JP2002306180A

JP2002306180A - 核酸塩基配列解析法および核酸塩基配列解析試薬キットおよび核酸塩基配列解析装置

Info

Publication number: JP2002306180A
Application number: JP2001117232A
Authority: JP
Inventors: Yuki Wakabayashi; 由記若林; Hideki Kanbara; 秀記神原; Kokuka Shu; 国華周; Masao Kamahori; 政男釜堀
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2001-04-16
Filing date: 2001-04-16
Publication date: 2002-10-22
Also published as: US20030165861A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＤＮＡの塩基変異（ＳＮＰｓ）を検出する核
酸塩基配列解析析法および試薬キットおよび核酸塩基配
列解析装置を提供する。【解決手段】相補鎖伸長反応および化学発光反応に使
用する各試薬を、ピロフォスファターゼ、Ａｐｙｒａｓ
ｅにより前処理する。化学発光反応を妨害する不純物の
ＰＰｉをピロフォスファターゼで分解し、不純物のＡＴ
ＰをＡｐｙｒａｓｅで分解する。前処理された試薬を使
用して相補鎖伸長反応および化学発光反応を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸塩基配列の解
析方法、これに用いる試薬キットおよびこの解析方法を
実施するための解析装置に関し、特に、ＤＮＡに相補鎖
結合したプライマーの伸長鎖の形成時に生じるピロリン
酸（ＰＰｉ：Pyrophosphoric acid）を化学発光反応に
より検出すことにより核酸塩基配列を解析する方法、こ
れに用いる試薬キットおよびこの解析方法を実施するた
めの解析装置に関する。より詳細には、ＤＮＡ塩基配列
の決定方法、１塩基変異（ＳＮＰｓ：Single Nucleotid
e Polymorphisms）の検出方法、１塩基変異の発現頻度
の計測方法およびこの解析方法を実施するための解析装
置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年のゲノム解析の進展に伴い、ＤＮＡ
情報を医療等に幅広く利用しようとする動きが活発であ
る。特に、ゲノムに存在する特定配列の有無の検査や特
定の配列に存在するＳＮＰｓの検出が重要な課題となっ
ている。ヒトゲノムに見られるＳＮＰｓは１０００塩基
に１つあると推定されているので、ヒトゲノムには３０
０万個から１０００万個のＳＮＰｓが存在すると考えら
れている。これらのＳＮＰｓは、各人の個性や医薬品に
対する感受性等と関連しており、最近、ＳＮＰｓの分析
が注目を集めている。

【０００３】ＳＮＰｓの分析では、分析１：ＳＮＰｓを
検出するための分析および塩基配列中に頻繁に発現する
位置の分析、分析２：得られたＳＮＰｓデータベースの
内で、医療分野で重要なＳＮＰｓデータがどれであるか
調べるための分析、分析３：医療分野で重要なＳＮＰｓ
を用いて個人毎の診断や治療の指針を得るための分析、
等がある。

【０００４】現在、各国で分析１のＳＮＰｓ探索が、Ｄ
ＮＡシーケンシングやＳＳＣＰ（single strand confor
mation polymorphism analysis）を用いて実行されてい
る。また、分析３では、最近、疾患遺伝子の同定法に於
いてＳＮＰｓ解析による体系的な遺伝子マッピングを行
なう方法が議論に上っており、よりスループットの高
い、より確実なＳＮＰｓタイピング方法（変異の在るで
あろう位置での変異の有無を調べる方法）の開発が必須
と考えられ、現段階でも種々の分析法が提案されてい
る。

【０００５】例えば、（１）特定の塩基配列に特異的に
ハイブリダイズするジェノタイピングプライマー（Geno
typing primer）を標的（ターゲット）ＤＮＡにハイブ
リダイズさせて相補鎖伸長反応を行ない、変異の有無に
より生じた相補鎖伸長反応生成物をゲル電気泳動で分析
するＳＮＰ−ＡＲＭＳ（Amplification refractory mut
ation system）法、（２）プライマーを標的ＤＮＡにハ
イブリダイズさせて１塩基だけ相補鎖伸長反応を行な
い、相補鎖伸長反応生成物を質量分析するＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption I
onization-Time of Flight/Mass Spectroscopy）、
（３）ＤＮＡプローブがミューテーションの期待される
位置で酵素切断されるように工夫し、酵素による分解物
を蛍光標識して高感度に分析するＴａｑｍａｎＰＣＲ
法、（４）ＴａｑｍａｎＰＣＲ法に於いて２種類の非
蛍光標識オリゴを用いるインベーダー（Ｉｎｖａｄｅ
ｒ）法（The Scientist 13、16(1999)）、（５）環状１
本鎖ＤＮＡの生成の有無に基づく増幅反応によりＳＮＰ
ｓの存在を調べるＲＣＡ（Rolling circle amplificati
on）法、（６）標的ＤＮＡにプライマーをハイブリダイ
ズさせ、相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をアデノ
シン５’−三リン酸に変換して、アデノシン５’−三リ
ン酸をルシフェリン等の発光試薬と反応させ生成する発
光の強度を計測して、プライマーの隣接部位から、順
次、塩基配列を決定して行くピロシーケンシング（pyro
sequencing）法（Anal. Biochemistry 280、103-110(200
0)）等がある。これら各方法については、「ポストシー
ケンスのゲノム科学（１）ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」
（中村祐輔編集、pp.93-pp.149(2000年)、中山書店、東
京）に詳述されている。

【０００６】なお、被検核酸の各塩基に相補的な塩基が
被検核酸の塩基とハイブリダイズし、プライマーの一方
向の伸長反応に伴って、ｎ個の塩基伸長により遊離する
ｎ個のピロリン酸を、発光反応により観察する記載があ
る（特開平０７−２０３９９８号公報）。また、試料中
に存在するピロリン酸をピロフォスファターゼ等により
予め酵素的に分解除去する記載がある（特開平０８−０
００２９９号公報）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前述の分析２では、膨
大なＤＮＡ試料について、膨大な部位のＳＮＰｓを調べ
ることが必要である。例えば、ある病気のグループに属
する多数の患者のＳＮＰｓ分析と、コントロール（対
照）としての多数の正常な人のＳＮＰｓ分析とを、膨大
な回数行ない、両結果を比較検討して注目するＳＮＰｓ
が医療的に意味のあるＳＮＰｓである否かを調べていく
必要がある。そのために、ランニングコストが安く、非
常にスループットの高い装置システムの開発が必要であ
るという問題がある。

【０００８】また、患者の特性毎に分類した多数のＤＮ
Ａ試料を混合してＳＮＰｓを検出して変異の起こる確率
を調べ、この確率と病気または医薬品に対する感受性と
の相関等を調べる必要がある。このために、定量分析の
精度の高い分析方法が必要であるが、現在、このような
方法は存在しない。

【０００９】従来技術の中で、低ランニングコストでか
つ高スループットな装置になり得る手法はピロシーケン
シング法である。ピロシーケンシング法は、高圧電源、
レーザ光源、蛍光色素、高価な質量分析装置等を必要と
せず、小型化・低コスト化が容易である。ピロシーケン
シング法では、不純物、不純物による望まない化学変化
により生成するピロリン酸（以下、ＰＰｉという）、使
用する試薬キットに不純物として含まれるＰＰｉ、アデ
ノシン５’−三リン酸、（adenocine 5’-triphosphat
e）（以下ＡＴＰという）等による検出限界があるとい
う問題がある。特に、ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補
鎖伸長反応の基質であるデオキシヌクレオチド（核酸基
質、ｄＮＴＰｓ：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）に含まれるＰＰ
ｉにより、伸長した核酸基質の検出限界があるという問
題がある。

【００１０】本発明の目的は、ランニングコストが安
く、定量精度に優れ、検出限界の向上による高感度検
出、スループットの高いＳＮＰｓ分析を可能とする核酸
塩基配列の解析方法、これに用いる試薬キットおよびこ
の解析方法を実施するための解析装置を提供することに
ある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、ピロシーケン
シング法に適用される核酸塩基配列解析析法、試薬キッ
トおよびこの解析方法を実施するための解析装置であ
る。また、本発明は、ＳＮＰｓ発現頻度分析法（ＢＡＭ
ＰＥＲ法：Bioluminescence of Artificial Mismatch P
rimer Extension Reaction）（特願２０００−３００５
７７）に適用される核酸塩基配列解析析法、試薬キット
およびこの解析方法を実施するための解析装置である。

【００１２】ＢＡＭＰＥＲ法では、プライマーの３’末
端から２塩基目、または、３塩基目の塩基が、標的核酸
（１本鎖ＤＮＡ試料）の塩基と相補的でない塩基に人為
的に置換された人工ミスマッチプライマーが使用され
る。人為的に置換された塩基は、標的核酸に相補鎖結合
した人工ミスマッチプライマーの伸長反応を進行させた
り、進行させなかったりする確実なスイッチング特性を
与えている。

【００１３】ＢＡＭＰＥＲ法では、相補鎖伸長を連続し
て数百塩基行ない、ＰＰｉを大量に生成して、化学発光
反応により生じる発光を検出するので、高い検出感度が
得られ、微量の１本鎖ＤＮＡ試料への適用、変異の検出
への適用が可能である。ピロシーケンシング法と同様
に、ＢＡＭＰＥＲ法でも、使用する試薬に不純物として
含まれるＰＰｉやＡＴＰが検出限界を決めている。

【００１４】本発明の核酸塩基配列解析析法では、ＤＮ
Ａプライマーの伸長反応に使用される試薬、および、ピ
ロシーケンシング法に使用される試薬に含まれるＰＰｉ
をピロフォスファターゼ（Pyrophosphatase、以下、Ｐ
Ｐａｓｅという）を用いて分解する前処理、または／お
よび、上記の試薬に含まれるＡＴＰをアピラーゼを用い
て分解する前処理が実行される。本発明の核酸塩基配列
解析析法は、核酸の塩基配列を解析する方法、核酸塩基
の多型を解析する方法、核酸塩基の多型の発現頻度を解
析する方法に適用できる。

【００１５】本発明の試薬キットは、ＰＰａｓｅ、およ
び／または、アピラーゼを含んでおり、試薬に不純物と
して含まれるＰＰｉやＡＴＰを効率よく分解しているの
で、高感度検出、定量精度の向上が実現できる。また、
低ランニングコスト、高スループットが実現できる。

【００１６】ＳＮＰｓ分析では遺伝子変異（ミューテー
ション）の有無を調べれば良いので、本発明では、ＤＮ
ＡのＳＮＰｓ部位に特異的にハイブリダイズし、ミュー
テーションの有無によって相補鎖伸長反応を制御し得る
プライマーを用いて、このプライマーの伸長反応により
生じたＰＰｉを、ルシフェラーゼを使用する化学発光反
応により高感度検出する。試料ＤＮＡに注目するミュー
テーションが存在すると、連続する伸長鎖の形成に伴う
化学発光を検出できる。

【００１７】変異のないワイルドタイプＤＮＡと変異の
あるミュータントＤＮＡの各々に特異的なプライマーを
用意してＳＮＰｓ分析を行なうと、ミュータントとワイ
ルドタイプの存在量を別々に知ることができるので、混
合試料を用いてもミュータントとワイルドタイプの存在
比等を調べることができる。

【００１８】ＢＡＭＰＥＲ法に本発明を適用する場合に
は、相補鎖伸長反応により連続してプライマーの伸長反
応を行ない、多数のＰＰｉを発生させて化学発光反応を
行なうので、ピロシーケンシング法より２桁以上の高感
度が得られる。

【００１９】本発明の実施の形態を列挙すると以下のよ
うである。

【００２０】（１）本発明の核酸塩基配列解析方法で
は、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補鎖結合した
ＤＮＡプライマーの伸長反応に使用される試薬に含まれ
るＰＰｉをＰＰａｓｅを用いて分解する前処理、または
／および、試薬に含まれるＡＴＰをアピラーゼ（Apyras
e）を用いて分解する前処理が実行される。前処理の後
に、ＰＰａｓｅ、または／および、アピラーゼを取り除
く処理を行うが、ＰＰａｓｅ、または／および、アピラ
ーゼは、例えば、担体に固定されており、担体はビー
ズ、磁気ビーズ等からなり、ＰＰａｓｅ、または／およ
び、アピラーゼの各試薬溶液への添加、各試薬溶液から
の取り出しが容易である。前処理が実行され、且つ前処
理後のＰＰａｓｅ、または／および、アピラーゼを取り
除く処理が終わった後に、伸長反応を行なわせ、これに
より生成されるＰＰｉによる化学発光が検出される。

【００２１】（２）本発明の核酸塩基配列解析方法は、
少なくとも１種類のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）をその種類毎に含む溶液のそれぞ
れに、または、少なくとも１種類のデオキシヌクレオチ
ドの類似体を含む少なくとも１種類のデオキシヌクレオ
チドをその種類毎に含む溶液のそれぞれに、（ａ）ＰＰ
ａｓｅを添加して、それぞれの溶液に含まれるＰＰｉを
分解する前処理、または／および、（ｂ）アピラーゼを
添加して、それぞれの溶液に含まれるＡＴＰを分解する
前処理が実行される。（１）の場合と同様に、前処理の
後に、ＰＰａｓｅ、または／および、アピラーゼを取り
除く処理を行う。

【００２２】ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼお
よび前処理された少なくとも１つの溶液を用いて、標的
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補鎖結合したＤＮＡプ
ライマーが伸長反応により伸長される。伸長反応により
生じたＰＰｉが、アデノシン−５’−ホスホ硫酸（Aden
ocine-5’-phosphosulfate、以下ＡＰＳという）および
ＡＴＰスルフリラーゼ（ATP sulfurylase）の存在下
で、ＡＴＰに変換され、次いで、ＡＴＰ、発光酵素（例
えば、ルシフェラーゼ：luciferase）、発光基質（例え
ば、ルシフェリン：luciferin）を含む化学発光反応に
より発光し、これによる発光が検出される。

【００２３】この例では、プライマーの３’末端の塩基
が、標的核酸の１塩基多型部位の３’末端側の１つ手前
の塩基に相補的である。また、ＤＮＡプライマーの３’
末端から２塩基目、または、３塩基目の塩基が標的核酸
の塩基配列と相補的でない塩基に置換されている。

