CN1193103C - 用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒及其制备方法，该试剂盒利用寡核苷酸芯片能快速、准确地大批量区分出与分支杆菌菌种鉴定和抗药性有关的结核分支杆菌rpoB基因的点突变。本发明的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒含有一个寡核苷酸芯片，该芯片包含一个由结核分支杆菌分支杆菌菌种鉴定探针和抗药性检测探针组成的复合探针、结核分支杆菌rpoB基因、以及荧光材料，其中的荧光材料含有生物素结合蛋白，作为生物素和相应探针的标记来检测样品扩增产物的杂交。
Description
技术领域
本发明涉及用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒及其制备方法，特别地，本发明涉及用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的试剂盒，该试剂盒利用一个寡核苷酸芯片能快速、准确地大批量区分与抗药性相关的分支杆菌rpoB基因的点突变，及该试剂盒的制备方法。
背景技术
全世界每年大约有两百万人死于结核，移民的增加、HIV/AIDS的传播、以及抗药性菌株的出现提高了结核的致命性。免疫系统弱的AIDS患者和新生儿会患上结核，这种结核不仅仅能由结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染，还可能由MOTT(Mycobacterium other than tuberculosis，除结核杆菌外的分支杆菌)感染，特别是这些菌株：Mycobacteriumaviumintracellμlare(MAI)，龟分支杆菌(Mycobacterium chelonae)，偶发分支杆菌(Mycobacterium fortuitum)，堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium kansasaii)，蟾分支杆菌(Mycobacterium xenopi)，海分支杆菌(Mycobacterium marinum)，瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)和斯氏分支杆菌(Mycobacteriumszulgai)。
结核病通常是利用多种抗结核的药物通过化学疗法进行治疗，由于存在具有不同药物感受性的多种不同的分支杆菌菌株，因此检测和鉴别致病菌对于有效治疗来说是很重要的。
为了诊断结核，通常要采用到胸腔X光检测和唾液检测。胸腔X光检测经常将已经治愈了的非活动性结核病或其他形式的胸腔疾病误诊为结核。唾液检测可以通过下列两种典型的方法来完成：唾液涂片显微观察法，在该方法中病人的唾液被很薄地涂布在载玻片上，然后对细菌进行选择性染色以进行显微观察；以及培养法，该方法是将细菌在生理条件下培养以用于目测。唾液涂片显微观察法相对简单、快速，但不能轻易从MOTT中区分出结核分支杆菌。 已经可以利用培养法对分支杆菌菌株进行检测和鉴定，但由于细菌的生长速度很慢，利用这种方法至少要花6-8个星期。在这一过程中，可联合应用一线抗结核药物，但可能会导致治疗的失败和抗药性。事实上，已经发现越来越多的菌株对一线抗结核药物如异烟肼(INH)，利福平(RIF)，链霉素(STR)，乙胺丁醇(EMB)，pyrasinamide(PZA)具有抗药性。
因此，为了实现有效地控制和治疗结核的目的，已经越来越认识到，有必要在感染的初级阶段快速地鉴别出致病菌。近来已发展出在相对短的时间内对分支杆菌种进行鉴别的分子生物学方法，这些方法利用分支杆菌基因的种特异性序列如IS6110作为靶DNA。但是，在不同种类的分支杆菌中IS6110基因具有不同的拷贝数，而在有些种中则不存在。一些报道表明IS6110基因不是分支杆菌特异性的。因此，利用IS6110作为靶DNA可能会导致假阳性或假阴性结果。由于16S rRNA DNA的高度多态性区域(highly polymorphicregion)表征了种特异性多态现象，因此也已经被用来进行菌种的鉴别。基于这种方法已经产生了几种商业产品：能直接应用于样品的Accuprobe(基因探针，圣地亚哥，CA，U.S.A.)、以及AMTD(基因探针，圣地亚哥，CA，U.S.A.)和Amplicor MTB(Roche诊断系统，萨默维尔，新泽西，U.S.A.)，这两种产品在靶DNA进行分析之前可利用PCR(聚合酶链反应)进行扩增从而使敏感性提高。但是16S rRNA基因有时在个别菌株中拥有不同的拷贝数，这将使得准确鉴别菌种变得复杂。而且，为了检测抗药性，必须对rpoB基因进行附加的分子生物学分析。
在下文中，将对与药物抗性有关的结核分支杆菌的点突变作详细的说明。已知RIF抗性剂(resistance against RIF)是一种主要的抗结核药物，它与编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因的突变有关。迄今为止已发现30多种已鉴定出的不同的突变都聚集在3,534bp rpoB基因的81bp的核心区域。(Amalio Telenti，Paμl Imboden，Francine Marchesi，Douglas Lowrie，SterwartCole，M.Joseph Colston，Lukas Matter，Kurt Schopfer，以及Thomas Bodmer，″Detection of rifampin-resistance mutation in Mycobacterium tuberculosis″THELACET，Vol.341，pp.647-650，1993).
表1列出了发生在结核分支杆菌rpoB基因的密码子507到533处的点突变。如表1所示，在密码子513、516、526、和531中发生点突变的频率更高，且比其他的突变更具有普遍性。
[表1]
密码子 I 不同的核苷(氨基酸改变)
510 CAG(Gln)＞CAT(His)
511 CTG(Leu)＞CCG(Pro)，CGG(Arg)
512 AGC(Ser)＞ACC(Thr)，CGC(Arg)
513 CAA(Gln)＞CTA(Leu)，AAA(Lys)，CCA(Pro)
515 ATG(Met)＞ATA(Ile)
516 GAC(Asp)＞GTC(Val)，TAC(Tyr)，GAG(Glu)，GGC(Gly)
521 CTG(Leu)＞ATG(Met)
522 TCG(Ser)＞TTG(Leu)
526 CAC(His)＞TAC(Tyr)，GAC(Asp)，CGC(Arg)，CTC(Leu)，CCC(Pro)，CAA(Glu)，AAC(Asn)，CAG(Gln)
531 TCG(Ser)＞TTG(Leu)，TGG(Trp)，TGT(Cys)，CAG(Gln)
Rifabutin (简称为RIB)，是利福霉素S的一种螺环哌啶衍生物，被用于防止AIDS患者的MAC感染(James M.Musser，″Antimicrobial AgentResistance in Mycobactera：Molecμlar Genetic Insights″，Clinical MicrobiologyReview，Vol.8，No.4，pp.496-514，1995)。RIB抗性剂(Resistance against RIB)也与rpoB基因的点突变相关。但是，在RIF和RIB中突变显示的药物敏感性不同：检测表明对RIF有抗性的几种突变体对RIB是敏感的。对RIF和RIB都表现出抗性的突变体也有报道(Della Bruna C.，G.Schiopacassi，D.Ungheri，D.Jabes，E.Morvillo，和A.Sanfilippo，″A new spiro-piperidylrifamycin：in vitro and in vivo studies″，J.Antibiot.Vol.36，pp.1502-1506，1983，Dessen A.，A.Quenmard，J.S.Blanchard，w.R.Jacobs，Jr.，and J.C.Sacchettini，″Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacteriumtuberculosis″Science，Vol.267，pp.1638-1641，1995)。RIB经常被用来治疗RIF抗性的感染，在许多情况下都证明其是有效的(Gillespie S.H.，A.J.Baskerville，R.N.Davidson，D.Felmingham，and A.D.M.Bryceson，″Theserum rifabutin concentrations in patient successfμlly treated for mμlti-resistantMycobacterium tuberculosis infection″，J.Antimicrobi.Chemother.Vol.33，pp.661-674，1990)。
另外，rpoB基因的种特异性特征已经被用来鉴别各种分支杆菌菌种。韩国专利登记号(Registration No.)No.234975公开了一种利用一系列能特异性地扩增分支杆菌rpoB基因的新PCR引物、并通过PCR-RFLP(聚合酶链反应后的限制性片段长度多态性)分析法来检测和鉴别分支杆菌菌种的方法。韩国专利登记号No.285254也公开了一种检测和鉴别结核分支杆菌复合物和MOTT的方法，该方法中使用可分别以不同大小(in a respectively differentsize)扩增结核分支杆菌复合物和MOTT中的rpoB基因片段的引物。
但是，以上方法在PCR扩增之前都要进行细菌培养步骤，只能分析有限的菌种和有限数量的样品，而且，在PCR步骤后还要费时地进行限制酶处理步骤和/或电泳步骤。
韩国专利登记号No.285253公开了一种利用巢式PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)和单步巢式PCR-SSCP来检测结核分支杆菌的利福平抗性的方法，该方法包括两个PCR和多态分析步骤，因此检测出利福平抗性大约要花四天。
Affymetrix申请的PCT国际专利公开号为No.W097/29212公开了一种rpoB基因的DNA芯片测序技术，利用该方法，可以分析rpoB基因中700bp的全部碱基序列以获得临床学上的重要信息，如种特异性和抗药性。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的一个目的就是提供一种用于分支杆菌鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，该试剂盒能够快速、准确地大批量区分出与分支杆菌鉴别和抗药性检测相关的特征。
