CN1910289A - 用于检测hiv的引物和探针 - Google Patents
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Abstract
此处提供了在测试样本中用于检测HIV(HIV－1)的引物/探针组。根据核酸扩增法，包括PCR、实时定量PCR或RT－PCR，使用该引物/探针组。该引物/探针组也可以试剂盒和其它试剂一起的形式提供，以用于核酸扩增反应。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)。本发明尤其涉及用于检测HIV-1的寡聚核苷酸和方法。
相关技术的描述
归类为HIV的病毒含有RNA作为它们的遗传信息，并且HIV的传染力依赖病毒将其遗传信息插入宿主DNA的能力。为了插入它的遗传信息并因此成功地感染宿主，HIV病毒必须将其遗传物质(RNA)转化为DNA，这样HIV遗传信息能够与宿主的遗传信息相容。考虑到艾滋病(AIDS)的流行，显而易见的是HIV在将其RNA转化为DNA上是成功的。然而，尽管病毒可以将RNA成功地转化为DNA，该转化很少是精确的。换句话说，病毒RNA的DNA复制并不是一直准确的，DNA拷贝与病毒RNA有几个碱基对的不同。因此，当宿主最初被单一病毒颗粒感染时，经过几轮的复制后，宿主可被遗传上不同的病毒种群感染。
在每种HIV-1的病毒分类中的是一些种群或亚型。由于高频率的突变，HIV-1有三个主要的遗传种群：O、N和M。在M种群中，存在亚型A、B、C、D、E、F和G。在每种种群和亚型中，在不同的位置发现许多突变。由于大多数美国病例是M种群B亚型，因此通用引物和探针可广泛应用于B亚型。然而，该系统并不适用于其它种群和亚型，并且取决于特定的流行频率，应在世界不同的地方使用不同的系统。这意味着现在还没有可利用的通用HIV检测体系。此外，甚至在美国，阴性测试结果并不能排除非B亚型HIV-1感染的可能性。这对输血是尤其重要的。值得提及的是，所有这些不一致是基于病毒之间的遗传变化，以及根据分类学理论，许多这些病毒是单一病毒的后代。HIV-1的亚型甚至可进一步分成很多种类。因此，大量的HIV型和亚型证明了HIV的高突变性和HIV基因组的遗传可变性。
如上面提及的，病毒的遗传可变性可归因于病毒将其RNA转化DNA的低效率。关于病毒遗传可变性的另一个理论是宿主可被多种不同的HIV种群感染(如上面提及的，可由单一病毒的感染引起)，并且通过病毒遗传信息的复制和包装过程，一种病毒基因组的片断可与其它病毒基因组的片断重组。因此，重组基因组包装后，形成遗传上不同的病毒。不管病毒突变的方式，清楚的是称作HIV的病毒具有高易变并因此不断变化的基因组。这为寻找基于其遗传信息检测病毒方法的人提供了不断改变的靶标。
因此，基于HIV的遗传信息来开发用于HIV检测的试剂和方法成为持续的挑战。
发明简述
本发明提供了基于这些病毒遗传信息用于检测HIV(特别是，HIV-1的多种亚型)的试剂。尤其是，试剂形式为引物和探针装置，该装置根据特异和敏感地检测多种HIV-1亚型的核酸扩增程序来使用。优选，此处所提供的引物/探针组包含两个引物序列和一个探针序列，并且按照反转录(RT)RCR形式来使用。尤其优选的实施方案按照TaqMan PCR形式来使用。
本发明包含两个通用引物(HIV-通用-F(正向)和HIV-通用-R(反向))和一个探针(HIV-通用-探针)的多种实施方案，其在HXB2基因组的pol区域得到鉴别。
检测HIV的方法通常包含的步骤(a)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、至少一种上文提及的引物/探针组和含有HIV靶序列的测试样本；(b)对混合物采用扩增条件，产生至少一种与靶序列互补的核酸序列拷贝；(c)为了形成包含探针和与靶序列互补的核酸序列的杂交体，将探针与同靶序列互补的核酸序列杂交；以及(d)检测杂交体，作为测试样本中HIV存在的指征。
优选的RT PCR形式包含与上文提及的相同的步骤，但扩增试剂将包含具有反转录活性的酶。另外，根据此处提供的任意方法，能够多次重复步骤(b)以增加靶序列的拷贝数目。对本领域技术人员，可以理解得是通过对反应混合物进行热循环，可重复步骤(b)。
尤其优选的TaqMan方式包含与上文描述相同的步骤，但引物/探针将包含用报告染料(如FAM、6-羧基荧光素)和猝灭剂染料(如TAMRA、6-羧基-四甲基-罗丹明)标记的探针，并且扩增试剂将包含TaqMan聚合酶，其为具有5′→3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。探针被设计为不能够延伸，例如通过出现3′磷酸基。当TaqMan聚合酶遇到与单链DNA杂交的被标记探针时，其切割探针并从与猝灭剂染料临近的空间去除报告染料。这消除了报告染料发射光谱的猝灭，并能够测定报告染料的荧光活性。探针的切割和生成物荧光的增加与PCR产物形成量成比例。荧光的变化可相对于循环数目来绘图，以产生扩增图，如图1所显示的。扩增图与阈值(定义为在3和15轮循环之间测量的背景荧光值标准差的10倍)的交点已知是循环阈(Ct)。
也可使用其它的实时PCR形式。一种形式使用嵌入染料，如SYBR Green。该染料在结合双链DNA时提供了强荧光信号，这种信号可定量扩增的DNA。尽管这种方式不允许扩增的序列特异性监视，但其能够不使用任何标记探针即可直接定量扩增DNA(参见，如Ponchel等人(2003)Real-time PCR based onSYBR-Green I fluorescence：An alternative to the TaqMan assay for a relativequantification of gene rearrangements，gene amplifications and micro genedeletions.BMC Biotechnology 3：18)。也可使用的其它这类荧光染料是SYBRGold、YO-PRO染料和Yo Yo染料。
另一种可以采用的实时RCR形式使用报告探针，探针与扩增子杂交以产生荧光信号。杂交事件不是在探针上分离报告和猝灭部分，就是使它们达到更接近的位置。探针本身并不降解，并且报告子荧光信号本身并不在反应中累积。当探针与扩增子杂交时，PCR期间的产物累积通过报告荧光信号的增加来监测。该类型的形式包括分子指示标(molecular beacons)(Sanjay，T和Russell，IL(1996)Molecular Beacons：Probes that Fluoresce upon Hybridization.NatureBiotech.Vol.14，March，pp303-308)，双杂交(dual-hybe)探针(Cardullo等人(1988)Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescenceresonance energy transfer.PNAS USA 85：8790-8794)，曙光(Sunrise)或扩增荧光(Amplifluor)(Nazarenko等人(1997)A closed tube format for amplificationand detection of DNA based on energy transfer.Nucleic Acid Res.25：2516-2521)，和蝎子(Scorpion)(Whitcombe等人(1999)Detection of PCR productsusing self quenching probing amplicons and fluorescence.NatureBiotech.17：804-807)实时PCR分析。
另一种可以采用的实时RCR形式是所谓的“警察(Policeman)”系统。在该系统中，引物包含荧光部分(例如FAM)和可猝灭荧光部分荧光的猝灭剂部分(如TAMRA，其共价结合到引物3′末端的至少一个核苷酸碱基)。在3味端，引物具有至少一个错配碱基，并因此在碱基上与核酸样本不互补。通过使用具有3′→5′核酸外切酶活性聚合酶(例如Pfu酶)的PCR，扩增模板核酸序列以产生PCR产物。通过3′→5′核酸外切酶活性从PCR产物3′末端切割结合于猝灭部分的错配碱基。当用聚合酶切割共价结合于猝灭部分的错配碱基，因此去除猝灭部分对荧光部分的猝灭作用时，在PCR期间的至少一个时间点检测和/或定量所得荧光。高于背景的荧光显示合成核酸样本的存在。该PCR方式详细描述于美国专利申请第10/309,691号，其在此引入作为参考。
附图简述
图1-2显示了使用18个模板寡聚核苷酸的TaqMan实时PCR。
图3显示了来自HIV血液的扩增。
优选实施方案的详述
此处提供的引物/探针组包含两个引物和至少一个探针。这些引物/探针组可根据核酸扩增技术来使用。因此，任何特定引物/探针组中的引物可用于扩增靶序列。在多数情况下，探针与通过引物之一产生的多拷贝靶序列杂交，并且通常有助于检测在扩增反应期间产生任意拷贝的靶序列。根据核酸扩增程序检测HIV-1的M、N和O种群和多种HIV-1亚型的特异性和敏感性，可使用所有的引物/探针序列。在下面的表1中提供了检测HIV-1亚型的引物和探针。在本发明中也优选使用与表1中列出的序列互补的寡聚核苷酸。
表1：模板寡聚核苷酸引物和探针。
| Seq ID No.正向引物 | Seq ID No.探针 | Seq ID No.反向引物 |
| 1 5’-GCRGTNYWYR THCACAATTT TAARA GAA-3’ | 2 5’-GGGAT TGRGGRDTAY WSWSC DSG-3’ | 3 5’-CGGGT YTVTTWCAGR GRYAR C-3’ |
| 解释Y：C or TR：A or GS：G or CN：A，G，C，T or UW：A，T or UD：A，G，T or UV：A，G or CH：A，C，T or U |
如上面所暗示，表1所包含(例如SEQ ID NO：1和3)引物可用于引导合成多拷贝的HIV-1靶序列拷贝。剩下的SEQ ID NO：2可与表1中出现的引物序列的任何一个或两个的扩增产物杂交。因此，探针序列也对多种HIV-1亚型具有特异性。优选本发明的实施方案包括从选自由SEQ ID NO：1、2和3所组成组的序列所包含的至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸。更优选本发明的实施方案包括从选自SEQ ID NO：1、2和3序列的所包含的至少16个连续核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更优选本发明的实施方案包括从选自由SEQ IDNO：1、2和3所组成组的序列所包含的至少17个连续核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更优选本发明的实施方案包括从选自由SEQ ID NO：1、2和3所组成组的序列所包含的至少18个连续核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更优选本发明的实施方案包括从选自由SEQ ID NO：1、2和3所组成组的序列所包含的至少19个连续核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更优选本发明的实施方案包括从选自由SEQID NO：1、2和3所组成组的序列所包含的至少20个连续核苷酸的寡聚核苷酸。甚至更优选本发明的实施方案包括从选自由SEQ ID NO：1、2和3所组成组的序列所包含的至少21个连续核苷酸的寡聚核苷酸。
引物序列一般包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在另一方面探针序列可包含DNA、RNA或核酸类似物例如不带电的核酸类似物包括但不限于肽核酸(PNAs)(其公开于国际专利申请WO92/20702)或吗啉代类似物，其描述于美国专利第5,185,444、5,034,506和5,142,047号，全部在此引入作为参考。这些序列可通过使用多种目前可用的技术来常规合成。例如，可使用常规核苷酸亚磷酰胺化学和可从Applied Biosystems，Inc，(FosterCity，Calif.)；DuPont(Wilmington，Del.)；或Milligen(Bedford，Mass.)获得的仪器合成DNA序列。同样地，当期望时，使用本领域公知的方法来标记序列，例如描述于美国专利申请第5,464,746、5,424,414和4,948,882号，全部在此引入作为参考。
此处所用的术语“标记”是指具有能被检测的性质或特征的分子或部分。标记可被直接检测，如使用例如放射性同位素、荧光基团、化学发光体、酶、胶体颗粒、荧光微粒等；或标记可被间接检测到，如使用例如特定结合成分。可以理解的是，可直接检测的标记要求另外的组分，例如底物、触发剂、光等，使得能够检测标记。当使用可间接检测标记时，他们通常以与“结合物”的组合来使用。通常结合物是特定结合成分，其可附着或偶联于可直接检测的标记。用于合成结合物的偶联化学反应是本领域公知的，并且包括例如任何不破坏特定结合成分的特定结合性质或标记的可检测性质的化学方法和/或物理方法。如此处所用的“特定结合成分”是指结合对的成员，即两种不同的分子，其中一个分子例如通过化学或物理方法，特定地结合于另一个分子。除抗原和抗体特定结合对之外，其它的特定结合对包括但不意味限于亲和素和生物素、半抗原和半抗原的特异性抗体、互补的核酸序列、酶辅助因子或底物与酶等。
如此处所用的术语“测试样本”是指怀疑含有HIV靶序列的任何物品。测试样本是或能得自任意生物来源，如血液、接目镜液体、脑脊液、奶、腹水、滑液、腹膜液、羊水、组织、发酵液、细胞培养物等。测试样本可(i)从来源得到后直接使用或(ii)经预处理改变样本特征后使用。因此，可以在使用前对测试样本进行预处理，如从血液制备血浆、分散细胞或病毒颗粒、从固体材料制备液体、稀释粘性液体、过滤液体、蒸馏液体、浓缩液体、灭活感染组分、添加试剂、纯化核酸等。
如此处所用的术语“靶序列”是指使用此处提供的引物/探针组进行检测、扩增或检测并扩增的核酸序列。另外，在某些情况下术语靶序列是指单链的时候，本领域普通技术人员将认识到靶序列实际上是双链的。因此，在靶标是双链情形下，本发明的引物序列将扩增靶序列的双链。
如早先提及的，按照本领域公知的核酸扩增方法，任何特定引物/探针组的引物序列(以其自身或与另外的寡聚核苷酸)可用作扩增引物。这些反应包括，但不意味着限定，描述于美国专利第4,683,195和4,683,202号的聚合酶链反应(PCR)、描述于EP-A-320 308的连接酶链反应(LCR)和描述于美国专利第5,427,930，号的缺口LCR(GLCR)，在此引入其全部作为参考。一般地，这些示范的扩增反应产生多重拷贝的DNA靶序列。
根据本发明，靶序列可的确是DNA，在另一方面根据HIV基因组RNA属性，按照描述于美国专利第5,322,770和5,310,652号(两专利在此引入作为参考)的“RT-PCR”形式，可使用引物/探针组。简单地说，RT-PCR方式提供了从RNA靶序列转录为DNA链的方法。从RNA靶转录的DNA拷贝链通常称作“cDNA”，其然后可用任何上面提及的方法作为扩增的模板。产生cDNA的方法与其它扩增方法(例如PCR)分享了很多杂交和延伸的原理，但其所使用的酶应具有反转录活性。具有反转录活性的酶和RT PCR方法对本领域技术人员是公知的。另外，合成cDNA的其它方法也是公知的，其包括美国专利第5,686,272号，其在此引入作为参考。