【００２４】（３）本発明の核酸塩基配列解析方法は、
デオキシアデノシン５'−α−チオ−三リン酸もしく
は、デオキシアデノシン５'−α−チオ−トリフォスフ
ェイト（deoxy adenosine 5’-triphosphate αＳ-sulp
hate，以下ｄＡＴＰαＳという）を含む溶液、デオキシ
チミジン５’−三リン酸（deoxy thiamine 5’-triphos
phate，以下ｄＴＴＰという）を含む溶液、デオキグア
ノシン５’−三リン酸（deoxy guanosine 5’-triphosp
hate，以下ｄＧＴＰという）を含む溶液、デオキシシチ
ジン５’−三リン酸（deoxy cytidine 5’-triphosphat
e，以下ｄＣＴＰという）を含む溶液のそれぞれに、
（ａ）ＰＰａｓｅを添加して、溶液のそれぞれに含まれ
るＰＰｉを分解する前処理、または／および、（ｂ）ア
ピラーゼを添加して、溶液のそれぞれに含まれるＡＴＰ
を分解する前処理が実行される。前処理の後、（１）の
場合と同様に、溶液のそれぞれの中のＰＰａｓｅまたは
およびアピラーゼを除去する。

【００２５】ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼお
よび前処理された少なくとも１つの溶液を用いて、標的
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補鎖結合したＤＮＡプ
ライマーが伸長反応により伸長される。伸長反応により
生じたＰＰｉが、ＡＰＳおよびＡＴＰスルフリラーゼの
存在下で、ＡＴＰに変換され、ＡＴＰ、ルシフェラー
ゼ、ルシフェリンを含む化学発光反応により発光し、こ
れによる発光が検出される。

【００２６】（４）本発明の核酸塩基配列解析方法は、
ｄＡＴＰαＳ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを含む溶
液に、（ａ）ＰＰａｓｅを添加して、溶液に含まれるＰ
Ｐｉを分解する前処理、または／および、（ｂ）アピラ
ーゼを添加して、溶液に含まれるＡＴＰを分解する前処
理が実行される。（１）の場合と同様に、前処理の後
に、ＰＰａｓｅ、または／および、アピラーゼを取り除
く処理を行う。

【００２７】ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼお
よび前処理された溶液を用いて、標的核酸（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）に相補鎖結合したＤＮＡプライマーが伸長反
応により伸長され、伸長反応により生じたＰＰｉが、Ａ
ＰＳおよびＡＴＰスルフリラーゼの存在下で、ＡＴＰに
変換され、ＡＴＰ、ルシフェラーゼ、ルシフェリンを含
む化学発光反応により発光し、これによる発光が検出さ
れる。

【００２８】この例では、ＤＮＡプライマーの３’末端
から２塩基目、または、３塩基目の塩基が標的核酸の塩
基配列と相補的でない塩基に置換されている。伸長反応
による伸長鎖を５’末端から、５’→３’エクソヌクレ
アーゼ反応で分解し、ＤＮＡプライマーを標的核酸に繰
り返し相補鎖結合させて伸長反応を行ない、化学発光反
応により生じた発光が検出される。

【００２９】（５）本発明の核酸塩基配列解析方法は、
デオキシアデノシン５’−三リン酸（deoxy adenosine
5’-triphosphate，以下ｄＡＴＰという）、ｄＴＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを含む溶液に、（ａ）ＰＰａｓｅを
添加して、溶液に含まれるＰＰｉを分解する前処理、ま
たは／および、（ｂ）アピラーゼを添加して、溶液に含
まれるＡＴＰを分解する前処理が実行される。（１）の
場合と同様に、前処理の後に、ＰＰａｓｅ、または／お
よび、アピラーゼを取り除く処理を行う。

【００３０】ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼお
よび前処理された溶液を用いて、標的核酸（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）に相補鎖結合したＤＮＡプライマーの伸長反
応が実行され、これにより生成されるＰＰｉによる化学
発光が検出される。

【００３１】この例の場合、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰの何れかの代りに類似体を使用できる。

【００３２】この例では、ＤＮＡプライマーの３’末端
から２塩基目、または、３塩基目の塩基が標的核酸の塩
基配列と相補的でない塩基に置換されている。伸長反応
による伸長鎖を５’末端から、５’→３’エクソヌクレ
アーゼ反応で分解し、ＤＮＡプライマーを標的核酸に繰
り返し相補鎖結合させて伸長反応を行ない、化学発光反
応により生じた発光が検出される。

【００３３】（６）本発明の核酸塩基配列解析方法は、
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを含む溶液
に、（ａ）ＰＰａｓｅを添加して、溶液に含まれるＰＰ
ｉを分解する前処理、または／および、（ｂ）アピラー
ゼを添加して、溶液に含まれるＡＴＰを分解するが実行
される。（１）の場合と同様に、前処理の後に、ＰＰａ
ｓｅ、または／および、アピラーゼを取り除く処理を行
う。

【００３４】この例では、相補鎖伸長能力を有し５塩基
長から８塩基長の範囲の第１のオリゴマーと、標的核酸
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補鎖結合し相補鎖伸長能力
のない第２のオリゴマーとを直列に標的核酸に相補鎖結
合させ、ＤＮＡポリメラーゼ、前処理された溶液を用い
て、第１のオリゴマーの伸長反応を行なう。伸長反応に
より生じるＰＰｉが化学発光反応により検出される。

【００３５】この例の場合、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰの何れかの代りに類似体を使用できる。
第１のオリゴマーの３’末端から２塩基目、または、３
塩基目の塩基が標的核酸の特定の領域の塩基配列と相補
的でない塩基に置換されている。

【００３６】上述の（１）−（６）の実施形態において
は、全ての場合に前処理の後に、ＰＰａｓｅ、または／
および、アピラーゼを取り除く処理を行うものとして説
明したが、これに代えて、ＰＰａｓｅ、または／およ
び、アピラーゼを失活させる薬剤を加えても良い。さら
には、具体例を後で示すように、ＰＰａｓｅ、または／
および、アピラーゼが少量なら残っていても特に支障が
無いので、前処理のために加える量によっては、前処理
の後にＰＰａｓｅ、または／および、アピラーゼを取り
除く処理を省略しても良い。

【００３７】（７）本発明の試薬キットは、少なくとも
１種類のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、Ｎ＝Ａ、
Ｃ、Ｇ、Ｔ）をその種類毎に含む溶液のそれぞれに、ま
たは、少なくとも１種類のデオキシヌクレオチドの類似
体を含む少なくとも１種類のデオキシヌクレオチドをそ
の種類毎に含む溶液のそれぞれに、ＰＰａｓｅを有す
る。

【００３８】（８）本発明の試薬キットは、少なくとも
１種類のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ、Ｎ＝Ａ、
Ｃ、Ｇ、Ｔ）をその種類毎に含む溶液のそれぞれに、ま
たは、少なくとも１種類のデオキシヌクレオチドの類似
体を含む少なくとも１種類のデオキシヌクレオチドをそ
の種類毎に含む溶液のそれぞれに、ＰＰａｓｅを有す
る。試薬キットにＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を加え
ても良い。

【００３９】（９）本発明の試薬キットは、ｄＡＴＰα
Ｓ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＰＰａｓｅを有す
る。ＰＰａｓｅは担体に固定されている。

【００４０】（１０）本発明の試薬キットは、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、および、ＰＰａｓ
ｅまたは／およびアピラーゼを有する。ｄＡＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの何れかの代りに類似体を使
用できる。

【００４１】なお、（７）から（１０）の本発明の試薬
キットは、標的核酸に相補鎖結合したＤＮＡプライマー
の伸長反応により生じたＰＰｉが、化学発光反応により
生じる発光により検出される核酸塩基配列解析方法に使
用される。

【００４２】（１１）本発明の試薬キットは、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡプライマー、ＡＰＳ、ＡＴＰスルフ
リラーゼ、発光酵素、発光基質、アピラーゼの少なくと
も１つ、および、ＰＰａｓｅを有し、標的核酸に相補鎖
結合したＤＮＡプライマーの伸長反応により生じたＰＰ
ｉがＡＴＰに変換され、ＡＴＰ、発光酵素、発光基質を
含む化学発光反応により生じた発光が検出される核酸塩
基配列解析方法に使用される。ＰＰａｓｅ、または／お
よび、アピラーゼは担体に固定されている。

【００４３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を図を参照
して詳細に説明する。

【００４４】（実施例１）実施例１では、ＤＮＡ試料
（標的（ターゲット）ＤＮＡ）にハイブリダイズしたプ
ライマーを伸長させ、伸長に応じて生成する多量のＰＰ
ｉを化学発光反応により検出する。化学発光反応を用い
た検出は、本来、非常に高感度であるが、試薬に含まれ
る種々の不純物が発光源となり、ノイズを含むものとな
ることも多い。高感度計測では、これら不純物を分解し
試薬から除去することが重要である。高感度計測を達成
することで、微量の試薬と試料で分析を実行できるので
安価な検査システムが実現する。種々の検討からノイズ
となる不要発光の原因は、使用する試薬ｄＮＴＰ（Ｎ＝
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）に含まれるＰＰｉや、ポリメラーゼ等
の酵素に含まれるＡＴＰであることが判明した。従っ
て、予め、使用する試薬に含まれる不純物であるＡＴ
Ｐ、ＰＰｉを分解し試薬から除去した後に化学発光反応
を行ない、発光を測定することが重要となる。

【００４５】図１は、本発明の実施例１に於ける相補鎖
伸長により生成するＰＰｉを化学発光反応により検出す
る核酸塩基配列解析方法での、ノイズを低減するための
試料溶液調整法を説明するフロー図である。核酸（ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ）の試料溶液調整法では、ＤＮＡ試料の基に
なる血液１０１からＤＮＡ１０２（２本鎖ＤＮＡ）を抽
出する。ＤＮＡ１０２の必要な領域部分をＰＣＲ１０３
等で増幅して試料として用いる。増幅後、磁気ビーズ等
を用いて１本鎖ＤＮＡ１０４とする。１本鎖ＤＮＡ１０
４を含む溶液には、増幅反応で用いたｄＮＴＰｓや増幅
反応で生じたＰＰｉが除去しきれずに含まれていること
がある。そこで、アピラーゼ（Ａｐｙｒａｓｅ）１０５
およびＰＰａｓｅ１０６の酵素を１本鎖ＤＮＡ１０４を
含む溶液に加えて、溶液に残存するｄＮＴＰｓやＰＰｉ
を分解する前処理を行なう。Ａｐｙｒａｓｅ１０５およ
びＰＰａｓｅ１０６の酵素は、以後の計測では妨害にな
るので溶液からから取り除く（１０７）。Ａｐｙｒａｓ
ｅ１０５およびＰＰａｓｅ１０６の酵素が取り除かれ
た、１本鎖ＤＮＡ１０４を含む溶液に、プライマー１１
７を加え、１本鎖ＤＮＡ１０４とプライマー１１７とが
混合され、１本鎖ＤＮＡ１０４にプライマー１１７がハ
イブリダイズしたＤＮＡ試料溶液１１８を得る。

【００４６】相補鎖伸長反応および化学発光反応に用い
る混合溶液１０８は、伸長酵素、硫酸還元酵素、発光基
質、発光酵素、酵素安定化剤、酵素活性化剤等を含む試
薬キットであり、混合溶液１０８に含まれるＡＴＰ、Ｐ
Ｐｉがノイズの原因となるので、Ａｐｙｒａｓｅ１０５
およびＰＰａｓｅ１０６の酵素で処理して、溶液１０８
に含まれるＡＴＰやＰＰｉを分解する前処理を行なう。
この場合、これらの内、伸長酵素および硫酸還元酵素は
相対的にノイズの原因となるＡＴＰ、ＰＰｉを多く含む
ので、これらを他のものと分けて、これらのみに対して
前処理を行なうものとしても良い。また、相補鎖伸長反
応のための核酸基質を含む溶液１０９も、核酸基質（ｄ
ＮＴＰｓ）の熱分解等で生じたＰＰｉを多く含み、ノイ
ズの要因となる。従って、核酸基質を含む溶液１０９に
対してもＡｐｙｒａｓｅ１０５およびＰＰａｓｅ１０６
の酵素で処理して、溶液１０９に含まれるＰＰｉを分解
する前処理を行なう。前処理で使用したＡｐｙｒａｓｅ
１０５およびＰＰａｓｅ１０６の酵素は、以後の計測で
は妨害になるので、ＤＮＡ試料溶液の作成時と同様に、
溶液１０８、１０９からから取り除く（１０７）。この
前処理がなされた溶液１１０、１１１を、ＤＮＡ塩基配
列解析に用いる。

【００４７】１本鎖ＤＮＡ１０４にハイブリダイズした
プライマー１１７を含む溶液１１８、試薬キットである
溶液１０８をＡｐｙｒａｓｅ１０５およびＰＰａｓｅ１
０６の酵素で処理した溶液１１０、核酸基質を含む溶液
１０９をＡｐｙｒａｓｅ１０５およびＰＰａｓｅ１０６
の酵素で処理した溶液１１１を混合して、伸長反応１１
２を行なう。プライマー１１７の伸長により生じるＰＰ
ｉを、化学発光反応による発光１１３として検出する
（１１４）。

【００４８】図２は、本発明の実施例１に於ける、プラ
イマーの１塩基伸長により生じるＰＰｉを化学発光反応
により検出する原理を説明する図である。１本鎖ＤＮＡ
試料２０１をタイタープレート等に入れて分析するが、
一度に種々の試料をタイタープレートの各ウェルに入
れ、同時に分析するのが通例である。タイタープレート
のウエルに、１本鎖ＤＮＡ試料２０１、プライマー２０
２、核酸基質であるｄＮＴＰｓ２０３、ＤＮＡポリメラ
ーゼ２０４、ＡＰＳ（Adenosine 5’-phosphosulfate）
２０７、ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ sulfuryrase）
２０８、ルシフェリン（luciferin）２１２、ルシフェ
ラーゼ（luciferase）２１４等を加える。

【００４９】図２（Ａ）は、１本鎖ＤＮＡ２０１にハイ
ブリダイズしたプライマー２０２が１塩基伸長し、ＰＰ
ｉ２０５が生成する化学反応を示す。図２（Ｂ）は、図
２（Ａ）に示す化学反応で生成したＰＰｉ２０５（図２
（Ｂ）では参照符号２０６とした）が、ＡＴＰスルフリ
ラーゼ２０８の作用でＡＰＳ２０７と反応し、ＡＴＰ２
０９と硫酸イオン２１０を生成する化学反応を示す。図
２（Ｃ）は、図２（Ｂ）に示す化学反応で生成したＡＴ
Ｐ２０９（図２（Ｃ）では参照符号２１１とした）が、
ルシフェリン２１２と酸素２１３とルシフェラーゼ２１
４の存在下で反応し、５’−アデニル酸（Adenosine
5’-monophosphate、以下ＡＭＰという）２１５、ＰＰ
ｉ２１６、オキシルシフェリン２１７、二酸化炭素２１
８、１個の光子（ｈν）２１９を生ずる化学反応を示
す。