本发明的另一个目的是提供一种用于分支杆菌鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒的制备方法，利用该试剂盒能够快速、准确的大批量区分出与分支杆菌鉴别和抗药性检测相关的特征。
本发明的又一个目的是提供聚合酶链反应(PCR)的引物对，利用该引物对可对直接来源于包括唾液样品在内的未经培养的样品中的多种菌种的rpoB基因片段(157bp)进行有效的PCR扩增，从而加快分支杆菌菌种的鉴定。
本发明的再一目的是提供聚合酶链反应(PCR)的试验条件，从而有效地扩增来源于不同分支杆菌的rpoB基因的157bp片段。
为了实现本发明的以上目的，本发明提供了一种用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其包括：一个寡核苷酸芯片，该芯片包括由分支杆菌rpoB基因的种特异性DNA序列构成的种鉴定探针、由一个或多个分支杆菌rpoB基因修饰密码子组成的分支杆菌抗药性检测探针、以及由野生型序列组成的与各个抗药性检测探针相应的对照组探针；该试剂盒还包括一种用于检测寡核苷酸芯片与样品DNA发生杂交的方法。
利用以上组成，可同时进行抗药性检测以及分支杆菌种鉴别，特别地，通过比较抗药性检测探针和对照组探针的杂交信号强度可以分辨出与抗药性相关的分支杆菌rpoB基因的点突变，而通过比较种特异性探针杂交的强度可以进行菌种的鉴定，因此，能快速、准确地大批量进行分支杆菌种的鉴定和抗药性检测。
在本发明的具体实施方式中，所说的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒中的抗药性检测探针包括一个或多个修饰密码子，这些修饰密码子位于rpoB基因的507-533密码子区。
通过上述组成，由于位于经常发生点突变的507-533密码子区的一个或多个修饰密码子可被用作为探针，因此，仅利用分支杆菌rpoB基因的一部分就能快速、准确的分辨出抗药性。
在本发明的另一个具体实施方式中，所说的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒中的抗药性检测探针是利福平抗性探针和/或rifabutin敏感性探针。
通过上述组成，可快速、准确地区分样品是否具有利福平抗性和/或rifabutin敏感性。
在本发明地另一个实施方式中，提供了一种用于分支杆菌鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒的制备方法，该方法包括以下步骤：(a)修饰由分支杆菌rpoB基因的种特异性DNA序列构成的菌种鉴定探针、由一个或多个分支杆菌rpoB基因修饰密码子组成的分支杆菌抗药性检测探针、以及由野生型序列组成的与各个抗药性检测探针相应的对照组探针，使其5’末端含有一个胺基；(b)在玻片上诱导产生一个醛基；以及(c)利用希夫碱(Schiff base)反应在玻片上固定修饰的探针而制备一个寡核苷酸芯片。
通过上述组成，可以很容易地制备出所述诊断试剂盒，该试剂盒的优点在于能同时快速、准确的大批量区分分支杆菌菌种和抗药性。
在本发明的另一方面中，用于分支杆菌鉴定的一对PCR引物包括具有一定碱基序列的DGR8和DGR9，利用这些碱基序列，可特异性的扩增分支杆菌rpoB基因片段(157bp)。
当使用引物对时，从未被培养的临床样品中分离出来的DNA可被用作聚合酶链反应的模板，属于分支杆菌属的44种菌种的rpoB基因片段(157bp)能得到有效的扩增。因此，能在较短的时间内进行分支杆菌菌种的鉴定和抗药性检测，例如大约在6小时内。通过使用引物对获得的PCR产物是157bp大小的DNA，该DNA可用作寡核苷酸芯片分析中的靶DNA(target DNA)。
在本发明的另一个方面涉及到的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的方法中，将样品中的rpoB基因片段在合适反应条件下进行PCR扩增，反应条件如：退火温度64℃，反应循环数40，引物DGR8和DGR9的浓度为100pmol。扩增得到的产物通过使用本发明的诊断试剂盒用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测。
DNA芯片技术产生于二十世纪八十年代早期，该技术提供了一种在同一时间内获得大量基因信息的方法，该方法已经被用于研究基因表达、突变、以及人或细菌基因组多态性。
本发明利用了能快速进行基因分析的DNA芯片技术，提供了一种用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒及其制备方法，在该试剂盒中，可将分支杆菌菌种鉴定和与抗药性相关的结核分支杆菌的点突变区分开。
在本发明中，基于在背景技术中描述的药物敏感性和rpoB基因突变之间的关系，发生在结核分支杆菌的rpoB基因的突变被用来研究对抗药性菌株的鉴定。更具体的说，将发生分支杆菌点突变频率最高的含有81bp核心区域的rpoB基因片段(157bp)利用特殊的引物对进行PCR扩增，然后，将扩增得到的DNA与寡核苷酸芯片杂交，从而检测点突变以进行抗药性检测。
使用寡核苷酸芯片的方法包括通过PCR扩增来自临床样品的靶DNA，的步骤。为了将该方法成功地用于临床样品，PCR应该使用高效引物。
在韩国专利申请号No.2000-0029369中，按照仅使用结核分支杆菌的rpoB基因碱基序列，已经设计出了生物素-TR8和TR9作为引物，利用该引物扩增的DNA是157bp的片段，该片段含有与利福平抗性相关的发生点突变频率最高的81bp的核心区域。然而，生物素-TR8/9引物的扩增效率并不能满足未经培养的样品、例如唾液的需要，因此，由于要进行细菌培养步骤，则使利用这些引物进行的分析时间超过了6-8周。甚至，由于这些引物的效能很低，培养样品中的MOTT可能得不到扩增。换句话说，如果不能从唾液样品中对DNA进行直接扩增，那么对菌种鉴别和抗药性的快速分析就不能完成。
因此，本发明结合分支杆菌属的43种不同的菌种以及结核分支杆菌的rpoB基因的碱基序列，设计了一个新的引物对。利用这组引物，可利用从未培养的样品中分离的DNA作为模板进行PCR反应，通过这个单步的PCR反应步骤(a single PCR step)，上述43种菌种和结核分支杆菌的特异性rpoB基因序列都能得到扩增。将扩增得到的产物应用于DNA芯片，则可在很短的时间内同时完成分支杆菌菌种鉴定和rpoB突变检测。
附图说明
图1是本发明中用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的寡核苷酸芯片的制备步骤的流程图；
图2显示了根据本发明用生物素-TR8和9作为引物扩增rpoB基因、并在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳的结果图；
图3A到3J显示了根据本发明用生物素-dUTP对临床样品进行PCR扩增后与寡核苷酸芯片进行杂交所得的荧光图象；
图4是图3A到3J中所用的寡核苷酸芯片的探针的位置排列图；
图5显示了根据本发明使用探针SEQ ID NO 5到12的寡核苷酸芯片的排列位置(array format)图；
图6A到6C显示了利用图5的寡核苷酸芯片进行分支杆菌菌种鉴定的试验结果图；
图7是寡核苷酸芯片的位置排列图，其中的核苷酸芯片含有碱基序列为SEQ ID NO 41到46的探针，可以用来检测结核分支杆菌中与利福平抗性相关的附加的(additional)rpoB基因突变；
图8A到8D显示了利用图7的寡核苷酸芯片所得的临床样品(clinicalisolates)的有关利福平抗性和rifabutin敏感性的诊断结果；
图9A显示了PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中的DNA条带图，该PCR扩增是利用本发明人的在先申请中公开的PCR条件进行的，即，退火温度63℃，35个循环，用50pmol的生物素-TR8和TR9作为引物；
图9B显示了PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中的DNA带的图象，该PCR扩增是根据本发明的PCR条件进行的，即，退火温度64℃，40个循环，用100pmol的生物素-DGR8和DGR9作为引物；
图10显示了本发明中的11种唾液样品在最优条件下利用生物素-DGR8和DGR9作为引物进行PCR扩增后在2％的琼脂糖凝胶中的图象；以及
图11A到11B显示了利用图7的寡核苷酸芯片对唾液样品进行有关利福平抗性进行诊断的结果。
实施本发明的最佳方式
下文将参照附图详细介绍本发明的优选实施方式。然而，下述实施例仅仅只是证实本发明的构成和效果，因此，本发明不仅限于下述实施例。
实施例1-1：分支杆菌基因组DNA
由the Department of Respiratory Diseases，Asan Medical Center(韩国，汉城)提供经过测序的从10份临床样品培养物(clinical isolate cultures)中提取的分支杆菌基因组DNA，其他的分支杆菌基因组DNA从ATCC(Manassas，VA USA)获得。
实施例1-2：寡核苷酸探针和引物的制备
表2显示了核苷酸探针和引物的序列，所用的每一种生物素-TR8和TR9和探针都是由Bionics(韩国，汉城)自定义合成，其他的所有试剂都是一级的。
[表2]
根据表2所显示的顺序，选用SEQ ID NO 1-40。
如表2所示，所设计的用于研究rpoB基因点突变的寡核苷酸芯片包括7个野生型探针、17个RIF抗性探针、以及8个RIB敏感性探针。
结构显示，17个RIF抗性探针SEQ ID NO 20-36可以区分下列密码子的突变：密码子511(Leu＞Pro)、密码子513(Gln＞Pro)、密码子516(a：Asp＞Val，b：Asp＞Tyr，c：Asp＞Glu)、密码子518(Asn＞His)、密码子521(Leu＞Met)、密码子522(Ser＞Leu)、密码子526(a：His)Tyr，b：His)Asp，c：His)Arg，d：His)Asn，e：His)Ala，f：His＞Cys，g：His)Gln，h：His＞Gly)、以及密码子531(Ser＞Leu)。
17个RIF抗性探针中的8个RIB敏感性探针SEQ ID NO 22，23和31-36能区分密码子516(a：Asp＞Val，b：Asp＞Tyr，c：Asp＞Glu)、以及密码子526(d：His＞Asn，e：His＞Ala，f：His＞Cys，g：His＞Gln，h：His＞Gly)的突变。