根据优选实施方案，在“寡聚核苷酸杂交PCR”(在此处有时称作“OHPCR”)扩增反应中使用引物/探针组。在优选方法中所使用的试剂包含至少一种引物/探针组(此处指定为引物/探针组1-8)，和用于进行扩增反应的其它试剂。“用于进行扩增反应的其它试剂”或“核酸扩增试剂”包括众所周知的试剂，可包括但不限于：具有聚合酶活性的酶、酶辅助因子(如镁)、盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和三磷酸脱氧核糖核苷(dNTPs)如脱氧三磷酸腺苷、脱氧三磷酸鸟苷、脱氧三磷酸胞苷和脱氧三磷酸胸苷。
一个优选的方法通常包含步骤：(a)形成反应混合物，该混合物包含核酸扩增试剂、至少一种本发明的引物/探针组和怀疑含有靶序列的测试样本；(b)对混合物采用扩增条件，以产生至少一种与靶序列互补的核酸序列拷贝；(c)为了形成包含探针和与靶序列互补的核酸序列的杂交体，将探针与同靶序列互补的核酸序列杂交；以及(d)检测杂交体，作为测试样本中HIV存在的指征。可以理解的是，先于步骤(c)通过对反应混合物进行热循环来重复上面方法中的步骤(b)10-100次，更典型的是20-60次，这是本领域公知的。
扩增条件一般定义为促进一个或多个核酸序列退火和延伸的条件。本领域众所周知的是这种退火以可预见的方式依赖于一些参数，其包括温度、离子强度、序列长度、互补性和序列的G:C含量。例如，降低与核酸互补环境中的温度会促进退火。对任何给定的序列、解链温度或Tm，可利用任何一些公知的方法进行估计。一般，诊断应用使用杂交温度，该杂交温度接近于解链温度(即10℃之内)。离子强度或“盐”浓度也影响解链温度，因为小的阳离子通过在磷酸二酯骨架上抵消负电荷，进而倾向于稳定双链体的形成。通常盐浓度取决于阳离子的性质和化合价，但其易于被本领域技术人员所理解。同样地，高G:C含量和增加的序列长度也已知能够稳定双链体的形成，因为G:C对包含3个氢键，而A:T对仅有2个，以及由于较长的序列具有更多的氢键将序列保持在一起。因此，通过升高解链温度，高G:C含量和较长序列长度会影响杂交条件。
一旦序列被选择用于给定的诊断应用，G:C含量和长度将是已知的，并且解决精确测量将包括的杂交条件。由于离子强度一般根据酶活性进行优选，因此所剩唯一可变化参数是温度。一般，杂交温度选择接近引物或探针的Tm或者选择引物或探针的Tm。因此，获得合适的用于特定引物/探针组的杂交条件是在本领域技术人员普通技能范围内。
根据OH PCR方法，优选选择引物、探针和反应条件，使得探针序列具有比引物序列更低的解链温度，这样通过将反应混合物置于扩增条件下，在高于探针Tm的温度下生成多拷贝的靶序列或其互补物(有时称作扩增子)。合成这些拷贝后，将其变性，混合物冷却以能够在探针和靶标或其互补拷贝之间形成杂交体。优选，从变性温度降至探针与单链拷贝结合的温度的降温速率为相当快，例如约8分钟至约15分钟，优选少于2分钟。这样快速的冷却有助于多拷贝的靶序列与探针之间形成杂交体，而不是例如扩增子互补链之间形成杂交体。
倘若使用探针来检测引物序列产物，则用捕获标记或检测标记来标记引物。探针序列用于与引物序列所产生的序列进行杂交，并且通常与不包括引物序列的序列杂交。与引物序列类似，探针序列也用捕获标记或检测标记来标记，需说明的是当引物用捕获标记来标记时，用检测标记来标记探针，反之亦然。检测标记具有与前面所定义的“标记”相同的定义，“捕获标记”通常用于从其它扩增试剂中分离延伸产物以及与任意这些产物相关的探针。特定的结合成分(如前面所定义)尤其适合于该目的。优选根据本方法所用探针也封闭于3′末端，使得在杂交条件下他们不能延伸。阻止探针延伸的方法是公知的，并且是本领域技术人员的选择依据。通常，在探针的3′末端加上磷酸基对阻断探针的3′末端的延伸是足够的。
复制序列/探针杂交体形成之后，在拷贝序列和探针序列上的不同标记(即捕获和检测标记)可用于分离和检测这些杂交体。优选，根据商业上可获得的Abbott LCx.RTM instrumentation(Abbott Laboratories；Abbott Park，111.)所使用的方案来进行检测。
如前面所讨论的，靶序列可以是DNA或靶序列包含于HIV基因组中，因此靶序列可以是RNA形式。在靶序列是部分HIV基因组的情况下，优选包含具有反转录活性的酶作为部分所谓的核酸扩增试剂，以能够生成cDNA用于随后的扩增。根据该实施方案，引物序列也作为cDNA合成的引物。尽管本发明考虑了生成cDNA和然后经扩增cDNA序列的扩增和检测的不同步骤，可以理解的是这些步骤可同时在单独的扩增反应混合物中发生。
可通过常规的方法分离或去除cDNA产物或者产物。优选扩增cDNA产物或者产物。可使用用于扩增的任何方法，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链反应、链替代扩增、转录介导扩增和核酸单碱基扩增。优选使用PCR。通常，含有用于PCR所有必需成分的反应混合物直接加于反转录反应混合物。然后使用所用碱基对的特定条件来进行扩增。
扩增后，可使用任意本领域公知的方法来检测扩增产物，包括，但不限于，琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、比色检测后在固体支撑物上的捕获扩增产物、Eci检测、荧光、放射性同位素检测和化学发光。用于这些检测方法的试剂为商业可获得的如从Molecular Probes、Eugene、Oregon和Ortho ClinicalDiagnostics，Rochester，N.Y.。
本发明尤其优选的一个实施方案包含用本发明的寡聚核苷酸进行实时定量PCR(TaqMan)。已知的TaqMan分析法描述于Holland等人，PNAS88：7276-7280(1991)。在聚合酶链式反应产物检测体系中使用具有5′→3′核酸外切酶活性Taq聚合酶，以产生与扩增相伴的特异性检测信号。将寡聚核苷酸探针引入聚合酶链反应分析，该探针在3′端无延展性，在5′端标记，并设计为与靶序列杂交。在扩增期间探针对一种聚合酶链反应产物链的退火产生适合外切酶活性的底物。在扩增期间，具有5′→3′核酸外切酶活性Taq聚合酶降解探针为更小的片断，使其不同于未降解探针。该方法是敏感和特异的，相比于更繁琐的方法，其有显著提高。该方法的方案也描述于Gelfand等人的美国专利第5,210,015号。在此引入Gelfand等人的美国专利第5,210,015号和Holland等人的PNAS 88：7276-7280(1991)作为参考。
进一步，Fisher等人的美国专利第5,491,063号提供了Taqman型分析法。Fisher等人的方法提供了导致用发光标记来标记的单链寡聚核苷酸探针分解的反应，其中在DNA结合化合物存在下进行反应，结合化合物与标记相互作用修正标记的发光。合适的标记包括例如FAM、HEM、TET和JOE；罗丹明及其衍生物如Texas Red，ROX和TAMRA；、Lucifer Yellow和香豆素衍生物如7-Me2-N-香豆素-4-乙酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酯和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酯(AMCA)。合适的DNA结合化合物包括，例如溴化乙锭、吖啶橙、proravine、吖黄素、氟代香豆素(fluorcoumarin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、二胺乙基苯菲啶、光辉霉素、多吡咯钌、氨茴霉素和所谓的“槽沟结合剂(groove binder)”如孔雀石绿。本方法利用标记探针发光的变化，该探针由降解的探针产生。本方法应用于一般的分析，该分析利用了导致寡聚核苷酸探针分解的反应，尤其是应用于同类的扩增/检测方法，其杂交探针伴随引物延伸而被分解。提供了同类的扩增/检测方法，其允许同时检测扩增靶的累积和靶序列的序列特异性检测。Fisher等人的美国专利第5,491,063号在此引入作为参考。
相对于经典的PCR分析法，TaqMan检测分析法呈现一些优点。首先，Taqman分析结合了PCR的敏感性以及HIV序列中所出现的内部寡聚核苷酸序列的杂交。PCR后，不一定在琼脂糖凝胶上分离样本，并删除了随后的DNA印迹和杂交步骤，这些步骤是验证PCR产物同一性所必需的。可以在几天后容易加入这些额外的PCR后确认步骤，以进行精确的鉴别。通过使用TaqMan系统，可以在2.5小时内完成分析。进一步，在分析步骤中的方法使得能够有效处理大量样本并且没有交叉污染，因此适合于自动操作取样。结果是，使用TaqMan分析可在非常短的时间内处理大量测试样本。TaqMan系统的另一个优点是由多元化(multiplexing)的潜力。由于不同的荧光报告染料可用于构建探针，因此一些不同的HIV系统可与相同的PCR反应联合，因此降低了人力成本，如果每个测试单独进行，将招致这些费用。快速、结论性数据连同标记和费用效率的优点使得利用本发明特定引物的TaqMan检测系统成为监测HIV存在高度有益的系统。
本发明的寡聚核苷酸也能作为用于检测HIV-1试剂盒的一部分得到提供。该试剂盒包括一种或多种合适的含有一种或多种根据本发明的引物/探针组的容器、具有聚合酶活性的酶、三磷酸脱氧核苷酸、以及任选地具有反转录活性的酶。通常，至少一种序列含有标记，但检测可能不用它。
下面的实施例将提供对本发明的进一步说明，但并为了限制本发明。
实施例1
在本研究中，2个通用引物(HIV-通用-F(正向)和HIV-通用-R(反向))和1个探针(HIV-通用-探针)在HXB2基因组中的pol区域(下文，表3)得到鉴别(下文，表2)。
解冻来自5名HIV患者的400μL冷冻肝素化血液，并应用于Leukosorb膜吸附滤板。然后在膜上应用在37℃孵育1小时的60μL裂解缓冲液。然后将滤板置于GenePlate的顶端，并以300rpm离心5分钟来将溶解产物转移至GenePlate。然后将GenePlate于4℃下孵育过夜。使用裂解缓冲液清洗GenePlate三次后，接着应用三次清洗缓冲液，在在GenePlate的孔中合成cDNA。利用上面描述的通用引物或探针，所得cDNA用于TaqMan分析。
使用260个完整的HIV-1和SIVcpz基因组序列来分析所得数据。从GenBank、BLAST、PrimerAligner、PrimerExpress和HYBsimulator下载病毒序列数据库(GBVRL)。
表II通用引物和探针
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| QUERY | 4 | GCAGTATTYATYCACAATTT TAAAAGAA | QUERY | 12 | GGGATTGGGGGRTACASTGC AGG | QUERY | 19 | CGGGTYTATTACAGRGACAG C |
| A_SE.SE8131 | 4 | ----- ----------- -------- | A_SE.SE8131 | 12 | --- ------------ --- | A_SE.SE8131 | 19 | ---- ------------- - |
| A_SE.UGSE8891 | 4 | -- ------------- -------- | A_SE.UGSE8891 | 12 | --- ------------ --- | A_SE.UGSE8891 | 19 | ---- ------------ - |
| A_SE.TZSE8538 | 4 | --- ------------ -------- | A_SE.TZSE8538 | 12 | ---- ------------ --- | A_SE.TZSE8538 | 19 | --- -------------- - |
| A_SE.UGSE6594 | 4 | -------------------- -------- | A_SE.UGSE6594 | 12 | -------------------- --- | A_SE.UGSE6594 | 19 | -------------------- - |
| A_KE.Q2317 | 4 | ---- ------------- -------- | A_KE.Q2317 | 12 | -------------------- --- | A_KE.Q2317 | 19 | --- ------------- |
| A_SE.UGSE7535 | 4 | ---- ------------ -------- | A_SE.UGSE7535 | 12 | ---- ------------ --- | A_SE.UGSE7535 | 19 | ---- ------------- - |
| A_SE.SOSE7253 | 4 | --------------- -------- | A_SE.SOSE7253 | 12 | ------------- - | A_SE.SOSE7253 | 19 | -------------------- - |
| A_UG.92UG037 | 5 | -----G-------------- -------- | A_UG.92UG037 | 12 | ---- ------------- --- | A_UG.92UG037 | 20 | -- -G------------ - |
| A_UG.U455 | 4 | ---- ------------- -------- | A_UG.U455 | 12 | --- ------------- --- | A_UG.U455 | 19 | --- ------------- - |
| B_US.DH123 | 4 | -------------------- -------- | B_US.DH123 | 12 | ---- ------------ --- | B_US.DH123 | 19 | ---- ------------- - |
| B_US.896 | 4 | ---- ------------- ------- | B_US.896 | 12 | ---- ------------- --- | B_US.896 | 19 | --- ------------ - |
| B_US.MN | 4 | ---------- | B_US.MN | 12 | ---------- | B_US.MN | 19 | ---------- |
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| ---------- -------- | ---------- --- | ---------- - | ||||||
| B_US.JRCSF | 4 | --------------- -------- | B_US.JRCSF | 12 | ---- ----------- --- | B_US.JRCSF | 21 | ---- ----------A - |
| B_US.JRFL | 4 | ---------------- -------- | B_US.JRFL | 12 | --------------- --- | B_US.JRFL | 19 | ---- ----------- - |
| B_US.YU10 | 4 | --------------- -------- | B_US.YU10 | 12 | ---- ----------- --- | B_US.YU10 | 19 | ---- ------------ - |
| B_US.YU2 | 4 | ---------------- -------- | B_US.YU2 | 12 | -------------- --- | B_US.YU2 | 19 | -- ----------- - |