【００５０】ルシフェリン２１２はルシフェラーゼ２１
４の存在下で酸素分子２１３によって酸化される時の自
由エネルギーで励起され、可視光を発して基底状態に戻
る。１分子のルシフェリン２１２の酸化によって１個の
光子（ｈν）２１９が化学発光として放出される。この
化学発光の光量を測定することにより、ｄＮＴＰｓ２０
３がＤＮＡ鎖に取り込まれ相補鎖が伸長していることを
知ることができる。

【００５１】図２（Ｃ）に示す化学反応で生成したＰＰ
ｉ２１６は、図２（Ｂ）に示す化学反応におけるＰＰｉ
２０６として、再度、ＡＰＳ２０７と反応し、ＡＴＰ２
０９を生成する。この結果、図２（Ｃ）に示す化学反応
が起こり、光子（ｈν）２１９を生ずる。即ち、図２
（Ａ）に示す化学反応により、ＤＮＡ鎖への１個の核酸
基質の取り込みにより１分子のＰＰｉ２０５が生成され
た結果、図２（Ｂ）、図２（Ｃ）に示す化学反応が繰り
返し起こることとなり、光子２１９を放出する反応が繰
り返される。その結果、１つの核酸基質の取り込みで多
数の光子が放出される。図２に示す化学発光反応は光源
を必要とせず、基本的にノイズが無く高感度の信号が得
られる。

【００５２】先に説明したように、図２に示す化学発光
反応で使用する各種の試薬に不純物として含まれるＡＴ
ＰやＰＰｉは、ノイズの原因となる。実施例１では、図
１で説明したように、各種の試薬、反応溶液の前処理を
行なう。

【００５３】図３は、本発明の実施例１に於ける、試薬
（相補鎖伸長反応および化学発光反応に必要な試薬の混
合溶液１０８、ｄＮＴＰｓを含む溶液１０９）およびＤ
ＮＡ試料１０４に含まれる不純物の分解を、固相または
膜を用いて、ＰＰａｓｅおよび／またはＡｐｙｒａｓｅ
により行なう前処理法の例およびそのための前処理装置
の例を模式的に説明する図である。

【００５４】図３（Ａ）に示す前処理の例では、前処理
を施していない試薬１０８、１０９またはＤＮＡ試料１
０４を含む溶液３０３を収納する容器３５０に、Ａｐｙ
ｒａｓｅ３０１が固定されたビーズ等の担体３１１を含
む試薬キット、ＰＰａｓｅ３０２が固定されたビーズ等
の担体３１２を含む試薬キットを添加して、試薬１０
８、１０９またはＤＮＡ試料１１８を含む溶液３０３に
含まれる不純物を分解して除去する。

【００５５】不純物のＡＴＰ３０５はＡＭＰ３０９、無
機リン酸（以下Ｐｉという）３１０に分解される。不純
物のｄＮＴＰ３０４はデオキシヌクレオチド１リン酸
（ｄＮＭＰ）３０８、Ｐｉ３１０に分解される。不純物
のＰＰｉ３０６はＰｉ３１０に分解される。この後、容
器３５０から、担体３１１、３１２を除去することによ
り、前処理が完了する。

【００５６】なお、上記の例では、Ａｐｙｒａｓｅ３０
１が固定された担体３１１を含む試薬キット、ＰＰａｓ
ｅ３０２が固定された担体３１２を含む試薬キットを使
用したが、Ａｐｙｒａｓｅ３０１およびＰＰａｓｅ３０
２が固定された担体を含む試薬キットを使用しても良
い。

【００５７】また、前処理後に、容器３５０から、担体
３１、３１２を除去するのに代えて、容器３５０にＡｐ
ｙｒａｓｅの阻害剤およびＰＰａｓｅの阻害剤を添加し
ても良い。

【００５８】図３（Ｂ）に示す前処理の例では、試薬１
０８、１０９またはＤＮＡ試料１０４を含む溶液３０３
を反応容器や試料容器に供給する細管３６０の内部また
はピペット先端部の内壁部の固相表面３１３に、Ａｐｙ
ｒａｓｅ３０１、ＰＰａｓｅ３０２を固定しておき、前
処理を施していない試薬１０８、１０９またはＤＮＡ試
料１１８を含む溶液３０３を細管の内部に流入させて、
細管の内部を試薬１０８、１０９またはＤＮＡ試料１０
４を含む溶液３０３が流下する過程で、図３（Ａ）と同
様の前処理を行なわせて、試薬１０８、１０９またはＤ
ＮＡ試料１０４を含む溶液３０３に含まれる不純物を分
解し、前処理済みの溶液３０７を反応容器や試料容器に
供給する。ここで言う細管は、いわゆるキャピラリーで
あり、溶液３０３の配送路に配送路の太さ分だけの太い
束にして配置されるものとすれば良い。

【００５９】なお、固相表面３１３に、Ａｐｙｒａｓｅ
３０１、ＰＰａｓｅ３０２を固定したが、何れか一方を
固定しても良い。

【００６０】図３（Ｃ）に示す前処理の例では、少なく
とも１種類のｄＮＴＰあるいはその類似体を含む前処理
を施していない試薬１０９を含む溶液３０３を収納する
容器３７０に、Ａｐｙｒａｓｅ３０１、ＰＰａｓｅ３０
２を添加して、図３（Ａ）と同様の前処理を行ない、試
薬１０９を含む溶液３０３に含まれる不純物ＰＰｉおよ
びＡＴＰの分解を行なった後に、分子量選択透過膜（フ
イルタ）３１４を用いて、前処理済みの溶液３０７を回
収する。ｄＮＴＰｓの平均分子量は約５７０なので、Ｎ
ＷＭＬ（Nominal molecular weight limit in Dalton
s）＝１０，０００の膜を用いれば、ＰＰａｓｅ（ＭＷ
＝７０，０００）およびＡｐｙｒａｓｅ（ＭＷ＝５０，
０００）と完全に分離することができる。なお、前処理
を施していない試薬１０８、１０９またはＤＮＡ試料１
０４を含む溶液３０３を収納する容器３５０に、Ａｐｙ
ｒａｓｅ３０１、ＰＰａｓｅ３０２を添加したが、何れ
か一方を添加しても良い。

【００６１】なお、図３では、前処理を施していない試
薬１０８、１０９またはＤＮＡ試料１０４を含む溶液３
０３に対する前処理について説明したが、ｄＮＴＰｓの
類似体、プライマー、ＡＰＳ、ＡＴＰスルフリラーゼ、
ルシフェリン、ルシフェラーゼ等の図２で説明した化学
反応を進めるための試薬についても、同様に前処理を行
うものとすることができるのは言うまでもない。

【００６２】実施例１では、ＰＰａｓｅおよびｄＡＴＰ
αＳ（ｄＡＴＰ類似体）（deoxy adenosine 5’-tripho
sphate α-sulphate）を含む試薬キット、ＰＰａｓｅお
よびｄＴＴＰ（deoxy thiamine 5’-triphosphate）を
含む試薬キット、ＰＰａｓｅおよびｄＧＴＰ（deoxy gu
anosine 5’-triphosphate）を含む試薬キット、ＰＰａ
ｓｅおよびｄＣＴＰ（deoxy cytidine 5’-triphosphat
e)を含む試薬キットの４種のキットを使用する。これら
４種のキットでＰＰａｓｅは、ビーズ等の担体に固定さ
れていても良い。

【００６３】図４は、本発明の実施例１に於ける、ＰＰ
ａｓｅによる前処理の有無によるノイズ信号の比較例を
示す図である。本発明で使用する試薬の中では、４種の
ｄＮＴＰｓ（図１：１０９、図２：２０３）が熱分解等
によりＰＰｉを生成するので、最も大きなノイズ信号源
となる。試薬の購入先、製造方法、ロット、保管条件の
違い等により、４種のｄＮＴＰｓまたはそれらの類似体
に不純物として含まれるＰＰｉの量は異なる。

【００６４】図４に示す結果例は、次の条件下で得られ
た。ｄＡＴＰαＳは１社から購入した２ロット、ｄＧＴ
Ｐは３社から購入した４ロット、ｄＴＴＰは２社から購
入した各１ロット、ｄＣＴＰは３社から購入した４ロッ
トの各ロットを、ＰＰａｓｅによるＰＰｉの分解を行な
う前処理の有無の２通りについてそれぞれプライマーの
伸長が起こらない条件下で、図２（Ｂ），（Ｃ）に示す
化学発光反応で検出されたノイズとなる発光信号強度の
平均値を示す。図４の縦軸は、検出されたノイズ信号の
最大値を１．０とする規格化をしている。

【００６５】図４の結果に示すように、試薬に含まれる
ＰＰｉの量が異なっていても、ＰＰｉはＰＰａｓｅで殆
ど分解されて、ノイズ発光信号強度は十分無視できる程
度の強度になる。特に、ｄＣＴＰの場合には、ノイズ信
号強度はＰＰａｓｅで前処理のなされる前の約８０分の
１である。

【００６６】図５は、本発明の実施例１に於けるＰＰａ
ｓｅによる前処理によるノイズ信号のｄＣＴＰの濃度依
存性の例を示す図である。使用するｄＮＴＰｓの濃度に
伴い、不純物として含まれるＰＰｉの量は変化するが、
濃度４ｎＭから濃度２６０ｎＭの範囲で、ＰＰａｓｅに
よる前処理により、不純物として含まれるＰＰｉを無視
できる程度に分解できることがわかる。図５の中の小さ
いグラフは、原点近傍のデータを拡大して示すグラフで
ある。図では、実際の計測結果はもっと少ないものであ
ったが、分かりやすくするために、前処理の結果のノイ
ズ信号をやや誇張して表示した。

【００６７】図４、図５に示す結果から、ＰＰａｓｅが
含まれる試薬キットの使用により、不純物のＰＰｉに起
因するノイズ信号を実用上無視できる程度に分解できる
ことが示された。

【００６８】本発明で使用される試薬キットは、混合溶
液１０８に含まれる個々の試薬（酵素、基質、安定化
剤、活性化剤等）に、Ａｐｙｒａｓｅ、および／また
は、ＰＰａｓｅが付加され、あるいは、これらが固定さ
れた担体が添加されたものとして構成される。

【００６９】以上説明したように、ノイズ信号の発生の
原因となる不純物ＡＴＰおよび／またはＰＰｉの分解に
より、非常な高感度が達成される。例えば、２００塩基
の相補鎖伸長を伴うＤＮＡ鎖の検出では、３００ｆｍｏ
ｌの検出が可能であった。

【００７０】図６は、本発明の実施例１に於ける、ピロ
シーケンシングを実行する核酸塩基配列解析装置の構成
例を示す模式図である。図６に示すように、ピロシーケ
ンシング法では、相補鎖伸長反応に際し、ｄＡＴＰα
Ｓ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの４種類の基質を１
種類ずつ、順次、反応槽６０１の反応溶液に注入する。
注入された基質が相補鎖伸長反応に使用されるとＰＰｉ
が生じて発光を生じる。その発光量はフォトセンサー６
０２で検出され、増幅器６０３で増幅され、電流電圧変
換後、測定系の外部からのノイズを除くためにローパス
フィルター６０４を通してデータ処理装置６０５に取り
込み、データ処理して表示、保存される。相補鎖伸長反
応により１種の塩基（基質）がＤＮＡ鎖に取り込まれる
毎に、発光量の検出が繰り返される。

【００７１】発光量の検出を行なう反応溶液に残存する
ｄＮＴＰｓは、次に加えられる核酸基質（塩基）が取り
込まれるか否かを調べるのに大きな影響を与える。そこ
で、ｄＮＴＰｓやＡＴＰを分解するＡｐｙｒａｓｅを反
応溶液に加えておき、一定時間後（１０秒程度以内）
に、加えたｄＮＴＰｓやＡＴＰが全て分解するようにす
ると、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの化学発光反応（図２
（Ｃ））、およびＡｐｙｒａｓｅによる分解反応（図
３）で競合して消費される。

【００７２】ピロシーケンシング法では、１種の塩基の
伸長により生成したＰＰｉを化学発光反応により順次検
出するが、反応溶液にＡｐｙｒａｓｅを存在させて発光
の持続時間を短縮させ、シーケンシングのスループット
を向上させている（Science281、363-364(1998)）。

【００７３】図７は、本発明の実施例１に於ける、ピロ
シーケンシング法による伸長鎖の検出例を説明する図で
ある。プライマー７０２が結合した１本鎖ＤＮＡ試料７
０１を含む反応溶液に、順次、核酸基質ｄＮＴＰｓを加
えて化学発光反応による発光の有無を調べる。図７に示
す例では、最初に、ｄＡＴＰαＳ７０３を添加するが、
この場合、基質Ａと標的ＤＮＡ鎖は相補的でなく、相補
鎖伸長反応は起こらない。よって核酸基質がＤＮＡ鎖に
取り込まれないのでＰＰｉは生成せず、発光は生じな
い。反応溶液に存在するｄＡＴＰαＳ７０３は、反応溶
液に存在するＡｐｙｒａｓｅにより分解される。次に添
加されたｄＣＴＰ７０４も標的ＤＮＡ鎖に相補的でなく
伸長反応が起きないので、ｄＡＴＰαＳ７０３と同様
に、Ａｐｙｒａｓｅにより分解される。ｄＴＴＰ７０５
が反応溶液に添加された場合は、標的ＤＮＡ鎖と相補的
で、伸長鎖７０６が形成され、ＰＰｉ７０７が生成し、
発光７０８が生じる。残存するｄＴＴＰ７０５はＡｐｙ
ｒａｓｅにより分解される。ｄＧＴＰ７０９が反応溶液
に添加された場合には、伸長鎖が形成されず、ｄＧＴＰ
７０９はＡｐｙｒａｓｅにより分解される。次にｄＡＴ
ＰαＳ７１０が添加されると伸長鎖７１１が形成され、
ＰＰｉ７１２が生成し発光７１３が生じる。

【００７４】核酸基質（ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む試薬には不純物としてＰＰｉが
含まれており、ノイズ信号の原因となる。本発明では、
ピロシーケンシング法の実施に先立って、使用される全
ての試薬に、予めＰＰａｓｅ、またはＰＰａｓｅが固定
された担体を添加して、各試薬に不純物として含まれる
ＰＰｉを分解する。また、ｄＮＴＰ以外の各試薬には、
予めＡｐｙｒａｓｅ、またはＡｐｙｒａｓｅが固定され
た担体を添加して、各試薬に不純物として含まれるＡＴ
Ｐを分解しておく。