正如许多报道中所指出的那样，含有突变型516a和516b的菌株表现出截然不同的RIB敏感性(James M.Musser，″Antimicrobial Agent Resistancein Mycobacteria：Molecμlar Genetic Insights″，Clinical Microbiology Review，Vol.8，No.4，pp.496-514，1995)。在RIB敏感性探针中寡核苷酸芯片的现行排列中含有516a和516b探针。
将为了使分支杆菌菌种和其他细菌区分开而设计的序列为SEQ ID NO1-3的探针Mc1、Mc2和Mc5混合，并使其单点附着在一个寡核苷酸芯片上。由探针上所产生的阳性反应可知，Mc1能检测出结核分支杆菌(M.Tuberculosis)、非洲分支杆菌(M.africanum)、亚洲分支杆菌(M.asiaticum)、牛型结核菌(2)(M.bovis(2))、胃分支杆菌(M.gastri)、鸟分支杆菌(2)(M.avium(2))、隐藏分支杆菌(2)(M.celatium(2))、日内瓦分支杆菌(M.genavense)、戈登氏分支杆菌(M.gordonae)、嗜血分支杆菌(M.haemophilum)、中庸分支杆菌(M.interjectum)、中间分支杆菌(M.intermedium)、胞内分支杆菌(M.intracellμlare)、堪萨斯分支杆菌(M.kansasii)、麻风分支杆菌(M.leprae)、玛尔摩分支杆菌(M.malmoense)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、斯氏分支杆菌(M.szμlgai)、蟾分支杆菌(M.xenopi)、土地分支杆菌(M.terrae)、次要分支杆菌(M.triviale)、不产色分支杆菌(M.nonchromogenicum)、金色分支杆菌(M.aurum)、千田分支杆菌(M.chitae)、外来分支杆菌(M.peregrmum)、草分支杆菌(M.phlei)、耻垢分支杆菌(M.smegmatis)、耐高温分支杆菌(M.thermoresistibile)、以及牝牛分支杆菌(M.vaccae)；Mc2能检测致病的或非致病的、但临床上很重要的M.marium、下出氏分支杆菌(M.shimoidei)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、脓肿分支杆菌(M.abscessus)、以及龟分支杆菌(M.chelonae)；Mc5能检测偶发分支杆菌(M.fortuitum)。而且，为了比较彼此的杂交信号，增加序列为SEQ ID NO 4的探针Mex作为对照组，该探针能检测不属于分支杆菌但和分支杆菌株相似的白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)，因此能更准确地鉴定被检测的菌株是否属于分支杆菌。
除了能区分分支杆菌和其他相似细菌的探针外，还可加入含有分支杆菌种特异性的rpoB基因部分序列的8个分支杆菌菌种鉴定探针SEQ ID NO 5到12，从而使分支杆菌的鉴别更精确。关于分支杆菌菌种鉴定探针，Msl探针能检测出结核分支杆菌(M.Tubercμlosis)、非洲分支杆菌、牛型结核菌、以及胃分支杆菌。其他探针被设计用来检测亚洲分支杆菌(Ms2)、猿猴分支杆菌(Ms2)(M.simiae)、金色分支杆菌(Ms2)、塞内加尔分支杆菌(Ms2)(M.senegalense)、下出氏分支杆菌(Ms2)(M.shimoidei)、新金色分支杆菌(Ms2)(M.neoaurum)、土地分支杆菌(Ms2)、戈登氏分支杆菌(Ms2)、嗜血分支杆菌(Ms2)、斯氏分支杆菌(Ms2)、胞内分支杆菌(Ms2)、堪萨斯分支杆菌(Ms2)、瘰疬分枝杆菌(Ms2)(M.scrofulaceum)、偶发分支杆菌(Ms2)、诡诈分支杆菌(Ms2)(M.fallax)、微黄分支杆菌(Ms2)(M.flavescens)、外来分支杆菌(Ms2)(M.peregrinum)、草分支杆菌(Ms2)(M.phlei)、牝牛分支杆菌(Ms2)、M.marinumv(Ms2)、溃疡分支杆菌(Ms2)、千田分支杆菌(Ms2)、日内瓦分支杆菌(Ms2)、耻垢分支杆菌(Ms2)、中间分支杆菌(Ms3)、玛尔摩分支杆菌(Ms3)、不产色分支杆菌(Ms3)、麻风分支杆菌(Ms3)、鸟分支杆菌(Ms4)、次要分支杆菌(Ms4)、隐藏分支杆菌(Ms4)、中庸分支杆菌(Ms5)、蟾分支杆菌(Ms6)、龟分支杆菌(Ms7)、脓肿分支杆菌(Ms7)、以及耐高温分支杆菌(Ms8)。以上是致病的或是非致病的、但临床上很重要的菌种，可以根据需要进行鉴定。
附加的菌种鉴定探针，MTAB和MF被设计用来特异地检测结核分支杆菌(MTAB)、非洲分支杆菌(MTAB)、牛型结核菌(MTAB)、牛型结核菌BCG(MTAB)、胞内分支杆菌(MTAB)、以及堪萨斯分支杆菌(MTAB)、偶发分支杆菌(MF)、和微黄分支杆菌(MF)。
实施例1-3：寡核苷酸芯片的制备
图1是本发明中用于构建分支杆菌DNA鉴定的寡核苷酸芯片的制备步骤的流程图，如图1所示，该寡核苷酸芯片的制备步骤包括：第一步(10)，修饰各个分支杆菌复合探针：使含有分支杆菌rpoB基因的分支杆菌种特异性DNA序列的分支杆菌菌种鉴定探针、含有一个或多个分支杆菌rpoB基因修饰密码子的分支杆菌抗药性检测探针、以及由野生型序列组成的与各个抗药性检测探针相应的对照组探针，使其5’末端含有一个胺基；第二步(20)，在硅烷化的玻片上引入一个醛基；以及第三步(30)，利用Schiff碱反应在玻片上固定修饰的探针，从而制备出一个寡核苷酸芯片。
更优选的，将一个特定的DNA探针(见表2)溶解在3×SSC中，使其浓度为200pmol/μl。将0.1-0.2μl的DNA探针溶液在衍生有醛基的玻片(CELAssociates，Inc.，MA，U.S.A)上点样，37℃下在潮湿的培养箱中反应4小时，然后依次用0.2％的十二烷基磺酸钠(SDS)、蒸馏水、NaBH4溶液(0.1gNaBH4，30ml PBS，和10ml EtOH)分别处理玻片1分钟、1分钟、5分钟，最后，用蒸馏水冲洗光滑玻片1分钟，风干，室温避光保藏，待用。
实施例1-4：聚合酶链反应(PCR)
进行PCR的总体积为50μl，内含10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCI、1.5mM MgCl2、1U Taq聚合酶、以及50pmol生物素-TR8和TR9引物(参见表2)。进一步地，含有1mM dATP、dGTP、以及dCTP各2μl、dTTP1.5μl，加入1mM的生物素-dUTP 0.50μl，使其与产生的靶DNA中的荧光标记随机结合。表3列出PCR混合物的组成。
[表3]
| PCR反应混合物的组成 | 量(μL) |
| 10x PCR buffer(MgCl2-free)MgCl2(25mM)dNTPs(1mM each)Biotin-dUTP(1mM)Primer 1：Bio-TR 8(50pmol/μl)Primer 2：TR9(50pmol/μl)Taq polymerase(5unlt/μl)Template DNA | 532(dT1.5)0.5220.21 |
PCR在下列条件下进行35个循环：
-预变性：94℃，5分钟
-变性：94℃，30秒
-引物退火：63℃，30秒
-聚合：72℃，45秒
-最后延伸：72℃，5分钟
通过以上方法获得的是包含81bp的核心区域的157bp的PCR产物，并已通过2％的琼脂糖电泳进行鉴定。
实施例1-5：杂交和扫描
采用PCR扩增的20μl的靶DNA(157bp)与20μl脱氧核糖核酸酶(DNase)缓冲液和1μl DNA酶I(DNase I)(0.1U/μl)混合，在0℃下处理5分钟。将所得靶DNA在99℃下热处理10分钟，使DNase I失活。然后用4μl的3NNaOH在25℃下处理5分钟，接着用Tris-HCl(pH7.2)2μl和3N HCl 4μl在0℃下处理5分钟，再往上述混合物中加入50μl 12x SSPE(磷酸钠盐-EDTA缓冲液)和0.5μl 10％ SDS，然后转移到寡核苷酸芯片上，于40℃杂交3小时。
杂交后，用2x SSPE和0.03％SDS在25℃下冲洗寡核苷酸芯片3分钟，用1x SSPE在25℃下冲洗5分钟，然后用0.2x SSPE在25℃下冲洗5分钟以除去未反应的DNA。寡核苷酸芯片在25℃下风干，加入49μl 3x SSPE和1μl抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白的混合物，25℃下处理10分钟，将被染色的寡核苷酸芯片用1x SSPE冲洗两次，每次1分钟，风干，用荧光激光扫描仪(GMS 418 array scanner，TaKaRa，日本)扫描。
野生型(wt)探针包括根据与密码子507-533相应的rpoB基因序列设计的7种17mer探针，该探针在中间位置(位点8-12)含有突变位点，并且在各野生型探针之间具有最大的序列重叠。本发明通过比较利福平抗性探针的信号强度与相应的野生型探针的信号强度能准确的检测出频繁发生的点突变，同时预测在密码子507-533处发生的所有点突变。
设计各个探针，使其发生点突变频率最高的位点位于中间位点(8-12位点)，这样的探针作为野生型探针，因此通过与野生型探针的信号强度进行比较可以提高检测的敏感性，使检测更准确。试验证明，在每个探针上连接一个T10间隔子(T10 spacer)可以提高杂交效率。这可能是因为T10间隔减小了空间位阻(steric hindrance)，从而提高了靶DNA和探针的杂交效率。
图2显示了本发明用生物素-TR8和TR9引物扩增10个临床样品(clinicalisolates)中的rpoB基因片段(157bp)，然后在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳的结果。用DNase I消化上述10个扩增的rpoB基因片段(157bp)，然后与寡核苷酸芯片杂交。在最佳条件下，即40℃下杂交3小时后，用抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白使寡核苷酸芯片染色，再在578nm下进行荧光扫描。通过得到的图象比较野生型(wt)探针的荧光强度和相应的突变(mt)型探针的荧光强度可以分析抗药性。除了在序列的中间位置的几个碱基不同外，突变型探针和野生型探针的序列是一致的。突变的靶DNA在相应的突变型探针上比在野生型探针上表现出更强的信号。杂交信号的差别可以根据视觉进行判断，其信号强度也可以利用合适的软件进行数值测定从而作更准确的比较。