| B_AU.MBC200 | 4 | ---------------- -------- | B_AU.MBC200 | 13 | -AT---T---- --- | B_AU.MBC200 | 19 | ------------ - |
| B_AU.MBC925 | 4 | --------------- -------- | B_AU.MBC925 | 12 | -------------- --- | B_AU.MBC925 | 19 | ---- ----------- - |
| B_US.BCSG3 | 4 | ---------------- -------- | B_US.BCSG3 | 12 | --------------- --- | B_US.BCSG3 | 21 | --- -----------A - |
| B_GA.OYI | 4 | -------------------- -------- | B_GA.OYI | 12 | --------------- --- | B_GA.OYI | 19 | --- ------------ - |
| B_GB.CAM1 | 4 | --------------- -------- | B_GB.CAM1 | 12 | --------------- --- | B_GB.CAM1 | 19 | ---- ------------ - |
| B_US.NY5CG | 4 | --------------- -------- | B_US.NY5CG | 12 | -- ------------ --- | B_US.NY5CG | 19 | ------------- - |
| B_XX.NL43 | 4 | ---------------- -------- | B_XX.NL43 | 12 | ------------- --- | B_XX.NL43 | 19 | ---- ----------- - |
| B_FR.LAI | 4 | ---------------- -------- | B_FR.LAI | 12 | ------------- --- | B_FR.LAI | 19 | -------------- - |
| B_FR.HXB2R | 4 | --------------- ------- | B_FR.HXB2R | 12 | --- ----------- --- | B_FR.HXB2R | 19 | --- ----------- - |
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| B_NL.ACH320A | 4 | ---------------- -------- | B_NL.ACH320A | 12 | --------------- --- | B_NL.ACH320A | 19 | ---- ----------- - |
| B_NL.ACH320B | 4 | ---- -----—---------- -------- | B_NL.ACH320B | 12 | --------------- --- | B_NL.ACH320B | 19 | ---- ----------- - |
| B_US.SF2CG | 4 | ---- -- -------------- -------- | B_US.SF2CG | 12 | ---- ----------- --- | B_US.SF2CG | 21 | ---- ----------A - |
| B_US.AD8 | 4 | ----- -- -------------- -------- | B_US.AD8 | 12 | ---- ----------- --- | B_US.AD8 | 19 | -------------- - |
| B_DE.D31 | 4 | --- -- ----------- -------- | B_DE.D31 | 12 | --------------- --- | B_DE.D31 | 19 | -------------- - |
| B_GB.MANC | 6 | ---------- -- —---------- ---G---- | B_GB.MANC | 12 | -------------------- --- | B_GB.MANC | 19 | -------------------- - |
| B_DE.HAN2 | 4 | ----- -------------- -------- | B_DE.HAN2 | 12 | --- ----------- --- | B_DE.HAN2 | 19 | ---- ----------- - |
| B_US.WEAU160 | 4 | ---------- ----------------- -------- | B_US.WEAU160 | 12 | ---- ----------- --- | B_US.WEAU160 | 19 | -------------- - |
| B_US.RF | 4 | ---- ---------------- -------- | B_US.RF | 12 | -------------- --- | B_US.RF | 19 | ---- ----------- - |
| B_CN.RL42 | 4 | ---- ------------- -------- | B_CN.RL42 | 12 | ----- ----------- --- | B_CN.RL42 | 22 | ---- -------G--- - |
| B_US.WR27 | 4 | ----- - —----------- -------- | B_US.WR27 | 14 | -------T----- --- | B_US.WR27 | 19 | --------------- - |
| C_BW.96BW0502 | 4 | ----- -------------- -------- | C_BW.96BW0502 | 12 | -------------- --- | C_BW.96BW050 | 19 | -------------- - |
| C_IN.11246 | 4 | ----- -------------- -------- | C_IN.11246 | 12 | ------------- --- | C_IN.11246 | 19 | -------------- - |
| C_IN.301904 | 4 | ---------- ---- | C_IN.301904 | 12 | ---------- | C_IN.301904 | 19 | ---------- |
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| ---------- -------- | ---------- --- | ---------- - | ||||||
| C_IN.301905 | 4 | --------------- -------- | C_IN.301905 | 12 | --- ------------ --- | C_IN.301905 | 19 | ----- ------------- - |
| C_IN.21068 | 4 | --------------- -------- | C_IN.21068 | 12 | --------------- --- | C_IN.21068 | 19 | ---- ------------ - |
| C_IN.3C1999 | 4 | --------------- -------- | C_IN.301999 | 12 | --------------- --- | C_IN.301999 | 19 | ------------ - |
| C_BR.92BR025 | 4 | -------------- -------- | C_BR.92BR025 | 12 | ---------------- --- | C_BR.92BR025 | 19 | ---- ------------ - |
| C_ET.FTH2220 | 4 | -------------------- -------- | C_ET.ETH2220 | 12 | ---------------- --- | C_ET.ETH2220 | 19 | --- ----------- - |
| D_ZR.Z2Z6 | 4 | -------------- -------- | D_ZR.Z2Z6 | 12 | --------------- --- | D_ZR.Z2Z6 | 19 | ----- ------------ - |
| D_ZR.ELI | 4 | --------------- -------- | D_ZR.ELI | 12 | ---------------- --- | D_ZR.ELI | 19 | ---- ------------ - |
| D_ZR.NDK | 4 | --------------- -------- | D_ZR.NDK | 12 | --------------- --- | D_ZR.NDK | 19 | ----- ----------- - |
| D_ZR.84ZR085 | 6 | -------------- ---G---- | D_ZR.84ZR085 | 12 | ------------- --- | D_ZR.84ZR085 | 19 | -------------- - |
| D_UG.94UG114 | 4 | --------------- -------- | D_UG.94UG114 | 12 | --------------- --- | D_UG.94UG114 | 19 | -------------- - |
| F_VI850 | 4 | ---------------- -------- | F_VI850 | 12 | --------------- --- | F_VI850 | 19 | ---- ----------- - |
| F_FI.FIN9353 | 4 | --------------- -------- | F_FI.FIN9363 | 12 | ------------- --- | F_FI.FIN9363 | 19 | ----- ------ --- |
| F_BR.93BR020 | 4 | --------------- -------- | F_BR.93BR020 | 12 | -------------- --- | F_BR.93BR020 | 19 | ----- ----------- - |
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| G_FI.HH8793-11 | 4 | --------------- -------- | G_FI.HH8793-11 | 12 | ---------------- --- | G_FI.HH8793-11 | 23 | --- --T--------- - |
| G_SE.SE6165 | 4 | -------------- -------- | G_SE.SE6165 | 12 | ---------------- --- | G_SE.SE6165 | 19 | ------------ - |
| G_BE.DRCBL | 4 | -------------- -------- | G_BE.DRCBL | 12 | ---------------- --- | G_BE.DRCBL | 19 | -------------- - |
| H_BE.VI991 | 4 | --------------- -------- | H_BE.VI991 | 15 | --------------- -C- | H_BE.VI991 | 19 | --------------- - |
| H_BE.VI997 | 4 | --------------- -------- | H_BE.VI997 | 12 | ------- ------- --- | H_BE.VI997 | 19 | ---- ----------- - |
| H_CF.90CF056 | 4 | -------------- -------- | H_CF.90CF056 | 12 | --------------- --- | H_CF.90CF056 | 19 | ---- ----------- - |
| J_SE.SE92809 | 7 | ------A-------- -------- | J_SE.SE92809 | 12 | --------------- --- | J_SE.SE92809 | 19 | ---- ------------ - |
| J_SE.SE91733 | 7 | -------A-------- -------- | J_SE.SE91733 | 12 | --------------- --- | J_SE.SE91733 | 19 | ---- ------------ - |
| A3_RU.KAL153-2 | 4 | -------------- -------- | AB_RU.KAL153-2 | 12 | -------------- --- | AB_RU.KAL153-2 | 19 | -------------- - |
| AC_ZM.ZAM184 | 4 | ---------------- -------- | AC_ZM.ZAM184 | 12 | --------------- --- | AC_ZM.ZAM184 | 19 | --- ------------ - |
| AC_RW.92RW009 | 4 | -------------------- -------- | AC_RW.92RW009 | 12 | --------------- --- | AC_RW.92RW00 | 19 | --- ------------ - |
| AC_IN 21301 | 4 | ---------------- -------- | AC_IN.21301 | 16 | -------------- G-- | AC_IN.21301 | 19 | -------------- - |
| ADI_ZR.MAL | 5 | -----G-------------- -------- | ADI_ZR.MAL | 12 | --------------- --- | ADI_ZR.MAL | 21 | -------------- - |
| AE_CF 90CF402 | 4 | ---------- | AE_CF.90CF402 | 11 | ---------- | AE_CF.90CF40 | 19 | ---------- |
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| ---------- -------- | A--------- --- | 2 | ---------- - | |||||
| AE_TH.CM240 | 4 | -- ----------- -------- | AE_TH.CM240 | 12 | --- ------------ --- | AE_TH.CM240 | 19 | --- ------------ - |