【００７５】あるいは、本発明のピロシーケンシング法
の実施に於いては、ＰＰａｓｅ、またはＰＰａｓｅが固
定された担体が添加された試薬キットを使用する。ピロ
シーケンシング法で使用される全ての試薬の各々に、Ｐ
Ｐａｓｅ、またはＰＰａｓｅが固定された担体が添加さ
れた試薬キットが提供される。また、ｄＮＴＰｓ以外の
試薬の各々に、Ａｐｙｒａｓｅ、またはＡｐｙｒａｓｅ
が固定された担体が添加された試薬キットが提供され
る。

【００７６】なお、図２に示す、４種類の核酸基質（ｄ
ＮＴＰｓ）２０３の少なくとも１種類、例えば、ｄＡＴ
Ｐの代りに、その類似体ｄＡＴＰαＳを使用することも
できる。

【００７７】本発明の試薬キットの使用により、試薬に
含まれる不純物ＰＰｉ、ＡＴＰを分解するので、測定感
度が向上し、測定の信頼性の向上が図れる。

【００７８】（実施例２）実施例２はＳＮＰｓ分析に関
する。ＳＮＰｓ分析では、各ＤＮＡ試料の変異型（ミュ
ータント）の有無を調べるタイピングに加え、混合ゲノ
ム試料に含まれる特定の変異の存在率や発現頻度（Freq
uency）測定が重要である。ＳＮＰｓは、核酸の１塩基
変異であり、人の集団に数％の発現頻度で存在する。１
塩基変異を詳細に調べると、例えば、偏頭痛を持ってい
る人に高発現頻度で現れる変異、たばこを吸うことで癌
になり易い人が高い発現頻度で持っている変異等が見つ
かってくる。

【００７９】このように種々の病気や対薬品感受性と関
連したＳＮＰｓは、医療診断に重要であり、探索がなさ
れている。しかし、膨大な数のＳＮＰｓについて非常に
多数の人々の試料を個々に測定することは手間がかか
り、効率は良くない。

【００８０】そこで、多数の人々のＤＮＡを混合（pool
ed sampleと呼ばれる）し、含まれる変異の存在率を調
べる方法が注目され始めている。ヒトＤＮＡに於ける変
異の平均存在率は５％程度であり、変異の発現頻度が病
気または対薬品感受性と関連する率は、１−２％であ
る。つまり、平均５％の変異と６％の変異を区別できる
計測が必要となる。しかし、平均５％の変異と６％の変
異を区別できる計測方法、装置は、まだ実現されておら
ず、重要な課題となっている。この課題に対しても、本
発明の方法、試薬キットは有効である。

【００８１】図８は、本発明の実施例２に於ける、プラ
イマー伸長法によるＳＮＰｓ発現頻度の計測方法の例の
原理を説明する模式図である。プライマー伸長法による
ＳＮＰｓ発現頻度分析法（出願番号２０００−３００５
７７）ついて、以下に説明する。

【００８２】図８（Ａ）に示すように、まず、１本鎖Ｄ
ＮＡ試料８０１の１つの変異部位に、プライマーの３’
末端８０３がＳＮＰｓのある塩基部位に一致するように
プライマー８０４を用意する。プライマー８０４の末端
塩基が１本鎖ＤＮＡ試料８０１と相補的な場合のみ相補
鎖伸長８０６が起き、大量のＰＰｉ８０７が生じ大量の
発光８０８が生成する。一方、図８（Ｂ）に示すよう
に、１本鎖ＤＮＡ試料８０２がプライマー８０４の３’
末端塩基８０５と相補でない場合には相補鎖伸長が起こ
らない８０９か、起こっても僅かである。そのため、生
じるＰＰｉ８１０も僅かで発光８１１も僅かである。

【００８３】このようにプライマーの３’末端の塩基種
を変えることで、相補鎖伸長反応を起こしたり、起こさ
なかったりするスイッチの役目を持たせることができる
（文献：Kwok、 S., et al. Nucleic Acids Res, 1990,1
8,999-1005. Huang, M. M.,Arnheim, N., Goodman, M.
R.、 Nucleic Acids Res, 1992,20,4567-73）。

【００８４】また、変異部位の検出のために、ワイルド
タイプのＤＮＡ試料に相補的なプライマーとミュータン
トのＤＮＡ試料に相補的なプライマーの２つを用意する
ことにより、検出精度を向上できる。ピロシーケンシン
グ法が１種の塩基伸長のみで生成したＰＰｉに基づく発
光を検出するのに対して、プライマー伸長法による方法
では、多数塩基伸長（長い相補鎖の形成）により生成す
る多数のＰＰｉに基づく化学発光反応を行なうので、発
光量が２桁以上大きく、更に、化学発光反応が持続する
ので非常に高感度な検出が期待できる。

【００８５】更に、高感度化を達成させるためには、プ
ライマーと１本鎖ＤＮＡ試料とが相補でない場合に僅か
に起こるミスマッチによる伸長反応を抑える必要があ
る。プライマーの３’末端から３塩基目を人為的に１本
鎖ＤＮＡ試料と相補でない核酸塩基となるように設計し
た人工ミスマッチプライマーを使用することにより、相
補鎖伸長反応を起こしたり、起こさなかったりするスイ
ッチング特性をより確実にしたＳＮＰｓ発現頻度分析法
（ＢＡＭＰＥＲ法）がある。

【００８６】ＢＡＭＰＥＲ法では、相補鎖伸長を連続し
て数百塩基行ない、ＰＰｉを大量に生成して化学発光反
応により生じる発光を検出するので高い検出感度が得ら
れ、微量の１本鎖ＤＮＡ試料への適用、変異の検出への
適用が可能であるという利点がある。図２に示す、４種
類の核酸基質（ｄＮＴＰｓ）２０３の少なくとも１種類
を類似体に置換することもできる。例えば、ｄＡＴＰの
代りにｄＡＴＰαＳを使用する。

【００８７】図２（Ｂ），（Ｃ）に示すサイクル反応に
より発光が持続するので、タイタープレートでの反応を
発光の測定系の外部で行ない、発光の測定時に測定系に
入れても良い。このようにすると、タイタープレートに
保持された９６試料または３８試料からの化学発光の計
測を１分以内に行なうことができ、多数のタイタープレ
ートを、順次、短時間に計測でき非常に高い測定スルー
プットを実現できる。例えば、１分間毎に９６試料に関
する化学発光の計測を行ない、１日当たり１０時間測定
すると仮定すると、１日に約６万試料の測定が行える。

【００８８】図９は、本発明の実施例２に於ける、人工
ミスマッチプライマーを用いたプライマー伸長法による
ＳＮＰｓ発現頻度の高感度な計測方法（ＢＡＭＰＥＲ
法）の例の原理を説明する図である。

【００８９】まず、ＰＣＲまたは特異的なＤＮＡプロー
ブをＤＮＡ試料とハイブリダイズさせて相補鎖伸長反応
により調整された１本鎖ＤＮＡ試料９０１を準備する。
この１本鎖ＤＮＡ試料９０１は、図９（Ａ）に示すよう
に、１本鎖ＤＮＡ試料９０１に核酸塩基９０６で示す塩
基Ｃが１つのＳＮＰｓとして存在するように調整され
る。

【００９０】次いで、人工ミスマッチプライマー９０５
を用意する。このプライマー９０５は３’末端９０３の
塩基ＧがＤＮＡ試料９０１の核酸塩基９０６と相補であ
り、３’末端から３つ目の核酸塩基９０４がＤＮＡ試料
９０１と相補でない塩基Ａとされる。プライマー９０５
のその他の配列はＤＮＡ試料９０１の配列に相補となる
ようにされる。

【００９１】このように準備された１本鎖ＤＮＡ試料９
０１と人工ミスマッチプライマー９０５とは、図９
（Ａ）に示すように、人工ミスマッチプライマー９０５
の３’末端の塩基Ｇが１本鎖ＤＮＡ試料９０１の塩基Ｃ
９０６と相補であり、相補鎖伸長９０７が進み、大量の
ＰＰｉ９０８が生じて発光９０９が生じる。これによ
り、１本鎖ＤＮＡ試料９０１に１つのＳＮＰｓが存在す
ることが確認される。

【００９２】一方、１本鎖ＤＮＡ試料９０１を準備した
のと同様の手法で、１本鎖ＤＮＡ試料９０２を準備す
る。この１本鎖ＤＮＡ試料９０２は、図９（Ｂ）に示す
ように、１本鎖ＤＮＡ試料９０１の１つのＳＮＰｓがあ
った部位（塩基ｃ９０６）には、これに代わる塩基Ａ９
１０が存在するように調整される。

【００９３】１本鎖ＤＮＡ試料９０２と人工ミスマッチ
プライマー９０５とをハイブリダイズさせようとする
と、図９（Ｂ）に示すように、プライマー９０５の３’
末端の塩基Ｇが１本鎖ＤＮＡ試料９０２の部位９１０に
ある塩基Ａと相補でないから、プライマー９０５の３’
末端９１１がほぼ完全に１本鎖ＤＮＡ９０２から離れ
る。そのため、相補鎖伸長は起こらず、図９（Ａ）に示
したようなＰＰｉは殆ど生成せず、殆ど発光は生じな
い。

【００９４】このように、人工ミスマッチププライマー
９０５の３’末端から２〜３塩基目の塩基種は相補鎖伸
長反応の進行にはあまりに影響を与えないが、人工ミス
マッチププライマー９０５の３’末端の塩基９１１が１
本鎖ＤＮＡ試料９０２の塩基９１０と相補でない場合に
は、人工ミスマッチププライマー９０５の３’末端がほ
ぼ完全に１本鎖ＤＮＡ試料から離れ、ミスマッチによる
相補鎖伸長反応が殆ど進行しない状態となる。このた
め、ＳＮＰｓの有無の検出が非常に明確となり、検出感
度が向上する。

【００９５】図１０に、本発明の実施例２に於ける人工
ミスマッチプライマーおよび５’→３’エクソヌクレア
ーゼを用いたプライマー伸長法によるＳＮＰｓ発現頻度
の高感度な計測方法の例の原理を説明する図を示す。こ
の例は、伸長相補鎖を酵素切断して、繰り返し相補鎖伸
長反応を行なうことにより、非常に多くの分子数のピロ
リン酸を生成して検出感度を向上させるものである（特
願２０００−３００５７７参照）。

【００９６】まず、最上段に示すように、５’末端をビ
ーズ等の固体担体１５０１に固定した標的１本鎖ＤＮＡ
１５０２とプライマー１１７をＤＮＡポリメラーゼとと
もに反応溶液中におく。その結果、図９（Ａ）で説明し
たのと同様に、プライマー１１７の伸長相補鎖８０６が
形成されるとともにＰＰｉ８０８が生成される。ただ
し、この実施例では、プライマー１１７の相補鎖８０６
の伸長段階では発光に関する酵素類は反応溶液に入れな
い。

【００９７】次いで、所定の相補鎖８０６の伸長が進ん
だ段階で相補鎖伸長反応は終了し、プライマー１１７の
伸長相補鎖８０６により形成された相補鎖１００６とタ
ーゲットＤＮＡ１５０２による２本鎖のＤＮＡが形成さ
れる。この状態で、反応溶液中に、相補鎖を酵素切断す
るためのエキソヌクレアーゼを投入する。この結果、形
成された相補鎖１００６は、エキソヌクレアーゼ反応に
より、１つずつヌクレオチドに分解され、最終的に標的
１本鎖ＤＮＡ１５０２が再生される。

【００９８】相補鎖を酵素切断するエキソヌクレアーゼ
について説明しておくと、エキソヌクレアーゼにはＤＮ
Ａ鎖の５’末端から３’末端へ１つずつヌクレオチドを
分解していく５’→３’エキソヌクレアーゼと、ＤＮＡ
鎖の３’末端から分解していく３’→５’エキソヌクレ
アーゼがある。プライマーの３’末端のマッチ、ミスマ
ッチを相補鎖合成の有無の検出に利用する場合には、
３’→５’エキソヌクレアーゼは都合が悪い。プライマ
ーのミスマッチ部分が削り取られ、正常ＤＮＡと変異を
持つＤＮＡとの差が区別できなくなるからである。５’
→３’エキソヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡの５’末端
からＤＮＡ鎖を分解するが、ターゲットＤＮＡ１５０２
の５’末端をビーズ等の固体担体１５０１に固定した
り、５’末端を修飾して、５’→３’エキソヌクレアー
ゼによりターゲットＤＮＡが分解を受けないようにして
おく。３’末端のミスマッチによる変異の識別を行なう
場合には、５’→３’エキソヌクレアーゼが適してい
る。

【００９９】反応溶液中に余剰に存在するプライマー１
１７はこのターゲットＤＮＡ１５０２に、再び、ハイブ
リダイズして、プライマー１１７の伸長相補鎖１００６
が再度形成される。これにより新たにＰＰｉ８０８が生
成される。

【０１００】プライマー１１７の伸長相補鎖８０６の形
成により、伸張塩基数に応じたｎ分子のＰＰｉ８０８が
生成され、伸長相補鎖８０６の形成、相補鎖１００６の
５’→３’エキソヌクレアーゼ反応による分解の繰り返
しをｍ回行なうものとすると、合計ｍ回の伸長相補鎖８
０６の形成により、（ｍ×ｎ）分子のＰＰｉ１０１０が
生成されることになる。

【０１０１】（ｍ×ｎ）分子のＰＰｉ１０１０が生成さ
れた後に、発光に関する酵素類を反応溶液中に投入する
と、ＰＰｉ１０１０はＡＴＰに変換され、ＡＴＰはルシ
フェリンを酸化しＰＰｉを新たに生成する。新たに生成
するＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼの働きで、再び、
ＡＴＰとなりルシフェリンと反応する。従って、ｍ＝１
０とすれば、１回のＰＰｉ生成は１つのＤＮＡ相補鎖を
作るときに約１０００個放出され、これが１０回繰り返
されるので、発光量はピロシーケンシングなどに比べて
１００００倍となる。

【０１０２】この例でも、図９（Ｂ）のように、ターゲ
ットＤＮＡ１５０２にプライマー１１７をハイブリダイ
ズさせたとき、プライマー１１７の３’末端のミスマッ
チがあるときは相補鎖伸長反応は進行しない。プライマ
ー１１７の３’末端の近傍に、必要に応じて人工的にミ
スマッチができるように配列を工夫する等により、正確
にミューテーションを調べることができる。

【０１０３】しかし、図８で説明したプライマー伸長
法、図９および図１０で説明したＢＡＭＰＥＲ法の何れ
の方法に於いても、使用する試薬に不純物としてＡＴＰ
やＰＰｉが含まれており、ノイズ信号の原因となってい
る。本発明では、図８、図９に示すＳＮＰｓ発現頻度の
分析法に於いてノイズ信号を激減させ、更に検出感度の
向上を可能とする。