图3A到3J显示了本发明扩增的含有生物素-dUTP的临床样品(clinicalsamples)利用寡核苷酸芯片所得的荧光图象。图4显示了图3A到3J中所用的探针的位置，其中每个探针被固定在各自独立的块中以便于信号比较，而且为了增加分析的准确性，每个探针都分别固定了两个位置。
在图3A中，野生型探针F1，F2，F4，F5，F6和F7的信号比突变型探针的信号更强，但是突变型探针516c的信号比相应的野生型探针F3和突变型探针516a和516b的信号更强。因此，该样品被确定为516c突变体。在图3B到3J中，样品采用与图3A相同的方式鉴定。
因此，如图3A到3J所示，可鉴定含有下列RIF抗性突变体的每一临床样品(clinical isolate)：#22(mt516c)、#24(mt516b/526e)、#30(mt531)、#36(mt516b)、#48(mt526f)、#82(mt531/516c)、#87(mt531/516c)、#90(mt516c/526d)、#91(mt531)、以及#94(mt511/531)。
另外，上述样品中显示具有RIB敏感性的临床样品有：#22(mt516c)、#24(mt526b/526e)、#36(mt516b)、#48(mt526f)、#82(mt531/516c)、#87(mt531/516c)、以及#90(mt516c/526d)。将上述结果与药物敏感性测试的结果进行比较或进行DNA测序，#24表现出不一致性(discrepancy)，它在药物敏感性测试中表现为RIB抗性，但测序结果表明，其是RIB敏感性526e突变体。寡核苷酸芯片的结果发现，在RIB抗性突变体526b和RIB敏感性突变体526e中都表现出信号。基于上述结果，认为该样品中含有两种形式的突变体或两种不同的菌株，因而产生混合结果。
L.B.Heifets已经报道了将含有511(Leu＞Pro)、516(Asp＞Tyr)、516(Asp＞Val)、以及522(Ser＞Leu)突变的菌株分类为对rifabutin MIC≤5μg/ml的、具有低水平抗性的菌株。(Heifets L.B.，Antituberculosis drugs：antimicrobial activity in vitro，pp.14-57 in L.B.Heifets(ed.)，Drug susceptibilityin the chemotherapy of mycobacterial infections，1st ed.CRC Press，Boca Raton，Fla，1991)。对此，除了要进行寡核苷酸芯片试验外，还需要进行药物敏感性测试。
关于密码子526突变体，已经清楚鉴定出His＞Gln、Gly、Asn、Ala、或Cys为RIB敏感性，而His＞Tyr、Pro、Arg、或Asp为RIB抗性，因此，单独的寡核苷酸芯片试验能区分RIB敏感性。
图5显示了使用探针Ms1-Ms8的的寡核苷酸芯片的排列位置图，其中的探针是为了进行菌种鉴定而设计的。图6A到6C显示了使用图5的寡核苷酸芯片进行分支杆菌菌种鉴定的试验结果。对于堪萨斯分支杆菌、偶发分支杆菌、以及瘰疬分枝杆菌来说，显示分支杆菌存在的MCmix探针的信号比对照Mex探针的信号要强得多，2号探针的信号比菌种鉴定探针中的1、3-8号探针的信号要强。同样地，临床上很重要的33种分支杆菌能得到鉴定。对于结核分支杆菌来说，Mcmix探针和1号探针的信号开启，除了胃分支杆菌外的MOTT可通过Mcmix探针和2号到8号探针的信号得到鉴定。
在下面的两个实施例中，用到的材料包括Jeju University(Jeju，韩国)提供的16种不同分支杆菌菌种的基因组DNA、以及由Bionics(Seoul，韩国)自定义合成的DNA探针和引物，所有其他试剂都是一级的。
实施例2-1：寡核苷酸探针的制备
检测结核分支杆菌利福平抗性的rpoB基因突变的附加探针可以和上文提到的抗药性探针一起使用，三种附加探针及其相应的野生型探针的碱基序列参见表4。
[表4]
| 探针 | 碱基序列 | 药物敏感性 | 鉴定结果 |
| Mt509 | 5’amine-t10-ggcaccagacagctgag-3’ | RFP-R，RBU-S | 509 MUTANT |
| Mt533 | 5’amine-t10-tgtcggcgccggggccc-3’ | RFP-R，RBU-R | 533 MUTANT |
| Mt524 | 5’amine-t10-tgtcggggttaacccac-3’ | RFP-R，RBU-R | 524 MUTANT |
| Wt509 | 5’amine-t10-ggcaccagccagctgag-3’ | RFP-S，RBU-S | 509 WILD TYPE |
| Wt533 | 5’amine-t10-tgtcggcgctggggccc-3’ | RFP-S，RBU-S | 533 WILD TYPE |
| Wt524 | 5’amine-r1o-tgtcggggttgacccac-3’ | RFP-S，RBU-S | 524 WILD TYPE |
通过比较探针的荧光强度，能检测出诸如密码子509(Ser)→AGA(Arg)、密码子533 CTG(Leu)→CCG(Pro)、密码子524TTG(Leu)→TTA(Leu)的突变。在表4中，RFP代表利福平，RBU代表rifabutin，R代表抗性，以及S代表敏感性。
图7显示了含有附加RIF抗性探针的寡核苷酸芯片的位置排列图。图8A到8D显示了利用图7的寡核苷酸芯片所得的临床样品(clinical isolates)的有关利福平抗性和rifabutin敏感性的诊断结果。实验中所使用的临床样品是由Asan Medical Center(Seoul，韩国)提供的。样品中的突变体采用与实施例1相同的方式鉴定，鉴定结果如图8A-8D所示，为#1(516a突变体)、#2(511突变体)、#3(516b突变体)、以及#4(531突变体)。通过比较Mcmix探针和Mex探针而判断出，所有的样品都是分支杆菌菌株，DNA测序的结果与寡核苷酸芯片的各结果一致。
实施例2-2：引物的制备
在先申请中，发明人使用的是生物素-TR8和TR9引物对(primer set)，此外本发明中发明人还设计了一对新的引物对(primer set)：生物素-DGR8和DGR9，该引物对能从未培养的样品，例如唾液中扩增结核分支杆菌和MOTT，且相对于生物素-TR8/TR9其效率有所提高。
通过将43种菌种的rpoB基因的部分碱基序列进行混合而设计出新的引物对：生物素-DGR8、DGR9，这43种菌种除结核分支杆菌外，还包括非洲分支杆菌、亚洲分支杆菌、鸟分支杆菌、牛型结核菌，牛型结核菌BCG strainFrench 1173P2(M.bovis BCG strain French 1173P2)、隐藏分支杆菌菌株ATCC51131(M.celatum strain ATCC51131)、隐藏分支杆菌菌株ATCC51130(M.celatum strain ATCC51130)、胃分支杆菌、日内瓦分支杆菌、戈登氏分支杆菌、嗜血分支杆菌、中庸分支杆菌、中间分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、麻风分支杆菌、玛尔摩分支杆菌、海洋分支杆菌(M.marinum)、鸟分支杆菌副结核亚种(M.avium subsp.Paratuberculosis)、瘰疬分枝杆菌、下出氏分支杆菌(M.shimoidei)、猿猴分支杆菌、斯氏分支杆菌、溃疡分支杆菌，蟾分支杆菌、土地分支杆菌、次要分支杆菌、不产色分支杆菌、脓肿分支杆菌、金色分支杆菌、龟分支杆菌、千田分支杆菌、诡诈分支杆菌、微黄分支杆菌、偶发分支杆菌ATCC6841、偶发分支杆菌ATCC49403、新金色分支杆菌、外来分支杆菌、草分支杆菌、塞内加尔分支杆菌、耻垢分支杆菌、耐高温分支杆菌、以及牝牛分支杆菌。
用于设计生物素-DGR8和DGR9引物的rpoB基因部分碱基序列SEQ IDNO 49-92在表5中列出。
[表5]
| 菌株 | DGR9 | DGR8 | |
| 1 | 结核分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 2 | 非洲分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 3 | 亚洲分支杆菌 | tt gccgcgatca aggagt | gga agtgcgtgac gtgca |
| 4 | 鸟分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 5 | 牛型结核菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 6 | 牛型结核菌BCG strainFrench 1173P2 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 7 | 隐藏分支杆菌菌株ATCC51131 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggtgcgcgac gtgca |
| 8 | 隐藏分支杆菌菌株ATCC51130 | tg gcggccatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 9 | 胃分支杆菌 | tc gccgccatta aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 10 | 日内瓦分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggtccgcgac gtgca |
| 11 | 戈登氏分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga agtacgtgac gtgca |
| 12 | 嗜血分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga agtacgtgac gtgca |
| 13 | 中庸分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | cga ggtccgcgac gtgca |
| 14 | 中间分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga agtccgtgac gtgca |
| 15 | 胞内分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgtgac gtcca |