| AE_TH.93TH253 | 4 | -- ------------- -------- | AE_TH.93TH253 | 12 | --- ------------- --- | AE_TH.93TH253 | 19 | -- ------------ - |
| AG_NG.IBNG | 4 | -- ------------ -------- | AG_NG.IBNG | 12 | -- -------------- --- | AG_NG.IBNG | 19 | -- ------------ - |
| AG_DJ.DJ264 | 4 | -- ------------ -------- | AG_DJ.DJ264 | 12 | ---- ------------- --- | AG_DJ.DJ264 | 19 | --- ------------- - |
| AG_DJ.DJ263 | 4 | -- ------------ -------- | AG_DJ.DJ263 | 12 | --- ------------- --- | AG_DJ.DJ263 | 19 | --- ------------- - |
| AG_NG.92NG003 | 4 | --- ----------- -------- | AG_NG.92NG003 | 12 | --- ------------ --- | AG_NG.92NG003 | 19 | ---- ------------ - |
| AG_NG.92NG083 | 4 | ------------ -------- | AG_NG.92NG083 | 12 | ---- ------------ --- | AG_NG.92NG08 | 19 | ---- ------------- - |
| AGI_ZR.Z321B | 4 | --- ----------- -------- | AGI_ZR.Z321B | 12 | --- ------------ --- | AGI_ZR.Z321B | 19 | --- ------------- - |
| AGI_CY.94CY0323 | 4 | --- ------------- -------- | AGI_CY.94CY0323 | 12 | ---- ------------- --- | AGI_CY.94CY0323 | 19 | --- -------------- - |
| AGI_GR.97PVCH | 4 | -- ------------- -------- | AGI_GR.97PVCH | 12 | --- ------------ --- | AGI_GR.97PVCH | 19 | --- ------------ - |
| AGI_GR.97PVMY | 4 | -- ------------- -------- | AGI_GR.97PVMY | 18 | --- -A------------ --- | AGI_GR.97PVMY | 19 | --- ------------- - |
| AGJ_AU.BFP90 | 4 | --- ------------ -------- | AGJ_AU.BFP90 | 12 | --- ------------- --- | AGJ_AU.BFP90 | 19 | ---- ------------ - |
| BF_BR.93BR029 | 4 | --- ------------ -------- | BF_BR.93BR029 | 12 | ---- ------------- --- | BF_BR.93BR029 | 19 | ---- ------------ - |
| HIV-通用-F(F-in-4794-28) | HIV-通用探针(P-1-4827-23) | HIV-通用-R(R-out-4929-21) | ||||||
| SEQ ID NO | SEQ ID NO | SEQ ID NO | ||||||
| N_CM.YBF30 | 8 | --G--T-------------- -------- | N_CM.YBF30 | 12 | --- ------------ --- | N_CM.YBF30 | 19 | -- -------------- - |
| O_CM.MVP5180 | 9 | -----C---G---------- -------- | O_CM.MVP5180 | 12 | -------------------- --- | O_CM.MVP5180 | 24 | -----------------T-- - |
| O_CM.ANT70 | 10 | ---------G--------- -------- | O_CM.ANT70 | 12 | -------------------- --- | O_CM.ANT70 | 19 | ----- ------------- - |
| SIVcpzUS | 4 | --- ------------ -------- | SIVcpzUS | 14 | ---- -------T----- --- | SIVcpzUS | 19 | --- ------------- - |
| SIVCPZANT | 11 | ----GCA----------- -------- | SIVCPZANT | 27 | --- ----- --AC- T-- | SIVCPZANT | 25 | - -C----------T-- - |
| SIVCPZGAB | 5 | -----G-------------- -------- | SIVCPZGAB | 12 | --- ------------ --- | SIVCPZGAB | 19 | -- ------------ - |
表3HXB2基因组信息(下划线的序列是通用引物和探针)
部位 HIVHXB2CG 9719个碱基双链RNA 线性VRL 1999-AUG-19
定义 I型人类免疫缺陷病毒(HXB2)，完整基因组；
HIV1/HTLV-III/LAV相关基因组
登记 K03455M38432
版本 K03455.1 GI：1906382
关键词 TAR蛋白；获得性免疫缺陷综合症；完整基因组；env蛋白；gag
蛋白；长末端重复(LTR)，pol蛋白；多聚蛋白；前病毒基因；
反转录酶；反式作用因子
来源 I型人类免疫缺陷病毒
生物 I型人类免疫缺陷病毒
病毒；类逆转录病毒；逆转录病毒科，慢病毒属，灵长类慢病
毒属组
碱基数 3411a 1772c 2373g 2163t
起始
1 tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca
61 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac
121 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca
181 acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg
241 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag
301 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg
361 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat
421 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga
481 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct
541 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc
601 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacctgaaag
661 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg
721 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga
781 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgatgggaa
841 aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca
901 agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt
961 agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca
1021 ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc
1081 aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaaaaa agcacagcaa
1141 gcagcagctg acacaggaca cagcaatcag gtcagccaaa attaccctat agtgcagaac
1201 atccaggggc aaatggtaca tcaggccata tcacctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa
1261 gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa gtgataccca tgttttcagc attatcagaa
1321 ggagccaccc cacaagattt aaacaccatg ctaaacacag tggggggaca tcaagcagcc
1381 atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatag agtgcatcca
1441 gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagca
1501 ggaactacta gtacccttca ggaacaaata ggatggatga caaataatcc acctatccca
1561 gtaggagaaa tttataaaag atggataatc ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat
1621 agccctacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgta
1681 gaccggttct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aggaggtaaa aaattggatg
1741 acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcattg
1801 ggaccagcgg ctacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtagg aggacccggc
1861 cataaggcaa gagttttggc tgaagcaatg agccaagtaa caaattcagc taccataatg
1921 atgcagagag gcaattttag gaaccaaaga aagattgtta agtgtttcaa ttgtggcaaa
1981 gaagggcaca cagccagaaa ttgcagggcc cctaggaaaa agggctgttg gaaatgtgga
2041 aaggaaggac accaaatgaa agattgtact gagagacagg ctaatttttt agggaagatc
2101 tggccttcct acaagggaag gccagggaat tttcttcaga gcagaccaga gccaacagcc
2161 ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag
2221 ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc
2281 tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg
2341 atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa
2401 ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata
2461 aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt
2521 tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa
2581 aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa
2641 taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaga tggaaaagga agggaaaatt tcaaaaattg
2701 ggcctgaaaa tccatacaat actccagtat ttgccataaa gaaaaaagac agtactaaat
2761 ggagaaaatt agtagatttc agagaactta ataagagaac tcaagacttc tgggaagttc
2821 aattaggaat accacatccc gcagggttaa aaaagaaaaa atcagtaaca gtactggatg
2881 tgggtgatgc atatttttca gttcccttag atgaagactt caggaagtat actgcattta
2941 ccatacctag tataaacaat gagacaccag ggattagata tcagtacaat gtgcttccac
3001 agggatggaa aggatcacca gcaatattcc aaagtagcat gacaaaaatc ttagagcctt
3061 ttagaaaaca aaatccagac atagttatct atcaatacat ggatgatttg tatgtaggat
3121 ctgacttaga aatagggcag catagaacaa aaatagagga gctgagacaa catctgttga
3181 ggtggggact taccacacca gacaaaaaac atcagaaaga acctccattc ctttggatgg
3241 gttatgaact ccatcctgat aaatggacag tacagcctat agtgctgcca gaaaaagaca
3301 gctggactgt caatgacata cagaagttag tggggaaatt gaattgggca agtcagattt
3361 acccagggat taaagtaagg caattatgta aactccttag aggaaccaaa gcactaacag
3421 aagtaatacc actaacagaa gaagcagagc tagaactggc agaaaacaga gagattctaa