【０１０４】実施例１と同様に、図８、図９に示すＳＮ
Ｐｓ発現頻度の分析の実施に先立って、使用される全て
の試薬に予め、ＰＰａｓｅ、またはＰＰａｓｅが固定さ
れた担体を添加して、各試薬に不純物として含まれるＰ
Ｐｉを分解する。また、ｄＮＴＰ以外の各試薬に予め、
Ａｐｙｒａｓｅ、またはＡｐｙｒａｓｅが固定された担
体を添加して、各試薬に不純物として含まれるＡＴＰを
分解しておく。

【０１０５】あるいは、図８、図９および図１０に示す
ＳＮＰｓ発現頻度の分析の実施に於いては、ＰＰａｓ
ｅ、またはＰＰａｓｅが固定された担体が添加された試
薬キットを使用する。図８、図９および図１０に示すＳ
ＮＰｓ発現頻度の分析の実施に於いて、使用される全て
の試薬の各々に、ＰＰａｓｅ、またはＰＰａｓｅが固定
された担体が添加された試薬キットが提供される。ま
た、ｄＮＴＰ以外の試薬の各々に、Ａｐｙｒａｓｅ、ま
たはＡｐｙｒａｓｅが固定された担体が添加された試薬
キットが提供される。

【０１０６】本発明の試薬キットの使用により、試薬に
含まれる不純物ＰＰｉ、ＡＴＰを分解するので、検出感
度が向上し、検出の信頼性の向上が図れる。

【０１０７】ところで、ピロシーケンシング法では、反
応溶液にＡｐｙｒａｓｅを加え、過剰のｄＮＴＰを速や
かに分解して、次の反応の邪魔にならないようにしてい
る。この場合、ＡｐｙｒａｓｅはＡＴＰも分解するの
で、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの化学発光反応（図３
（Ｃ））、およびＡｐｙｒａｓｅによる分解反応（図
３）で競合して消費される。従って、化学発光反応によ
り生じる発光の強度はＡｐｙｒａｓｅを入れない時に比
較すると数〜数十％になっている。

【０１０８】このピロシーケンシング法の反応を利用し
て塩基配列決定またはＳＮＰｓ検出を行なう場合には、
ＤＮＡ試料は０．２ｐｍｏｌ程度必要となる。

【０１０９】本発明ではＢＡＭＰＥＲ法に於いて、ＰＰ
ａｓｅを固定した担体、Ａｐｙｒａｓｅを固定した担体
を用いて、不純物を分解した後に、ＰＰａｓｅを固定し
た担体、Ａｐｙｒａｓｅを固定した担体を反応溶液から
取り出すことにより、相補鎖伸長に伴い放出されたＰＰ
ｉによって生じたＡＴＰを無駄なくルシフェリン等の発
光基質と反応させることを可能とし、高い検出感度が得
られる。

【０１１０】図１１は、本発明の実施例２に於ける、人
工ミスマッチプライマーを用いたプライマー伸長法（Ｂ
ＡＭＰＥＲ法）によるＳＮＰｓ検出での、ＰＰａｓｅに
よる前処理の効果の一例を示す図である。即ち、本発明
の試薬キット使用の有無による、ＢＡＭＰＥＲ法に基づ
くＳＮＰｓ発現頻度分析の結果例について説明する。

【０１１１】試料として、配列番号１）の配列をもつ、
Ｍ１３ｍｐ１８の一部の１本鎖ＤＮＡを使用した。使用
した試料量は０．５ｆｍｏｌである。配列中、下線を付
した塩基がＳＮＰｓ部位である。３’末端がＳＮＰｓ部
位と一致する（相補鎖が伸長する）人工ミスマッチプラ
イマーとして配列番号２）の配列をもつプライマーを、
３’末端がＳＮＰｓ部位と一致しない（相補鎖が伸長し
ない）人工ミスマッチプライマーとして配列番号３）の
配列をもつプライマーを、それぞれ、使用した。なお、
配列番号１）、配列番号２）、配列番号３）の配列に於
いて、大文字で示す塩基がミスマッチ部位である。ａｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇａ
ｔｔａｃｇａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃ
ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｃｃｔｇ
ｃａｇｇｃａｔｇｃａａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔＧ
ｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃａ：（配列番号１）ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃＧａｇ：（配列番号
２）ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃＧａｔ：（配列番号
３）図１１に、伸張が無い条件での本発明による前処理を実
行しない場合の発光強度を「前処理無」で示し、本発明
のＰＰａｓｅおよびＡｐｙｒａｓｅを含む試薬キットを
用いて、ＢＡＭＰＥＲ法の実施に先立って、ＢＡＭＰＥ
Ｒ法で使用する各試薬に対して、不純物を分解する前処
理を実行した場合の発光強度を「前処理有」で対比して
示したように、「前処理無」はノイズ信号としての発光
強度が非常に高く、ＤＮＡ試料が微量の場合にはＳＮＰ
ｓ部位の有無による信号を分離できないのに対して、
「前処理有」ではノイズ信号としての発光強度は微小で
ある。

【０１１２】図１１には、さらに、伸張が無い条件での
データをコントロールとして、ＳＮＰｓが存在するにＤ
ＮＡ試料に対して、本発明のＰＰａｓｅおよびＡｐｙｒ
ａｓｅを含む試薬キットを用いて、ＢＡＭＰＥＲ法を実
施して解析したときの伸張による発光強度を「前処理
有」として示した。「前処理有」における相補鎖の伸長
の有無に対応する発光強度を比較すれば、本発明の効果
は明確に理解できる。

【０１１３】図１２は、本発明の実施例２に於ける、人
工ミスマッチプライマーを用いたプライマー伸長法によ
るＳＮＰｓ検出とピロシーケンシング法によるＳＮＰｓ
検出の感度の比較例を示す図である。即ち、本発明のＰ
ＰａｓｅおよびＡｐｙｒａｓｅを含む試薬キットにより
前処理した各試薬を用いた場合の、ピロシーケンシング
法（Anal Biochemistry 280、103〜110(2000)）とＢＡＭ
ＰＥＲ法によるＳＮＰｓ検出の結果の一例について、以
下説明する。

【０１１４】試料として、図１１の結果を得た分析と同
じ配列番号１の配列をもつ、Ｍ１３ｍｐ１８の一部の１
本鎖ＤＮＡを使用した。使用した試料量は、ピロシーケ
ンシング法では０．５ｆｍｏｌ、１５０．０ｆｍｏｌで
あり、ＢＡＭＰＥＲ法では０．５ｆｍｏｌである。プラ
イマーとして、ピロシーケンシング法では配列番号４の
配列をもつ通常のプライマーを、ＢＡＭＰＥＲ法では図
１１の結果を得た分析と同じ配列番号２の配列をもつ人
工ミスマッチプライマーを用いた。なお、配列番号４の
配列に於いて、大文字で示す塩基がミスマッチ部位であ
る。ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃＣａｇ：（配列番号
４）ＢＡＭＰＥＲ法に本発明を適用した場合に得られる発光
の信号強度は、従来のピロシーケンシング法により得ら
れる発光の信号強度と比較して非常に高い。使用した試
料量が０．５ｆｍｏｌである場合、ピロシーケンシング
法では、発光は検出できなかった。Ｓ／Ｂ（伸長鎖の形
成に基づく信号／伸長鎖が形成されない場合のノイズ信
号）が、ＢＡＭＰＥＲ法で約１３、ピロシーケンシング
法で約１４であるとき、それぞれの方法で得られる発光
の信号強度比、即ち検出感度比は、およそ、２０００：
１である。

【０１１５】このように、ＢＡＭＰＥＲ法によるＳＮＰ
ｓ検出法に於いて本発明の前処理を適用した各試薬の使
用により、従来のピロシーケンシング法に比べて２桁〜
３桁以上の高感度な検出が可能となる。従来のピロシー
ケンシング法、または通常のゲル電気泳動に基づくシー
ケンシングでは、ｐｍｏｌオーダーの試料が必要である
が、本発明を適用したＢＡＭＰＥＲ法に必要な１本鎖Ｄ
ＮＡ試料の量は、５０ａｍｏｌ以下と非常に少ない。

【０１１６】ＢＡＭＰＥＲ法に於いてＳＮＰｓ部位を検
出するための、ワイルドタイプの１本鎖ＤＮＡ試料に相
補的なプライマーと、ミューテーションのある１本鎖Ｄ
ＮＡ（ミュータント）試料に相補的なプライマーの２つ
を用意して、発現頻度分析を実行できる。

【０１１７】図１３は、本発明の実施例２に於ける従来
のプライマーおよび人工ミスマッチプライマーをそれぞ
れ用いたＳＮＰｓ発現頻度の測定での求めるべき発光強
度、擬陽性の発光強度の比較例を示す図である。ここで
は、１本鎖ＤＮＡ試料としてｐ５３遺伝子の一部を用い
た場合のＳＮＰｓの検出結果例について説明する。

【０１１８】ワイルドタイプの１本鎖ＤＮＡは配列番号
５の配列をもつ。ワイルドタイプの１本鎖ＤＮＡに相補
的なプライマーはｐｒｉｍｅｒ−Ａであり、配列番号６
の配列をもつ。ミュータントの１本鎖ＤＮＡは配列番号
７の配列をもつ。ミュータントの１本鎖ＤＮＡに相補的
なプライマーはｐｒｉｍｅｒ−Ｔであり、配列番号８の
配列をもつ。本来、発光を生じないはずの通常のプライ
マー２種を、配列番号９の配列をもつｐｒｉｍｅｒ−
Ｃ、配列番号１０の配列をもつｐｒｉｍｅｒ−Ｇとす
る。なお、配列番号６から配列番号１１の配列に於い
て、大文字で示す塩基がミスマッチ部位である。ｃｔｔｔｃｔｔｇｃｇｇａｇａｔｔｃｔｃｔｔｃｃ
ｔｃｔｇｔｇｃｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｇ
ａｃａｇｇｃａｃＡａａｃａｃｇｃａｃｃｔｃａａ
ａｇｃｔｇｔｔｃｃｇｔｃｃｃａｇｔａｇａｔｔ
ａｃｃａ：（配列番号５）ａａｃａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇＡｔｔ
：（配列番号６）ｃｔｔｔｃｔｔｇｃｇｇａｇａｔｔｃｔｃｔｔｃｃ
ｔｃｔｇｔｇｃｇｃｃｇｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｇ
ａｃａｇｇｃａｃＴａａｃａｃｇｃａｃｃｔｃａａ
ａｇｃｔｇｔｔｃｃｇｔｃｃｃａｇｔａｇａｔｔ
ａｃｃａ：（配列番号７）ａａｃａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇＡｔａ
：（配列番号８）ａａｃａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇＡｔｇ：
（配列番号９）ａａｃａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇＡｔｃ：
（配列番号１０）図１３（Ａ）に示すように、本発明の前処理を実行しな
かった場合または本発明のＰＰａｓｅ、Ａｐｙｒａｓｅ
を含む試薬キットを用いないで、且つ、通常のプライマ
ーを使用した場合には、本来、発光しないはずのプライ
マーＰｒｉｍｅｒ−Ｃ、ｐｒｉｍｅｒ−Ｇを用いたとき
ですら、不純物による反応または擬似的なＤＮＡ鎖への
核酸基質の取り込みにより生じる擬陽性の発光（擬陽性
発光）１２０１がある。

【０１１９】しかし、図１３（Ｂ）に示すように、本発
明の前処理を実行し、または、本発明のＰＰａｓｅ、Ａ
ｐｙｒａｓｅを含む試薬キットを用い、プライマーの
３’末端から３塩基目に人為的にＤＮＡ試料の塩基と相
補でない核酸塩基が導入された人工ミスマッチプライマ
ーを用いたＢＡＭＰＥＲ法では、擬陽性発光１２０２の
発生を殆ど抑制できる。この結果、高感度検出が可能と
なる。

【０１２０】試料がワイルドタイプとミュータントの２
種のＤＮＡを含んでいる場合、各々に相補的な２種のプ
ライマーＰ_ＷおよびＰ_Ｍを用いる相補鎖伸長反応で生成
するＰＰｉによる化学発光の強度Ｉ_ＷおよびＩ_Ｍは、ワ
イルドおよびミュータントＤＮＡの存在率Ａ_Ｗ、Ａ_Ｍに
比例する。即ち、２つの化学発光反応での発光の測定に
より、Ｉ_ＷとＩ_Ｍを計測して相対強度Ｉ_Ｗ／（Ｉ_Ｗ＋Ｉ
_Ｍ）、およびＩ_Ｍ／（Ｉ_Ｗ＋Ｉ_Ｍ）を求めると、ワイル
ドおよびミュータントの試料中の存在率Ａ_Ｗ、およびＡ
_Ｍを知ることができる。この存在率の測定は、使用する
各試薬に含まれる不純物に起因する化学発光等に影響を
受ける。しかし、図１３に示すように、本発明の試薬キ
ットの使用により、不純物に起因する化学発光が低減さ
れているため、高い精度で存在率を計測できる。

【０１２１】本発明の実施例２に於けるｐ５３遺伝子お
よび人工ミスマッチプライマーを用いたＳＮＰｓ発現頻
度の分析結果例を表１に示す。

【０１２２】

【表１】

【０１２３】図１４は、本発明の実施例２に於ける人工
ミスマッチプライマーを用いたＢＡＭＰＥＲ法によるＳ
ＮＰｓ発現頻度の分析結果例をグラフで示す図である。
発現頻度の平均値は、０．６％以下の誤差で存在率（Ｓ
ＮＰ allele frequency）に一致し、１％以下の誤差で
存在率が決定できる。

【０１２４】単純にタイピング（試料がワイルドタイ
プ、ミュータント、あるいは、ワイルドタイプとミュー
タントのヘテロ体であるか否かを決めるタイピング）を
行なう場合は非常に簡単であり、ほぼ１００％の正確さ
でタイピングを実行できる。

【０１２５】（実施例３）実施例３は１種類の試料ＤＮ
Ａに複数の１塩基変異（ＳＮＰｓ）部があり、複数の１
塩基変異部を同一反応槽で順次分析する例である。

【０１２６】図１５は、本発明の実施例３に於ける同一
ＤＮＡまたは複数のＤＮＡに存在する複数ＳＮＰｓを同
一の反応槽で測定する方法の例を示す図である。実施例
３では、実施例２と同様に、ＢＡＭＰＥＲ法で使用する
人工ミスマッチプライマーを使用する。ＤＮＡ試料は、
血液からＤＮＡを抽出した後、必要な配列領域をＰＣＲ
等で増幅し、または特異的なＤＮＡプローブ（ＳＮＰｓ
検出に使用するプライマーとは異なる）をＤＮＡにハイ
ブリダイズさせて相補鎖伸長反応により調整する。