| 16 | 堪萨斯分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgtgac gtcca |
| 17 | 麻风分支杆菌 | tc gccgctatca aggaat | aga ggtccgtgac gtgca |
| 18 | 玛尔摩分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgtgac gtgca |
| 19 | 海洋分支杆菌 | tt gcggcgatca aggagt | gga agttcgtgac gtgca |
| 20 | 鸟分支杆菌副结核亚种 | tg gcggcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 21 | 瘰疬分枝杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtgca |
| 22 | 下出氏分支杆菌 | tt gccgcgatca aggagt | gga agttcgtgac gtgca |
| 23 | 猿猴分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtgca |
| 24 | 斯氏分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgtgac gtgca |
| 25 | 溃疡分支杆菌 | tt gccgcgatca aggagt | gga agttcgtgac gtgca |
| 26 | 蟾分支杆菌 | tg gccgcgatca aggagt | gga ggtccgtgac gtgca |
| 27 | 土地分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | tga ggtccgtgac gtgca |
| 28 | 次要分支杆菌 | tc gccgcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 29 | 不产色分支杆菌 | tc gccgccatca aggaat | gga agttcgtgac gtgca |
| 30 | 脓肿分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggtccgcgac gtgca |
| 31 | 金色分支杆菌 | tt gccgcgatca aggagt | gga agtgcgtgac gtgca |
| 32 | 龟分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtgca |
| 33 | 千田分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggttcgtgac gtgca |
| 34 | 诡诈分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | gga ggtccgcgac gtgca |
| 35 | 微黄分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga agtccgtgac gtgca |
| 36 | 偶发分支杆菌菌株ATCC6841 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtcca |
| 37 | 偶发分支杆菌菌株ATCC49403 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtcca |
| 38 | 新金色分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtgca |
| 39 | 外来分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtgca |
| 40 | 草分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggtccgcgac gtgca |
| 41 | 塞内加尔分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | tga ggtccgcgac gtgca |
| 42 | 耻垢分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggtccgcgac gtgca |
| 43 | 耐高温分支杆菌 | tg gcggcgatca aggagt | cga ggtccgcgac gtcca |
| 44 | 牝牛分支杆菌 | tg gcggcgatca aggaat | cga ggtccgcgac gtgca |
在表6中，通过上述方法制备的生物素-DGR8和DGR9的碱基序列被列出，并和在先申请中的生物素-TR8和TR-9进行了比较。
[表6]
| 引物 | 碱基序列 |
| biotin-TR8 | 5’biotin t g c a c g t c g c g g a c c t c c 3’ |
| TR9 | 5′t c g c c g c g a t c a a g g a g t 3’ |
| biotin-DGR8 | 5’blotin t g S a c g t c R c g N a c Y t c 3’ |
| DGR9 | 5’t B g c S g c B a t Y a a g g a R t 3’ |
参数)B：c，t，g
N：c，t，g，a
R：g，a
S：c，g
Y：c，t
实施例2-3：聚合酶链反应(PCR)
为了寻找使用新设计的生物素-DGR8和DGR9引物对进行PCR的最佳条件，反应条件如下述进行变化：
A：温度程序
a.94℃ 5分钟，94℃ 30秒，47℃ 30秒，以及72℃ 45秒
b.94℃ 5分钟，94℃ 30秒，63℃ 30秒，以及72℃ 45秒
c.94℃ 5分钟，94℃ 30秒，64℃ 30秒，以及72℃ 45秒
d.94℃ 5分钟，94℃ 30秒，65℃ 30秒，以及72℃ 45秒
通过2％的凝胶电泳分析，使用生物素-DGR8和生物素-DGR9引物进行PCR的产量根据退火温度而发生改变，当退火温度为64℃或65℃时获得最大产量，在47或63℃时获得少量的不同大小的副产品。
B.反应循环
以生物素-DGR8和生物素-DGR9作为引物，64℃下退火，进行35或40个循环，聚合酶链反应的扩增产物通过2％的琼脂糖凝胶鉴定表现为单一条带，扩增产物的量根据反应循环数而变化，进行40个循环时产量更高。因此，最优PCR条件是64℃和40个循环。
C.引物浓度
使用不同浓度的生物素-DGR8和DGR9引物：50pmol、100pmol、500pmol和1000pmol，聚合酶链反应的退火温度设定为64℃，进行40个循环，发现在50～100pmol浓度范围内产量增加，但超过100pmol时产量下降，因此，生物素-DGR8和DGR9引物的浓度在50～100pmol范围内被认为是合适的。
利用上文试验测得的最佳反应条件，对16种不同的分支杆菌菌种进行PCR扩增。图9A显示了PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中的DNA条带图，该PCR扩增是在发明人的在先申请中公开的PCR条件下进行的，即，退火温度63℃，35个循环，50pmol生物素-TR8和TR9引物。图9B显示了PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中的DNA条带图，该PCR扩增是在本发明的PCR条件下进行的，如退火温度64℃，40个循环，100pmol生物素-DGR8和DGR9引物。
如图9A和9B所示，本发明的引物对生物素-DGR8和DGR9在扩增16种分支杆菌菌种的rpoB157bp区域时都表现出比生物素-TR8和TR9引物对更高的效率。其157bp的扩增产物可以作为靶DNA用于核苷酸芯片分析。
实施例2-4：唾液样品的抗药性诊断
从Department of Respiratory Diseases，Asan Medical Center(Seoul，韩国)的结核患者或可能的结核患者的唾液样品中直接提取得到11个DNA样品。
图10显示了根据本发明的实施例2-3中的最优条件，即：64℃、40个循环、使用100pmol的生物素-DGR8和DGR9引物，对唾液样品进行PCR扩增后的产物在2％琼脂糖凝胶中的图象。如图10所示，在#16和#36样品中没有检测到结核分支杆菌，除了上述#16和#36样品外的其他9个样品检测结果显示结核分支杆菌阳性。因此(Thus)，利用图7中的寡核苷酸芯片诊断来检测抗药性，结果检测到8个样品是野生型的，其中包括#6、#20、#26、#27、#29、#38、#41、#49，也就是说，这些是利福平敏感性菌株。#57是在密码子509和513处发生突变的抗性菌株。图11A到11B显示了寡核苷酸芯片分别检测#27(野生型)#57(509，513突变体)所获得的图象。将这8种野生型菌株进行DNA测序的结果和使用寡核苷酸芯片进行检测的结果是一致的，通过药物敏感性测试检测到#57是利福平抗性菌株。
实施例2-5：随机标记插入酞菁5-dUTP(Cyanine 5-dUTP)
相对于在先申请在PCR随机结合生物素标记后采用抗生蛋白链菌素-R-藻红蛋白着色的方法，已设计出的新的检测方法可减少检测时间。更具体的说，用酞菁5-dUTP(NEN，U.S.A)代替生物素-dUTP进行PCR以使酞菁(cyanine)随机与扩增产物结合，这样，在扫描之前就不需要进行单独的着色步骤，因此，可快速、简便地获得明显可见的结果。在进行聚合酶链反应时，所用酞菁5-dUTP的浓度与已知方法中生物素-dUTP的浓度相同，优选地，使用没有被生物素修饰的DGR8作为引物。除了着色步骤被删除以及在633nm处进行荧光扫描外，试验条件与已有方法的条件相同。
在实施例2-1到2-5没有特别说明的部分和实施例1-1到1-5相同，因此这些步骤被省略。
工业应用
最后，如同上文所述，仅利用分支杆菌rpoB基因的一部分(157bp)，本发明能协同、快速且准确地大批量进行分支杆菌菌种的鉴定和抗药性检测，这能为治疗结核提供有用的信息，从而能给予患者进行合适的药物治疗。因此，在分支杆菌感染的早期阶段，可以为分支杆菌感染的患者提供合适的抗生素药剂和其他必须的治疗。
序列表
<110> 百奥麦雷公司(biomedlab Co.，Ltd.)