3481 aagaaccagt acatggagtg tattatgacc catcaaaaga cttaatagca gaaatacaga
3541 agcaggggca aggccaatgg acatatcaaa tttatcaaga gccatttaaa aatctgaaaa
3601 caggaaaata tgcaagaatg aggggtgccc acactaatga tgtaaaacaa ttaacagagg
3661 cagtgcaaaa aataaccaca gaaagcatag taatatgggg aaagactcct aaatttaaac
3721 tgcccataca aaaggaaaca tgggaaacat ggtggacaga gtattggcaa gccacctgga
3781 ttcctgagtg ggagtttgtt aatacccctc ccttagtgaa attatggtac cagttagaga
3841 aagaacccat agtaggagca gaaaccttct atgtagatgg ggcagctaac agggagacta
3901 aattaggaaa agcaggatat gttactaata gaggaagaca aaaagttgtc accctaactg
3961 acacaacaaa tcagaagact gagttacaag caatttatct agctttgcag gattcgggat
4021 tagaagtaaa catagtaaca gactcacaat atgcattagg aatcattcaa gcacaaccag
4081 atcaaagtga atcagagtta gtcaatcaaa taatagagca gttaataaaa aaggaaaagg
4141 tctatctggc atgggtacca gcacacaaag gaattggagg aaatgaacaa gtagataaat
4201 tagtcagtgc tggaatcagg aaagtactat ttttagatgg aatagataag gcccaagatg
4261 aacatgagaa atatcacagt aattggagag caatggctag tgattttaac ctgccacctg
4321 tagtagcaaa agaaatagta gccagctgtg ataaatgtca gctaaaagga gaagccatgc
4381 atggacaagt agactgtagt ccaggaatat ggcaactaga ttgtacacat ttagaaggaa
4441 aagttatcct ggtagcagtt catgtagcca gtggatatat agaagcagaa gttattccag
4501 cagaaacagg gcaggaaaca gcatattttc ttttaaaatt agcaggaaga tggccagtaa
4561 aaacaataca tactgacaat ggcagcaatt tcaccggtgc tacggttagg gccgcctgtt
4621 ggtgggcggg aatcaagcag gaatttggaa ttccctacaa tccccaaagt caaggagtag
4681 tagaatctat gaataaagaa ttaaagaaaa ttataggaca ggtaagagat caggctgaac
4741 atcttaagac agcagtacaa atg
gcagtat
tcatccacaa
ttttaaaaga
aaaggg
ggga
4801
ttggggggta
cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta
4861 aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt
cg
ggtttattac
agggacagca
4921 gaaatccact ttggaaagga ccagcaaagc tcctctggaa aggtgaaggg gcagtagtaa
4981 tacaagataa tagtgacata aaagtagtgc caagaagaaa agcaaagatc attagggatt
5041 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagaaca
5101 tggaaaagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaggga aagctagggg atggttttat
5161 agacatcact atgaaagccc tcatccaaga ataagttcag aagtacacat cccactaggg
5221 gatgctagat tggtaataac aacatattgg ggtctgcata caggagaaag agactggcat
5281 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaagagat atagcacaca agtagaccct
5341 gaactagcag accaactaat tcatctgtat tactttgact gtttttcaga ctctgctata
5401 agaaaggcct tattaggaca catagttagc cctaggtgtg aatatcaagc aggacataac
5461 aaggtaggat ctctacaata cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag
5521 ccacctttgc ctagtgttac gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc
5581 aagggccaca gagggagcca cacaatgaat ggacactaga gcttttagag gagcttaaga
5641 atgaagctgt tagacatttt cctaggattt ggctccatgg cttagggcaa catatctatg
5701 aaacttatgg ggatacttgg gcaggagtgg aagccataat aagaattctg caacaactgc
5761 tgtttatcca ttttcagaat tgggtgtcga catagcagaa taggcgttac tcgacagagg
5821 agagcaagaa atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca
5881 gcctaaaact gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg
5941 tttcataaca aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag
6001 agctcatcag aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcagtaag tagtacatgt
6061 aacgcaacct ataccaatag tagcaatagt agcattagta gtagcaataa taatagcaat
6121 agttgtgtgg tccatagtaa tcatagaata taggaaaata ttaagacaaa gaaaaataga
6181 caggttaatt gatagactaa tagaaagagc agaagacagt ggcaatgaga gtgaaggaga
6241 aatatcagca cttgtggaga tgggggtgga gatggggcac catgctcctt gggatgttga
6301 tgatctgtag tgctacagaa aaattgtggg tcacagtcta ttatggggta cctgtgtgga
6361 aggaagcaac caccactcta ttttgtgcat cagatgctaa agcatatgat acagaggtac
6421 ataatgtttg ggccacacat gcctgtgtac ccacagaccc caacccacaa gaagtagtat
6481 tggtaaatgt gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaatga catggtagaa cagatgcatg
6541 aggatataat cagtttatgg gatcaaagcc taaagccatg tgtaaaatta accccactct
6601 gtgttagttt aaagtgcact gatttgaaga atgatactaa taccaatagt agtagcggga
6661 gaatgataat ggagaaagga gagataaaaa actgctcttt caatatcagc acaagcataa
6721 gaggtaaggt gcagaaagaa tatgcatttt tttataaact tgatataata ccaatagata
6781 atgatactac cagctataag ttgacaagtt gtaacacctc agtcattaca caggcctgtc
6841 caaaggtatc ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt tttgcgattc
6901 taaaatgtaa taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc agcacagtac
6961 aatgtacaca tggaattagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat ggcagtctag
7021 cagaagaaga ggtagtaatt agatctgtca atttcacgga caatgctaaa accataatag
7081 tacagctgaa cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa
7141 gaatccgtat ccagagagga ccagggagag catttgttac aataggaaaa ataggaaata
7201 tgagacaagc acattgtaac attagtagag caaaatggaa taacacttta aaacagatag
7261 ctagcaaatt aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat aatctttaag caatcctcag
7321 gaggggaccc agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg aggggaattt ttctactgta
7381 attcaacaca actgtttaat agtacttggt ttaatagtac ttggagtact gaagggtcaa
7441 ataacactga aggaagtgac acaatcaccc tcccatgcag aataaaacaa attataaaca
7501 tgtggcagaa agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa attagatgtt
7561 catcaaatat tacagggctg ctattaacaa gagatggtgg taatagcaac aatgagtccg
7621 agatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat
7681 ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg
7741 tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag
7801 caggaagcac tatgggcgca gcctcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt
7861 ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt
7921 tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat
7981 acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca
8041 ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca
8101 cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa
8161 ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat
8221 gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca
8281 taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga
8341 atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg
8401 gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca
8461 ttcgattagt gaacggatcc ttggcactta tctgggacga tctgcggagc ctgtgcctct
8521 tcagctacca ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac gaggattgtg gaacttctgg
8581 gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacagtat tggagtcagg
8641 aactaaagaa tagtgctgtt agcttgctca atgccacagc catagcagta gctgagggga
8701 cagatagggt tatagaagta gtacaaggag cttgtagagc tattcgccac atacctagaa
8761 gaataagaca gggcttggaa aggattttgc tataagatgg gtggcaagtg gtcaaaaagt
8821 agtgtgattg gatggcctac tgtaagggaa agaatgagac gagctgagcc agcagcagat
8881 agggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca
8941 gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt
9001 ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc
9061 cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat
9121 atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattagca gaactacaca
9181 ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt
9241 gagccagata agatagaaga ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg
9301 agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc
9361 ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg catccggagt acttcaagaa ctgctgacat
9421 cgagcttgct acaagggact ttccgctggg gactttccag ggaggcgtgg cctgggcggg
9481 actggggagt ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg
9541 gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact
9601 gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg
9661 tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagca
(SEQ ID NO：26)
通过收集显示错配的序列从表2中提取得下面的表4。通过在每个引物和探针中使用两个退化的寡聚核苷酸(Y、R和S)，模板数总共为18个。为了验证是否这些引物和探针扩增了所有的种群和亚型，合成了18个寡聚核苷酸模板，其在适当位置显示了错配(表4)。
表4：用于错配分析的模板寡聚核苷酸
| F-in-4794-28 | P-1-4827-23 | R-out-4929-21 | |||||||
| 模板号 | 标记 | SEQID4 | GC AGTATTYATY CACAATTTTAAAAGAA | 标记 | SEQ ID12 | GGG ATTGGGGGRTACASTGCAGG | 标记 | SEQ ID19 | CGGGTYTATTACAGRGACAG C |
| 1. | A_UG.92UG03 | 5 | - --G------ ---------- | A_UG.92UG037 | 12 | --- - ----------- | A_UG.92UG03 | 20 | --- -G------------ - |
| 2. | B_US.JRCSF | 4 | ---- ---------- | B_US.JRCSF | 12 | --- ------------- | B_US.JRCSF | 21 | --- ----------- - |
| 3. | B_AU.MBC200 | 4 | -- -- ------------ | B_AU.MBC200 | 13 | --- --AT-T-------- | B_AU.MBC200 | 19 | --- ----------- - |
| 4. | B_GB.MANC | 6 | -- ----G---- ------- | B_GB.MANC | 12 | --- - ------------- | B_GB.MANC | 19 | --- ----------- - |
| 5. | B_CN.RL42 | 4 | -- ---- ------------ | B_CN.RL42 | 12 | --- ------------ | B_CN.RL42 | 22 | --- --------G-- - |
| 6. | B_US.WR27 | 4 | -- ----- ------------ | B_US.WR27 | 14 | --- ---T-------- | B_US.WR27 | 19 | --- ----------- - |
| 7. | G_FI.HH8793-11 | 4 | -- --- -A ------------ | G_FI.HH8793-1 | 12 | --- ------------ | G_FI.HH8793-11 | 23 | --- -T--------- - |
| 8. | H_BE.VI991 | 4 | -- ---- ----------- | H_BF.VI991 | 15 | --- ----------C- | H_BE.VI991 | 19 | --- ------------ - |
| 9. | J_SE.SE92809 | 7 | -- --- -A ----------- | J_SE.SE92809 | 12 | --- ----------- | J_SE.SE9280 | 19 | --- ------------ - |
| 10. | AC_IN 21301 | 4 | -- ---- --------- | AC_IN.213101 | 16 | --- - ---------G-- | AC_IN.2131C | 19 | ---- ----------- - |
| 11. | ADI_ZR.MAL | 5 | -- ---G-- --------- | ADT_ZR.MAL | 12 | --- ------------ | ADI_ZR.MAL | 21 | --- ----------A - |
| 12. | AE_CF90CF402 | 4 | -- ---- ------------ | AE_CF.90CF402 | 17 | --- -A------------ | AE_CF.90CF402 | 19 | -- ----------- - |
| 13. | AGI_GR.97PVMY | 4 | -- ---- ---------- | AGI_GR.97PVMY | 18 | --- ----A--------------- | AGI_GR.97PVMY | 19 | ---- ----------- - |
| 14. | N_CM.YBF30 | 8 | -- G--T- ---------- | N_CM.YBF30 | 12 | --- - ------------ | N_CM.YBF30 | 19 | -------------- - |
| 15. | O_CM.MVP5180 | 9 | -- -C---G ------- | O_CM.MVP5180 | 12 | --- - ------------ | O_CM.MVP518O | 24 | ---- --------T-- - |
| 16. | O_CM.ANT70 | 10 | -- --- -G- ----------- | O_CM.ANT70 | 12 | --- -------------- | O_CM.ANT7C | 19 | --- ----------- - |
| 17. | SIVCPZANT | 11 | -- -GCA-- ------ | SIVCPZANT | 27 | --- - -----AC-T-- | SIVCPZANT | 25 | -- C----------T-- - |
| 18. | SIVCPZGAB | 5 | -- -G--- -------- | SIVCPZGAB | 12 | --- - ------------ | SIVCPZGAB | 19 | --------------- - |
如图1-2所显示，除了第3和17外所有的模板在10fM浓度时均显示了相似的扩增曲线，其中PCR条件为95℃30秒，50℃退火1分钟随后60℃延伸1分钟，共45个循环。第3和17模板也得到扩增，尽管这两个模板显示微弱的倾斜(图1)和高Ct值(图2)。如图3所显示，这些引物-探针系统对HIV患者工作良好。
此外，如上面描述的，尽管所提供数据得自TaqMan PCR，但这些寡聚核苷酸序列可用于上面描述的其它实时PCR技术，包括使用嵌入染料(如SYBR Green)的系统、探针与扩增子杂交以产生荧光信号的系统，如分子指示标、双染料探针(dual-hybe probes)、Sunrise或Amplifluor和Scorpion以及Policeman系统。此外这些寡聚核苷酸也可用于其它基因扩增技术(NASBA和bDNA)。
当详细和参考具体实施方案来描述本发明时，显而易见的是本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下，将对这些实施方案进行多种变化和修饰。
序列表
<110>日立化成研究中心公司
日立化成工业株式会社
<120>用于检测HIV的引物和探针
<130>HITACHI.062VPC
<150>60/534,754
<151>2004-01-07
<160>27
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>3，10，24
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝A，G，C，T，or U
<221>misc_feature
<222>7，9
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>8
<223>n＝A，T，or U
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A，C，T，or U
<400>1
gcngtnnnnn tncacaattt taanagaa 28
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>17，19，22
<223>n＝G or C
<221>misc_feature
<222>8，11
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>12，21
<223>n＝A，G，T，or U
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>16，18
<223>n＝A，T，or U
<400>2
gggattgngg nntannnnnc nng 23
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6，18
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>8
<223>n＝A，G，or C
<221>misc_feature
<222>11
<223>n＝A，T，or U
<221>misc_feature
<222>15，17，20
<223>n＝A or G
<400>3
cgggtntntt ncagngnnan c 21
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>4
gcagtattna tncacaattt taaaagaa 28
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>5
gcagtgttna tncacaattt taaaagaa 28
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>6
gcagtattna tncacaattt taagagaa 28
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9
<223>n＝C or T
<400>7
gcagtattna tacacaattt taaaagaa 28
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>8
gcggttttna tncacaattt taaaagaa 28
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>9
gcagtcttng tncacaattt taaaagaa 28
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>10
gcagtattng tncacaattt taaaagaa 28
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>9，12
<223>n＝C or T
<400>11
gcagtgcana tncacaattt taaaagaa 28
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>12
gggattgggg gntacantgc agg 23
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>13
gggattgggg attactntgc agg 23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>14
gggattgggg gntatantgc agg 23
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>15
gggattgggg gntacantgc acg 23
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>16
gggattgggg gntacantgc ggg 23
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>17
gggattgggg antacantgc agg 23
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>18
gggattgagg gntacantgc agg 23
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>19
cgggtntatt acagngacag c 21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>20
cgggtntgtt acagngacag c 21
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>21
cgggtntatt acagngacaa c 21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>22
cgggtntatt acagnggcag c 21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>23
cgggtntatt tcagngacag c 21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>24
cgggtntatt acagngatag c 21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<221>misc_feature
<222>6
<223>n＝C or T
<221>misc_feature
<222>15
<223>n＝A or G
<400>25
cgggtncatt acagngatag c 21
<210>26