【０１２７】アビジンコートを施した磁気ビーズ等の担
体を用いて１本鎖ＤＮＡを調整する場合には、ビオチン
標識プライマーを用いて行うのが一般的である。その
際、調整したＤＮＡ試料溶液には増幅反応で用いたｄＮ
ＴＰｓや増幅反応で生じたＰＰｉが含まれるので、これ
らをＡｐｙｒａｓｅやＰＰａｓｅ等の酵素により分解す
ることで、化学発光反応に於けるノイズ信号を著しく低
下させる。これら酵素が発光の計測を妨害する場合に
は、図３に示す方法、装置を用いて、反応溶液から分離
して計測系外へ取り除く。

【０１２８】１本鎖ＤＮＡ試料１５０２に、複数のＳＮ
Ｐｓ部位ａ１５０３、ＳＮＰｓ部位ｂ１５０４、ＳＮＰ
ｓ部位ｃ１５０５が存在するとき、同一ＤＮＡを用いて
これらを分析することもできる。たとえば、標的１本鎖
ＤＮＡ試料１５０２の３’末端をビーズなどの担体１５
０１に固定し、まず、１本鎖ＤＮＡ試料１５０２とプラ
イマーの３’末端がＳＮＰｓ部位ｂ１５０４に一致する
第１のプライマー１５０６を、１本鎖ＤＮＡ試料１５０
２にハイブリダイズさせる。

【０１２９】第１のプライマー１５０６の３’末端塩基
がＤＮＡ試料１５０２のＳＮＰｓ部位ｂ１５０４の塩基
と相補的な場合のみ相補鎖伸長１５０７が形成され、大
量のＰＰｉ１５０８が生じ、化学発光反応により大量に
発光する。第１のプライマーの３’末端塩基が１本鎖Ｄ
ＮＡ試料１５０２の塩基と相補でない場合には、相補鎖
伸長が起こらないので発光しない。この発光の有無によ
り、ミューテーションの有無を判定する。

【０１３０】第１のプライマー１５０６による発光の測
定終了後、各試薬を洗い流し洗浄する。伸長して１本鎖
ＤＮＡ試料に結合した相補鎖は、溶液の温度を上昇させ
て解離させたり、液性をアルカリ性にしたり、あるい
は、図１０で説明したように、５’→３’エクソヌクリ
アーゼ反応により分解させて、１本鎖ＤＮＡ試料を溶液
内に再生させる。

【０１３１】次に、１本鎖ＤＮＡ試料１５０２とプライ
マーの３’末端塩基がＳＮＰｓ部位ａ１５０３に一致す
る第２のプライマー１５０９をハイブリダイズさせ、伸
長反応を行ない化学発光反応により生じる発光を測定す
る。１本鎖ＤＮＡ試料１５０２による発光の測定終了
後、上記と同様にして、１本鎖ＤＮＡ試料のみを溶液に
残す。

【０１３２】さらに、同様にして、１本鎖ＤＮＡ試料１
５０２と第３のプライマー１５１０をハイブリダイズさ
せ、伸長反応を行ない化学発光反応により生じる発光を
測定する。以下、同様の操作を、順次、繰り返す。

【０１３３】また、ＰＰａｓｅがＰＰｉは分解するがｄ
ＮＴＰｓは分解しないことを利用して、最初に第１のプ
ライマーにより形成される伸長鎖を除去せずに、異なる
ＳＮＰｓ部位を、順次、検出することも可能である。こ
の場合は、図３に説明した方法、装置を用いて、必要に
応じて、ＰＰａｓｅを反応溶液に導入したり、反応系の
外部へ取り出したりする。この場合、第２、第３のプラ
イマーの結合部位は同一のＤＮＡ鎖の上にあっても、異
なるＤＮＡ鎖上であっても良いが、同一ＤＮＡ鎖上にあ
る場合には、第２のプライマーの方が第１のプライマー
よりもＤＮＡ鎖の３’末端寄りにすることで、第１のプ
ライマーにより形成されたＤＮＡ相補鎖を取り除きなが
ら、相補鎖伸長が進行する様にできる。

【０１３４】このように、ＰＰａｓｅを用いることによ
り、バックグランドを低減し、高感度で１本鎖ＤＮＡ試
料のＳＮＰｓ部位を検出できる。また、一度生成したＰ
Ｐｉを、洗浄または分解により除去することで、同一の
試料ＤＮＡを相補鎖伸長反応の鋳型（標的）として繰り
返し使用できるので、１つのＤＮＡ試料で種々のＳＮＰ
ｓ部位を調べることができる。従って、試料調製の手間
が省け、効率の良い分析ができる。実施例３では、１種
のＤＮＡのみを用いて説明したが、複数種のＤＮＡ試料
を同時に用いても、同様にして容易に分析できる。

【０１３５】上述の洗浄の実行を省略して測定すること
もできる。この場合、発光を検出した後、反応系を計測
部から取り出して、ＰＰａｓｅによりＰＰｉが十分に分
解されるまで、数分間放置するか、ＰＰａｓｅを多量に
加えてＰＰｉが速やかに分解されるようにし、発光の持
続時間が短くなるようにして計測上問題が無い様にす
る。この測定では、発光強度が十分弱くなってから第２
のプライマーを入れて相補鎖伸長反応を行なう。反応溶
液には、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼが存在す
るので、相補鎖伸長は支障無く行われる。再び、多量の
ＰＰｉが生成し、化学発光反応により発光が生ずるの
で、計測部に反応系を導入して、化学発光を計測するこ
とになる。

【０１３６】以上、本発明における核酸塩基配列解析方
法の実施例においてＰＰａｓｅおよびＡｐｙｒａｓｅで
あらかじめ処理した試薬溶液を用いる有用性を示した。
ＰＰａｓｅ、Ａｐｙｒａｓｅ等の酵素は作用温度内で活
性を表すが、使用試薬にＰＰａｓｅ処理を施す場合、そ
の添加量（濃度）は十分に夾雑ＰＰｉを分解し、且つ信
号検出に影響しない範囲で設定されていることが重要で
ある。一方、適切な範囲で添加量が設定されていれば、
ＰＰａｓｅが残存していても本来の計測に支障はない。

【０１３７】図１６は、本発明の実施例１に於ける、ピ
ロシーケンシング法における添加されたＰＰａｓｅの残
存量の違いに基づく信号強度の比較を示す図である。信
号測定は表２に示す条件とした。

【０１３８】

【表２】

【０１３９】試料には配列番号１１に示すｐ５３の一部
の１本鎖ＤＮＡを用いた。ｇｔｇｇｔａａｔｃｔａｃｔｇｇｇａｃｇｇａａｃ
ａｇｃｔｔｔｇａｇｇｔｇｃｇｔｇｔｔｔｇｔｇｃ
ｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇａｇａｇａｃｃ（配列番号
１１）プライマーは試料ＤＮＡと完全に相補的な配列番号１２
の配列を持つ伸長プライマーを用い、試料ＤＮＡ中に下
線を施した３塩基ｔｔｔの信号強度を比較した。ｇｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｇａｃａｇｇｃａ（配列
番号１２）図１６においては、伸張が無い条件でのＰＰａｓｅ処理
を施した場合のノイズ信号（ａ）をコントロールとし伸
張があるときの発光強度信号（ｂ）を、残存量をパラメ
ータして比較して示したものである。

【０１４０】本測定では、伸長が起こる条件で観測され
る信号（Ｓ）強度がノイズ信号（Ｎ）の１．２５倍以上
であれば（Ｓ／Ｎ＝１．２５）、伸長に基づく発光によ
る信号として検出できる。図から分かるように、０．２
Ｕ／ＬのＰＰａｓｅ（１６０１）であらかじめ反応溶液
を処理すれば核酸の塩基配列解析は行える。しかし、ま
だノイズ信号のレベルは高く、高感度検出は出来ない。
ノイズ信号が観測されなくなるまで十分量のＰＰａｓｅ
を作用させた方が良い。ところが、たとえば、５．０Ｕ
／ＬのＰＰａｓｅ（１６０３）であらかじめ反応溶液を
処理すると、ノイズ信号はほぼ観測されなくなるが、同
時に伸長に基づく信号も減少する。これはＰＰｉの分解
速度が速まり、伸長に基づいて放出されたＰＰｉを発光
反応前に分解してしまうからで、結果として、核酸試料
は相補鎖伸長しているにも関わらず発光は検出されにく
くなり、この場合も高感度検出は出来ない。図には示さ
なかったが、残存量が２０Ｕ／Ｌ以上となるほどＰＰａ
ｓｅを添加すると発光信号は全く検出されなかった。た
とえば、５．０Ｕ／ＬのＰＰａｓｅ処理を施し、これを
完全に除去した後に発光測定を行なう方法（１６０４）
が最も良好なＳ／Ｎを与え、高感度検出を可能にするこ
とが分かる。しかし、計測に必要十分な分解能でのＳ／
Ｎを持つという点では、０．８Ｕ／ＬのＰＰａｓｅ（１
６０２）を添加したのみの場合と大きな違いはない。

【０１４１】このことは、本発明では、事前のＰＰａｓ
ｅ処理は不可欠であり、最適な添加量を選択すれば、除
去しなくても、また、大過剰のＰＰａｓｅで処理して
も、伸張、測定に先んじてこれを除去すれば、十分にノ
イズ信号を減少させ、かつ、十分な強度の発光強度信号
を得ることができることを意味している。これにより高
感度検出が可能になる。

【０１４２】ＡｐｙｒａｓｅはｄＮＴＰｓおよびその類
似体を含む溶液以外の試薬溶液に加えるが、これについ
ても同じことが言える。

【０１４３】図１７に、本発明のＰＰａｓｅおよびＡｐ
ｙｒａｓｅを用いた反応試薬の処理工程を有する核酸塩
基配列自動解析装置の一例を示す。（Ａ）は全体の構成
図を、（Ｂ）−（Ｄ）は試薬から夾雑のＰＰｉあるいは
ＡＴＰを除去するための除去部の具体例を示す。図の実
施例によれば、多数の試料を同時に解析すること、試薬
注入、試料注入、検出などの測定に要する諸操作のオン
ライン自動化により、核酸塩基配列解析のスループット
を向上させることが可能となる。図において、１８０１
は数μＬ以下の容積の反応槽であり、１８０２は解析チ
ップである。反応槽１８０１は解析チップ１８０２上に
同心円上に多数配列される。解析チップ１８０２の形状
は本例のようにＣＤ型でもスクエアシート型でも良い。
１８０３は試薬ディスペンサーであり、プライマー、相
補鎖伸長反応に必要な諸試薬、発光反応に必要な諸試薬
を反応槽１８０１に供給する。１８０５は試薬から夾雑
のＰＰｉあるいはＡＴＰを除去するための除去部であ
る。

【０１４４】すなわち、本発明では、測定に先行して、
試薬をＰＰａｓｅあるいはＡｐｙｒａｓｅで処理するわ
けであるが、試薬ディスペンサー１８０３から試料に試
薬を供給する前段階に、試薬から夾雑のＰＰｉあるいは
ＡＴＰを除去するための除去部１８０５を配置する。
（Ｂ）に示す除去部１８０５は、フィルター１８０６と
フィルターホルダー１８０７からなる例である。ビーズ
等の固体に固定したＰＰａｓｅあるいはＡｐｙｒａｓｅ
が入れてある試薬を用いる場合には、これらはフィルタ
ー１８０６により試薬から除去される。フィルター１８
０６の素材はポリスチレンなどの高分子シートでも多孔
質ガラスでも良いが、φ１〜２ｃｍ、孔径φ０．２〜
１．４μｍ程度のものを用い、ここに酵素固定のφ３μ
ｍ程度のビーズを含む溶液を流速２ｍＬ／分程度で流
す。フィルタホルダーの大きさは処理する試薬量により
適宜選べ、全長が１〜５ｃｍ程度である。ここで、図３
（ｃ）に説明したように、フイルターの代わりにＮＷＭ
Ｌ＝１０，０００程度の分子量選択透過膜を用いれば、
ＰＰａｓｅ分子、Ａｐｙｒａｓｅ分子を直接除去するこ
ともできる。（Ｃ）に示す除去部１８０５は、内部にＰ
Ｐａｓｅ固定のビーズ１８０８およびＡｐｙｒａｓｅ固
定のビーズ１８０９を詰めたカラム１８１０とした例で
ある。測定条件に応じて未処理の試薬を用意した場合に
も溶液がカラム１８１０を通過する過程で処理が施さ
れ、夾雑ＰＰｉおよび夾雑ＡＴＰは測定前に自動的に除
去される。（Ｄ）に示す除去部１８０５は、カラム内部
に直接成長させた多孔質１８１１に直接ＰＰａｓｅやＡ
ｐｙｒａｓｅが固定されているカラム１８１２とした例
である。カラム１８１２にはポリスチレン、溶融シリ
カ、ガラスなどを素材とする粒径φ３μｍ程度のビーズ
を詰める。カラム全体の体積は５〜１０ｍＬ程度とし、
流速は処理したい溶液に合わせて適宜選択し、作用時間
を調節する。例えば体積１０ｍＬのカラムを用い、カラ
ム中の全ＰＰａｓｅ量を３０ｍＵ程度（Ｕ：活性単位、
ユニット）にしておけば、０．５ｍＬ／分程度の流速で
試薬溶液を通過させれば夾雑ＰＰｉを分解・除去するの
に十分である。なお、除去部１８０５は、いずれの場合
でも、フィルターホルダー１８０７を備えて、その中を
フィルターあるいはカラムを着脱・交換するものとする
のが便利である。

【０１４５】試薬溶液の送液は、いずれにおいても、シ
リンジや圧電素子を用いて直接液体を押し出し（ポンピ
ング）ても、圧縮ガスを介して間接的に押しても良い。
あるいはディスペンサー１８０３側を負圧にして引いて
も良い。