<120> 用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒及其制备方法
<130> SGG1601PCT
<150> KR10-2000-0029369
<151> 2000-05-30
<160> 92
<170> Kopatentln 1.71
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 1
tcttcggcac cagccag 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 海洋分支杆菌(Mycobacterium marinum)
<400> 2
tcttcggaac cagccag 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 偶发分支杆菌(Mycobacterium fortuitum)
<400> 3
tcttcggaac gtcgcag 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
<400> 4
tcttcggaac ctcgcag 17
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌、非洲分支杆菌、牛型结核菌、胃分支杆菌，MTB复合物
(Mycobacterium tuberculosis，M.africanum，M.bovis，M.gastri，MTB complex)
<400> 5
ggtctgtcac gtgagcgtg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 亚洲分支杆菌、猿猴分支杆菌、金色分支杆菌、塞内加尔分支杆菌、下出氏
分支杆菌、新金色分支杆菌(Mycobacterium asiaticum，M.simiae，
M.aurum，M.senegalense，M.shimoidei，M.terrae，M.neoaurum)
<400> 6
ggtctgtccc gtgagcgtg 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 中间分支杆菌、麻风分支杆菌、玛尔摩分支杆菌、不产色分支杆菌
(Mycobacterium intermedium，M.leprae，M.malmoense，M.nonchromogenicum)
<400> 7
ggtctgtcgc gtgagcgtg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 鸟份枝杆菌副结核亚种、鸟分支杆菌、次要分支杆菌、隐藏分支杆菌
(Mycobarerium avium paratuberculosis，M.avium，M.triviale，M.celatium)
<400> 8
ggtctgtccc gggagcgtg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 中庸分支杆菌(Mycobacterium interjectum)
<400> 9
ggtctgtccc gcgagcgtg 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 蟾分支杆菌(Mycobacterium xenopi)
<400> 10
ggtctgtcgc gcgagcgtg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 龟分支杆菌、脓肿分支杆菌(Mycobacterium chelonae，M.abscessus)
<400> 11
ggtctgaccc gtgaccgtg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 耐高温分支杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)
<400> 12
ggtctgagcc gggagcgtg 19
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 13
cagccagctg agccaat 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 14
gctgagccaa ttcatgg 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 15
attcatggac cagaaca 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 16
tggaccagaa caacccg 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 17
caacccgctg tcggggt 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 18
ggttgaccca caagcgc 17
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 19
ccgactgtcg gcgctgg 17
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 20
cagccagccg agccaat 17
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 21
gctgagccca ttcatgg 17
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 22
attcatggtc cagaaca 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 23
attcatgtac cagaaca 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 24
tggaccagca caacccg 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 25
caacccgatg tcggggt 17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 26
caacccgctg ttggggt 17
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 27
ggttgaccta caagcgc 17
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 28
ggttgaccga caagcgc 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 29
ggttgacccg caagcgc 17
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 30
ccgactgttg gcgctgg 17
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 31
attcatggag cagaaca 17
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 32
ggttgaccaa caagcgc 17
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 33
ggttgaccgc caagcgc 17
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 34
ggttgacctg caagcgc 17
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 35
ggttgaccca gaagcgc 17
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 36
ggttgaccgg caagcgc 17
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 37
tgcacgtcgc ggacctcc 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 38
tcgccgcgat caaggagt 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌、非洲分支杆菌、牛型结核菌、牛型结核菌BCG、胞内分支杆
菌、堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.africanum，
M.bovis，M.bovisBCG，M.intracelluare，M.kansasii)
<400> 39
gcagctgagc caattcat 18
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 偶发分支杆菌、微黄分支杆菌(Mycobacterium fortuitum，M.flavescens)
<400> 40
cgacgtcgca gctgtcg 17
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 41
ggcaccagac agctgag 17
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 42
tgtcggcgcc ggggccc 17
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 43
tgtcggggtt aacccac 17
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 44
ggcaccagcc agctgag 17
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 45
tgtcggcgct ggggccc 17
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 46
tgtcggggtt gacccac 17
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 该序列与44种分支杆菌菌株的rpoB基因结合(this sequence is combinated
with the rpoB genes of 44 species belonged to Mycobaterium)
<400> 47
tgsacgtcrc gnacytc 17
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 该序列与44种分支杆菌菌株的rpoB基因结合(This sequence is combinated
with the rpoB genes of 44 species belonged to Mycobacterium)
<400> 48
tbgcsgcbat yaaggart 18
<210> 49
<211> 306
<212> DNA
<213> 结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 49
tgcgtacggt cggcgagctg atccaaaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtggaggc gatcacaccg cagacgttga 120
tcaacatccg gccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc 240
tggggcccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 50
<211> 306
<212> DNA
<213> 非洲分支杆菌(Mycobacterium africanum)
<400> 50
tgcgtacggt cggcgagctg atccaaaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtggaggc gatcacaccg cagacgttga 120
tcaacatccg gccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc 240
tggggcccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 51
<211> 306
<212> DNA
<213> 亚洲分支杆菌(Mycobacterium asiaticum)
<400> 51
tgcgcaccgt gggcgagttg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtt gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctttcgg gtctgaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgtg ccggcctgga agtgcgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 52
<211> 300
<212> DNA
<213> 鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)
<400> 52
tgcgcaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtccc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggctcaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggcccggg tggtctgtcc cgggagcggg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
300
<210> 53
<211> 306
<212> DNA
<213> 牛型结核菌(Mycobacterium bovis)
<400> 53
tgcgtacggt cggcgagctg atccaaaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtggaggc gatcacaccg cagacgttga 120
tcaacatccg gccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc 240
tggggcccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 54
<211> 306
<212> DNA
<213> 牛型结核菌BCG株French 1173P2
(Mycobacterium bovis BCG strain French 1173P2)
<400> 54
tgcgtacggt cggcgagctg atccaaaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtggaggc gatcacaccg cagacgttga 120
tcaacatccg gccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc 240
tggggcccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 55
<211> 306
<212> DNA
<213> 隐藏分支杆菌菌株ATCC51131(Mycobacterium celatum strain ATCC51131)
<400> 55
ttcgtaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgagt cggcatgtcc cgcatggagc 60
gggtggtccg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg ggctgaccca caagcggcgc ctgaacgcac 240
tgggcccggg tggtctgtcc cgggagcggg cgggcctcga ggtgcgcgac gtgcacccga 300
gtcact 306
<210> 56
<211> 306
<212> DNA
<213> 隐藏分支杆菌菌株ATCC51130(Mycobacterium celatum strain ATCC51130)
<400> 56
ttcgtaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgagt cggcatgtcc cgcatggagc 60
gggtggtccg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg ggctgaccca caagcggcgc ctgaacgcac 240
tgggcccggg tggtctgtcc cgggagcggg cgggcctcga ggtgcgcgac gtgcacccga 300
gtcact 306
<210> 57
<211> 306
<212> DNA
<213> 胃分支杆菌(Mycobacterium gastri)
<400> 57
tgcgcacggt gggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc aggatggagc 60
gcgtcgtccg ggagcggatg accactcagg acgtcgaggc catcacgccg cagacgctga 120
tcaacattcg cccggtggtc gccgccatta aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gcctgaccca caagcgccgg ctttcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 58
<211> 306
<212> DNA
<213> 日内瓦分支杆菌(Mycobacterium genavense)
<400> 58