<211>9719
<212>DNA
<213>I型人类免疫缺陷病毒
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>26
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180
acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacctgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgatgggaa 840
aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca 900
agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt 960
agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca 1020
ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc 1080
aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaaaaa agcacagcaa 1140
gcagcagctg acacaggaca cagcaatcag gtcagccaaa attaccctat agtgcagaac 1200
atccaggggc aaatggtaca tcaggccata tcacctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa 1260
gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa gtgataccca tgttttcagc attatcagaa 1320
ggagccaccc cacaagattt aaacaccatg ctaaacacag tggggggaca tcaagcagcc 1380
atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatag agtgcatcca 1440
gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagca 1500
ggaactacta gtacccttca ggaacaaata ggatggatga caaataatcc acctatccca 1560
gtaggagaaa tttataaaag atggataatc ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat 1620
agccctacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgta 1680
gaccggttct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aggaggtaaa aaattggatg 1740
acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcattg 1800
ggaccagcgg ctacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtagg aggacccggc 1860
cataaggcaa gagttttggc tgaagcaatg agccaagtaa caaattcagc taccataatg 1920
atgcagagag gcaattttag gaaccaaaga aagattgtta agtgtttcaa ttgtggcaaa 1980
gaagggcaca cagccagaaa ttgcagggcc cctaggaaaa agggctgttg gaaatgtgga 2040
aaggaaggac accaaatgaa agattgtact gagagacagg ctaatttttt agggaagatc 2100
tggccttcct acaagggaag gccagggaat tttcttcaga gcagaccaga gccaacagcc 2160
ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag 2220
ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc 2280
tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg 2340
atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa 2400
ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata 2460
aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 2520
tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa 2580
aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa 2640
taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaga tggaaaagga agggaaaatt tcaaaaattg 2700
ggcctgaaaa tccatacaat actccagtat ttgccataaa gaaaaaagac agtactaaat 2760
ggagaaaatt agtagatttc agagaactta ataagagaac tcaagacttc tgggaagttc 2820
aattaggaat accacatccc gcagggttaa aaaagaaaaa atcagtaaca gtactggatg 2880
tgggtgatgc atatttttca gttcccttag atgaagactt caggaagtat actgcattta 2940
ccatacctag tataaacaat gagacaccag ggattagata tcagtacaat gtgcttccac 3000
agggatggaa aggatcacca gcaatattcc aaagtagcat gacaaaaatc ttagagcctt 3060
ttagaaaaca aaatccagac atagttatct atcaatacat ggatgatttg tatgtaggat 3120
ctgacttaga aatagggcag catagaacaa aaatagagga gctgagacaa catctgttga 3180
ggtggggact taccacacca gacaaaaaac atcagaaaga acctccattc ctttggatgg 3240
gttatgaact ccatcctgat aaatggacag tacagcctat agtgctgcca gaaaaagaca 3300
gctggactgt caatgacata cagaagttag tggggaaatt gaattgggca agtcagattt 3360
acccagggat taaagtaagg caattatgta aactccttag aggaaccaaa gcactaacag 3420
aagtaatacc actaacagaa gaagcagagc tagaactggc agaaaacaga gagattctaa 3480
aagaaccagt acatggagtg tattatgacc catcaaaaga cttaatagca gaaatacaga 3540
agcaggggca aggccaatgg acatatcaaa tttatcaaga gccatttaaa aatctgaaaa 3600
caggaaaata tgcaagaatg aggggtgccc acactaatga tgtaaaacaa ttaacagagg 3660
cagtgcaaaa aataaccaca gaaagcatag taatatgggg aaagactcct aaatttaaac 3720
tgcccataca aaaggaaaca tgggaaacat ggtggacaga gtattggcaa gccacctgga 3780
ttcctgagtg ggagtttgtt aatacccctc ccttagtgaa attatggtac cagttagaga 3840
aagaacccat agtaggagca gaaaccttct atgtagatgg ggcagctaac agggagacta 3900
aattaggaaa agcaggatat gttactaata gaggaagaca aaaagttgtc accctaactg 3960
acacaacaaa tcagaagact gagttacaag caatttatct agctttgcag gattcgggat 4020
tagaagtaaa catagtaaca gactcacaat atgcattagg aatcattcaa gcacaaccag 4080
atcaaagtga atcagagtta gtcaatcaaa taatagagca gttaataaaa aaggaaaagg 4140
tctatctggc atgggtacca gcacacaaag gaattggagg aaatgaacaa gtagataaat 4200
tagtcagtgc tggaatcagg aaagtactat ttttagatgg aatagataag gcccaagatg 4260
aacatgagaa atatcacagt aattggagag caatggctag tgattttaac ctgccacctg 4320
tagtagcaaa agaaatagta gccagctgtg ataaatgtca gctaaaagga gaagccatgc 4380
atggacaagt agactgtagt ccaggaatat ggcaactaga ttgtacacat ttagaaggaa 4440
aagttatcct ggtagcagtt catgtagcca gtggatatat agaagcagaa gttattccag 4500
cagaaacagg gcaggaaaca gcatattttc ttttaaaatt agcaggaaga tggccagtaa 4560
aaacaataca tactgacaat ggcagcaatt tcaccggtgc tacggttagg gccgcctgtt 4620
ggtgggcggg aatcaagcag gaatttggaa ttccctacaa tccccaaagt caaggagtag 4680
tagaatctat gaataaagaa ttaaagaaaa ttataggaca ggtaagagat caggctgaac 4740
atcttaagac agcagtacaa atggcagtat tcatccacaa ttttaaaaga aaagggggga 4800
ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta 4860
aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac agggacagca 4920
gaaatccact ttggaaagga ccagcaaagc tcctctggaa aggtgaaggg gcagtagtaa 4980
tacaagataa tagtgacata aaagtagtgc caagaagaaa agcaaagatc attagggatt 5040
atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagaaca 5100
tggaaaagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaggga aagctagggg atggttttat 5160
agacatcact atgaaagccc tcatccaaga ataagttcag aagtacacat cccactaggg 5220
gatgctagat tggtaataac aacatattgg ggtctgcata caggagaaag agactggcat 5280
ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaagagat atagcacaca agtagaccct 5340
gaactagcag accaactaat tcatctgtat tactttgact gtttttcaga ctctgctata 5400
agaaaggcct tattaggaca catagttagc cctaggtgtg aatatcaagc aggacataac 5460
aaggtaggat ctctacaata cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 5520
ccacctttgc ctagtgttac gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 5580
aagggccaca gagggagcca cacaatgaat ggacactaga gcttttagag gagcttaaga 5640
atgaagctgt tagacatttt cctaggattt ggctccatgg cttagggcaa catatctatg 5700
aaacttatgg ggatacttgg gcaggagtgg aagccataat aagaattctg caacaactgc 5760
tgtttatcca ttttcagaat tgggtgtcga catagcagaa taggcgttac tcgacagagg 5820
agagcaagaa atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca 5880
gcctaaaact gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg 5940
tttcataaca aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag 6000
agctcatcag aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcagtaag tagtacatgt 6060
aacgcaacct ataccaatag tagcaatagt agcattagta gtagcaataa taatagcaat 6120
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caggttaatt gatagactaa tagaaagagc agaagacagt ggcaatgaga gtgaaggaga 6240
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tgatctgtag tgctacagaa aaattgtggg tcacagtcta ttatggggta cctgtgtgga 6360