【０１４６】本実施例では、（１）異なる複数の核酸試
料の塩基配列解析、（２）異なる複数の核酸試料のある
特定個所の一塩基多型部の解析、あるいは（３）一種の
核酸試料における複数の一塩基多型部などを同時に解析
することができる。（１）の場合は個々の反応槽に核酸
試料を入れておき、１種のプライマー、相補鎖伸長反応
に必要な諸試薬、発光反応に必要な諸試薬をから同時に
供給し、４種の核酸基質（ｄＮＴＰ：Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、
Ｃ）あるいはその類似体は順次供給する。（２）の場合
には４種の核酸基質の混合溶液を試薬ディスペンサー１
８０３から同時に供給する。（３）の場合は個々の反応
槽に同一の核酸試料を入れておき、複数種のプライマー
を順次加えても、個々の反応槽に各々異なる核酸試料を
入れておき複数種のプライマーを順次加えても良い。い
ずれの場合も個々の反応槽からの相補鎖伸長に伴う生物
発光をフォトセンサー１８０４で検出することで核酸塩
基の配列解析を行う。

【０１４７】

【発明の効果】本発明の核酸塩基配列解析析法および試
薬キットおよび核酸塩基配列解析装置によれば、高感度
で短時間にＤＮＡ試料のＳＮＰｓの有無を検出できる。
また、本発明の前処理、または試薬キットを使用して、
本発明の核酸塩基配列解析方法で使用される試薬に含ま
れる不純物、または核酸基質が熱分解して生成する無機
ピロリン酸（ＰＰｉ）等の不純物を分解し除去して、Ｓ
ＮＰｓの存在比の測定を、高い信頼度、高い精度で実行
可能にする。更に、本発明の核酸塩基配列解析方法で
は、短時間で多数の試料を測定できる、高速高スループ
ットのＤＮＡ検査システムを実現できる。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> HITACHI, LTD. <120> Method of DNA Sequencing, Reagent Kit for DNA Sequencing and Appar atus for DNA Sequencing <130> NT01P0333 <160> 12 <210> 1 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template DNA originating from M13mp18 <400> 1 acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga 60 gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt ttaca 105 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer complementary with base sequence between 88 and 105 of SEQ ID NO:1, but the base replaced C at 15 of this DNA primer by G for i ntroducing a mismatch between DNA primer and template DNA, and DNA prime r being able to be extended <400> 2 tgtaaaacga cggcgag 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> DNA primer complementary with base sequence between 88 and 105 of SEQ ID NO:1, but the base replaced C at 15 of this DNA primer by G for i ntroducing a mismatch between DNA primer and template DNA, and DNA prime r being not able to be extended <400> 3 tgtaaaacga cggcgat 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> DNA primer complementary with base sequence between 88 and 105 of SEQ ID NO:1, and DNA primer being able to be extended <400> 4 tgtaaaacga cggccag 17 <210> 5 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template DNA originating from p53 and including base sequence of e xon 8 <400> 5 ctttcttgcg gagattctct tcctctgtgc gccggtctct cccaggacag gcacaaacac 60 gcacctcaaa gctgttccgt cccagtagat tacca 95 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer complementary with base sequence between 55 and 76 of S EQ ID NO:5, but the base replaced T at 19 of this DNA primer by A for i ntroducing a mismatch between DNA primer and template DNA, and DNA prime r being able to be extended <400> 6 aacagctttg aggtgcgtga tt 22 <210> 7 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template DNA originating from p53 and including base sequence of e xon 8, but the base replaced A at 55 of this template DNA by T <400> 7 ctttcttgcg gagattctct tcctctgtgc gccggtctct cccaggacag gcactaacac 60 gcacctcaaa gctgttccgt cccagtagat tacca 95 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer complementary with base sequence between 55 and 76 of S EQ ID NO:7, but the base replaced T at 19 of this DNA primer by A for in troducing a mismatch between DNA primer and template DNA, and DNA primer being able to be extended <400> 8 aacagctttg aggtgcgtga ta 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer complementary with base sequence between 55 and 76 of S EQ ID NO:5 and 7, but the base replaced T at 19 of this DNA primer by A for introducing a mismatch between DNA primer and template DNA, and this DNA primer being not able to be extended <400> 9 aacagctttg aggtgcgtga tc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer complementary with base sequence between 55 and 76 of S EQ ID NO:5 and 7, but the base replaced T at 19 of this DNA primer by A for introducing a mismatch between DNA primer and template DNA, and this DNA primer being not able to be extended <400> 10 aacagctttg aggtgcgtga tg 22 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template DNA originating from p53 and including base sequence of e xon 8 <400> 11 gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt cctgggagag 60 acc 63 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> DNA primer complementary with base sequence between 44 and 63 of S EQ ID NO:11, and DNA primer being able to be extended <400> 12 ggtctctccc aggacaggca 20 配列表フリーテキスト（１）配列番号1の配列に関する他の情報の記載Ｍ１３ｍｐ１８遺伝子由来のサンプル１本鎖ＤＮＡ。（２）配列番号２の配列に関する他の情報配列番号１の配列の５’末端から８８番目から１０５番
目の部分に相補鎖結合し、１７塩基長を持つプライマー
で、５’末端から１５番目の塩基Ｃを塩基Ｇに置き換え
ミスマッチを導入した相補鎖伸長能力のあるＤＮＡ伸長
プライマー。（３）配列番号３の配列に関する他の情報配列番号１の配列の５’末端から８８番目から１０５番
目の部分に相補鎖結合し、１７塩基長を持つプライマー
で、５’末端から１５番目の塩基Ｃを塩基Ｇに置き換え
ミスマッチを導入した相補鎖伸長能力のないＤＮＡ伸長
プライマー。（４）配列番号４の配列に関する他の情報配列番号１の配列の５’末端から８８番目から１０５番
目の部分に相補鎖結合し、１７塩基長を持つプライマー
で、相補鎖伸長能力のあるＤＮＡ伸長プライマー。（５）配列番号５の配列に関する他の情報Ｐ５３遺伝子由来の１本鎖ＤＮＡであり、エクソン８の
配列を含むサンプル１本鎖ＤＮＡ。（６）配列番号６の配列に関する他の情報配列番号５の配列の５’末端から５５番目から７６番目
の部分に相補鎖結合し、２２塩基長を持つプライマー
で、５’末端から１９番目の塩基Ｔを塩基Ａに置き換え
ミスマッチを導入した相補鎖伸長能力のあるＤＮＡ伸長
プライマー。（７）配列番号７の配列に関する他の情報Ｐ５３遺伝子由来の１本鎖ＤＮＡであり、５’末端から
５５番目の塩基Ａを塩基Ｔに置き換えたサンプル１本鎖
ＤＮＡ。（８）配列番号８の配列に関する他の情報配列番号７の配列の５’末端から５５番目から７６番目
の部分に相補鎖結合し、２２塩基長を持つプライマー
で、５’末端から１９番目の塩基Ｔを塩基Ａに置き換え
ミスマッチを導入した相補鎖伸長能力のあるＤＮＡ伸長
プライマー。（９）配列番号９の配列に関する他の情報配列番号５および配列番号７の配列の５’末端から５５
番目から７６番目の部分に相補鎖結合し、２２塩基長を
持つプライマーで、５’末端から１９番目の塩基Ｔを塩
基Ａに置き換えミスマッチを導入した相補鎖伸長能力の
ないＤＮＡ伸長プライマー。（１０）配列番号１０の配列に関する他の情報配列番号５および配列番号７の配列の５’末端から５５
番目から７６番目の部分に相補鎖結合し、２２塩基長を
持つプライマーで、５’末端から１９番目の塩基Ｔを塩
基Ａに置き換えミスマッチを導入した相補鎖伸長能力の
ないＤＮＡ伸長プライマー。（１１）配列番号１１の配列に関する他の情報Ｐ５３遺伝子由来の１本鎖ＤＮＡであり、エクソン８の
配列を含むサンプル１本鎖ＤＮＡ。（１２）配列番号１２の配列に関する他の情報配列番号１１の配列の５’末端から４４番目から６３番
目の部分に相補鎖結合し、２０塩基長を持つプライマー
で、相補鎖伸長能力のあるＤＮＡ伸長プライマー。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１に於ける相補鎖伸長により生
成するＰＰｉを化学発光反応により検出する核酸塩基配
列解析方法での、ノイズを低減するための試料溶液調整
法を説明するフロー図。

【図２】本発明の実施例１に於ける、プライマーの１塩
基伸長により生じるＰＰｉを化学発光反応により検出す
る原理を説明する図。

【図３】（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は本発明の実施例
１に於ける、試薬やＤＮＡ試料に含まれる不純物の分解
を、固相または膜を用いてピロフォスファターゼおよび
アピラーゼにより行う前処理法の例、前処理装置の例を
説明する図。

【図４】本発明の実施例１に於ける、ＰＰａｓｅによる
前処理の有無によるノイズ信号の比較例を示す図。

【図５】本発明の実施例１に於けるＰＰａｓｅによる前
処理によるノイズ信号のｄＣＴＰの濃度依存性の例を示
す図。

【図６】本発明の実施例１に於ける、ピロシーケンシン
グを実行する核酸塩基配列解析装置の構成例を示す模式
図。

【図７】本発明の実施例１に於ける、ピロシーケンシン
グ法による伸長鎖の検出例を説明する図。

【図８】本発明の実施例２に於ける、プライマー伸長法
によるＳＮＰｓ発現頻度の計測方法の例の原理を説明す
る模式図。

【図９】本発明の実施例２に於ける人工ミスマッチプラ
イマーを用いたプライマー伸長法によるＳＮＰｓ発現頻
度の高感度な計測方法の例の原理を説明する図。

【図１０】本発明の実施例２に於ける人工ミスマッチプ
ライマーおよび５’→３’エクソヌクレアーゼを用いた
プライマー伸長法によるＳＮＰｓ発現頻度の高感度な計
測方法の例の原理を説明する図

【図１１】本発明の実施例２に於ける、人工ミスマッチ
プライマーを用いたプライマー伸長法によるＳＮＰｓ検
出での、ＰＰａｓｅによる前処理の効果の一例を示す
図。

【図１２】本発明の実施例２に於ける人工ミスマッチプ
ライマーを用いたプライマー伸長法によるＳＮＰｓ検出
とピロシーケンシング法によるＳＮＰｓ検出の感度の比
較例を示す図。

【図１３】本発明の実施例２に於ける従来のプライマー
および人工ミスマッチプライマーをそれぞれ用いたＳＮ
Ｐｓ発現頻度の測定での求めるべき発光強度、擬陽性の
発光強度の比較例を示す図。

【図１４】本発明の実施例２に於ける人工ミスマッチプ
ライマーを用いたＳＮＰｓ発現頻度の分析結果例をグラ
フで示す図。

【図１５】本発明の実施例３に於ける同一ＤＮＡまたは
複数のＤＮＡに存在する複数ＳＮＰｓを同一の反応槽で
測定する方法の例を示す図。

【図１６】本発明の実施例１に於ける、ピロシーケンシ
ング法における添加されたＰＰａｓｅの添加量の違い
と、ＰＰａｓｅ除去操作の有無に基づく信号強度の比較
を示す図。

【図１７】本発明に於ける、ＰＰｉ、ｄＮＴＰｓおよび
ＡＴＰ除去機構を備えた核酸塩基配列およびＳＮＰｓ自
動解析装置を示す図。本発明のＰＰａｓｅおよびＡｐｙ
ｒａｓｅを用いた反応試薬の処理工程を有する核酸塩基
配列自動解析装置の一例を示す図であり、（１）は全体
の構成図を、（Ｂ）−（Ｄ）は試薬から夾雑のＰＰｉあ
るいはＡＴＰを除去するための除去部の具体例を示す。