tgcgcacggt gggcgatctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg tgagcggatg accactcagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tccggttgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcag gtctcaccca caagcgccgg ttgtcggcgc 240
tggggccggg cggtctgtcc cgtgagcggg cgggcctcga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 59
<211> 306
<212> DNA
<213> 戈登氏分支杆菌(Mycobacterium gordonae)
<400> 59
tgcgcaccgt gggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tggggccggg tggtctgtcc cgtgagcgtg cgggtctgga agtacgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 60
<211> 306
<212> DNA
<213> 嗜血分支杆菌(Mycobacterium haemophhilum)
<400> 60
tgcgcaccgt gggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tggggccggg tggtctgtcc cgtgagcgtg cgggtctgga agtacgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 61
<211> 306
<212> DNA
<213> 中庸分支杆菌(Mycobacterium interjectum)
<400> 61
tgcgcaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc aggatggagc 60
gcgtcgtccg ggagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagacgctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gcctcaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggcccggg cggtctgtcc cgcgagcggg ccggcctcga ggtccgcgac gtgcacccga 300
accact 306
<210> 62
<211> 306
<212> DNA
<213> 中间分支杆菌(Mycobacterium intermedium)
<400> 62
tgcgtaccgt cggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cgcatggagc 60
gcgttgtccg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccttga 120
tcaacatccg gccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgt 240
tgggcccggg tggtctgtcg cgtgagcgtg ccgggctgga agtccgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 63
<211> 306
<212> DNA
<213> 胞内分支杆菌(Mycobacterium intracellulare)
<400> 63
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accacgcagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg gtctgaccca caagcgccgc ctctcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggcctgga ggtccgtgac gtccacccct 300
cgcact 306
<210> 64
<211> 306
<212> DNA
<213> 堪萨斯分支杆菌(Mycobacterium kansasii)
<400> 64
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accacgcagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg gtctgaccca caagcgccgc ctctcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggcctgga ggtccgtgac gtccacccct 300
cgcact 306
<210> 65
<211> 306
<212> DNA
<213> 麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)
<400> 65
tgcgcacggt cggcgaattg atccagaacc agatccgggt cggtatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagacgctga 120
tcaatatccg tccggtggtc gccgctatca aggaattctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga tcagaacaac cctctgtcgg gcctgaccca caagcgccgg ctgtcggcgc 240
tgggcccggg tggtttgtcg cgtgagcgtg ccgggctaga ggtccgtgac gtgcaccctt 300
cgcact 306
<210> 66
<211> 306
<212> DNA
<213> 玛尔摩分支杆菌(Mycobacterium malmoense)
<400> 66
tgcgcacggt cggggagctg atccagaacc agatccgcgt cggcatgtcg cggatggagc 60
gcgtcgtccg ggagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagacgctga 120
tcaacatccg gccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggctgaccca caagcgccgg ctgtcggcgc 240
tgggcccggg tggtctgtcg cgtgagcgtg ccggcttgga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 67
<211> 306
<212> DNA
<213> 海洋分支杆菌(Mycobacterium marinum)
<400> 67
tgcgcacggt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagacgctga 120
tcaacatccg tccggtcgtt gcggcgatca aggagttctt cggaaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctctccg gtctcaccca caagcgccgc ctctcggcgc 240
tggggccggg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggtctgga agttcgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 68
<211> 306
<212> DNA
<213> 鸟分支杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis)
<400> 68
tgcgcaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagttgtccc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggctcaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggcccggg tggtctgtcc cgggagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 69
<211> 306
<212> DNA
<213> 瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)
<400> 69
tgcgcaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcg cgtatggagc 60
gtgtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg ccccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggccttga ggtccgcgac gtgcactcca 300
gccact 306
<210> 70
<211> 306
<212> DNA
<213> 下出氏分支杆菌(Mycobacterium shimoidei)
<400> 70
tgcgcacggt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagacgctga 120
tcaacatccg tccggtcgtt gccgcgatca aggagttctt cggaaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg gtctcaccca caagcgccgc ctctcggcgc 240
tggggccggg cggtctgtcc cgtgagcgtg ccgggctgga agttcgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 71
<211> 306
<212> DNA
<213> 猿猴分支杆菌(Mycobacterium simiae)
<400> 71
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcc cgcatggagc 60
gcgtcgtgcg tgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggtaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctttcgg gtctgaccca caagcgtcgc ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgtg ccggccttga ggtccgcgac gtgcacgcca 300
gccact 306
<210> 72
<211> 306
<212> DNA
<213> 斯氏分支杆菌(Mycobacterium szulgai)
<400> 72
tgcgcaccgt gggcgagttg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gcccgtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctctccg gtctgaccca caagcggcgt ctgtccgctc 240
tggggccggg cggtctgtcc cgtgagcggg ccgggctgga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 73
<211> 306
<212> DNA
<213> 溃疡分支杆菌(Mycobacterium ulcerans)
<400> 73
tgcgcacggt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcg cggatggagc 60
gggtggtccg ggagcggatg accacccagg atgtcgaggc gatcacgccg cagacgctga 120
tcaacatccg tccggtcgtt gccgcgatca aggagttctt cggaaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctctccg gtctcaccca caagcgccgc ctctcggcgc 240
tggggccggg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggtctgga agttcgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 74
<211> 306
<212> DNA
<213> 蟾分支杆菌(Mycobacterium xenopi)
<400> 74
tgcgcacggt cggcgagctg atccaaaacc agatccgggt cggcatgtcg aggatggagc 60
gggtggtccg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccttga 120
tcaacatccg ccccgtggtg gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga tcagaacaac ccgctgtcgg ggctcaccca caagcggcgg ctctcggcgc 240
ttggtccggg cggtctgtcg cgcgagcggg ccgggctgga ggtccgtgac gtgcactcga 300
gccact 306
<210> 75
<211> 306
<212> DNA
<213> 土地分支杆菌(Mycobacterium terrae)
<400> 75
tgcgcacggt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cgggttgtcc cggatggagc 60
gtgtggtccg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg cccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgccgg ctgtcggcgc 240
tgggcccggg tggtctgtcc cgtgagcgtg ccgggcttga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 76
<211> 306
<212> DNA
<213> 次要分支杆菌(Mycobacterium triviale)
<400> 76
tgcgcaccgt cggggagttg atccagaacc agatccgggt cgggctgtcc cggatggagc 60
gggtggtgcg cgagcggatg accacccagg atgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg cccggtggtc gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg ggctgaccca caagcgccgg ctgtcggcgc 240
tggggcccgg cgggctctcc cgggagcggg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccca 300
gccact 306
<210> 77
<211> 306
<212> DNA
<213> 不产色分支杆菌(Mycobacterium noRchromogenicum)
<400> 77
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cgggctgtcc cggatggagc 60
gcgtggtccg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg cccggtggtc gccgccatca aggaattctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcag gtctgaccca caagcggcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg tggtctgtcg cgtgagcgcg ccggcctgga agttcgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 78
<211> 306
<212> DNA
<213> 脓肿分支杆菌(Mycobacterium abscessus)
<400> 78
tgcgtaccgt cggcgagctg attcagaacc agatccgggt cggcctgtcc cgtatggagc 60
gcgtcgtgcg tgagcgcatg accacgcagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggaaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gcctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg tggtctgacc cgtgaccgcg ccggcctcga ggtccgcgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 79
<211> 306
<212> DNA
<213> 金色分支杆菌(Mycobacterium aurum)
<400> 79