aggaagcaac caccactcta ttttgtgcat cagatgctaa agcatatgat acagaggtac 6420
ataatgtttg ggccacacat gcctgtgtac ccacagaccc caacccacaa gaagtagtat 6480
tggtaaatgt gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaatga catggtagaa cagatgcatg 6540
aggatataat cagtttatgg gatcaaagcc taaagccatg tgtaaaatta accccactct 6600
gtgttagttt aaagtgcact gatttgaaga atgatactaa taccaatagt agtagcggga 6660
gaatgataat ggagaaagga gagataaaaa actgctcttt caatatcagc acaagcataa 6720
gaggtaaggt gcagaaagaa tatgcatttt tttataaact tgatataata ccaatagata 6780
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caaaggtatc ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt tttgcgattc 6900
taaaatgtaa taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc agcacagtac 6960
aatgtacaca tggaattagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat ggcagtctag 7020
cagaagaaga ggtagtaatt agatctgtca atttcacgga caatgctaaa accataatag 7080
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gaatccgtat ccagagagga ccagggagag catttgttac aataggaaaa ataggaaata 7200
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ataacactga aggaagtgac acaatcaccc tcccatgcag aataaaacaa attataaaca 7500
tgtggcagaa agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa attagatgtt 7560
catcaaatat tacagggctg ctattaacaa gagatggtgg taatagcaac aatgagtccg 7620
agatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat 7680
ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg 7740
tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag 7800
caggaagcac tatgggcgca gcctcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt 7860
ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt 7920
tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat 7980
acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca 8040
ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca 8100
cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa 8160
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gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca 8460
ttcgattagt gaacggatcc ttggcactta tctgggacga tctgcggagc ctgtgcctct 8520
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gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacagtat tggagtcagg 8640
aactaaagaa tagtgctgtt agcttgctca atgccacagc catagcagta gctgagggga 8700
cagatagggt tatagaagta gtacaaggag cttgtagagc tattcgccac atacctagaa 8760
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agggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 8940
gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt 9000
ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 9060
cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat 9120
atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattagca gaactacaca 9180
ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 9240
gagccagata agatagaaga ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg 9300
agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc 9360
ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg catccggagt acttcaagaa ctgctgacat 9420
cgagcttgct acaagggact ttccgctggg gactttccag ggaggcgtgg cctgggcggg 9480
actggggagt ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg 9540
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gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 9660
tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagca 9719
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<221>misc_feature
<222>12
<223>n＝A or G
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝G or C
<400>27
gggattgggg gntacanacc tgg 23
Claims (15)
1.一种分离出的寡聚核苷酸，其具有来自SEQ ID NO：1、2或3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的序列。
2.一种用于检测存在HIV的方法，所述的方法包括：
a)提供核酸样本；
b)使用至少1种权利要求1所述的寡聚核苷酸作为引物，在所述的核酸样本中扩增HIV的靶核酸序列；
c)检测HIV靶序列扩增产物的存在以作为HIV存在的指标。
3.根据权利要求2所述的方法，所述的扩增步骤使用至少1种具有来自SEQ ID NO：1或其互补序列至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸，和至少1种具有来自SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸，作为引物。
4.根据权利要求3所述的方法，所述的检测步骤包含与靶核酸序列杂交，其中所述靶核酸序列为至少一种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中的至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸。
5.根据权利要求2所述的方法，其还包含提供PCR反应混合物，其中所述混合物含有：
所述的核酸样本；
一对寡核酸引物，其为至少1种具有来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；
具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和
至少1种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸探针，其能够与所述靶核酸序列的区域杂交；
其中所述寡聚核苷酸探针与同所述寡聚核苷酸引物结合的所述靶核苷酸序列杂交，所述的寡聚核苷酸探针被发光标记共价标记，所述的核酸结合化合物能够修改所述标记的发光，并且在所述反应混合物中测量所述标记的发光。
6.根据权利要求2所述的方法，其还包含提供PCR反应混合物，混合物包含：
所述的核酸样本；
一对寡聚核苷酸引物，其为至少1种具有来自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；
具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和
至少1种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸探针，其能够与所述靶核苷酸序列的区域杂交；
其中在PCR条件下处理PCR反应混合物，并且具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶切割与靶核苷酸序列杂交的探针。
7.根据权利要求2所述的方法，进一步包含提供PCR反应混合物，混合物包含：
所述的核酸样本；
一对寡聚核苷酸引物，其为至少1种具有来自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；
核酸聚合酶；和
与双链DNA结合时会发光的标记；
其中在PCR条件下处理PCR反应混合物，并在所述反应混合物中测量所述标记的发光。
8.根据权利要求2所述的方法，其还包含提供PCR反应混合物，所述混合物包含：
所述的核酸样本；
一对寡聚核苷酸引物，其位至少1种具有来自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；和
具有3′→5′核酸酶活性的核酸聚合酶；
其中在PCR条件下处理PCR反应混合物，并且具有3′→5′核酸酶活性的核酸聚合酶切割至少一个所述寡聚核苷酸引物3′末端的核苷酸。
9.一种使用聚合酶链式反应(PCR)在样本中检测HIV核苷酸序列的方法，其中该工艺包括：
(a)提供PCR反应混合物，其包含：所述的核酸样本；一对寡聚核苷酸引物，其为至少1种具有来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和至少1种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸探针，其能与所述靶核苷酸的区域杂交；其中所述寡聚核苷酸探针与同所述寡聚核苷酸引物结合的所述靶核苷酸序列杂交，并且所述的寡聚核苷酸探针被发光标记共价标记；
(b)在所述的反应混合物中测量所述标记的发光；
(c)在PCR条件下处理PCR反应混合物，其中具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶切割与靶序列杂交的探针；
(d)在所述的反应混合物中测量所述标记的发光；和
(e)测量是否所述的靶序列在步骤(b)中测量的发光与步骤(d)中测量的发光之间存在差别。
10.一种试剂盒，其包含：
a)至少1种具有来自SEQ ID NO：1、2或3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；和
b)用于扩增靶序列核苷酸的试剂。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其包含：至少1种具有来自SEQID NO：1或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；至少1种具有来自SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其包含：至少1种具有来自SEQID NO：1或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；至少1种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；至少1种具有来自SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸。
13.根据权利要求10所述的试剂盒，其包含：至少1种具有来自SEQID NO：1或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；至少1种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸。
14.根据权利要求10所述的试剂盒，其包含：至少1种具有来自SEQID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸；至少1种具有来自SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸。
15.根据权利要求10所述的试剂盒，其还包含：
(a)PCR反应混合物，其包含核酸样本，其为一对至少1种具有来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸引物；
(b)具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶；和
(c)至少1种具有来自SEQ ID NO：2或其互补序列中至少15个连续核苷酸的寡聚核苷酸探针，其能与靶核苷酸的区域杂交。
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