【符号の説明】１０１：被験者から採取した血液、１０２：抽出した２
本鎖ＤＮＡ、１０３：ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）、１０７：アピラーゼ
（Ａｐｙｒａｓｅ）および／またはピロフォスファター
ゼ（ＰＰａｓｅ）、１０８：相補鎖伸長および化学発光
に用いる混合溶液、１０９：ｄＮＴＰｓを含む溶液、１
１０：前処理を施したｄＮＴＰｓを含む溶液、１１２：
相補鎖伸長反応、１１３：化学発光、１１４：発光検出
１１８：伸長したプライマーがハイブリダイズした標的
１本鎖ＤＮＡ、１０４，２０１，７０１，８０１，８０
２，９０１，９０２，１５０２：１本鎖ＤＮＡ試料、１
１７，２０２，７０２：プライマー，２０３：核酸基質
（ｄＮＴＰｓ：ｄＡＴＰαＳ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＴＴＰ）、２０４：ＤＮＡポリメラーゼ、２０５，２０
６，２１６，７０７，７１２：ＰＰｉ、２０７：ＡＰ
Ｓ、２０８：ＡＴＰスルフリラーゼ、２０９，２１１：
ＡＴＰ、２１０：硫酸イオン、２１２：ルシフェリン、
２１３：酸素、２１４：ルシフェラーゼ、２１５：ＡＭ
Ｐ、２１７：オキシルシフェリン、２１８：二酸化炭
素、２１９：発光（１光子放出）、１０５，３０１：Ａ
ｐｙｒａｓｅ、１０６，３０２：ＰＰａｓｅ、３０３：
前処理を施していない試薬またはＤＮＡ試料、３０４：
試薬またはＤＮＡ試料中の不純物の核酸基質（ｄＮＴＰ
ｓ：ｄＡＴＰαＳ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、
３０５：試薬またはＤＮＡ試料中の不純物のＡＴＰ、３
０６：試薬またはＤＮＡ試料中の不純物のＰＰｉ、３０
７：前処理済みの溶液、３０８：デオキシヌクレオシド
一リン酸（ｄＮＭＰ）、３０９：アデニル酸（ＡＭ
Ｐ）、３１０：ＡＴＰ，ＰＰｉおよび核酸基質の分解で
生ずるＰｉ、３１１，３１２：：ビーズなどの固相表
面、３１３：細管内壁などの固相表面、３１４：分子量
選択透過膜、６０１：反応槽、６０２：ホトセンサー、
６０３：増幅器、６０４：ローパスフィルター、６０
５：データ処理装置、７０３，７１０：ｄＡＴＰαＳ、
７０４：ｄＣＴＰ、７０５：ｄＴＴＰ、７０６，７１
１：１塩基伸長反応、７０７，７１２：１塩基伸長に伴
い放出されたＰＰｉ、７０８，７１３：化学発光、７０
９：ｄＧＴＰ、８０３，８０５：プライマーの３’末
端、８０４：プライマー、８０６，９０７：相補鎖伸長
反応による伸長、８０７，９０８，１５０８：大量のＰ
Ｐｉ、８０８，９０９：大量のＰＰｉに基づく強い発
光、８０９：僅かな相補鎖伸長、８１０：極微量のＰＰ
ｉ、８１１：極微量のＰＰｉに基づく微弱な発光、９０
３，９１１：人工ミスマッチプライマーの３’末端の塩
基、９０４：人工ミスマッチプライマーの３’末端から
３塩基目の塩基、９０５：人工ミスマッチプライマー、
９０６：人工ミスマッチプライマーの３’末端の塩基が
１本鎖ＤＮＡ試料の塩基と相補である状態、９１０：人
工ミスマッチプライマーの３’末端の塩基が１本鎖ＤＮ
Ａ試料の塩基に相補でない状態、９１２：伸長反応が起
こらない状態、９１３：ＰＰｉが殆ど生じない状態、９
１４：発光が殆ど無い状態、１０１０：ｍ回の繰り返し
伸張反応で生じたｍ×ｎ個のＰＰｉ、１２０１，１２０
２：擬陽性発光、１５０１：ビーズなどの固相表面、１
５０３，１５０４，１５０５：同一ＤＮＡ鎖上の異なる
ＳＮＰｓ部位、１５０６：ＳＮＰｓ部位ｂ用に設計した
人工ミスマッチプライマー、１５０９：ＳＮＰｓ部位ａ
用に設計した人工ミスマッチプライマー、１６０１：
０．２Ｕ／ＬのＰＰａｓｅで処理（発光測定時のＰＰａ
ｓｅ除去無）した場合の発光信号、１６０２：０．８Ｕ
／ＬのＰＰａｓｅで処理（発光測定時のＰＰａｓｅ除去
無）した場合の発光信号、１６０３：５．０Ｕ／ＬのＰ
Ｐａｓｅで処理（発光測定時のＰＰａｓｅ除去無）した
場合の発光信号、１６０４：５．０Ｕ／ＬのＰＰａｓｅ
で処理（発光測定時のＰＰａｓｅ除去有）した場合の発
光信号、１８０１：伸長および発光反応用反応槽、１８
０２：核酸塩基配列自動解析装置、１８０３：試薬ディ
スペンサー、１８０４：発光測定用フォトセンサー、１
８０５：ＰＰｉおよび／またはＡＴＰ除去用ユニット、
１８０６：ＰＰａｓｅおよび／またはＡｐｙｒａｓｅ保
持担体分離用フィルター、１８０７：フィルターホルダ
ー、１８０８：ＰＰａｓｅ固定ビーズ、１８０９：Ａｐ
ｙｒａｓｅ固定ビーズ、１８１０：カラム、１８１１：
多孔質担体、１８１２：ＰＰａｓｅおよび／またはＡｐ
ｙｒａｓｅ固定カラム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者周国華東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者釜堀政男東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA19 4B029 AA23 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR13 QR55 QR62 QS01 QS11 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的核酸に相補鎖結合したＤＮＡプライマ
ーの伸長反応に使用される試薬に含まれるピロリン酸を
ピロフォスファターゼにより分解する、または／およ
び、前記試薬に含まれるアデノシン５’−三リン酸をア
ピラーゼにより分解する工程と、前記伸長反応を行なう工程と、前記伸長反応により生成されるピロリン酸を検出する工
程と、を有することを特徴とする核酸塩基配列解析方
法。
【請求項２】請求項１に記載の核酸塩基配列解析方法に
於いて、前記ピロフォスファターゼ、または／および、
前記アピラーゼが担体に固定されていることを特徴とす
る核酸塩基配列解析方法。
【請求項３】少なくとも１種類のデオキシヌクレオチド
をその種類毎に含む溶液のそれぞれに、または、少なく
とも１種類の前記デオキシヌクレオチドの類似体を含む
少なくとも１種類の前記デオキシヌクレオチドをその種
類毎に含む溶液のそれぞれに、ピロフォスファターゼを
添加して、前記溶液のそれぞれに含まれるピロリン酸を
分解する工程と、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、前記工程で得
られた少なくとも１つの前記溶液を用いて、標的核酸に
相補鎖結合した前記ＤＮＡプライマーが伸長反応により
伸長され、前記伸長反応により生じたピロリン酸が化学
発光反応により検出される工程と、を有することを特徴
とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項４】少なくとも１種類のデオキシヌクレオチド
をその種類毎に含む溶液のそれぞれに、または、少なく
とも１種類の前記デオキシヌクレオチドの類似体を含む
少なくとも１種類の前記デオキシヌクレオチドをその種
類毎に含む溶液のそれぞれに、ピロフォスファターゼを
添加して、前記溶液のそれぞれに含まれるピロリン酸を
分解する工程と、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、前記工程で得
られた少なくとも１つの前記溶液を用いて、標的核酸に
相補鎖結合した前記ＤＮＡプライマーが伸長反応により
伸長され、前記伸長反応により生じたピロリン酸が、ア
デノシン−５’−ホスホ硫酸およびＡＴＰスルフリラー
ゼの存在下で、アデノシン５’−三リン酸に変換され、
前記アデノシン５’−三リン酸、発光酵素、発光基質を
含む化学発光反応により生じた発光が検出される工程
と、を有することを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項５】請求項４に記載の核酸塩基配列解析方法に
於いて、前記最初の工程の後に、前記溶液のそれぞれの
中の前記ピロフォスファターゼを除去する、または、失
活させる工程を有することを特徴とする核酸塩基配列解
析方法。
【請求項６】請求項４に記載の核酸塩基配列解析方法に
於いて、前記最初の工程は、前記ＤＮＡプライマーを含
む溶液、前記ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液、前記発光
酵素を含む溶液、前記発光基質を含む溶液、前記アデノ
シン−５’−ホスホ硫酸を含む溶液、前記ＡＴＰスルフ
リラーゼを含む溶液の少なくとも１つに、前記ピロフォ
スファターゼを添加して、前記溶液の少なくとも１つに
含まれる前記ピロリン酸を分解する工程、または／およ
び、アピラーゼを添加して、前記溶液の少なくとも１つ
に含まれるアデノシン５’−三リン酸を分解する工程を
有することを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項７】請求項６に記載の核酸塩基配列解析方法に
於いて、前記ピロフォスファターゼまたは／およびアピ
ラーゼが添加された前記溶液の中の前記ピロフォスファ
ターゼまたは／およびアピラーゼを除去する、または、
失活させる工程を有することを特徴とする核酸塩基配列
解析方法。
【請求項８】請求項７に記載の核酸塩基配列解析方法に
於いて、前記ピロフォスファターゼまたは／およびアピ
ラーゼが担体に固定されていることを特徴とする核酸塩
基配列解析方法。
【請求項９】請求項４に記載の核酸塩基解析法に於い
て、前記プライマーの３’末端の塩基が、標的核酸の１
塩基多型部位の３’末端側の１つ手前の塩基に相補的で
あることを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項１０】請求項４に記載の核酸塩基解析法に於い
て、前記ＤＮＡプライマーの３’末端から２塩基目、ま
たは、３塩基目の塩基が前記標的核酸の塩基配列と相補
的でない塩基に置換されていることを特徴とする核酸塩
基配列解析方法。
【請求項１１】デオキシアデノシン５’−α−チオ−三
リン酸もしくは、デオキシアデノシン５’−α−チオ−
トリフォスフェイトを含む溶液、デオキシチミジン５’
−三リン酸を含む溶液、デオキグアノシン５’−三リン
酸を含む溶液、デオキシシチジン５’−三リン酸を含む
溶液のそれぞれに、ピロフォスファターゼを添加して、
前記溶液のそれぞれに含まれるピロリン酸を分解する第
１の工程と、前記溶液のそれぞれの中の前記ピロフォスファターゼを
除去する、または、失活させる第２の工程と、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、前記第２の工
程で得られた少なくとも１つの前記溶液を用いて、標的
核酸に相補鎖結合した前記ＤＮＡプライマーが伸長反応
により伸長され、前記伸長反応により生じたピロリン酸
が、アデノシン−５’−ホスホ硫酸およびＡＴＰスルフ
リラーゼの存在下で、アデノシン５’−三リン酸に変換
され、前記アデノシン５’−三リン酸、ルシフェラー
ゼ、ルシフェリンを含む化学発光反応により生じた発光
が検出される第３の工程と、を有することを特徴とする
核酸塩基配列解析方法。
【請求項１２】デオキシアデノシン５’−α−チオ−三
リン酸もしくは、デオキシアデノシン５’−α−チオ−
トリフォスフェイト、デオキシチミジン５’−三リン
酸、デオキグアノシン５’−三リン酸、デオキシシチジ
ン５’−三リン酸を含む溶液に、ピロフォスファターゼ
を添加して、前記溶液に含まれるピロリン酸を分解する
第１の工程と、前記溶液の中の前記ピロフォスファターゼを除去する、
または、失活させる第２の工程と、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、前記第２の工
程で得られた前記溶液を用いて、標的核酸に相補鎖結合
した前記ＤＮＡプライマーが伸長反応により伸長され、
前記伸長反応により生じたピロリン酸が、アデノシン−
５’−ホスホ硫酸およびＡＴＰスルフリラーゼの存在下
で、アデノシン５’−三リン酸に変換され、前記アデノ
シン５’−三リン酸、ルシフェラーゼ、ルシフェリンを
含む化学発光反応により生じた発光が検出される工程
と、を有することを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の核酸塩基解析法に於
いて、前記ＤＮＡプライマーの３’末端から２塩基目、
または、３塩基目の塩基が前記標的核酸の塩基配列と相
補的でない塩基に置換されていることを特徴とする核酸
塩基配列解析方法。
【請求項１４】請求項１２に記載の核酸塩基配列解析方
法に於いて、前記伸長反応による伸長鎖を５’末端か
ら、５’→３’エクソヌクレアーゼ反応で分解し、前記
ＤＮＡプライマーを前記標的核酸に繰り返し相補鎖結合
させて前記伸長反応を行なうことを特徴とする核酸塩基
配列解析方法。
【請求項１５】デオキシアデノシン５’−三リン酸、デ
オキシチミジン５’−三リン酸、デオキグアノシン５’
−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸を含む溶
液に、ピロフォスファターゼを添加して、前記溶液に含
まれるピロリン酸を分解する第１の工程と、前記溶液の中の前記ピロフォスファターゼを除去する、
または、失活させる工程と、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび前記第２
の工程で得られた前記溶液を用いて、標的核酸に相補鎖
結合した前記ＤＮＡプライマーの伸長反応により生じた
ピロリン酸が化学発光反応により検出される工程と、を
有することを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項１６】請求項１５に記載の核酸塩基配列解析方
法に於いて、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオ
キシチミジン５’−三リン酸、デオキグアノシン５’−
三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸の何れかの
代りに類似体を使用することを特徴とする核酸塩基配列
解析方法。
【請求項１７】請求項１５に記載の核酸塩基配列解析方
法に於いて、前記ＤＮＡプライマーの３’末端から２塩
基目、または、３塩基目の塩基が前記標的核酸の特定の
領域の塩基配列と相補的でない塩基に置換されているこ
とを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項１８】請求項１５に記載の核酸塩基配列解析方
法に於いて、前記伸長反応による伸長鎖を５’末端か
ら、５’→３’エクソヌクレアーゼ反応で分解し、前記
ＤＮＡプライマーを前記標的核酸に繰り返し相補鎖結合
させて前記伸長反応を行なうことを特徴とする核酸塩基
配列解析方法。
【請求項１９】デオキシアデノシン５’−三リン酸、デ
オキシチミジン５’−三リン酸、デオキグアノシン５’
−三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸を含む溶
液に、ピロフォスファターゼを添加して、前記溶液に含
まれるピロリン酸を分解する第１の工程と、前記溶液の中の前記ピロフォスファターゼを除去する、
または、失活させる第２の工程と、相補鎖伸長能力を有し５塩基長から８塩基長の範囲の第
１のオリゴマーと、標的核酸に相補鎖結合し相補鎖伸長
能力のない第２のオリゴマーとを直列に前記標的核酸に
相補鎖結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ、前記第２の工程
で得られた前記溶液を用いて、前記第１のオリゴマーの
伸長反応を行ない、前記伸長反応により生じるピロリン
酸が化学発光反応により検出される工程と、を有するこ
とを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の核酸塩基配列解析方
法に於いて、デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオ
キシチミジン５’−三リン酸、デオキグアノシン５’−
三リン酸、デオキシシチジン５’−三リン酸の何れかの
代りに類似体を使用することを特徴とする核酸塩基配列
解析方法。
【請求項２１】請求項１９に記載の核酸塩基配列解析方
法に於いて、前記第１のオリゴマーの３’末端から２塩
基目、または、３塩基目の塩基が前記標的核酸の特定の
領域の塩基配列と相補的でない塩基に置換されているこ
とを特徴とする核酸塩基配列解析方法。
【請求項２２】少なくとも１種類のデオキシヌクレオチ
ドをその種類毎に含む溶液のそれぞれに、または、少な
くとも１種類の前記デオキシヌクレオチドの類似体を含
む少なくとも１種類の前記デオキシヌクレオチドをその
種類毎に含む溶液のそれぞれに、ピロフォスファターゼ
を有することを特徴とする試薬キット。
【請求項２３】請求項２２に記載の試薬キットに於い
て、ＤＮＡポリメラーゼを有することを特徴とする試薬
キット。
【請求項２４】デオキシアデノシン５’−α−チオ−三
リン酸もしくは、デオキシアデノシン５’−α−チオ−
トリフォスフェイト、デオキシチミジン５’−三リン
酸、デオキグアノシン５’−三リン酸、デオキシシチジ
ン５’−三リン酸、ピロフォスファターゼを有すること
を特徴とする試薬キット。
【請求項２５】請求項２４に記載の試薬キットに於い
て、前記ピロフォスファターゼが担体に固定されている
ことを特徴とする試薬キット。
【請求項２６】ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡプライマ
ー、アデノシン−５’−ホスホ硫酸、ＡＴＰスルフリラ
ーゼ、発光酵素、発光基質、アピラーゼの少なくとも１
つ、および、ピロフォスファターゼを有することを特徴
とする試薬キット。
【請求項２７】請求項２６に記載の試薬キットに於い
て、前記ピロフォスファターゼ、または／および、前記
アピラーゼが担体に固定されていることを特徴とする試
薬キット。
【請求項２８】標的核酸とこれにハイブリダイズするＤ
ＮＡプライマーとを固体表面の異なる区画に保持する複
数の前記区画を具備する反応チップと、前記複数の各区
画に前記プライマーを始点とする相補鎖伸長反応を起こ
すための試薬を供給する手段と、前記ターゲットＤＮＡ
にハイブリダイズした前記プライマーを始点とする相補
鎖伸長反応で生成されるピロリン酸と前記試薬を利用し
て生じる化学発光を検出する光検出器とを有するととも
に、前記試薬を供給する手段が前記試薬から夾雑のピロ
リン酸あるいはアデノシン５’−三リン酸を除去するた
めの除去部を介して試薬を供給するものであることを特
徴とする核酸塩基配列解析装置。