tgcgcaccgt gggcgagttg atccagaacc agatccgggt cggcatgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtt gccgcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctttcgg gtctgaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgtg ccggcctgga agtgcgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 80
<211> 306
<212> DNA
<213> 龟分支杆菌(Mycobacterium chelonae)
<400> 80
tgcgtaccgt cggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcg cgtatggagc 60
gcgtcgtgcg tgagcgcatg accactcagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggaaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctttcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggctc 240
tgggccccgg tggtctgacc cgtgaccgcg ctggccttga ggtccgcgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 81
<211> 306
<212> DNA
<213> 千田分支杆菌(Mycobacterium chitae)
<400> 81
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcc cgcatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc catcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg ggctgaccca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tcgggcccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggtctcga ggttcgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 82
<211> 306
<212> DNA
<213> 诡诈分支杆菌(Mycobacterium fallax)
<400> 82
tgcgcaccgt gggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcc cggatggagc 60
gcgtcgtccg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtggtg gcggcgatca aggagttctt cgggaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gcctgaccca caagcgccgg ctgtccgcgc 240
ttggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggcctgga ggtccgcgac gtgcacgcca 300
gccact 306
<210> 83
<211> 306
<212> DNA
<213> 微黄分支杆菌(Mycobacterium flavescens)
<400> 83
tgcgcaccgt cggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcg cggatggagc 60
gcgtcgtccg tgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggtacgtcg cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggccccgg tggtctgtcc cgtgagcgcg ccggcctcga agtccgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 84
<211> 306
<212> DNA
<213> 偶发分支杆菌菌株ATCC6841(Mycobacterium fortuitum strain ATCC6841)
<400> 84
tgcgcaccgt gggcgagctg atccagaacc agatccgcgt cggcctgtcc cgcatggagc 60
gcgtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggaacgtcg cagctgtcgc 180
agttcatgga tcagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggccttga ggtccgcgac gtccactcgt 300
cgcact 306
<210> 85
<211> 306
<212> DNA
<213> 偶发分支杆菌菌株ATCC49403(Mycobaterium fortuitum strain ATCC49403)
<400> 85
tgcgcaccgt gggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcc cgcatggagc 60
gcgtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggaacgtcg cagctgtcgc 180
agttcatgga tcagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggccttga ggtccgcgac gtccactcgt 300
cgcact 306
<210> 86
<211> 306
<212> DNA
<213> 新金色分支杆菌(Mycobacterium neoaurum)
<400> 86
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaatc agatccgggt cggcctgtcg cgcatggagc 60
gggtcgtgcg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cgggaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg tggtctgtcc cgtgagcgtg ccggacttga ggtccgcgac gtgcactcca 300
gccact 306
<210> 87
<211> 306
<212> DNA
<213> 外来分支杆菌(Mycobacterium peregrinum)
<400> 87
tgcgcaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcg cgtatggagc 60
gtgtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcaccccg cagaccctga 120
tcaacatccg ccccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggccttga ggtccgcgac gtgcactcca 300
gccact 306
<210> 88
<211> 306
<212> DNA
<213> 草分支杆菌(Mycobacterium phlei)
<400> 88
tgcgcaccgt cggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcg cgtatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgccgc ctgtcggcgc 240
tgggcccggg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggcctcga ggtccgcgac gtgcaccaca 300
gccact 306
<210> 89
<211> 306
<212> DNA
<213> 塞内加尔分支杆菌(Mycobacterium senegalense)
<400> 89
tgcgcaccgt gggtgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcc cgcatggagc 60
gcgtcgtgcg tgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggtaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctttcgg gtctgaccca caagcgtcgc ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgtg ccggccttga ggtccgcgac gtgcacgcca 300
gccact 306
<210> 90
<211> 306
<212> DNA
<213> 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)
<400> 90
tgcgcaccgt cggtgagctg atccagaacc agatccgcgt gggcctgtcc cgcatggagc 60
gtgtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctttcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ctggcctcga ggtccgcgac gtgcacccca 300
gccact 306
<210> 91
<211> 306
<212> DNA
<213> 耐高温分支杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)
<400> 91
tgcgcaccgt cggcgagctg atccagaacc agatccgggt cggcctgtcc cgcatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg ccccgtcgtg gcggcgatca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgccgg ctgtcggcgc 240
tgggcccggg cggtctgagc cgggagcgcg ccggcctcga ggtccgcgac gtccacccgt 300
cgcact 306
<210> 92
<211> 306
<212> DNA
<213> 牦牛分支杆菌(Mycobacterium vaccae)
<400> 92
tgcgcacggt cggtgagctg atccagaacc agatccgcgt cggcctctcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcggatg accacccagg acgtcgaggc gatcactccg cagaccctga 120
tcaacatccg tcccgtcgtg gcggcgatca aggaattctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgc ctgtcggcgc 240
tgggccccgg cggtctgtcc cgtgagcgcg ccggcctcga ggtccgcgac gtgcactcca 300
gccact 306
Claims (27)
1.一种用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，包括：
一个寡核苷酸芯片，所述芯片包括：由分支杆菌rpoB基因(157bp)的种特异性DNA序列构成的菌种鉴定探针、由一个或多个分支杆菌rpoB基因(157bp)修饰密码子组成的分支杆菌利福平抗性检测探针和/或rifabutin敏感性检测探针、以及与上述抗药性检测探针相应的由野生型序列组成的对照组探针；和
用于检测上述核苷酸探针与样品发生杂交的标记物。
2.根据权利要求1的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的菌种鉴定探针包含SEQ ID NO 5到12。
3.根据权利要求1或2的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的分支杆菌抗药性检测探针含有一个或多个rpoB基因密码子507-533的修饰密码子。
4.根据权利要求1的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的利福平抗性检测探针含有修饰过的511、513、516、518、522、526和53 1密码子。
5.根据权利要求4的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的利福平抗性检测探针包含序列为SEQ ID NO 20到36的探针。
6.根据权利要求4的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的利福平抗性检测探针进一步包含修饰过的509、533和524密码子。
7.根据权利要求6的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的利福平抗性检测探针进一步包含序列为SEQ ID NO 41到46的探针。
8.根据权利要求1的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的rifabutin敏感性检测探针含有修饰过的516和526密码子。
9.根据权利要求8的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的rifabutin敏感性检测探针包含序列为SEQ ID NO 22、23和31到36的探针。
10.根据权利要求1或2的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的寡核苷酸芯片是利用含有部分rpoB基因的各个探针通过希夫碱反应而形成的，经过修饰使其含有一个胺基，并在玻片上诱导产生一个醛基。
11.根据权利要求1或2的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其进一步包括一个扩增样品DNA的装置。
12.根据权利要求11的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的装置包括序列为SEQ ID NO 37和38的生物素-TR8和TR9引物，所述引物能特异性的扩增rpoB基因片段(157bp)。
13.根据权利要求11的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的装置包括序列为SEQ ID NO 47和48的生物素-DGR8和DGR9引物，所述引物能特异性的扩增rpoB基因片段(157bp)。
14.根据权利要求11的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的标记物是包括所说的生物素结合蛋白的荧光物质。
15.根据权利要求14的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的荧光材料是抗生蛋白链菌素-R-藻红蛋白。
16.根据权利要求11的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的标记物是加入到聚合酶链反应中的酞菁5-dUTP。
17.根据权利要求1或2的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的探针含有5’间隔子T10。
18.根据权利要求1或2的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的寡核苷酸芯片还含有能首先检测样品是否为分支杆菌的探针。
19.根据权利要求18的用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒，其中所说的结核菌探针含有序列为SEQ ID NO 1到4的探针。20.一种用于分支杆菌菌种鉴定和抗药性检测的诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：
(a)修饰由分支杆菌rpoB基因(157bp)的种特异性DNA序列构成的菌种鉴定探针、由一个或多个分支杆菌rpoB基因(157bp)修饰密码子组成的分支杆菌利福平抗性检测探针和/或rifabutin敏感性检测探针、以及由野生型序列组成的与所述的各个抗药性检测探针相应的对照组探针，使其5’末端含有一个胺基；
(b)在玻片上诱导产生一个醛基；以及
(c)利用希夫碱反应在玻片上分别固定修饰的探针，以制备一个寡核苷酸芯片。
21.根据权利要求20的诊断试剂盒的制备方法，还包括利用NaBH4来减少在步骤(c)中形成的稳定亚胺键的步骤。
22.包含碱基序列SEQ ID NO 47和48的一对引物，所述引物能特异性地扩增分支杆菌属菌种的rpoB基因片段。
23.一种用于分支杆菌菌种鉴定和利福平抗性检测及rifabutin敏感性检测的方法，该方法包括以下步骤：
利用权利要求22的引物对通过聚合酶链反应(PCR)扩增样品中的rpoB基因片段；以及
利用权利要求1的诊断试剂盒根据相应的特定菌种的荧光强度区分各菌种。
24.根据权利要求23的用于分支杆菌菌种鉴定和利福平抗性检测及rifabutin敏感性检测的方法，其中所说的PCR反应中的退火温度为64-65℃。
25.根据权利要求23或24的用于分支杆菌菌种鉴定和利福平抗性检测及rifabutin敏感性检测的方法，其中所说PCR反应的循环数为38-42。
26.根据权利要求23或24的用于分支杆菌菌种鉴定和利福平抗性检测及rifabutin敏感性检测的方法，其中进行PCR反应的引物浓度为50-100pmol。
27.根据权利要求23的用于分支杆菌菌种鉴定和利福平抗性检测及rifabutin敏感性检测的方法，其中的PCR反应还包括加入酞菁5-dUTP作为标记物的步骤。
28.根据权利要求23的用于分支杆菌菌种鉴定和利福平抗性检测及rifabutin敏感性检测的方法，其中所说的样品是病人的未经培养的唾液、血液或脑脊液。
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