muscle aldolase. Kinetic studies | |
| CN103695380A (zh) | 果糖氨基酸氧化酶、制备方法及含该酶的糖化白蛋白检测试剂盒 | |
| US7476525B2 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability | |
| Patel et al. | Disease variants of human Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase 2 (PYCR2) | |
| Jelikić-Stankov et al. | Determination of uric acid in human serum by an enzymatic method using N-methyl-N-(4-aminophenyl)-3-methoxyaniline reagent | |
| EP1666586B1 (en) | Pyrroloquinoline quinone (pqq)-dependent glucose dehydrogenase modification having excellent substrate specificity | |
| CN109554376A (zh) | 一种碱性尿酸氧化酶及其在检测试剂盒和降低食品中尿酸的应用 | |
| RU2418072C1 (ru) | Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus | |
| Dugan et al. | The Binding of Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate to Mammalian and Avian Fatty Acid Synthetases: NUMBER OF BINDING SITES AND THE EFFECT OF REAGENTS AND CONDITIONS ON THE BINDING OF REDUCED NICOTINAMIDE ADENINE DINUCLEOTIDE PHOSPHATE TO ENZYME | |
| JP2017158441A (ja) | カタラーゼ | |
| US20210222227A1 (en) | Enzymatic measurement method and reagent for enzymatic measurement | |
| RU2420594C2 (ru) | Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата | |
| JPH0373276B2 (ru) | ||
| JPH0575397B2 (ru) | ||
| US20090246783A1 (en) | Method of measuring pyrophosphate | |
| Newell et al. | Mutants of Salmonella typhimurium that are insensitive to catabolite repression of proline degradation | |
| CN116064427B (zh) | 一种酰基辅酶a合成酶突变体、其编码基因、表达菌株及其应用 | |
| Aygün et al. | Heterologous expression, purification, and partial characterisation of the apicoplast protein 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase from Toxoplasma Gondii | |
| WO2022172343A1 (ja) | ウリカーゼ活性化剤及び尿酸測定試薬 | |
| Xu | Preparation and Analysis of Catalytic Efficiency of Mutant IDH1/2 and Tie2 | |
| JPH0191778A (ja) | マルトースホスホリラーゼ | |
| Killick | A continuous coupled polarographic assay for trehalase | |
| JP2579082B2 (ja) | 安定な６−ホスホグルコノラクトナーゼ、その製造方法および該酵素の使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200408 |